專利名稱：Δ6去飽和酶及其在制備多不飽和脂肪酸中的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。更具體地講，本發(fā)明涉及編碼Δ6脂肪酸去飽和酶的多核苷酸序列的鑒定以及這些去飽和酶在制備長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸[“PUFA”]中的用途。
背景技術(shù)：
人們正研究包括植物、藻類、真菌、原生藻菌(stramenopiIes)和酵母在內(nèi)的多種不同宿主作為商業(yè)化多不飽和脂肪酸[“PUFA”]生產(chǎn)的手段。基因工程已經(jīng)證明能夠基本上改變一些宿主(甚至那些天然不能產(chǎn)生亞油酸[LA;18:2gj-6]和α -亞麻酸[ALA; 18:3 ω-3]脂肪酸)的天然能力以高水平的生產(chǎn)多種長(zhǎng)鏈《-3/co-6PUFA。無論這是天然能力還是重組技術(shù)的結(jié)果，生產(chǎn)花生四烯酸[ARA;20:4co-6]、二十碳五烯酸[ΕΡΑ;20:5ω-3] 和二十二碳六烯酸[DHA ；22:6ω-3]可能都需要表達(dá)Δ6去飽和酶。迄今為止鑒定的大多數(shù)Δ6去飽和酶具有將LA轉(zhuǎn)化成Y-亞麻酸WLA; 18:3ω-6]的基本能力，以及將ALA轉(zhuǎn)化成十八碳四烯酸[STA ； 184ω-3]的次級(jí)活性?；讦?6去飽和酶可在例如ARA、EPA和DHA合成中起作用，已經(jīng)投入相當(dāng)大的努力鑒定和研究這些來自不同來源的酶。同樣地，在公開文獻(xiàn)(例如GenBank)和專利文獻(xiàn)(例如美國(guó)專利5，968，809,7, 067，285、和7，335，476以及美國(guó)專利申請(qǐng)公布2006-0117414)中已經(jīng)公開了多種Δ 6去飽和酶。連同Δ 5、Δ8和Δ 4去飽和酶一起，已知Δ 6去飽和酶是長(zhǎng)鏈 PUFA “前端”去飽和酶(其中去飽和發(fā)生在先前存在的雙鍵和脂肪酸?；聂然┒酥g， 與甲基定向的去飽和相反)。這些去飽和酶特征在于三個(gè)組氨酸框[H(X)3_4H(SEQ ID NO 3 和 4)、H(X)2_3HH(SEQ ID N0:5 禾口 6)和 H/Q (X) 2_3HH(SEQ ID NO :7 和 8)]，以及是細(xì)胞色素 b5融合超家族的成員，因?yàn)樗鼈冊(cè)贜末端具有融合細(xì)胞色素b5結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域起到電子供體的作用。盡管編碼Δ 6去飽和酶的基因是已知的，仍需要這些酶的附加種類，它們具有不同的酶特性，適于在多種宿主生物中的異源表達(dá)以用于生產(chǎn)ω-3/ω-6脂肪酸。申請(qǐng)人已經(jīng)通過從紅藻紫球藻(Porphyridium cruentum)中分離編碼Δ 6去飽和酶的基因滿足了所述需求。發(fā)明概述本發(fā)明涉及編碼具有△ 6去飽和酶活性的多肽的新的遺傳構(gòu)建體，以及它們?cè)谠孱悺⒓?xì)菌、酵母、類眼蟲、卵菌、原生藻菌和真菌中的使用，用于產(chǎn)生PUFA。因此本文提供了分離的核酸分子，其包含編碼Δ6去飽和酶的核苷酸序列，所述分離的核酸分子選自(a)編碼如SEQ ID NO 2所示的氨基酸序列的分離的核酸分子；(b)在以下雜交條件下與(a)雜交的分離的核酸分子0. IX SSC,0. 1% SDS,65°C并用2X SSC, 0. 1% SDS洗滌，隨后用0. 1XSSC，0. 1% SDS洗滌；或者與(a)或(b)完全互補(bǔ)的分離的核酸分子。在第二實(shí)施方案中，本發(fā)明提供分離的核酸分子，所述分離的核酸分子包含編碼至少471個(gè)氨基酸的Δ 6去飽和酶的第一核苷酸序列，所述去飽和酶基于BLASTP比對(duì)方法在與包含如SEQ ID NO 2所示的序列的多肽進(jìn)行比較時(shí)具有至少80%的同一性；或包含第一核苷酸序列的互補(bǔ)序列的第二核苷酸序列。