專利名稱：缺血性組織的細(xì)胞療法的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及采用由血液分離的單核細(xì)胞治療缺血性病癥和疾病(特別是心肌、腦部和肢體缺血)的領(lǐng)域。本發(fā)明涉及基于單核細(xì)胞譜系細(xì)胞富集的治療性細(xì)胞群的治療手段、組合物以及它們的制備方法。本發(fā)明還涉及采用上述治療手段和組合物治療或防止缺血癥或以其他方式促進(jìn)組織血流灌注和側(cè)支血管形成的增強(qiáng)的方法。在一個(gè)方面中，采用單核細(xì)胞譜系細(xì)胞富集的單核細(xì)胞群來治療心臟缺血和心絞痛。在另一個(gè)方面中，疾病為腦卒中，并且單核細(xì)胞是由人臍帶血(HUCB)分離的。
背景技術(shù)：
心絞痛是由流向心肌的血液不足而引起的胸部疼痛或不適。在美國20歲以上的成年人中，心絞痛的患病數(shù)為9，100，000例。穩(wěn)定型心絞痛為在強(qiáng)體力活動后或?qū)ο筇幱谇榫w壓力時(shí)可以預(yù)計(jì)發(fā)生的心絞痛。穩(wěn)定型絞痛在美國45歲以上的成年人中的患病數(shù)(不包括相對應(yīng)的心肌梗塞)為500，000例。參見Rosamond等Circulation 117(4) e25(2008)。
目前的療法包括阿司匹林；β阻斷劑(例如，卡維地洛、心得安、阿替洛爾)；硝酸甘油(用于急性病緩解)；血管擴(kuò)張劑，如鈣通道阻斷劑(例如，硝苯地平(心痛定)和阿洛地平)；單硝酸異山梨酯和尼可地爾；If通道抑制劑(例如，伊伐布雷定)、ACE抑制劑、 斯達(dá)汀和雷諾嗪(Ranexa)。然而，這些療法通常僅治療疼痛，而不防止疼痛復(fù)發(fā)，并且并不是所有患者都對這種治療方式有反應(yīng)。目前正采用CD34干細(xì)胞進(jìn)行臨床試驗(yàn)以治療難治愈性心絞痛，其目的是采用干細(xì)胞生成新的血管，從而防止疼痛復(fù)發(fā)。然而，這種治療方式尚未證實(shí)是安全、有效的。因此，需要心絞痛(特別是難治愈性心絞痛)的長期治療方案。
治療患有難治愈性心絞痛的患者是復(fù)雜的，并且需要多學(xué)科方法。目前的療法包括阿司匹林；β阻斷劑(例如，卡維地洛、心得安、阿替洛爾)；硝酸甘油(用于急性病緩解)；血管擴(kuò)張劑，如鈣通道阻斷劑(例如，硝苯地平(心痛定)和阿洛地平)；單硝酸異山梨酯和尼可地爾；If通道抑制劑(例如，伊伐布雷定)、ACE抑制劑、斯達(dá)汀和雷諾嗪 (Ranexa)。此外，這些療法通常涉及窮舉式用藥法，其嘗試多種不同的用藥方案以及組合， 以減輕疼痛。然而，這些療法通常僅治療疼痛，而不防止疼痛復(fù)發(fā)，并且并不是所有患者都對這種治療方式有反應(yīng)。
除了藥物療法以外，還可以用介入方法治療心絞痛，所述介入方法例如為經(jīng)皮腔內(nèi)冠狀動脈成形術(shù)或冠狀動脈旁路搭橋(CABG)手術(shù)，但是這些療法由于多種因素而不能用于一些心絞痛患者，所述因素例如為不利的管狀解剖床、冠狀動脈較薄、近端或擴(kuò)散冠狀病變等。美國心臟協(xié)會2002對于可供選用的其他療法的指南中的建議包括手術(shù)激光經(jīng)心肌血管再生術(shù)(IIa類)、增強(qiáng)體外反搏術(shù)和脊髓刺激(nb類)。
新的治療方式正在研究之中，包括使用干細(xì)胞群。多個(gè)研究人員對于證明在心肌梗塞的情況下使用含有骨髓單核干細(xì)胞的部分使心臟組織再生方面已經(jīng)邁出了第一步。這些研究已經(jīng)觀察到(i)梗塞后心肌層的再生；(ii)減小了梗塞大??；以及(iii)通過人骨髓細(xì)胞使得心臟蛋白重新表達(dá)。通過對這些預(yù)先研究的隨訪，幾個(gè)小組已經(jīng)證明了得自骨髓的間質(zhì)細(xì)胞在不同的試驗(yàn)?zāi)Ｐ椭械脑偕鷿摿?，其結(jié)果主要基于它們的肌源性潛力和血管源潛力。
已經(jīng)開展了臨床試驗(yàn)(主要是對急性心肌梗塞患者和經(jīng)冠狀動脈內(nèi)輸送干細(xì)胞) 來研究自體細(xì)胞移植對于增強(qiáng)心臟修復(fù)的安全性和效力。然而，這些試驗(yàn)產(chǎn)生了相互抵觸的結(jié)果，而沒有得到在研究設(shè)計(jì)與細(xì)胞群或輸送之間具有差異的明顯依據(jù)。
對于缺血性心臟組織，一些臨床試驗(yàn)已經(jīng)至少證實(shí)了得自骨髓的單核胞的安全性，其中有效程度不一。在這些研究中，最主要的輸注技術(shù)是經(jīng)心肌內(nèi)輸注干細(xì)胞-經(jīng)心內(nèi)膜輸注或經(jīng)心外膜輸注。
在難治愈性心絞痛情況下，一些小組已近主要采用骨髓單核細(xì)胞(BMMC)進(jìn)行了臨床試驗(yàn)，這些試驗(yàn)主要采用BMMC單獨(dú)治療或者與CABG結(jié)合進(jìn)行治療。
例如，Hamano等通過經(jīng)心外膜方法將BMMC與CABG結(jié)合注入到具有相關(guān)缺血性心肌癥的5個(gè)“無選擇”患者中。結(jié)果表明，在三個(gè)患者中注射區(qū)域的心肌血流灌注發(fā)生客觀增加。然而，該研究受困于伴隨CABG的效果，而BMMC的治療效果仍然不清楚。
其他的研究人員已經(jīng)報(bào)道了經(jīng)心肌內(nèi)注射BMMC的初始研究情況，該研究在點(diǎn)機(jī)械標(biāo)測系統(tǒng)(N0GATM系統(tǒng))采用經(jīng)經(jīng)皮導(dǎo)管輸送BMMC?？偟膩碚f，這些非隨機(jī)化研究已經(jīng)證明，直接將BMMC轉(zhuǎn)移至缺血心肌層在一些患有難治愈性心絞痛的患者(而不是全部)中改善了癥狀和運(yùn)動能力，并且增加了心肌血流灌注和功能。大多數(shù)這些研究登記的是患有缺血性心肌癥的“無選擇”患者。
近年來，已經(jīng)報(bào)道了通過在嚴(yán)重的冠心病內(nèi)經(jīng)心肌內(nèi)注射BMMC而進(jìn)行的第一例前瞻隨機(jī)化試驗(yàn)(PR0TECT-CAD試驗(yàn))。該研究顯示了在研究組中運(yùn)動時(shí)間、左室射血分?jǐn)?shù)和負(fù)荷誘導(dǎo)的心肌缺血狀況得到顯著改善。
Losordo等進(jìn)行了 I/IIa期、雙盲、隨機(jī)化、安慰劑對照的給藥劑量逐漸增加的臨床試驗(yàn)，其通過對難治愈性心絞痛心肌內(nèi)注射自體CD34+干細(xì)胞而進(jìn)行。與施用安慰劑的對照對象相比，包括絞痛頻率、硝化甘油使用、運(yùn)動時(shí)間和CCSAC級別在內(nèi)的效力參數(shù)顯示出有利于⑶34+細(xì)胞治療患者的傾向。
因此，對于“無選擇”心絞痛患者，使用得自骨髓的單核肝細(xì)胞的臨床研究已經(jīng)顯示出一些心肌血流灌注改善效果，至少改是改善了心室功能。多數(shù)這些研究都納入了患有缺血性心肌癥的患者，其中所述患者具有中等至嚴(yán)重的左室流血分?jǐn)?shù)(LVEF)抑制。然而， 目前尚未有基于治療細(xì)胞(即，單核細(xì)胞或中胚層干細(xì)胞)的療法能夠可靠地在多數(shù)或全部治療患者中減輕疼痛或改善血流灌注。
約5至15%的患有慢性冠狀動脈疾病的患者表現(xiàn)出嚴(yán)重的心絞痛，其不能通過常規(guī)治療手段的組合進(jìn)行控制，所述治療手段包括多個(gè)系列的藥物療法優(yōu)化治療、經(jīng)皮腔內(nèi)冠狀動脈成形術(shù)(PTCA)和冠狀動脈旁路搭橋(CABG) (35，37)。嚴(yán)重的心絞痛通常導(dǎo)致生活質(zhì)量的嚴(yán)重下降。對于“無選擇”難治愈性心絞痛患者的癥狀緩解方法是復(fù)雜、困難的過程。根據(jù)美國心臟協(xié)會指南的可供選用的其他療法(11，14)均至多提供了中等的效果，其中所述其他療法例如為手術(shù)激光經(jīng)心肌血管再生成、體外反搏術(shù)和脊髓刺激(9，26，31，妨)。絕大多數(shù)難治愈性心絞痛患者(75% )都保持了左心室功能，其死亡率低于一般的冠心病群體(36，M)，并且該患者群正在迅速增加。
細(xì)胞療法(具體為自體骨髓細(xì)胞移植)已經(jīng)發(fā)展為一種用于心臟再生的新治療方案。一些假設(shè)性機(jī)理闡釋涉及肝細(xì)胞的肌源性和血管源性潛力，并且通過旁分泌效果激活固有祖細(xì)胞生長0，15-17，22，48，49，52)。雖然已經(jīng)在動物模型中證實(shí)了心肌組織的再生以及同時(shí)發(fā)生的梗塞區(qū)域的減少(7，33)，但是將這些結(jié)果專用到人體仍然存在很多不確定性，從而使得BMMC移植用于心臟組織再生成為一種實(shí)驗(yàn)方法，而不是用于臨床實(shí)踐的治療標(biāo)準(zhǔn)。
另一方面，難治愈性心絞痛患者可以受益于細(xì)胞療法，主要是在血管再生方面。當(dāng)考慮細(xì)胞療法作為用于人類患者的治療方案時(shí)，這些血管生成效果被研究者認(rèn)為是非常重要的⑶。
在多個(gè)臨床前研究中報(bào)道了血管生成效果(8，28，33，48)。與陰性對照小鼠相比， 移植有c-kit骨髓(BM)細(xì)胞的心臟觀察到血管再生的改善00)。在急性心肌梗塞之后，小鼠BM細(xì)胞移動進(jìn)入血液循環(huán)使得肌細(xì)胞和血管結(jié)構(gòu)再生(39)。使用相似的方案在非人類靈長類動物內(nèi)的最近研究表明，BM治療的動物的局部血流灌注得到改善，從而顯示了潛在的血管生成效果(30)。BM細(xì)胞移植的這種效果可能歸因于旁分泌效果，其中血管發(fā)生通過多種生長因子的局部釋放而增加，所述生長因子例如為血管內(nèi)皮生長因子以及得自基質(zhì)細(xì)胞的因子-1等(8，48)。
在包括難治愈性心絞痛患者(其接受了得自骨髓細(xì)胞的肝細(xì)胞或BMMC)的臨床研究中，觀察到癥狀和運(yùn)動能力以及心肌血流灌注的改善(4，6，8，12，13，19，21，41，53，55， 56，59)。Beeres等( 通過在患有難治愈性心絞痛的25個(gè)患者內(nèi)心肌內(nèi)注射自體BMMC 而進(jìn)行了試驗(yàn)，該試驗(yàn)顯示出對心絞痛癥狀和心肌血流灌注的長期有益效果。Losordo等 (34)通過對難治愈性心絞痛患者心肌內(nèi)注射自體⑶34+干細(xì)胞，從而進(jìn)行了 I/IIa期、雙盲、隨機(jī)化、安慰劑對照的劑量逐漸增加的臨床試驗(yàn)，從而證實(shí)了 CD34+細(xì)胞治療的患者除了加拿大心血管協(xié)會絞痛分級(CCSAC)改善以外，還顯示出運(yùn)動時(shí)間增加的傾向。van Ramshorst等(58)通過對難治愈性心絞痛患者心肌內(nèi)注射骨髓細(xì)胞而進(jìn)行了隨機(jī)化的對照試驗(yàn)，其中短期的隨訪(3至6個(gè)月)表明與安慰劑組相比，心肌血流灌注得到中等改善。
通過在以前的難治愈性心絞痛試驗(yàn)中觀察最低程度的左心室改善以及臨床反應(yīng)， 表明在人體內(nèi)的骨髓干細(xì)胞移植的主要作用是促進(jìn)心肌血管再生，而不是單純的肌生成。 在這種情況下，血管再生能夠通過喚醒或恢復(fù)冬眠心肌層而確實(shí)地改善左心室功能，但是程度有限，如這些試驗(yàn)和一些元分析證明的那樣(1，32，44)。
