專利名稱：：來自半片藻屬的脂肪酸脫飽和酶的利用的制作方法來自半片藻屬的脂肪酸脫飽和酶的利用對相關申請的引用本申請要求2008年10月14日提交的美國臨時申請NO.61/105，316的優(yōu)先權，通過引用將其完全合并在本文中。序列表的引入作為當前的公開的一部分的序列表包括標題為“M0NS219W0_ST25.txt”的36KB計算機可讀文件，其包含通過EFS-Web提交的本發(fā)明的核苷酸和/或氨基酸序列。序列表的內(nèi)容通過完全引用合并在本文中。
背景技術：
：1.發(fā)明領域本發(fā)明一般地涉及脫飽和酶，其調(diào)節(jié)長鏈多不飽和脂肪酸(LC-PUFA)中雙鍵的數(shù)量和位置。特別地，本發(fā)明涉及利用△5脫飽和酶和編碼這樣的脫飽和酶的核酸來改變脂肪酸分布。2.相關技術的說明在大多數(shù)生物體中脂肪酸生物合成的主要產(chǎn)物是16-碳和18-碳化合物。這些脂肪酸的鏈長度與不飽和度的相對比例在物種之中廣泛地變化。例如，哺乳動物主要產(chǎn)生飽和脂肪酸和單不飽和脂肪酸，而大多數(shù)高等植物生產(chǎn)具有一個、兩個或三個雙鍵的脂肪酸，后兩者包括多不飽和脂肪酸(PUFA)。兩種主要的PUFA家族是ω-3脂肪酸(也稱為“η_3”脂肪酸)，例子是二十碳五烯酸(ΕΡΑ，20:5，η-3)，以及ω-6脂肪酸(也稱為“η_6”脂肪酸)，例子是花生四烯酸(ARA，20:4,n-6)。PUFA是細胞的質(zhì)膜和脂肪組織的主要成分，在其中它們可以分別以磷脂和甘油三酯的形式存在。PUFA是哺乳動物中適當?shù)陌l(fā)育所必需的，特別是在嬰兒腦部的發(fā)育中，以及對于組織形成和修復是必需的?；ㄉ南┧崾穷惢ㄉ犷愇镔|(zhì)的合成的主要前體，類花生酸類物質(zhì)包括白細胞三烯、前列腺素和凝血噁烷，其也在炎癥過程中起到重要作用。幾種失調(diào)響應于脂肪酸的治療。補充PUFA已經(jīng)顯示了降低血管成形術后再狹窄的幾率。證據(jù)表明，PUFA可能涉及鈣代謝，表明PUFA可能在骨質(zhì)疏松癥的治療或預防以及腎臟或泌尿道結石的治療或預防中是有用的。健康效益的大部分證據(jù)適用于長鏈ω-3脂肪、二十碳五烯酸和二十二碳六烯酸(DHA，22:6，n-3)，它們在魚類和魚油中存在。PUFA，例如，亞油酸(LA,18:2,Δ9，12)和α-亞麻酸(ALA,18:3,Δ9，12，15)被認為是膳食中的必需脂肪酸，因為哺乳動物缺乏合成這些酸的能力。LA通過Δ12-脫飽和酶從油酸(0Α，18:1，Δ9)產(chǎn)生，而ALA通過Δ15-脫飽和酶從LA產(chǎn)生。然而，當攝食時，哺乳動物具有代謝LA和ALA以形成長鏈多不飽和脂肪酸(LC-PUFA)的η_6和η_3家族的能力。在哺乳動物中，LC-PUFA的形成由Δ6脫飽和的步驟限速，這個步驟將LA轉化成GLA，將ALA轉化成SDA。許多生理學和病理學的狀況已經(jīng)顯示了甚至進一步地降低這種代謝步驟，因而，降低LC-PUFA的產(chǎn)生。為了克服限速步驟和提高EPA的組織水平，人們可以消費大量的ALA。作為選擇，通過飲食補充EPA或DHA來繞過Δ6-脫飽和可以有效地減輕許多與低水平的PUFA相關的病理性疾病。然而，如以下更詳細地闡述的，PUFA的當前可用的來源不是理想的。主要的重要長鏈PUFA包括DHA和EPA，其主要在不同類型的魚油中存在，以及ARA，其在絲狀真菌例如被孢霉屬(Mortierella)中發(fā)現(xiàn)。對于DHA，存在著商業(yè)生產(chǎn)的許多來源，包括多種海洋生物、從冷水海洋魚類獲得的油、以及蛋黃級分。