在第三實(shí)施方案中，本發(fā)明提供由本發(fā)明的核酸序列編碼的多肽以及包含相同多肽的微生物宿主細(xì)胞。在第四實(shí)施方案中，本發(fā)明提供用于產(chǎn)生Y-亞麻酸的方法，該方法包括a)提供表達(dá)權(quán)利要求1或權(quán)利要求4的核酸序列的微生物宿主細(xì)胞；以及b)在產(chǎn)生Y-亞麻酸的條件下，在亞油酸源的存在下培養(yǎng)(a)的宿主細(xì)胞。在第五實(shí)施方案中，本發(fā)明提供用于產(chǎn)生十八碳四烯酸的方法，該方法包括a)提供表達(dá)權(quán)利要求1或權(quán)利要求4的核酸序列的微生物宿主細(xì)胞；以及b)在產(chǎn)生十八碳四烯酸的條件下，在α -亞麻酸的存在下培養(yǎng)(a)的宿主細(xì)胞。附圖
簡(jiǎn)沭和序列表圖IA和圖IB示出了 ω-3和ω-6脂肪酸生物合成途徑，并且當(dāng)考慮下文對(duì)該途徑的描述時(shí)應(yīng)被視為一起。圖2是兩個(gè)保守區(qū)域的比對(duì)，這兩個(gè)保守區(qū)域位于來自三角褐指藻 (Phaeodactylum tricornatum) (SEQ ID NO 37) ,^h^MM (Physomitrella patens) (SEQ ID NO 38)、地錢(Marchantia polymnorpha) (SEQ ID NO 39)、和高山被孢霉(Mortierella alpina) (SEQID NO 40)的△ 6 去飽和酶中；以及來自小眼蟲(Euglena gracilis) (SEQID NO 41)的Δ 8去飽和酶中，使用LASERGENE生物信息學(xué)計(jì)算軟件包(DNASTAR Inc.， Madison, WI)的MegAlign v6. 1程序進(jìn)行比對(duì)。保守氨基酸的三個(gè)加框區(qū)域?qū)?yīng)于七個(gè)簡(jiǎn)并引物。
圖3是pY109#l的質(zhì)粒圖譜。根據(jù)下面的詳細(xì)描述和附帶的序列描述可以更充分地理解本發(fā)明，下面的詳細(xì)描述和附帶的序列描述形成了本申請(qǐng)的一部分。下面的序列遵循37C. F. R. § 1. 821-1. 825( “對(duì)包含核苷酸序列和/或氨基酸序列公開內(nèi)容的專利申請(qǐng)的要求-序列規(guī)則”(“Requirements for Patent Applications Containing Nuceotide Sequences and/or Amino Acid Sequence Disclosures-the Sequence Rules”))，并且符合世界知識(shí)產(chǎn)權(quán)組織(World Intellectual Property Organization) (WIPO) ST. 25標(biāo)準(zhǔn)(1998)以及EPO和PCT的序列表要求(規(guī)則5. 2和 49. 5(a-bis)以及行政指令(Administrative Instructions)的 208 節(jié)和附錄 C)。用于核苷酸和氨基酸序列數(shù)據(jù)的符號(hào)和格式遵循在37C. F. R. § 1. 822中所列出的規(guī)定。SEQ ID NO :1至50是表1中鑒定的ORF編碼基因、蛋白質(zhì)(或它們的部分)、引物或質(zhì)粒。^ 1核酸和蛋白質(zhì)SEQ ID號(hào)總匯
權(quán)利要求
1.分離的核酸分子，其包含編碼Δ6去飽和酶的核苷酸序列，所述分離的核酸分子選自(a)編碼如SEQID NO 2所示的氨基酸序列的分離的核酸分子；(b)在以下雜交條件下與(a)雜交的分離的核酸分子0.IX SSC, 0. 1% SDS，65°C，并且用2X SSC, 0. 1 % SDS洗滌，隨后用0. IX SSC, 0. 1 % SDS洗滌；或者，與(a)或(b)完全互補(bǔ)的分離的核酸分子。