以前的臨床前研究和臨床研究已經(jīng)支持了干細(xì)胞療法對于心肌層組織再生的可行性、安全性和有效性，并且涵蓋了表現(xiàn)為從急性心肌梗塞到慢性缺血心臟病在內(nèi)的一系列診斷疾病的患者(33)。
此處最大的問題在于將實(shí)驗(yàn)室結(jié)果轉(zhuǎn)化為醫(yī)院常規(guī)治療手段。研究設(shè)計(jì)、干細(xì)胞和單核細(xì)胞制備以及灌注技術(shù)的差別已經(jīng)顯示出某些潛力，但是不同研究的總體數(shù)據(jù)并不一致(43)。
在全世界，心血管疾病(其被認(rèn)為是頭五種非傳染性疾病之一)感染了約5000萬人，從而導(dǎo)致每年約550萬人死亡。在這5000萬人中，腦卒中大致占4000萬人。
與心絞痛一樣，腦卒中是缺血占很大作用的另一種病癥。腦卒中是發(fā)達(dá)國家死亡的第三誘因，并且承擔(dān)成人殘疾的主要誘因。目前，僅存在一種可供利用的治療方案。心血管疾病損害認(rèn)知和運(yùn)動功能，并且改變免疫系統(tǒng)。本研究集中于腦卒中的病理生理學(xué)，并且開發(fā)了新的細(xì)胞療法(人臍帶血(HUCB)細(xì)胞)。在早期研究中，該細(xì)胞療法顯示出明顯改善了運(yùn)動機(jī)能障礙，并且減小了梗塞大小。免疫/炎性反應(yīng)在腦卒中后大腦損害的發(fā)展過程中作用尚未完全理解。在缺血性事件之后，引起免疫反應(yīng)，使得嗜中性粒細(xì)胞、T細(xì)胞、 B細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞以及小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞涌入梗塞的半球內(nèi)，并且導(dǎo)致相同的這些免疫細(xì)胞在外周血內(nèi)的變化。本研究探測了 HUCB注射的有益效果是否能夠由特定細(xì)胞群產(chǎn)生。
腦卒中治療包括兩種類型預(yù)防和急性處理。預(yù)防處理目前涉及抗血小板劑、抗凝集劑、手術(shù)療法、血管成形術(shù)、生活方式調(diào)節(jié)和醫(yī)療調(diào)節(jié)。通常使用的抗血小板劑為阿司匹林。采用抗凝集劑似乎沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。手術(shù)療法似乎對于特定的亞組是有效的。血管成形術(shù)仍然是一種實(shí)驗(yàn)方法，其中沒有充分的數(shù)據(jù)以供分析。生活方式調(diào)節(jié)包括戒煙、有規(guī)律的運(yùn)動、飲食調(diào)節(jié)、限制鈉攝入和控制飲酒。醫(yī)學(xué)調(diào)節(jié)包括服藥降低血壓、降低膽固醇、控制糖尿病和控制循環(huán)問題。
急性處理治療涉及采用溶解血栓劑、神經(jīng)保護(hù)、氧化氟碳營養(yǎng)乳(OFNE)療法、神經(jīng)灌注、GPIIb/IIIa血小板抑制劑療法和康復(fù)/物理療法。
溶解血栓劑誘導(dǎo)或引起血栓溶解，并且最通常使用的藥劑為組織纖維蛋白溶酶原激活劑(t-PA)。重組t-PA(rt-PA)通過溶解(裂解)堵塞血流的凝塊而有助于重新建立大腦循環(huán)。重組t-PA為有效的治療劑，但是具有極短的治療窗；它必須在疾病發(fā)作3小時(shí)內(nèi)施用。重組t-PA還必須在施用治療之前進(jìn)行CT掃描，從而進(jìn)一步縮短了可供利用的時(shí)間量。GenetechPharmaceuticals公司制造了 ACTIV ASE ,并且目前是rt-P A的唯一來源。
神經(jīng)保護(hù)劑為最大程度地降低缺血級聯(lián)反應(yīng)的作用的藥物，并且包括(例如)谷氨酸拮抗劑、鈣拮抗劑、阿片制劑拮抗劑、GAB A-A拮抗劑、鈣蛋白酶抑制劑、激酶抑制劑和抗氧化劑。幾個(gè)對急性缺血腦卒中的臨床試驗(yàn)正在進(jìn)行中。由于溶解血栓劑和神經(jīng)保護(hù)劑具有凝塊-破碎和腦部保護(hù)的互補(bǔ)功能，因此以后的急性治療方法最可能包括溶解血栓劑和神經(jīng)保護(hù)劑的組合。然而，如溶解血栓劑一樣，大多數(shù)神經(jīng)保護(hù)及需要在腦卒中發(fā)生后6 小時(shí)內(nèi)施用才會有效。
氧化氟碳營養(yǎng)乳(OFNE)通過腦脊液向腦部輸送氧和營養(yǎng)。神經(jīng)灌注是這樣一種實(shí)驗(yàn)方法，其中富有氧的血液改變途徑通過腦部，以作為最大程度地降低缺血性腦卒中的損害的途徑。GPIIblIIIa血小板抑制劑療法抑制血小板上的糖蛋白GPIIb/IIIa受體凝集或團(tuán)聚?？祻?fù)/物理療法必須在腦卒中的早期開始，然而，它們不能改變腦部損害。康復(fù)的目的是改善功能，使得腦卒中存活者盡可能變得獨(dú)立。
雖然一些急性治療方法在臨床試驗(yàn)中顯示出潛力，但是在Cleveland進(jìn)行的研究表明，只有1.8%的具有腦卒中癥狀的患者接受了 t-PA治療(Katz an IL等，2000 JAMA, 283 :1151-1158)。t_PA是上述急性腦卒中治療方法中最常用的，但是據(jù)估計(jì)，接受任何新的“有效”急性腦卒中治療的患者數(shù)目低于10%。這些統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)清楚地表明需要在腦卒中發(fā)生M小時(shí)以后的急性腦卒中治療方法。
對于這些急性治療方法(Le.，t-PA)，施用時(shí)間是關(guān)鍵的。最近的研究已經(jīng)表明 42%的患者在達(dá)到醫(yī)院之前需要等待長達(dá)M小時(shí)，其中在腦卒中后到達(dá)醫(yī)院的平均時(shí)間為6小時(shí)。t-PA已經(jīng)顯示出增強(qiáng)了接受該療法的113例患者的恢復(fù)，但是由FDA委托的一項(xiàng)最新研究(采用Alteplase逆轉(zhuǎn)腦卒中的標(biāo)準(zhǔn)治療)發(fā)現(xiàn)，有多次都違背了 3小時(shí)治療窗，從而導(dǎo)致治療無效。除了康復(fù)療法以外，其余的急性治療方法仍然處于臨床試驗(yàn)階段， 并且在美國(特別是農(nóng)村地區(qū))尚未廣泛利用，其中所述農(nóng)村地區(qū)可能不具備具有所需神經(jīng)學(xué)專家和急救人員的大型醫(yī)療中心，因此可能在有些時(shí)候?qū)崿F(xiàn)任何上述腦卒中診斷和治療的新方法受到限制。
在美國，腦卒中的花費(fèi)超過430億美元，包括直接和間接的花費(fèi)。直接花費(fèi)占總量的約60%，并且包括住院費(fèi)用、醫(yī)生費(fèi)用和康復(fù)費(fèi)用。這些費(fèi)用通常在頭三個(gè)月達(dá)到 15，000美元/患者，然而，在約10%的病例中，花費(fèi)超過了 35，000美元。間接的費(fèi)用構(gòu)成其余部分，并且包括腦卒中受害者的生產(chǎn)力損失以及家庭成員護(hù)理者的生產(chǎn)力損失(參見神經(jīng)疾病和腦卒中國立研究所，NIH)。
在美國，每年發(fā)生約750，000例腦卒中，其中約1/3是致命的。在其余患者中，約 1/3中度受損，并且1/3嚴(yán)重受損。缺血性腦卒中占這些腦卒中病例的80%。
隨著嬰兒高峰潮出生的人老齡化，腦卒中患者的總數(shù)也隨之顯著增加。腦卒中的風(fēng)險(xiǎn)隨年齡而增加。在55歲之后，患有腦卒中的風(fēng)險(xiǎn)每十年加倍，其中約40%的個(gè)體在80 歲時(shí)患腦卒中。此外，患有二次腦卒中的風(fēng)險(xiǎn)隨著時(shí)間推移而增加。在第一次腦卒中之后 5年時(shí)患有二次腦卒中的風(fēng)險(xiǎn)為25-40%。由于預(yù)期隨著嬰兒高峰潮出生的人達(dá)到其黃金年齡而超過65歲的人群增加，因此這部分市場的規(guī)模會顯著增加。此外，對有效治療方法的需求會明顯增加。
考慮到不能有效地減輕腦卒中的損害相應(yīng)，因此必須開發(fā)新的治療策略，以便隨著腦卒中的病理級聯(lián)反應(yīng)發(fā)展就最大程度地減少初始神經(jīng)創(chuàng)傷以及修復(fù)腦部損害。
已經(jīng)提出移植單核細(xì)胞作為治療腦卒中的手段。由于難于有效地治療患有腦卒中的患者，因此本領(lǐng)域內(nèi)需要增強(qiáng)腦卒中治療效果的方法。
新血管形成是在組織受損時(shí)的炎性反應(yīng)以及隨后的修復(fù)級聯(lián)反應(yīng)的完整過程。單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞在炎性過程中具有重要作用，包括血管再生以及通過發(fā)揮殺菌劑和免疫調(diào)節(jié)活性而產(chǎn)生的防御機(jī)制。目前的研究已經(jīng)證明，補(bǔ)充的單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞有助于在缺血性組織、腫瘤和慢性炎癥中調(diào)節(jié)血管再生。在新血管形成以后隨后的組織再生方面，與其他任何肝細(xì)胞相比，單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞由于具有以下顯著優(yōu)點(diǎn)而對細(xì)胞療法而言具有高度吸引力，所述優(yōu)點(diǎn)例如為非致癌性、非致畸性、沒有倫理爭議、多種分泌功能(包括促血管形成因子和生長因子)以及容易自發(fā)捕集。除了諸如骨髓或外周血等成人來源之外， 臍帶血(UCB)也可以為自體或異體的單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞的潛在來源。特別是，UCB單核細(xì)胞由于因素而被認(rèn)為是首要候選體快速的可行性、低的免疫排斥性、和多種殺傷作用(如由于獨(dú)特的免疫和炎性未發(fā)育成熟性而產(chǎn)生的抗炎反應(yīng))以及促血管形成能力。單核細(xì)胞 /巨噬細(xì)胞的一般特性和潛力可供用于細(xì)胞療法，特別關(guān)注的是新血管形成得自UCB的單核細(xì)胞。
單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞的一個(gè)關(guān)注功能是促進(jìn)與炎性反應(yīng)相關(guān)的血管再生。血管再生(或新血管形成)炎性過程的主要因素，包括隨后的修復(fù)級聯(lián)反應(yīng)[Simderkotter， 1994 #4]。在炎性反應(yīng)早期，循環(huán)的單核細(xì)胞滲入至組織內(nèi)[BOSCO，2008 #3]。最初，相鄰的內(nèi)皮細(xì)胞和炎性細(xì)胞通過釋放一系列的粘附和趨化性材料而調(diào)節(jié)通過血管壁的單核細(xì)胞[Baggiolini，2000 #9 ；Imhof，2004 #2 ；Bosco, 2008 #3]。由于正常和受損組織之間的趨化性和氧梯度，滲入的單核細(xì)胞移動并且匯集在患病組織的低氧和/或壞死核內(nèi)，隨后分化為組織巨噬細(xì)胞。單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞傾向于聚集的代表性病理組織如下實(shí)體瘤、心肌或心臟梗塞、慢性關(guān)節(jié)炎或動脈粥樣斑塊的滑液關(guān)節(jié)、細(xì)菌感染部位和愈合的傷口 [Baggiolini，2000 #9 ；Murdoch, 2004 #1 ；Bosco，2008 #3 ；Mantovani，2002 #15](圖 1)。