然而，從天然來源商業(yè)生產(chǎn)PUFA存在幾個缺點。PUFA的天然來源傾向于具有高度異質(zhì)的油組成。因而從這些來源獲得的油可能需要大量的純化來分離出一種或多種期望的PUFA，或來產(chǎn)生富集了一種或多種PUFA的油。其他天然的限制也希望獲得生產(chǎn)PUFA的新方法。天氣和疾病可以導致來自魚類和其他海洋來源的產(chǎn)量的變動。生物體例如被孢霉屬的大規(guī)模的發(fā)酵是昂貴的。天然的動物組織含有很低數(shù)量的ARA，并且難以被加工。發(fā)明概述本發(fā)明的一個方面提供了編碼多肽的分離的核酸，所述多肽能夠在碳5使脂肪酸分子脫飽和。這些核酸可以用于轉化細胞或修飾植物的脂肪酸組成或植物產(chǎn)生的油。本發(fā)明的某些實施方式提供了分離自具有獨特的脫飽和酶活性的半片藻屬物種(Hemiselmisspp.)的分離的多核苷酸序列。在本發(fā)明的某些進一步的實施方式中，所述多核苷酸編碼與SEQIDNO2或SEQIDNO4的多肽序列具有至少75%的序列同一性、包括與這些序列具有至少約80%、82%、85%、87%、90%、92%、95%、98%和99%同一性的多肽。本領域技術人員將認識到，由于這些序列是相關的，給定的序列可能同時與這些多肽序列的超過一種享有75%或更高的序列同一性。在某些實施方式中，本發(fā)明的半片藻屬物種的脫飽和酶進一步被限定為ω-3Δ5脫飽和酶(即，具有ω-3底物偏愛的脫飽和酶)。在另一個方面，本發(fā)明提供了編碼多肽的分離的多核苷酸，所述多肽具有在碳5使脂肪酸分子脫飽和的脫飽和酶活性，所述多核苷酸包含選自以下的序列(a)編碼SEQIDNO2或SEQIDNO4的多肽的多核苷酸；(b)包含SEQIDNO:1或SEQIDNO3的核酸序列的多核苷酸；(c)在5XSSC、50%甲酰胺和42°C的條件下與SEQIDNO:1或SEQIDNO3或其互補物雜交的多核苷酸；(d)編碼與SEQIDNO:2或SEQIDNO:4的多肽序列具有至少75%、85%、95%、98%或99%的序列同一性的多肽的多核苷酸；和e)編碼具有至少一種以下氨基酸基序的多肽的多核苷酸LeupheGlyGlyAsnAspValSerValGlnTyrArgMetIle(LFGGNDVSVQYRMI)(SEQIDNO:15)；IIeAlaIIeGlyMetSerGlnAlaSerIIeGlyLeuAsnValGln(IAIGMSQASIGLNVQ)(SEQIDNO:16)；GlyAlaAspMetlleGlyGlyCysLysTyrLeuTrpLeuGln(GADMIGGCKYLffLQ)(SEQIDNO:17)；AlaSerSerThrAspProPhePheLeuPheHisAspTyrGlyLys(ASSTDPFFLFHDYGK)(SEQIDNO:18)；LeuAlaMetTyrTrpAlaSerSerllePheAsnThrAsnValValThrLeuGlnHis(LAMYffASSIFNTNVVTLQH)(SEQIDNO19)；AsnSerTyrArgGluAlaHisArgProIIeSerIIe(NSYREAHRPISI)(SEQIDNO20)；HisValTrpThrMetAlaValSerGluSerLeuThr(HVffTMAVSESLT)(SEQIDNO21)；LeuAlalleProPheAlaLeuSerHisAsnPhe(LAIPFALSHNF)(SEQIDNO22)；或GlnProAlaValArgGluValCysLysLysHisGlyValAsnTyrVal(QPAVREVCKKHGVNYV)(SEQIDNO23)。