2.權(quán)利要求1的分離的核酸分子，其中至少227個(gè)密碼子經(jīng)密碼子優(yōu)化以在耶氏酵母屬中表達(dá)。
3.權(quán)利要求1的分離的核酸分子，所述分離的核酸分子選自SEQIDNO :1和SEQ ID NO46。
4.分離的核酸分子，所述分離的核酸分子包含編碼至少471個(gè)氨基酸的Δ6去飽和酶的第一核苷酸序列，所述酶基于BLASTP比對(duì)方法在與具有如SEQ ID NO :2所示的序列的多肽進(jìn)行比較時(shí)具有至少80%的同一性；或包含第一核苷酸序列的互補(bǔ)序列的第二核苷酸序列。
5.編碼如SEQID N0:2所示的Δ 6去飽和酶的多肽。
6.嵌合基因，其包含可操作地連接至少一種調(diào)控序列的權(quán)利要求1或4中任一項(xiàng)的分離的核酸分子。
7.包含權(quán)利要求1或權(quán)利要求4的分離的核酸序列的微生物宿主細(xì)胞。
8.權(quán)利要求7的微生物宿主細(xì)胞，其中所述微生物宿主細(xì)胞選自酵母、藻類、細(xì)菌、類眼蟲、原生藻菌、卵菌和真菌。
9.權(quán)利要求8的微生物宿主細(xì)胞，其中所述細(xì)胞是選自被孢霉屬(Mortierella)、破囊壺菌屬(Thraustochytrium)、和裂殖壺菌屬(Schizochytrium)的屬的成員。
10.權(quán)利要求8的微生物宿主細(xì)胞，其中所述細(xì)胞是含油的酵母。
11.權(quán)利要求10的微生物宿主細(xì)胞，其中所述含油酵母是選自下組的屬的成員耶氏酵母屬(Yarrowia)、假絲酵母屬(Candida)、紅酵母屬(Rhodotorula)、紅冬孢酵母屬 (Rhodosporidium)、隱球酵母屬(Cryptococcus)、絲孢酵母屬(Trichosporon)和油脂酵母屬(Lipomyces)。
12.—種生產(chǎn)Y-亞麻酸的方法，所述方法包括a)提供表達(dá)權(quán)利要求1或權(quán)利要求4的核酸序列的微生物宿主細(xì)胞；以及b)在產(chǎn)生Y-亞麻酸的條件下，在亞油酸源的存在下培養(yǎng)(a)的宿主細(xì)胞。
13.—種生產(chǎn)十八碳四烯酸的方法，所述方法包括a)提供表達(dá)權(quán)利要求1或權(quán)利要求4的核酸序列的微生物宿主細(xì)胞；以及b)在產(chǎn)生十八碳四烯酸的條件下，在α-亞麻酸源的存在下培養(yǎng)(a)的宿主細(xì)胞。
14.根據(jù)權(quán)利要求12或13中的任一項(xiàng)的方法，其中a)所述分離的核酸分子具有選自SEQID NO 1和SEQ ID NO 46的核酸序列；并且b)所述宿主細(xì)胞是解脂耶氏酵母(Yarrowialipolytica)。
全文摘要
本發(fā)明涉及Δ6去飽和酶，它具有將亞油酸[“LA”；18:2ω-6]轉(zhuǎn)化成γ-亞麻酸[“GLA”；18:3ω-6]和/或?qū)ⅵ?亞麻酸[“ALA”；18:3ω-3]轉(zhuǎn)化成十八碳四烯酸[“STA”；18:4ω-3]的能力。公開了包含此類編碼Δ6去飽和酶的片段的分離核酸片段和重組構(gòu)建體、以及使用這些在含油酵母中的Δ6去飽和酶制備長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸[“PUFA”]的方法。
文檔編號(hào)C12N15/53GK102171345SQ200980139225
公開日2011年8月31日 申請(qǐng)日期2009年7月30日 優(yōu)先權(quán)日2008年8月1日
發(fā)明者H·張, N·S·亞達(dá)夫, Q·朱, Z·薛 申請(qǐng)人:納幕爾杜邦公司