在巨噬細(xì)胞由單核細(xì)胞分化出之后，已知組織內(nèi)的巨噬細(xì)胞以極化群的形式(Ml 禾口M2 亞組)存在[Mantovani ,2004 #67 ；Sica, 2006 #16 ；Mantovani，2004 #67 ；Mantovani， 2002 #15]。Ml極化巨噬細(xì)胞為產(chǎn)生促炎細(xì)胞因子的有效炎性細(xì)胞并且吞噬抗原，而M2巨噬細(xì)胞調(diào)節(jié)炎性反應(yīng)并且有助于血管再生和組織修復(fù)[Mantovani，2004 #67 ;Sica，2006 #16 ；Mantovani,2004 #67 ；Mantovani, 2002 #15]。有意思的是，在巨噬細(xì)胞的基因表達(dá)過程中，傷口愈合早期的Ml和M2組合在后期轉(zhuǎn)變?yōu)橹饕獮镸2基因[DeOnarine，2007 #68]。 在傷口愈合過程的早期，Ml巨噬細(xì)胞產(chǎn)生清潔傷口和微生物殘骸和/或受損主體組織的直接炎性反應(yīng)，而M2巨噬細(xì)胞則同時(shí)啟動組織修復(fù)和血管再生。在Ml清潔幾乎結(jié)束的后期階段，主要是M2巨噬細(xì)胞發(fā)揮其作用，即組織再生(包括血管再生)[Deonarine,2007#68]。 聚集證據(jù)表明補(bǔ)充的單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞有助于調(diào)整和調(diào)節(jié)缺血性組織、腫瘤和慢性炎癥 (如關(guān)節(jié)炎和動脈粥樣硬化)中的新血管形成。
發(fā)明概述 本發(fā)明通過提供用于治療缺血(其優(yōu)選的例子為心絞痛和腦卒中)并且用于改善血流灌注的方法和組合物而實(shí)現(xiàn)了這些長期的要求，所述方法和組合物治療潛在的缺血癥，或者本發(fā)明實(shí)現(xiàn)了改善血流灌注而非由上述病癥引起的疼痛的需求，并且提高了基于治療性細(xì)胞的療法對上述病癥的效力的可靠性。
由成單核細(xì)胞(骨髓(BM)內(nèi)的造血干細(xì)胞前體)產(chǎn)生的單核細(xì)胞在血流內(nèi)循環(huán)， 然后滲入到身體的組織內(nèi)。在組織內(nèi)，單核細(xì)胞根據(jù)它們的解剖學(xué)位置而分化成各種類型的定居巨噬細(xì)胞，例如，在皮膚內(nèi)為Langerhans細(xì)胞，在肝臟內(nèi)為Kupffer細(xì)胞，在骨內(nèi)為破骨細(xì)胞、在中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)為小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，在肺內(nèi)為肺泡巨噬細(xì)胞，并且在滑液關(guān)節(jié)內(nèi)為滑液 A 型細(xì)胞(Bosco 等，2008，Gordon，2003，Imhof■和 Aurrand-Lions，2004，Murdoch 等，2004，Sunderkotter等，1994)(

圖1)。單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞能夠通過以下方式進(jìn)行噬菌作用利用介體(如抗體)或包被微生物的互補(bǔ)成分，或者借助于識別抗原的具體受體直接結(jié)合抗原(內(nèi)吞作用)。此外，單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞能夠通過被稱為抗體介導(dǎo)的細(xì)胞毒性的免疫系統(tǒng)應(yīng)答而殺死由抗原感染的主體細(xì)胞(Nathan，1987，Sunderkotter等，1994)。 此外，它們?yōu)榧饶軌虼碳っ庖呋钚?、又抑制免疫活性的?dú)特免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞，包括對T細(xì)胞的抗原呈遞并且控制多種細(xì)胞因子和生長因子的分泌(Bosco等，2008，Murdoch等，2004， Paulnock等，2000)?？傊瑔魏思?xì)胞/巨噬細(xì)胞通過殺死抗原(包括噬菌作用和細(xì)胞毒性) 以及免疫調(diào)節(jié)(Bosco，等，2008，Paulnock等，2000)而在天生防御系統(tǒng)中起到主要作用。
心絞痛和腦卒中為其中患者需要改善的血流灌注的代表性缺血性病癥。在這方面，本發(fā)明部分地實(shí)現(xiàn)了確立用于治療心絞痛、腦卒中和其他形式的缺血的新的獨(dú)特方法的需求。其中需要改善的血流灌注的其他缺血性病癥也類似地需要改善的療法。
在一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法包括對需要治療的個(gè)體施用單核細(xì)胞，其中所述單核細(xì)胞在具體確定為提供治療效能的量和時(shí)間點(diǎn)的條件下以系統(tǒng)方式被施用給個(gè)體。
本發(fā)明的一個(gè)方面包括治療對象內(nèi)的缺血的方法，包括將單核細(xì)胞譜系細(xì)胞富集的治療性細(xì)胞群注入對象的缺血性組織內(nèi)。在某些實(shí)施方案中，缺血為心臟缺血，并且缺血性組織為心臟的心肌層。本發(fā)明的另一個(gè)方面包括改善對象內(nèi)血流灌注的方法，包括 將單核細(xì)胞譜系細(xì)胞富集的治療性細(xì)胞群注入到需要改善的血流灌注的對象內(nèi)。在某些實(shí)施方案中，組織為心臟的心肌層。本發(fā)明的又一方面涉及治療對象內(nèi)的心絞痛的方法，包括將單核細(xì)胞譜系細(xì)胞富集的干細(xì)胞群注入到對象的心肌層內(nèi)。在上述任意方面的實(shí)施方案中，所述方法包括注射單核細(xì)胞譜系細(xì)胞富集的治療性細(xì)胞群內(nèi)的IO7個(gè)單核細(xì)胞譜系細(xì)胞。上述的方面和實(shí)施方案還可以包括通過以下方式將單核細(xì)胞群注入心肌層內(nèi)的實(shí)施方案，所述方式為至少兩次獨(dú)立的注射、至少三次獨(dú)立的注射、至少四次獨(dú)立的注射、至少五次獨(dú)立的注射、至少十次獨(dú)立的注射、至少12次獨(dú)立的注射、至少30次獨(dú)立的注射、至少40 次獨(dú)立的注射、至少50次獨(dú)立的注射、至少60次獨(dú)立的注射、至少70次獨(dú)立的注射、至少 80次獨(dú)立的注射、至少90次獨(dú)立的注射和至少100次獨(dú)立的注射。上述的方面和實(shí)施方案還可以包括其中注射量為0. 05ml至0. 3ml或約0. 2ml的實(shí)施方案。上述的方面還可以包括單核細(xì)胞譜系細(xì)胞富集的治療性細(xì)胞群相對于對象為自體細(xì)胞群或異體細(xì)胞群實(shí)施方案。上述的方面和實(shí)施方案還可以包括其中治療性細(xì)胞群為單核細(xì)胞群的實(shí)施方案。上述的方面和實(shí)施方案還可以包括其中在注射步驟之前，進(jìn)行選自以下步驟中的步驟的實(shí)施方案利用富集單核細(xì)胞譜系細(xì)胞的方法分離干細(xì)胞；在富集單核細(xì)胞譜系細(xì)胞的條件下培養(yǎng)治療性細(xì)胞群以及將單核細(xì)胞譜系細(xì)胞加入到治療性細(xì)胞群中。
本發(fā)明的另一方面包括可注射治療工具，包括能夠?qū)⑺鶞y定注射量的輸送至缺血性組織內(nèi)的設(shè)施，其中所述設(shè)施為包括治療劑的貯存器，并且所述治療劑包含單核細(xì)胞譜系細(xì)胞富集的治療性細(xì)胞群。在一個(gè)實(shí)施方案中，治療性細(xì)胞群為單核細(xì)胞群。上述的方面和實(shí)施方案還可以其中單核細(xì)胞譜系細(xì)胞富集的治療性細(xì)胞群包含至少IO7個(gè)單核細(xì)胞譜系細(xì)胞的實(shí)施方案。
附圖簡述 圖1示出在細(xì)胞治療過程之后6個(gè)月，經(jīng)心肌內(nèi)注入的單核細(xì)胞的數(shù)量(細(xì)胞數(shù)目χ 10~6，x-軸)與心肌血流灌注改善狀況(％，y軸)之間的比較。該圖示意性示出單核細(xì)胞注入數(shù)量與心肌血流灌注改善狀況之間的相關(guān)性，并且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P < 0. 05,FD =6)。
圖2示出在細(xì)胞治療過程之后6個(gè)月，經(jīng)心肌內(nèi)注入的單核細(xì)胞的數(shù)量(χ-軸) 與心肌血流灌注改善狀況(％，y軸)之間的比較。該圖示出血流灌注的改善是由注入的細(xì)胞、而不是由針或液體灌注的物理沖擊引起的，因?yàn)樵谛募⊙鞴嘧⒑妥⑷氪螖?shù)之間沒有觀察到明顯的相關(guān)性(p = n. s ；FD = 6)。
圖3示出CCSAC在18個(gè)月隨訪期間的變化。圖中的各線表示登記入ReACT內(nèi)的一個(gè)患者，以及在18個(gè)月隨訪期間的相應(yīng)CCSAC改善。χ軸表示CCSAC級別(數(shù)字4表示難治愈心絞痛，并且數(shù)字0表示無疼痛)。y軸便表示患者隨訪月份。左側(cè)的表格表示在3個(gè)月、6 個(gè)月、12個(gè)月和18個(gè)月隨訪時(shí)的CCSAC改善。相對于基線而言；如果ρ < 0. 0125 (0. 05/4)(Bonferroni相關(guān)性)，則心絞痛級別的變化具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
圖4示出由負(fù)荷Tecnecium閃爍掃描法評價(jià)的心肌缺血區(qū)域在12個(gè)月隨訪時(shí)的變化。圖中的各線表示登記入ReACT內(nèi)的一個(gè)患者，以及在12個(gè)月隨訪期間的相應(yīng)閃爍掃描心肌缺血區(qū)域的改善狀況。X軸表示閃爍掃描心肌缺血區(qū)域的比例。y軸表示患者的隨訪月份(僅在6月份和12月份評價(jià)閃爍掃描分析)。右下欄側(cè)的表格示出6月份和12月份隨訪時(shí)的閃爍掃描心肌缺血區(qū)域的改善的單邊Wilcoxon檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)分析。相對于基線而言；如果P < 0. 0125 (0. 05/4) (Bonferroni相關(guān)性)，則閃爍掃描心肌缺血區(qū)域的改善的變化具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