在另一個方面，本發(fā)明提供了包含SEQIDNO2或SEQIDNO4的多肽序列或其片段、具有在碳5使脂肪酸分子脫飽和的脫飽和酶活性的分離的多肽。在又一個方面，本發(fā)明提供了包含分離的多核苷酸的DNA構建體，所述分離的多核苷酸編碼具有在碳5使脂肪酸分子脫飽和的脫飽和酶活性的多肽，所述DNA構建體包含選自以下的序列(a)編碼SEQIDNO:2或SEQIDNO4的多肽的多核苷酸；(b)包含SEQIDNO:1或SEQIDNO:3的核酸序列的多核苷酸；(c)在5XSSC、50%甲酰胺和42°C的條件下與SEQIDNO:1或SEQIDNO3或其互補物雜交的多核苷酸；和(d)編碼與SEQIDNO2或SEQID而4的多肽序列具有至少75%、85%、95%、98%或99%的序列同一性的多肽的多核苷酸。在進一步的實施方式中，所述DNA構建體進一步包含與如上所述的分離的多核苷酸可操作地連接的異源啟動子。在其他實施方式中，所述啟動子是在原核細胞或真核細胞中有功能的。在某些實施方式中，在其中啟動子有功能的真核細胞是植物細胞。在進一步的實施方式中，所述啟動子是種子增強的啟動子。種子增強的啟動子的實例包括，但不限于，USP88啟動子、7Sa啟動子、7Sa’啟動子、Arcelin-5啟動子、napin啟動子和油質(zhì)蛋白啟動子。在又一個實施方式中，所述DNA構建體進一步包含編碼脂肪酸延伸酶(elongase)的至少一種其他的多核苷酸序列。在再又一個方面中，本發(fā)明提供了用包含分離的多核苷酸的DNA構建體轉化的宿主細胞，所述分離的多核苷酸編碼本發(fā)明提供的具有在碳5使脂肪酸分子脫飽和的脫飽和酶活性的多肽。所述宿主細胞可以是植物、動物、真菌或細菌細胞。在進一步的實施方式中，本發(fā)明的宿主細胞提供了相對于與所述宿主細胞相同基因型、但是缺乏所述DNA構建體的細胞展現(xiàn)了改變的脂肪酸生物合成的宿主細胞。例如，本發(fā)明的轉化的宿主細胞可以包含相對于AA含量提高的EPA水平，例如，為AA的約2或約3倍的EPA。在又一個方面中，所述宿主細胞從所述細胞的祖代遺傳了所述DNA構建體。在再又一個方面中，本發(fā)明提供了植物和它的子代，其包含用本發(fā)明的DNA構建體轉化的宿主細胞。這樣的植物可以被限定為，相對于缺乏所述DNA構建體的相同基因型的植物，包含改變的脂肪酸新陳代謝。在一個實施方式中，本發(fā)明提供了包含ω-3Δ5脫飽和酶(即，具有ω-3底物偏愛的脫飽和酶)的轉基因植物或其部分。在又一個方面中，這樣的植物可以進一步包含至少一種編碼脂肪酸延伸酶的其他的多核苷酸序列。在一個實施方式中，所述植物選自芥花(canola)、菜苔(Brassicacampestris)、含油種子油菜(oilseedrape)、油菜籽、大豆、海甘藍、芥菜、蓖麻子、花生、芝麻、棉籽、亞麻子、紅花、油棕、亞麻、葵花、玉米、水稻、大麥、粟、黑麥、小麥、燕麥、苜蓿和高粱。本發(fā)明還提供了本發(fā)明的植物的種子，例如，相對于不包含本發(fā)明的DNA構建體的種子、具有改變的脂肪酸含量的種子。例如，本發(fā)明的種子可以包含相對于AA含量提高的EPA水平，例如，為AA的約2或約3倍的EPA。在更進一步的方面中，提供了包含多核苷酸分子的轉化的細胞、轉基因植物或其部分，所述多核苷酸分子編碼本發(fā)明的Δ5脫飽和酶，并可操作地連接到異源啟動子和編碼脂肪酸延伸酶或脫飽和酶的至少一種其他的多核苷酸分子。在某些實施方式中，所述其他的脂肪酸延伸酶或脫飽和酶可以是Δ6脫飽和酶、Δ6延伸酶(例如，高山被孢霉(Mortierellaalpina)Δ6延伸酶)、Δ18延伸酶、Δ15脫飽和酶、Δ9延伸酶、Δ8脫飽和酶、Δ17脫飽和酶(例如，異枝水霉(Saprolegniadiclina)Δ17脫飽和酶)、Δ4脫飽和酶和/或C20延伸酶。例如，Δ15脫飽和酶可以是構巢曲霉(Aspergillusnidulans)Δ15脫飽和酶、串珠鐮刀菌(Fusariummoniliforme)Δ12/Δ15脫飽和酶、擬南芥(Arabidopsis讓￡11化11￡1)八15脫飽和酶或高山被孢霉八15脫飽和酶。在某些實施方式中，Δ6脫飽和酶可以是ω-6特異性Δ6脫飽和酶(例如，亞心形扁藻(T.suecica)Δ6脫飽和酶，或高山被孢霉Δ6脫飽和酶)或ω-3特異性Δ6脫飽和酶(例如，九萊報春(Primulajuliae)Δ6脫飽和酶)。Δ9延伸酶的某些實例包括，但不限于，纖細裸藻(Euglenagracilis)Δ9延伸酶和球等鞭金藻(Isochrysisgalbana)Δ9延伸酶。在某些實施方式中，Δ8脫飽和酶可以是TetriKipretiapomquetensisΔ8脫飽和酶或纖細裸藻Δ8脫飽和酶。在再進一步的實施方式中，所述其他脂肪酸延伸酶或脫飽和酶可操作地連接到種子增強啟動子。在又進一步的方面中，本發(fā)明提供了提高宿主細胞或植物中的EPA的方法。在一個實施方式中，提高EPA含量的方法包括在宿主細胞或植物中表達根據(jù)本發(fā)明的Δ5脫飽和酶和Δ6脫飽和酶(例如，ω-3特異性Δ6脫飽和酶)。在進一步的實施方式中，提高EPA含量的方法進一步涉及在宿主細胞或植物中表達Δ15脫飽和酶。在另一個實施方式中，提高植物中EPA含量的方法包括在宿主細胞或植物中表達根據(jù)本發(fā)明的Δ5脫飽和酶、Δ9延伸酶、Δ8脫飽和酶，以及Δ15脫飽和酶或Δ17脫飽和酶之一。在再又一個方面中，本發(fā)明提供了生產(chǎn)商業(yè)產(chǎn)品例如食物或飼料的方法，包括步驟(a)獲得本發(fā)明的轉基因植物；和(b)從該轉基因植物的組織、種子、果實和/或油生產(chǎn)商業(yè)產(chǎn)品。例如，所述商業(yè)產(chǎn)品可以是食物或飼料組合物，例如油、青貯飼料、粗粉、谷粒、淀粉、細粉或蛋白質(zhì)。食物或飼料組合物被限定為包含本發(fā)明提供的可檢測的多核苷酸序列或可檢測的多肽。另外，本發(fā)明提供了包含EPA、ARA或DHA的動物飼料和人類食品組合物(參見附圖4)。在再又一個方面中，本發(fā)明提供了提高用于人類或動物消費的可食用產(chǎn)品的營養(yǎng)價值的方法，包括向可食用產(chǎn)品添加本發(fā)明提供的轉化的植物或植物部分或其衍生物。在某些實施方式中，所述產(chǎn)品是人類和/或動物食品。所述可食用產(chǎn)品還可以是動物飼料和/或食品增補劑。在再又一個方面，本發(fā)明提供了制造食物或飼料的方法，包括向起始的食物或飼料成分添加本發(fā)明提供的轉化的植物或植物部分或其衍生物來生產(chǎn)所述食物或飼料。在某些實施方式中，所述方法進一步限定為制造食物和/或飼料的方法。本發(fā)明還提供通過所述方法制得的食物或飼料。附圖的簡要說明以下附圖形成了本說明書的部分，被包括在內(nèi)以進一步說明本發(fā)明的某些方面。通過參考一個或多個這些附圖并結合在此呈現(xiàn)的具體實施方式的詳細說明，可以更好地理解本發(fā)明。