圖5 單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞為臍帶血中用于修復(fù)大鼠內(nèi)的中度冠動脈閉塞(MCAO) 后的腦部損傷的關(guān)鍵成分。A)在MCAO之后，身體同側(cè)的大腦半球(特別是紋狀體、海馬狀突起和皮層)內(nèi)具有明顯的損傷。MCAO 48小時(shí)后的HUCB治療減小了病變大小，而從人臍帶血(HUCB)部分中除去⑶14+單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞則消除了這種效果。B)在從HUCB中除去CD14+單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞時(shí)，MCAO后的梗塞體積增加至未治療的MCAO大鼠的梗塞體積水平。⑶14缺失組的梗塞體積顯著大于HUCB治療組的梗塞體積。
圖6 運(yùn)動不對稱性的登階檢驗(yàn)測量。A)在MCAO之后，殘肢登的臺階數(shù)降低。HUCB 施用改善了該肢體的性能，而從HUCB部分中除去CD14+細(xì)胞(單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞)則使得這種恢復(fù)喪失。B)僅注射⑶14+HUCB細(xì)胞改善了患病前肢的運(yùn)動功能。
圖7 自發(fā)性活動由于施用⑶14+HUCB細(xì)胞而減少。在MCAO后，大鼠變得極度活躍。施用臍帶血單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞將活動趨向正常水平(基線)降低，其體現(xiàn)為多個(gè)運(yùn)動參數(shù)，包括A)水平活動B)在籠內(nèi)移動的距離C)豎直活動(向后)以及D)逆時(shí)針轉(zhuǎn)動。
圖8:示出單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞個(gè)體發(fā)育的示意圖。多能性干細(xì)胞在骨髓內(nèi)分化為骨髓祖細(xì)胞或淋巴祖細(xì)胞。粒細(xì)胞-單核細(xì)胞祖細(xì)胞由骨髓祖細(xì)胞產(chǎn)生，然后分化為成髓細(xì)胞和成單核細(xì)胞。單核細(xì)胞由成單核細(xì)胞分化，隨后由骨髓遷移至血液內(nèi)。血液單核細(xì)胞在滲入組織后根據(jù)解剖學(xué)位置而分化為各種類型的定居巨噬細(xì)胞。另一方面，在炎性過程的早期，循環(huán)的單核細(xì)胞的補(bǔ)充和穿內(nèi)皮遷移由一系列粘附和趨化性材料(由炎性細(xì)胞表達(dá))增強(qiáng)。補(bǔ)充的單核細(xì)胞由于正常組織和受損組織之間的趨化性梯度和氧梯度而遷移，并且聚集在缺血癥或?qū)嶓w瘤或慢性炎性疾病的炎性和低氧核內(nèi)，然后分化為發(fā)生極化的補(bǔ)充巨噬細(xì)胞(Ml或M2亞組)。
發(fā)明詳述 一般而言，本發(fā)明通過提供用于治療缺血和改善血流灌注的方法和組合物而實(shí)現(xiàn)了上述的長期要求。優(yōu)選的治療方法為治療心肌缺血和心絞痛。所述方法部分地取決于以下出乎意料的發(fā)現(xiàn)具有單核細(xì)胞譜系細(xì)胞的干細(xì)胞群的富集改善了目前利用基于肝細(xì)胞的療法觀察的效力的可靠性。
骨髓和源自骨髓的干細(xì)胞群為參與血管生成和炎性過程的廣譜細(xì)胞因子的天然來源。
在血管再生的各個(gè)階段，各種細(xì)胞因子被表達(dá)，所述細(xì)胞因子例如為腫瘤壞死因子-a (TNFa)、白細(xì)胞介素(IL)、干擾素-g (IFN_g)和巨噬細(xì)胞集落刺激因子(MCSF)。這些細(xì)胞因子誘導(dǎo)平滑肌細(xì)胞表達(dá)間質(zhì)性膠原酶和基質(zhì)降解酶，這些酶進(jìn)而降解局部膠原， 從而導(dǎo)致血管變薄，以及血管向外凸出。在血管內(nèi)表達(dá)的細(xì)胞因子為炎性細(xì)胞的有效化學(xué)引誘物，從而誘導(dǎo)粘性分子在內(nèi)皮上的表達(dá)以及它們的反配體在白細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)，促進(jìn)血小板活性和血栓形成，并且抑制血栓溶解。
骨髓單核細(xì)胞或前單核細(xì)胞能夠在趨化性刺激物作用下被激活，并且最終分化為巨噬細(xì)胞。巨噬細(xì)胞通過其分泌蛋白酶、生長因子、單核因子的能力以及血管生成過程的各個(gè)階段的影響而在血管再生過程中起到重要作用，所述影響例如為局部細(xì)胞外基質(zhì)的改變、誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞遷移或增殖，并且抑制血管生長以及形成分化的毛細(xì)血管。
缺血性疾病的病理生理學(xué)過程為某些組織區(qū)域內(nèi)的血流灌注的減少。血流灌注不足的區(qū)域內(nèi)的細(xì)胞缺乏足夠的氧供應(yīng)，因此不能執(zhí)行其固有功能。在這種情況下，誘導(dǎo)血管再生能夠通過增加氧的供應(yīng)喚醒或補(bǔ)充冬眠細(xì)胞，從而改善組織功能。
標(biāo)準(zhǔn)的難治愈性心絞痛患者(其具有活性心肌層以及保留或輕度受抑制的左心室功能)為采用本發(fā)明的心肌內(nèi)注射單核細(xì)胞譜系細(xì)胞富集的干細(xì)胞群的血管再生療法的理想候選者。
我們啟動了難治愈性心絞痛患者(其具有保留或輕度受抑制的左心室功能)的非隨機(jī)化臨床試驗(yàn)，并且采用心肌內(nèi)注射BMMC作為唯一的療法，以便增強(qiáng)通過血管再生心肌增強(qiáng)血流(骨髓肝細(xì)胞療法的唯一明確的效果以及該患者群的獨(dú)特具體需求)。
定義 如本文所用，術(shù)語“治療性細(xì)胞群”可以為能夠分化為中胚層譜系細(xì)胞的單核細(xì)胞群和干細(xì)胞群中的任一者或這兩者。
術(shù)語患者“患者”在本文中用于描述采用本發(fā)明的細(xì)胞對其進(jìn)行治療的動物，優(yōu)選為人類。對于治療具體動物(如人類患者)所特有的那些感染、病癥或疾病狀態(tài)，術(shù)語患者是指該具體的動物。術(shù)語“捐獻(xiàn)者”用于描述捐獻(xiàn)用于患者內(nèi)的臍帶血或臍帶血細(xì)胞的個(gè)體(動物，包括人類)。
術(shù)語“臍帶血”在本文中用于表示由新生兒或胎兒(最優(yōu)選新生兒)獲得的血，并且優(yōu)選表示由新生兒的臍帶或胎盤獲得的血。優(yōu)選的是，臍帶血由人的新生兒分離得到。采用臍帶血作為單核細(xì)胞來源是有利的，因?yàn)槠淠軌蛳鄬θ菀椎孬@得，并且不會對捐獻(xiàn)者造成創(chuàng)傷。與此形成對比的是，由捐獻(xiàn)者收集骨髓細(xì)胞為創(chuàng)傷型過程。根據(jù)需要，臍帶血細(xì)胞可以用于自體移植或異體移植。臍帶血優(yōu)選由臍帶直接排出和/或用針從輸送的胎盤的根部和擴(kuò)張的靜脈抽取，從而獲得。如本文所用，術(shù)語“臍帶血細(xì)胞”是指存在于臍帶血內(nèi)的細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，臍帶血細(xì)胞為采用本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的方法從臍帶血中進(jìn)一步分離的單核細(xì)胞。在另一個(gè)實(shí)施方案中，臍帶血細(xì)胞可以在施用給患者之前進(jìn)一步分化。
術(shù)語“有效量”在本文中用于描述成分的濃度或量，所述成分例如為分化劑、臍帶血細(xì)胞、前體細(xì)胞或祖細(xì)胞、特化細(xì)胞(如神經(jīng)和/或神經(jīng)元或神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞)、血腦屏障滲透劑和/或有效產(chǎn)生期望結(jié)果或?qū)崿F(xiàn)這些細(xì)胞向待治療患者內(nèi)的移植的其他試劑，所述期望結(jié)果包括將肝細(xì)胞和/或祖細(xì)胞分化為特化細(xì)胞(如神經(jīng)細(xì)胞、神經(jīng)元細(xì)胞和/或神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞)，或者治療神經(jīng)疾病或其他病癥，包括患者中樞神經(jīng)系統(tǒng)的損害，如腦卒中、心臟病或事故受害。本發(fā)明的組合物可以用于實(shí)現(xiàn)組合物內(nèi)的臍帶血細(xì)胞的移植，以產(chǎn)生腦部或脊髓的有利變化或者所治療疾病或病癥的有利變化，無論所述變化為改善(如終止或逆轉(zhuǎn)疾病或病癥的惡化，減少神經(jīng)不足或改善神經(jīng)應(yīng)答)還是完全治愈所治療的疾病或病癥。
術(shù)語“干細(xì)胞”或“祖細(xì)胞”在本文中可交換用于表示源自臍帶血的干細(xì)胞和祖細(xì)胞。術(shù)語干細(xì)胞和祖細(xì)胞是本領(lǐng)域內(nèi)已知的(例如，Stem cells Scientific Progress and Future Research Directions，由國立健康研究所制定的報(bào)告，2001年6月)。術(shù)語“神經(jīng)細(xì)胞”為具有至少一種神經(jīng)元或神經(jīng)膠質(zhì)表型指示的細(xì)胞，所述表型例如為染有一種或多種神經(jīng)元或神經(jīng)膠質(zhì)標(biāo)記，或者其分化為表現(xiàn)出神經(jīng)元或神經(jīng)膠質(zhì)標(biāo)記的細(xì)胞?？捎糜谧R別本發(fā)明的神經(jīng)細(xì)胞的神經(jīng)元標(biāo)記的例子包括(例如)神經(jīng)元特異性核蛋白、酪氨酸羥化酶、微管相關(guān)蛋白和鈣結(jié)合蛋白等。術(shù)語神經(jīng)細(xì)胞還包括作為神經(jīng)前體細(xì)胞的細(xì)胞，所述神經(jīng)前體細(xì)胞為分化成或變?yōu)樽罱K表現(xiàn)出神經(jīng)元或神經(jīng)膠質(zhì)標(biāo)記的細(xì)胞的干細(xì)胞和/祖細(xì)胞，該術(shù)語包括最終分化為神經(jīng)元和/或神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的多能性干細(xì)胞和/或祖細(xì)胞。為了本發(fā)明的目的，所有上述細(xì)胞和它們的子代均被稱為神經(jīng)細(xì)胞。神經(jīng)干細(xì)胞為在機(jī)體的生命期間能夠增增殖、表現(xiàn)出自我修復(fù)性或更新并且產(chǎn)生克隆相關(guān)神經(jīng)后代的細(xì)胞。神經(jīng)干細(xì)胞在發(fā)育過程中產(chǎn)生神經(jīng)元、星細(xì)胞和少突細(xì)胞，并且能夠置換成年人腦部中的多種神經(jīng)細(xì)胞。為了本發(fā)明的目的，神經(jīng)干細(xì)胞為神經(jīng)細(xì)胞。術(shù)語“經(jīng)細(xì)胞”和“神經(jīng)元細(xì)胞”在本發(fā)明的多個(gè)方面中可互換使用。本發(fā)明的某些方面優(yōu)選使用的神經(jīng)細(xì)胞包括表現(xiàn)出一種或多種神經(jīng)/神經(jīng)元表型標(biāo)記的那些細(xì)胞，所述標(biāo)記例如為Musashi-1、Nestin、NeuN、III 類β -微管蛋白、GFAP、NF-L、NF-M、微管相關(guān)蛋白(MAP2)、S100、CNPase、磷脂酰肌醇蛋白聚糖(具體為磷脂酰肌醇蛋白聚糖4)、神經(jīng)元穿透素II，神經(jīng)元PAS 1、神經(jīng)元生長相關(guān)蛋白43、神經(jīng)突增生延伸蛋白、波形蛋白、Hu、互聯(lián)蛋白、04、髓磷脂基礎(chǔ)蛋白和多效蛋白等。
如本文所用，“干細(xì)胞”為得自胚胎、胎兒或成人的細(xì)胞，其在適當(dāng)?shù)臈l件下能夠被培養(yǎng)數(shù)個(gè)輪次，而不會分化或死亡。此外，干細(xì)胞在適當(dāng)?shù)臈l件下能夠分化為至少兩種細(xì)胞類型。
如本文所用，“多能性干細(xì)胞”能夠分化為屬于不同胚層譜系(中胚層、內(nèi)胚層和外胚層)的至少兩種細(xì)胞類型，體內(nèi)的所有細(xì)胞均由上述胚層譜系產(chǎn)生。多能性細(xì)胞可以得自胚胎。
“胚胎干細(xì)胞”為得自胚胎的干細(xì)胞、通常為得自被稱為內(nèi)細(xì)胞群的細(xì)胞群組的細(xì)胞，其為被稱為胚泡的早期胚胎0至5天)的一部分。一旦從胚泡中取出，內(nèi)細(xì)胞群可以被培養(yǎng)為任何其他干細(xì)胞。
“成人干細(xì)胞”為由成人(即非胚胎組織)分離的干細(xì)胞。所有成人干細(xì)胞通過數(shù)輪培養(yǎng)均能夠產(chǎn)生自身的相同拷貝。這種性能被稱為“自更新”。成人干細(xì)胞在適當(dāng)?shù)臈l件下通常產(chǎn)生祖細(xì)胞或前體細(xì)胞，其然后分化或發(fā)育為具有特征形狀或特定功能的成熟細(xì)胞，例如，構(gòu)成細(xì)胞壁的細(xì)胞。成人干細(xì)胞可以由多種組織分離，所述組織例如為腦部、 骨髓、骨膜、外周血、血管、骨骼肌、皮膚和結(jié)締組織的上皮細(xì)胞、角膜、牙齒的牙髓、腎臟、肝臟、胰腺和脂肪組織。
術(shù)語“施用”或“給予”在本說明書中被用于描述本發(fā)明的細(xì)胞(如由臍帶血獲得的臍帶血細(xì)胞或由臍帶血細(xì)胞獲得的進(jìn)一步分化的細(xì)胞)被輸送給患者以進(jìn)行治療的過程。以多種方式施用本發(fā)明的細(xì)胞，所述方式包括(但不限于)腸胃外方式(該術(shù)語表示靜脈內(nèi)和動脈內(nèi)途徑以及其他合適的腸胃外途徑)、胸內(nèi)方式、心室內(nèi)方式、腦組織內(nèi)方式 (包括脊髓、腦干或運(yùn)動皮層)、腦池內(nèi)方式、顱骨內(nèi)方式、紋狀體內(nèi)方式和黑質(zhì)內(nèi)方式等，這些方式允許本發(fā)明的細(xì)胞遷移到需要的最終目標(biāo)位置。本發(fā)明的細(xì)胞可以以完整臍帶血或其一部分的形式(該術(shù)語包括其單核細(xì)胞部分或單核細(xì)胞的一部分，包括高濃度的干細(xì)胞或祖細(xì)胞)施用?？梢栽诓皇褂脛訂T劑或分化劑治療的情況下(“未經(jīng)治療”，即不進(jìn)行進(jìn)一步治療以促進(jìn)臍帶血樣品中的細(xì)胞分化)使用本發(fā)明的組合物，或者在用分化劑或其他試劑治療后再使用本發(fā)明的組合物，其中所述其他試劑引起臍帶血樣品內(nèi)的某些干細(xì)胞和/或祖細(xì)胞分化為表現(xiàn)出分化表型的細(xì)胞，如神經(jīng)元和/或神經(jīng)膠質(zhì)表型)。
可以以系統(tǒng)方式施用單核細(xì)胞，或者將單核細(xì)胞施用至目標(biāo)解剖位置，從而使細(xì)胞在該細(xì)胞所遇到的生理信號的作用下分化(例如位置特異性分化)。或者，細(xì)胞可以在施用至患者之前發(fā)生體外分化。
施用方式通常取決于所治療的疾病或病癥，并且可以優(yōu)選借助于腸胃外途徑(例如靜脈內(nèi))、通過施用至腦脊液或通過直接施用至腦內(nèi)的患病組織內(nèi)而進(jìn)行施用。例如，在阿爾茲海默氏病、亨廷頓疾病和帕金森病的情況下，優(yōu)選的施用途徑為直接移植至紋狀體 (caudate cutamen)，或者直接移植至黑質(zhì)(帕金森病)。在肌萎縮病(Lou Gehrig氏病) 和多種硬化癥的情況下，優(yōu)選的施用方式為通過腦脊液。在溶酶體貯積癥的情況下，優(yōu)選的施用途徑為借助于靜脈內(nèi)途徑或通過腦脊液。在腦卒中的情況下，優(yōu)選的施用途徑取決于腦卒中的位置，但是可以直接施用至患病組織內(nèi)(其可以采用MRI或其他成像技術(shù)容易地確定)，或者全身式施用。在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，用于治療個(gè)體腦卒中后的施用途徑為通過靜脈內(nèi)或動脈內(nèi)施用而進(jìn)行全身式施用。
術(shù)語“植入”和“移植”在整個(gè)說明書中以同義的方式被用于描述本發(fā)明的細(xì)胞被輸送至期望細(xì)胞表現(xiàn)出有利效果的位置的過程，所述有利效果例如為修復(fù)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的損害(其可以減輕由損害導(dǎo)致的認(rèn)知或行為缺陷)，治療神經(jīng)變性疾病或治療由腦卒中、心血管疾病、心臟病、物理損害或創(chuàng)傷或基因損害或腦部和/或脊髓的環(huán)境損害(例如，其由事故或其他活動導(dǎo)致)引起的神經(jīng)損害的影響。本發(fā)明的細(xì)胞還可以通過上述的任何施用方式被輸送至體內(nèi)的遠(yuǎn)端位置，然后依賴于細(xì)胞遷移而到達(dá)合適的區(qū)域，以實(shí)現(xiàn)移植。優(yōu)選的是，將細(xì)胞與血腦屏障滲透劑共同施用。
術(shù)語“非腫瘤性”是指細(xì)胞不產(chǎn)生贅生物或腫瘤的情況。用于本發(fā)明的干細(xì)胞和 /或祖細(xì)胞優(yōu)選不形成腫瘤或癌癥。
術(shù)語“神經(jīng)變性疾病”在本文中被用于描述這樣的疾病，其由中樞神經(jīng)系統(tǒng)的損害導(dǎo)致，并且該損害能夠通過移植本發(fā)明的神經(jīng)細(xì)胞至腦部和/或脊髓的受損區(qū)域而得到減輕和/或緩解?？梢圆捎帽景l(fā)明的神經(jīng)細(xì)胞和方法治療的示例性神經(jīng)變性疾病包括(例如)帕金森病、亨廷頓疾病、肌萎縮病(Lou Gehrig氏病)、阿爾茲海默氏病、Rett綜合癥、 溶酶體貯積癥(“白質(zhì)體病”或神經(jīng)膠質(zhì)/脫髓鞘病，例如，如文獻(xiàn)R)lkerth，J. Neuropath. Exp. Neuro.，1999年9月，58 :9所述的那些)，包括Sanfilippo綜合癥、戈謝病、泰_薩克斯病(β_己糖胺酶缺乏癥)、其他遺傳疾病、多硬化癥、由缺血、事故、環(huán)境損傷等導(dǎo)致的腦部受損或創(chuàng)傷、脊髓受損、共濟(jì)失調(diào)和酒精中毒。此外，本發(fā)明還可以用于減輕和/或消除對患者內(nèi)的腦卒中或心臟病的中樞神經(jīng)系統(tǒng)的影響，所述影響由所述患者內(nèi)的腦部位置缺乏血流或缺血導(dǎo)致，或者由對腦部和/或脊髓的物理損害導(dǎo)致。神經(jīng)變性疾病還包括神經(jīng)發(fā)育障礙，其包括(例如)孤獨(dú)癥和相關(guān)的神經(jīng)疾病，如精神分裂癥等。
術(shù)語“基因療法”在本說明書的全文中被用于描述將新的基因信息轉(zhuǎn)移和穩(wěn)定的插入值細(xì)胞內(nèi)，以治療疾病或病患。外源基因被轉(zhuǎn)移至細(xì)胞內(nèi)，該細(xì)胞增殖從而在細(xì)胞群內(nèi)擴(kuò)散新的基因。臍帶血細(xì)胞或祖細(xì)胞為在分化之前或分化為神經(jīng)細(xì)胞表型之后的基因轉(zhuǎn)移的目標(biāo)。本發(fā)明的臍帶血干細(xì)胞或祖細(xì)胞可以用異源核苷酸序列進(jìn)和可操作地連接的啟動子進(jìn)行基因修飾，所述啟動子驅(qū)動異源核苷酸序列的表達(dá)。核苷酸序列可以編碼所關(guān)注的各種蛋白或肽。由基因修飾細(xì)胞產(chǎn)生的基因產(chǎn)物可以在體外捕集，或者細(xì)胞可以用作體內(nèi)輸送基因產(chǎn)物的載體(即基因療法)。
單核細(xì)胞譜系細(xì)胞 以下書面說明對實(shí)施本發(fā)明的多個(gè)方面提供給了示例性的(但不是限制性的)的方法和指導(dǎo)。
在本文中討論的各種細(xì)胞和細(xì)胞群可以通過多種方式表征，所述方式包括(例如)生長特性(例如，細(xì)胞群加倍能力、加倍時(shí)間、傳代至衰老)、染色體組型分析(例如，正常染色體組型、母系或出生譜系)、流量細(xì)胞技術(shù)(例如，F(xiàn)ACS分析)、免疫組織化學(xué)和/或免疫細(xì)胞化學(xué)(例如，檢測抗原決定基)、基因表達(dá)圖譜(例如，基因芯片陣列、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(例如，逆轉(zhuǎn)錄酶PCR、實(shí)時(shí)PCR和常規(guī)PCR))、蛋白陣列、蛋白分泌(例如，通過血漿凝塊分析或PDC調(diào)理基質(zhì)的分析，例如通過酶聯(lián)免疫吸附分析(ELISA))、混合淋巴細(xì)胞反應(yīng) (例如，由PBMC的刺激測量)和/或本領(lǐng)域內(nèi)已知的其他方法。
分離的細(xì)胞或細(xì)胞群可以用于啟動或接種用于本發(fā)明的細(xì)胞培養(yǎng)物?？梢詫⑦@種分離的細(xì)胞或細(xì)胞群轉(zhuǎn)移至滅菌的組織培養(yǎng)容器內(nèi)，該容器未包被或包被有細(xì)胞外基質(zhì)或配體，如昆布氨酸、膠原(天然、變性或交聯(lián)的膠原)、凝膠、纖維連接蛋白和其他細(xì)胞外基質(zhì)蛋白?？梢栽谀軌蚓S持細(xì)胞生長的任何培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)細(xì)胞。上述培養(yǎng)基的例子(本領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員可以根據(jù)細(xì)胞或細(xì)胞群的類型以及本領(lǐng)域技術(shù)人員可供利用的任何其他培養(yǎng)基而適當(dāng)選擇)包括DMEM(高或低葡萄糖)、高級DMEM、DMEM/MCDB 201、Eagle基礎(chǔ)培養(yǎng)基、Ham' s FlO 培養(yǎng)基(FlO)、HamF-12 培養(yǎng)基(F12)、Iscove 改造的 Dulbecco-17 培養(yǎng)基、間質(zhì)干細(xì)胞生長培養(yǎng)基(MSCGM)、DMEM/F12、RPMI 1640和CELL-GR0-FREE。培養(yǎng)基可以根據(jù)細(xì)胞或細(xì)胞類型而適當(dāng)?shù)匮a(bǔ)充一種或多種成分，包括(例如)牛血清蛋白(FBS)、馬血漿(ES)、人血漿(HS)、β-巰基乙醇(BME或2-ΜΕ)、一種或多種生長因子(例如，源自血小板的生長因子(PDGF)、外皮生長因子(EGF)、成纖維細(xì)胞生長因子(FGF)、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、類胰島素生長因子-I(IGF-I)、白細(xì)胞抑制生長因子(LIF)和紅細(xì)胞生長素 (EPO))；氨基酸，包括L-谷氨酸和L-纈氨酸；以及一種或多種抗生素和/或控制微生物污染的抗真菌劑(如盤尼西林G、硫酸鏈霉素、兩性霉素B、慶大霉素和制霉菌素，其單獨(dú)使用或以組合方式施用)。可以將細(xì)胞以允許細(xì)胞擴(kuò)增的密度進(jìn)行接種。
基于細(xì)胞或細(xì)胞類型選擇最合適的培養(yǎng)基、培養(yǎng)基制備和細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的方法是本領(lǐng)域內(nèi)已知的，并且在多個(gè)來源有所描述，所述來源包括文獻(xiàn)Doyle等，(eds. )，1995， CELL &TISSUE CULTURE :LAB0RAT0RYPR0CEDURES, John Wiley & Sons，Chichester ；以及Ho 禾口 Wang(eds.)，1991，ANIMAL CELL BI0REACT0RS, Butterworth-Heinemann, Boston。
可以通過在含有至少一種促進(jìn)細(xì)胞擴(kuò)增的因子的確定生長培養(yǎng)基(根據(jù)所應(yīng)用的細(xì)胞或細(xì)胞群而適當(dāng)選擇)內(nèi)培養(yǎng)，從而使用于本發(fā)明的細(xì)胞和細(xì)胞群擴(kuò)增。所述至少一種因子包括(例如)煙酰胺；TGF-β家族的成員，包括TGF-β 1、2和3 ；成骨蛋白(ΒΜΡ-2、 ΒΜΡ-4、ΒΜΡ-6、ΒΜΡ-7、BMP-IU BMP-12和BMP-13)、血清血蛋白；成纖維細(xì)胞生長因子家族的成員、源自血小板的生長因子-AA和源自血小板的生長因子-BB ；血小板富集血漿；胰島素生長因子(IGF-I、IGF-II)；生長分化因子(GDF-5、GDF-6、GDF-8、GDF-10, GDF-11)；胰高血糖素類肽-I和胰高血糖素類肽-II (GLP-I和GLP-II) ；GLP-I和GLP-II模擬體；毒蜥外泌肽-4 ；維甲酸；甲狀旁腺激素；胰島素；孕酮；抗蛋白酶肽；氫化可的松；乙醇胺；β 巰基乙醇；外皮生長因子(EGF)；胃分泌素I和II ；銅螯合劑，如三亞乙基五胺；福斯高林； 丁酸鈉；活化素；β動物纖維素；noggin ；神經(jīng)元生長因子；nodal ；胰島素/轉(zhuǎn)鐵因子/硒 (ITS)；肝細(xì)胞生長因子(HGF)；角化細(xì)胞生長因子(KGF)；牛垂體提取物；胰島新生相關(guān)蛋白(INGAP)；蛋白酶體抑制劑；notch通路抑制劑；sonic hedgehog抑制劑或它們的組合?；蛘撸梢酝ㄟ^在調(diào)理的培養(yǎng)基內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)從而使適用于本發(fā)明的細(xì)胞擴(kuò)增，所述調(diào)理的培養(yǎng)基為限定的細(xì)胞培養(yǎng)基，其中使細(xì)胞群生長，以允許細(xì)胞將可溶的因子釋放至培養(yǎng)基內(nèi)， 使得調(diào)理的培養(yǎng)基包含用于所關(guān)注細(xì)胞或細(xì)胞群的適當(dāng)可溶因子。在某些實(shí)施方案中，從培養(yǎng)基內(nèi)取出細(xì)胞，而所產(chǎn)生的可溶性因子仍然保留在其中。然后，可以將這種培養(yǎng)基用于支持不同的細(xì)胞或細(xì)胞群。
在單核細(xì)胞譜系的造血期間，造血干細(xì)胞首先分化為常規(guī)的骨髓祖細(xì)胞，然后分化為成髓細(xì)胞。在分化為成髓細(xì)胞之后，細(xì)胞然后分化為成單核細(xì)胞。成單核細(xì)胞是適當(dāng)?shù)刈鳛閱魏俗V系細(xì)胞的一部分的第一細(xì)胞，因?yàn)槠浔挥糜诜只癁閱魏思?xì)胞。成單核細(xì)胞分化為前單核細(xì)胞。前單核細(xì)胞然后分化為單核細(xì)胞。單核細(xì)胞然后經(jīng)歷單核細(xì)胞發(fā)生，而分化為巨噬細(xì)胞或骨髓樹突細(xì)胞。因此，單核細(xì)胞譜系細(xì)胞包括從成單核細(xì)胞直至單核細(xì)胞發(fā)生過程中的所有細(xì)胞類型。
成單核細(xì)胞對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言可以容易地識別。成單核細(xì)胞的直徑為12 至20微米。其核與細(xì)胞質(zhì)的相對體積比為4 1至3 1，并且如大多數(shù)成骨髓細(xì)胞一樣， 成單核細(xì)胞具有圓形至橢圓形的具有微細(xì)染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的核。核可以為中心的或同心的，并且其可以表現(xiàn)出凹陷或折疊的跡象。細(xì)胞質(zhì)為粒狀的，中度至輕度嗜堿性的，并且通常具有稠密染色的外周和突出的核周區(qū)。
單核細(xì)胞同樣容易地為本領(lǐng)域的技術(shù)人員所識別。成單核細(xì)胞的直徑通常為13 至25微米之間。單核細(xì)胞為較大的循環(huán)的噬菌性白血細(xì)胞，其具有單一的、較大的、平滑的、明確的橢圓形或腎形核。細(xì)胞質(zhì)的較大區(qū)域都具有許多用于處理外來材料的內(nèi)部囊泡， 并且包含微細(xì)的、噬天青細(xì)胞質(zhì)粒子。單核細(xì)胞通常在血流內(nèi)循環(huán)約1至3天，然后遷移到全身的其他組織內(nèi)(如肺和肝臟)。在遷移到其他組織內(nèi)之后，單核細(xì)胞進(jìn)單核細(xì)胞發(fā)生行作用，從而根據(jù)單核細(xì)胞所遷移入的組織類型而成為不同類型的巨噬細(xì)胞。前單核細(xì)胞與單核細(xì)胞類似，但是前單核細(xì)胞的核比成熟單核細(xì)胞更規(guī)則，并且其核與細(xì)胞質(zhì)的比例較尚ο 單核細(xì)胞譜系細(xì)胞可以采用本領(lǐng)域內(nèi)可用的任何方法從多種來源分離。其例子包括骨髓、外周血和臍帶血。除了通過直接從對象分離而獲得單核細(xì)胞譜系細(xì)胞以外，還可以干細(xì)胞(包括但是不限于造血干細(xì)胞)分化而獲得單核細(xì)胞譜系細(xì)胞。
單核細(xì)胞群 單核細(xì)胞群可以由多種來源分離。其一個(gè)例子為以下的實(shí)施例證明的密度梯度 (從1. 0g/L至1. lg/L，優(yōu)選為1. 077g/L)。其他例子包括骨髓、外周血和臍帶血。除了通過直接從對象分離而獲得單核細(xì)胞譜系細(xì)胞以外，還可以干細(xì)胞(包括但是不限于造血干細(xì)胞)分化而獲得單核細(xì)胞譜系細(xì)胞。
干細(xì)胞群 適合用于本發(fā)明的方法的干細(xì)胞群可以由以下的任意組織獲得，所述組織可以提供能夠分化為至少細(xì)胞類型的中胚層譜系的肝細(xì)胞。
源自骨髓的干細(xì)胞為兩種研究最多的成人干細(xì)胞。目前，目前，這種源自骨髓的肝細(xì)胞在臨床上用于通過移植而為骨髓補(bǔ)充各種血液和免疫成分。目前有兩種在骨髓中發(fā)現(xiàn)的主要類型的干細(xì)胞造血干細(xì)胞(HSC或CD34+細(xì)胞)，其能夠分化為所有類型的血液和免疫細(xì)胞，以及基質(zhì)(間質(zhì))干細(xì)胞(MSC)，其通常被認(rèn)為形成骨骼、軟骨、肌肉和脂肪。然而，這兩種類型的原子骨髓的干細(xì)胞均被證實(shí)具有比以前認(rèn)為的更強(qiáng)的塑性。
本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以利用分離和培養(yǎng)肝細(xì)胞的任意手段，因?yàn)橛袔追N方法是公知的。例如，造血干細(xì)胞可以由含有豐富供應(yīng)的該細(xì)胞的臍帶血獲得。由臍帶血分離的造血干細(xì)胞和由骨髓或外周血分離的造血干細(xì)胞在用于移植時(shí)行為基本相同。此外，胎盤和骨髓為間質(zhì)干細(xì)胞的優(yōu)異來源。類似地，能夠分化為中胚層譜系細(xì)胞的肝細(xì)胞已經(jīng)由脂肪組織獲得(但是明顯不如源自骨髓的間質(zhì)干細(xì)胞那么具有塑性)，并且干細(xì)胞也可以存在于其他組織內(nèi)。
還可以利用結(jié)合特異于干細(xì)胞的標(biāo)志物的抗體(例如，SH2，SH3和SH4-參見美國專利No. 5，486，359和5，837，539)從多種組織內(nèi)分離干細(xì)胞，或者通過利用結(jié)合特異于不期望的細(xì)胞的標(biāo)志物的抗體分離干細(xì)胞，所述不期望的細(xì)胞例如為CD4+和CD8+(T細(xì)胞)、 CD45+(panB細(xì)胞)、GR_1 (粒細(xì)胞)和Iad細(xì)胞(分化的抗原呈遞細(xì)胞)。這種方法的例子可參見于文獻(xiàn) Izaba 等，I. Exp. Med. 176-16931702 (1992)。
造血干細(xì)胞可以類似地由多種來源獲得，所述來源包括臍帶血、骨髓和動員的外周血?？梢酝ㄟ^抗體親和方法對造血干細(xì)胞進(jìn)行純化(例如，利用結(jié)合特異于造血細(xì)胞的⑶34的抗體)。利用上述抗體分離細(xì)胞的親和柱分離方法可見于Ho等，Stem Cells 13 (suppl. 31 :100-105(1995)。還可見于文獻(xiàn) Brenner，Journal of Hematotherapy 2 7-17(1993)。間質(zhì)肝細(xì)胞的親和純化以及培養(yǎng)擴(kuò)增的方法也是公知的(例如，參見美國專利No. · 5，486，359和5，837，539)。上述分離方法的其他例子在美國專利No. 6，087，113、美國專利 No. 6，261，549、美國專利 No. 5，914，262、美國專利 No. 5，908，782 和 US20040058412 中有所教導(dǎo)。
單核細(xì)胞譜系細(xì)胞富集的治療性細(xì)胞群 治療性細(xì)胞群可以通過可供本領(lǐng)域技術(shù)人員利用的任意方法富集。一個(gè)例子包括分離干細(xì)胞群，然后選擇由于分離而使得單核細(xì)胞富集的那些細(xì)胞群。該方法基本如以下的實(shí)施例所示，不同之處在于在利用單核細(xì)胞群之后再進(jìn)行測定。可以容易地對這些實(shí)施例進(jìn)行改造，使得在利用之前測量單核細(xì)胞的富集情況，然后選擇具有充分的富集的那些細(xì)胞群和/或?qū)@些細(xì)胞群進(jìn)行進(jìn)一步富集。由于干細(xì)胞群和單核細(xì)胞群包括能夠被誘導(dǎo)而分化為單核譜系細(xì)胞的細(xì)胞，因此一種富集方法包括添加一種或多種合適的因子，以誘導(dǎo)細(xì)胞群的分化(其為本領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員所知)。富集的其他例子包括添加一種或多種細(xì)胞因子或其他生長因子，以促進(jìn)單核譜系細(xì)胞比細(xì)胞群內(nèi)的非單核細(xì)胞譜系細(xì)胞更快地分化或生長；和/或添加一種或多種因子，以選擇性地抑制非單核細(xì)胞譜系細(xì)胞的細(xì)胞分化和生長。最后，可以將獨(dú)立獲得或培養(yǎng)的單核細(xì)胞譜系細(xì)胞加入到治療性細(xì)胞群內(nèi)。實(shí)施例 以下的實(shí)施例示出了本說明書公開的方法和組合物的代表性用途。 _4] _仿丨丨 通過標(biāo)準(zhǔn)密度梯度進(jìn)行骨髓單核細(xì)胞的制備(從1. Og/L至1. lg/L，優(yōu)選為 1. 077g/L)。在以下的實(shí)施例2中討論的細(xì)胞制備具有不同量的單核細(xì)胞譜系細(xì)胞。
通過利用Ficoll Paque PREMIUM (GE Healthcare)進(jìn)行密度梯度分離，從而進(jìn)行BMMC的制備。將35mL的骨髓血仔細(xì)地加入至IOml Ficoll/管內(nèi)，不進(jìn)行混合，從而保持完整的Ficoll表面張力。在9個(gè)管內(nèi)重復(fù)上述過程，其中每個(gè)患者總共使用10管。 然后將這些管在350g、20°C的條件下離心40分鐘(不減速)。在密度分離后，從這10個(gè)管中仔細(xì)地分離單核環(huán)(血漿/Ficoll界面)，并且懸浮于4個(gè)管內(nèi)，向其中加入0. 9%鹽水溶液，使得總管體積為45mL。將這4個(gè)管在400g、20°C的條件下離心10分鐘，從而將細(xì)胞與殘余的Ficoll分離。在廢棄上清液之后，從所有管中收集單核細(xì)胞，并且合并于單一一個(gè)管(其含有總體積為40ml的0.9%鹽水溶液)內(nèi)。將單核細(xì)胞溶液再次在在400g、20°C 的條件下離心10分鐘。再次廢棄上清液，并且將細(xì)胞圖懸浮于IOml的0. 9%鹽水溶液內(nèi)。 一旦細(xì)胞通過批次放行標(biāo)準(zhǔn)(包括無菌狀態(tài)、活力和不存在內(nèi)毒素)，然后通過良好控制規(guī)范(GMP)，并且進(jìn)行適當(dāng)?shù)淖詣蛹?xì)胞計(jì)數(shù)之后，將細(xì)胞懸浮于0. 9%鹽水以及20%自體血漿內(nèi)，以保持細(xì)胞活力(自體血漿預(yù)先用0. 22μπι濾膜過濾，以除去污染細(xì)胞)，其最終濃度為 IxlO7個(gè)細(xì)胞/mL。將最終的單核細(xì)胞溶液通過100 μ m的濾膜，以除去細(xì)胞團(tuán)聚物。
實(shí)施例2所注入的單核細(xì)胞數(shù)量與結(jié)果的相關(guān)性 以下的實(shí)施例提供由由本文所述的方法和組合物治療的患者獲得的數(shù)據(jù)。
我們的研究目的是評價(jià)專有設(shè)計(jì)的方案-難治愈性心絞痛細(xì)胞治療方案(ReACT) 的安全性和效力，其中對特定的BMMC制劑進(jìn)行了單一系列的多次心肌內(nèi)注射，以作為用于這些患者的唯一手術(shù)療法。
ReACT的設(shè)計(jì)符合良好生產(chǎn)規(guī)范(GMP)和FDA標(biāo)準(zhǔn)。
納入該方案的患者需要患有難治愈性心絞痛，具有活性心肌層(通過負(fù)荷 Tecnecium閃爍掃描診斷)，沒有左心室機(jī)能障礙(射血分?jǐn)?shù)為至少45% )，并且不適合于心肌血管再生成(PTCA或CABG)。
8例難治愈性心絞痛患者納入從2005年9月至2007年七月的本項(xiàng)研究。所有患者以前均進(jìn)行過血管再生成手術(shù)一次G例患者)、兩次(3例患者)或4次(1例患者)，而沒有緩解心絞痛?；颊叩幕€特征記載于表1中。
還納入了另外4例難治愈性心絞痛患者，并且進(jìn)行了 ReACT，但是要求同時(shí)進(jìn)行冠狀動脈旁路搭橋術(shù)，因此從該分析中排除。這些患者目前正在作為獨(dú)立的小組進(jìn)行隨訪。
難治愈性心絞痛患者定時(shí)來訪位于巴西SSO Paulo市的S§0 Paulo醫(yī)院(一家用于治療冠心病的提供高等教育的周立大學(xué)醫(yī)院)，并且這些患者納入本研究中。研究方案 (ReACT)由我們當(dāng)?shù)氐膰覀惱砦瘑T會批準(zhǔn)(CEP-EPM-0314/05)，并且所有患者均提交了書面的知情同意書。根據(jù)加拿大心血管協(xié)會絞痛分級(CCSAC)，難治愈性心絞痛患者被定義為患有功能性IV級心絞痛(安靜時(shí)心絞痛)的患者，而不管是否進(jìn)行了最大程度的醫(yī)學(xué)治療，并且這些患者不適合于常規(guī)的心肌血管再生成手術(shù)并且確認(rèn)具有活性心肌層。由至少
20兩名心臟病專家和2名心血管外科醫(yī)生根據(jù)最近來訪患者(6個(gè)月內(nèi))的管狀動脈造影照片確認(rèn)了患者不適合于進(jìn)行血管再生成術(shù)(經(jīng)皮或手術(shù))。排除標(biāo)準(zhǔn)為(1)根據(jù)經(jīng)胸超聲心電圖，左室射血分?jǐn)?shù)(LVEF) < 45%； (2)根據(jù)心臟核成像測試不存在活性心肌層；(3)人免疫缺陷病毒(HIV)，A型、B型和C型肝炎病毒，人T細(xì)胞淋巴病毒(HTLV)或Chagas病的血清測試結(jié)果為陽性；(4)明顯的心瓣膜疾??；( 透析中的慢性腎臟疾??；(6)濫用酒精和藥物；(7)估計(jì)存活期< 5年的任何其他醫(yī)學(xué)病癥；(8)參與了以前的細(xì)胞治療研究以及 (9)懷孕。
進(jìn)行I/IIa期前景臨床試驗(yàn)的一次性手術(shù)過程，其中骨髓單核細(xì)胞(根據(jù)實(shí)施例 1制備)經(jīng)心肌內(nèi)被注入到患有難治愈性心絞痛的患者(其具有正?；蜉p度受抑制的左心室功能)的多個(gè)注射點(diǎn)?；颊叩碾y治愈性心絞痛被嚴(yán)格地定義為加拿大心血管協(xié)會絞痛分級(CCSAC)的IV級，其經(jīng)過完全優(yōu)化的藥理治療，而沒有任何醫(yī)學(xué)或可能的介入過程(CABG 和PTCA)- “無選擇”患者。
對于各患者，從其髂嵴內(nèi)抽取總共IOOcc的骨髓，并且儲存在含有濃度為80U. I.肝磷脂/ml的鹽水溶液內(nèi)。通過密度梯度法分離單核細(xì)胞，并且根據(jù)ReACT和良好生產(chǎn)規(guī)范(GMP)將其稀釋至最終濃度為IO7個(gè)細(xì)胞/mL。進(jìn)行細(xì)胞活力、總單核細(xì)胞數(shù)、白細(xì)胞差異計(jì)數(shù)和CD34+含量分析，以及好氧菌和厭氧菌微生物學(xué)分析。將進(jìn)一步用于評價(jià)的樣品儲存。
通過左側(cè)胸廓切開術(shù)以手術(shù)方式將一系列的多個(gè)細(xì)胞制劑注射到左心室心肌層內(nèi)，注射條件如下0. 2mL(2xl06個(gè)細(xì)胞)/次注射，注射位置之間的距離為Icm并且心外肌膜注入深度為1cm。每個(gè)患者的注射次數(shù)(40至90)根據(jù)核成像測試、磁共振成像(MRI)、 閃爍掃描成像和左心室放大所確定的心肌層活性缺血區(qū)域的延伸程度而有不同。
膽 手術(shù)后48小時(shí)監(jiān)測患者的心律。在手術(shù)后第3個(gè)月、6個(gè)月、12個(gè)月和18個(gè)月進(jìn)行CCSAC臨床評價(jià)。在基線以及第1、3、6和12個(gè)月時(shí)進(jìn)行超聲波心動圖測試，并且在基線以及第6和12個(gè)月時(shí)進(jìn)行心臟磁共振成像，以評價(jià)安全性。在基線以及手術(shù)過程第6和12 個(gè)月時(shí)進(jìn)行核成像測試(Tecnecium負(fù)荷誘導(dǎo)的心肌層灌注掃描和MRI)，以評價(jià)心肌層缺血區(qū)域的比例。關(guān)于心臟缺血區(qū)域的客觀分析(負(fù)荷閃爍掃描)，重要的是指出所有患者都被認(rèn)為在細(xì)胞制劑注射之前，在由負(fù)荷Tecnecium閃爍掃描確認(rèn)的那些具體左心室壁上具有100%的活性心肌缺血區(qū)域。這些可逆的心臟缺血區(qū)域被認(rèn)為是基線，以與隨后第6個(gè)和 12個(gè)月的閃爍掃描分析進(jìn)行比較。僅在隨訪的第6和12個(gè)月進(jìn)行閃爍掃描分析。
統(tǒng)計(jì)分析 采用Friedman非參數(shù)檢驗(yàn)評價(jià)在隨訪第3、6和12個(gè)月時(shí)的CCSAC心絞痛級別的變化以及在隨訪第6和12個(gè)月時(shí)的心肌層缺血區(qū)域的變化。對于hoc后比較，采用具有 Bonferroni校正的Wilcoxon檢驗(yàn)。通過Spearman檢驗(yàn)評價(jià)結(jié)果(注射過程后的心絞痛級別和心肌層缺血區(qū)域)與注射次數(shù)之間的相關(guān)性。為了比較注射過程之前與注射過程之后 12個(gè)月時(shí)的超聲波心動圖上的左心室功能，采用Wilcoxon非參數(shù)檢驗(yàn)。
如下詳細(xì)所示，患者的心肌血流灌注的改善(或不改善)與單核細(xì)胞譜系細(xì)胞的劑量相關(guān)。接受最高數(shù)量的單核細(xì)胞譜系細(xì)胞的患者顯示出心絞痛級別由IV降至 0(CCSAC)。
下表IA示出只接種重組蛋白或者接種重組蛋白與OMV的組合的人對象內(nèi)的完全血清轉(zhuǎn)化(滴定度彡1 4)結(jié)果。

權(quán)利要求
1.一種治療對象內(nèi)的缺血癥的方法，包括將單核細(xì)胞譜系細(xì)胞富集的治療性細(xì)胞群注入所述對象的缺血性組織內(nèi)。
2.一種改善對象內(nèi)的血流灌注的方法，包括將單核細(xì)胞譜系細(xì)胞富集的治療性細(xì)胞群注入所述對象的需要改善血流灌注的組織內(nèi)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述缺血癥為心臟缺血癥，并且所述缺血性組織為缺血的心肌層。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中所述血流灌注為心臟血流灌注并且所述組織為心肌層。
5.一種治療對象內(nèi)的心絞痛的方法，包括將單核細(xì)胞譜系細(xì)胞富集的治療性細(xì)胞群注入所述對象的心肌層內(nèi)。
6.根據(jù)權(quán)利要求3-5中任一項(xiàng)所述的方法，其中注入所述心肌層中的富集的治療性細(xì)胞群包含至少107個(gè)單核細(xì)胞譜系細(xì)胞。
7.根據(jù)權(quán)利要求3-6中任一項(xiàng)所述的方法，其中以如下方式將所述單核細(xì)胞群注入所述心肌層內(nèi)，所述方式為至少兩次獨(dú)立的注射、至少三次獨(dú)立的注射、至少四次獨(dú)立的注射、至少五次獨(dú)立的注射、至少10次獨(dú)立的注射、至少20次獨(dú)立的注射、至少30次獨(dú)立的注射或至少40次獨(dú)立的注射。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述注射的量為0.05ml至0. 3mL·
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中所述注射的量為約0.2mL·
10.根據(jù)權(quán)利要求1-9任一項(xiàng)所述的方法，其中所述單核細(xì)胞譜系細(xì)胞富集的治療性細(xì)胞群相對于所述對象為自體的。
11.根據(jù)權(quán)利要求1-9任一項(xiàng)所述的方法，其中所述單核細(xì)胞譜系細(xì)胞富集的治療性細(xì)胞群相對于所述對象為異體的。
12.根據(jù)權(quán)利要求1-11任一項(xiàng)所述的方法，還包括在注射之前，進(jìn)行選自下列步驟的步驟利用富集單核細(xì)胞譜系細(xì)胞的方法由樣品分離所述治療性細(xì)胞；在富集單核細(xì)胞譜系細(xì)胞的條件下培養(yǎng)治療性細(xì)胞群以及將單核細(xì)胞譜系細(xì)胞加入到治療性細(xì)胞群中。
13.根據(jù)權(quán)利要求1-12任一項(xiàng)所述的方法，其中所述治療性細(xì)胞群為單核細(xì)胞群。
14.一種可注射治療工具，包括能夠?qū)⑺鶞y定注射量的治療劑輸送至缺血性組織內(nèi)的設(shè)施，其中所述設(shè)施包括治療劑的貯存器，并且所述治療劑包含單核細(xì)胞譜系細(xì)胞富集的治療性細(xì)胞群。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的可注射治療工具，其中所述治療性細(xì)胞群為單核細(xì)胞群。
16.根據(jù)權(quán)利要求14-15任一項(xiàng)所述的可注射治療工具，其中所述單核細(xì)胞譜系細(xì)胞富集的治療性細(xì)胞群包含至少107個(gè)單核細(xì)胞譜系細(xì)胞。
17.一種由臍帶血分離人單核細(xì)胞的方法，包括a)由所述臍帶血獲取單核細(xì)胞的樣品；b)從步驟a)中選擇并且分離所述樣品中的所述人單核細(xì)胞。
18.一種制備包含由臍帶血獲得的人單核細(xì)胞的藥物組合物的方法，包括a)由所述臍帶血獲取單核細(xì)胞的樣品；b)從步驟a)中選擇并且分離所述樣品中的所述人單核細(xì)胞；c)將由步驟b獲得的所述細(xì)胞與可藥用的載體、添加劑或賦形劑組合。
19.一種由外周血分離單核細(xì)胞的方法，包括a)由所述外周血獲取單核細(xì)胞的樣品；b)從步驟a)中選擇并且分離所述樣品中的所述人單核細(xì)胞。
20.一種制備包含由外周血獲得的人單核細(xì)胞的藥物組合物的方法，包括a)由所述外周血獲取單核細(xì)胞的樣品；b)從步驟a)中選擇并且分離所述樣品中的所述人單核細(xì)胞；c)將由步驟b獲得的所述細(xì)胞與可藥用的載體、添加劑或賦形劑組合。
21.一種由骨髓分離單核細(xì)胞的方法，包括a)由所述骨髓獲取單核細(xì)胞的樣品；b)從步驟a)中選擇并且分離所述樣品中的所述人單核細(xì)胞。
22.—種制備包含由骨髓獲得的人單核細(xì)胞的藥物組合物的方法，包括a)由所述骨髓獲取單核細(xì)胞的樣品；b)從步驟a)中選擇并且分離所述樣品中的所述人單核細(xì)胞；c)將由步驟b獲得的所述細(xì)胞與可藥用的載體、添加劑或賦形劑組合。
23.根據(jù)權(quán)利要求18、20和22所述的方法，其中所述可藥用的載體、添加劑或賦形劑選自包含下列物質(zhì)的組
24.一種治療患有神經(jīng)變性疾病的人類患者的方法或者治療神經(jīng)損傷作用的方法，包括通過植入方式將所述患者的有效量的人單核細(xì)胞施用給所述患者。
25.一種治療患有肌萎縮病的人類患者的方法，包括在不存在放射步驟或化療步驟的情況下，通過植入方式將所述患者的有效量的人單核細(xì)胞施用給所述患者，其中所述放射步驟或化療步驟被用于減少骨髓產(chǎn)生的造血細(xì)胞。
26.一種治療患有神經(jīng)變性疾病的人類患者的方法或者治療神經(jīng)損傷作用的方法，包括通過植入方式將所述患者的有效量的人單核細(xì)胞施用給所述患者。
27.一種治療患有神經(jīng)變性疾病的人類患者的方法或者治療神經(jīng)損傷作用的方法，包括在不存在放射步驟或化療步驟的情況下，通過植入方式將所述患者的有效量的人單核細(xì)胞施用給所述患者，其中所述放射步驟或化療步驟被用于減少骨髓產(chǎn)生的造血細(xì)胞。
28.一種治療患有神經(jīng)變性疾病的人類患者的方法或者治療神經(jīng)損傷作用的方法，包括通過植入方式將有效量的人單核細(xì)胞施用給所述患者。
29.一種治療患有神經(jīng)變性疾病的人類患者的方法或者治療神經(jīng)損傷作用的方法，包括在不存在放射步驟或化療步驟的情況下，通過植入方式將有效量的人單核細(xì)胞施用給所述患者，其中所述放射步驟或化療步驟被用于減少骨髓產(chǎn)生的造血細(xì)胞。
30.一種治療患有神經(jīng)變性疾病的人類患者的方法或者治療神經(jīng)損傷作用的方法，包括通過植入方式將根據(jù)權(quán)利要求2、4和6所述的方法獲得的有效量的人單核細(xì)胞施用給所述患者。
31.根據(jù)權(quán)利要求M-30所述的方法，其中所述神經(jīng)變性疾病選自包含下列疾病的組 帕金森病、亨廷頓疾病、艾爾茲海默氏病、肌萎縮病(ALS)、多硬化癥(MQ、泰-薩克斯病 (β -己糖胺酶缺乏癥)、Rett綜合癥、溶酶體貯積癥、缺血癥、脊髓損傷、創(chuàng)傷性腦受損、共濟(jì)失調(diào)、酒精中毒、精神分裂癥或孤獨(dú)癥。
32.根據(jù)權(quán)利要求M-30所述的方法，其中所述神經(jīng)損傷的誘因選自包含下列因素的組腦卒中、心血管疾病、心臟病、物理受損、創(chuàng)傷、基因損傷或環(huán)境對腦部和/或脊髓的損害。
33.一種治療患有循環(huán)疾病的人類患者的方法，包括通過植入方式將所述患者的有效量的人單核細(xì)胞施用給所述患者。
34.一種治療患有循環(huán)疾病的人類患者的方法，包括通過植入方式將所述患者的有效量的人單核細(xì)胞施用給所述患者。
35.一種治療患有循環(huán)疾病的人類患者的方法，包括在不存在放射步驟或化療步驟的情況下，通過植入方式將所述患者的有效量的人單核細(xì)胞施用給所述患者，其中所述放射步驟或化療步驟被用于減少骨髓產(chǎn)生的造血細(xì)胞。
36.一種治療患有循環(huán)疾病的人類患者的方法，包括通過植入方式將有效量的人單核細(xì)胞施用給所述患者。
37.一種治療患有循環(huán)疾病的人類患者的方法，包括在不存在放射步驟或化療步驟的情況下，通過植入方式將有效量的人單核細(xì)胞施用給所述患者，其中所述放射步驟或化療步驟被用于減少骨髓產(chǎn)生的造血細(xì)胞。
38.一種治療患有循環(huán)疾病的人類患者的方法，包括通過植入方式將根據(jù)權(quán)利要求 18,20和22所述的方法獲得的有效量的人單核細(xì)胞施用給所述患者。
39.一種治療個(gè)體內(nèi)受損組織的方法，包括a)確定所述個(gè)體內(nèi)組織受損的位置；以及b)將有效量的人單核細(xì)胞施用至所述患者內(nèi)組織受損的位置處或該受損的位置周圍。
40.一種將細(xì)胞移植給需要該細(xì)胞的患者的方法，所述方法包括將有效量的人單核細(xì)胞施用給所述患者。
41.根據(jù)權(quán)利要求40所述的方法，其中所述患者處于病理狀態(tài)。
42.根據(jù)權(quán)利要求所述的方法，其中所述病理狀態(tài)與細(xì)胞死亡、細(xì)胞損失或細(xì)胞功能障礙有關(guān)。
43.根據(jù)權(quán)利要求41所述的方法，其中所述病理狀態(tài)選自包含癌癥、神經(jīng)變性疾病、糖尿病和創(chuàng)傷的組。
44.根據(jù)權(quán)利要求41所述的方法，其中所述病理狀態(tài)選自包含下列疾病的組灼傷、頭部創(chuàng)傷、脊髓受損、腦卒中、心肌梗塞、關(guān)節(jié)病、帕金森病、阿爾茲海默氏病、亨廷頓疾病、妥瑞氏綜合癥、肌萎縮病、愛迪森病、垂體機(jī)能不全、肝功能衰竭、炎性關(guān)節(jié)炎、神經(jīng)性疼痛、失明和聽力損耗。
45.一種減輕接受細(xì)胞移植的人類患者內(nèi)的移植物抗宿主病的方法，所述方法包括將有效量的人單核細(xì)胞給所述患者。
46.根據(jù)權(quán)利要求45所述的方法，其中所述患者處于病理狀態(tài)。
47.根據(jù)權(quán)利要求46所述的方法，其中所述病理狀態(tài)與細(xì)胞死亡、細(xì)胞損失或細(xì)胞功能障礙有關(guān)。
48.根據(jù)權(quán)利要求46所述的方法，其中所述病理狀態(tài)選自包含癌癥、神經(jīng)變性疾病、糖尿病和創(chuàng)傷的組。
49.根據(jù)權(quán)利要求46所述的方法，其中所述病理狀態(tài)選自包含下列疾病的組灼傷、頭部創(chuàng)傷、脊髓受損、腦卒中、心肌梗塞、關(guān)節(jié)病、帕金森病、阿爾茲海默氏病、亨廷頓疾病、妥瑞氏綜合癥、肌萎縮病、愛迪森病、垂體機(jī)能不全、肝功能衰竭、炎性關(guān)節(jié)炎、神經(jīng)性疼痛、失明和聽力損耗。
50.根據(jù)權(quán)利要求M-30、33-40和45所述的方法，其中所述施用方式選自包含下列方式的組腸胃外施用(其包括靜脈內(nèi)施用或動脈內(nèi)施用)、胸內(nèi)施用、心室內(nèi)施用、腦組織內(nèi)施用、腦池內(nèi)施用、顱骨內(nèi)施用、紋狀體內(nèi)施用或黑質(zhì)內(nèi)施用。
51.根據(jù)權(quán)利要求M-30、33-40和45所述的方法，其中所述移植方式包括異體移植或自體移植。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于治療缺血性疾病和病癥(特別是心肌缺血、CNS/腦部缺血和肢體缺血)的組合物和方法。更具體而言，本發(fā)明提供通過將由血液(包括臍帶血、外周血或骨髓)獲得的單核細(xì)胞施用給需要治療過的患者而治療疾病的方法，其中在具體確定為提供治療效能的時(shí)間點(diǎn)，將所述藥物施用給所述個(gè)體。在一個(gè)實(shí)施方案中，將細(xì)胞注入缺血性心肌層內(nèi)以治療心絞痛。
文檔編號C12N5/071GK102186970SQ200980139421
公開日2011年9月14日 申請日期2009年9月14日 優(yōu)先權(quán)日2008年9月12日
發(fā)明者P·R·薩柏格, N·霍斯尼, A·E·威林, A·因維蒂 申請人:克里奧普拉斯低溫生物有限公司, 圣保羅聯(lián)邦大學(xué), 南佛羅里達(dá)大學(xué)