附圖1說明了來自HemiselmisrufescensHrD5D(SEQIDNO:4)、HemiselmisvirescensHvD5D(SEQIDNO:2)、畸雌腐霉(Pythiumirregulare)PiD5D(SEQIDN0:10)、高山被孢霉DOT(SEQIDNO:11)、假微型海鏈藻(Thalassiosirapseudonana)TpD5D(SEQIDNO:13)、多甲藻屬物種(Peridiniumsp.)CCMP626PD5D(SEQIDNO:14)的D5脫飽和酶和來自高山被孢霉D6D(SEQIDNO12)的D6脫飽和酶的氨基酸比對。附圖2說明了質(zhì)粒載體pM0N67056的圖譜。附圖3說明了質(zhì)粒載體pM0N104220的圖譜。附圖4數(shù)目了PUFA生物合成的路徑圖。發(fā)明的詳細說明本發(fā)明通過提供方法和組合物用于創(chuàng)造具有增強的PUFA含量的植物來克服了現(xiàn)有技術的限制。生物體例如植物的脂肪酸含量的修飾具有許多優(yōu)點，包括對于人類和/或動物消費的改善的營養(yǎng)和健康效益。脂肪酸含量的修飾可以用于實現(xiàn)植物、植物部分和植物產(chǎn)品(包括植物種子油)中期望的PUFA的有益水平或分布。例如，當期望的PUFA在植物的種子組織中產(chǎn)生時，所述油可以從種子中分離，一般產(chǎn)生期望的PUFA方面很高的油或具有期望的脂肪酸含量或分布的油，其隨后可以用于提供食物和其他產(chǎn)品中的有益特征。本發(fā)明的各種方面包括用于細胞的PUFA含量的修飾(例如，植物細胞的PUFA含量的修飾)的方法和組合物。與本發(fā)明相關的組合物包括新的分離的多核苷酸序列、多核苷酸構建體，和通過本發(fā)明的多核苷酸轉化的植物和/或植物部分。根據(jù)本發(fā)明，分離的多核苷酸可以編碼半片藻屬物種D5脫飽和酶。宿主細胞可以被操縱來表達編碼Δ5脫飽和酶多肽的多核苷酸，所述多肽催化脂肪酸的脫飽和。提供了以下定義作為對理解本發(fā)明的幫助。用語“DNA序列”、“核酸序列”、“核酸分子”、“多核苷酸”和“核酸片段”是指包含核苷酸的有序排列的物理結構。DNA片段、序列或核苷酸序列可以含有在較大核苷酸分子、載體等等之內(nèi)。此外，在這些序列中核酸的有序排列可以以序列表、附圖、表格、電子媒體等等的形式描繪。用語“編碼序列”、“編碼區(qū)”、“結構序列”和“結構核酸序列”是指其中核苷酸以各自形成密碼子的一系列三聯(lián)體排列的DNA序列、核酸序列、核酸分子的全部或片段。每個密碼子編碼特定的氨基酸。因而，編碼序列、編碼區(qū)、結構序列和結構核酸序列編碼形成蛋白、多肽、基序或肽序列的一系列氨基酸。編碼序列、編碼區(qū)、結構序列和結構核酸序列可以含有在較大的核酸分子、載體等等之內(nèi)。此外，在這些序列中核苷酸的排列可以以序列表、附圖、表格、電子媒體等等的形式描繪。術語“cDNA”是指互補于并來自mRNA的雙鏈DNA?！懊擄柡兔浮笔侵敢环N多肽，其可以脫飽和或催化一個或更多個脂肪酸的連續(xù)的碳之間雙鍵的形成，來產(chǎn)生單-或多-不飽和脂肪酸或其前體。特別感興趣的是可以通過在自脂肪酸的羧基端第5個碳之處脫飽和來催化DGLA向ARA或ETA向EPA的轉化的多肽。選擇具有脫飽和酶活性的特定多肽的考慮包括，但不限于，多肽的最佳PH值，多肽是否是限速酶或其部分，使用的脫飽和酶對于理想的PUFA的合成是否是必需的，和/或所述多肽是否需要輔助因子。表達的多肽優(yōu)選地具有與它在宿主細胞中的位置的生物化學環(huán)境相容的特征。例如，所述多肽可以不得不競爭底物。“延伸酶”是指一種多肽，其通過向脂肪酸的羧酸末端添加兩個碳原子來延長脂肪酸。選擇具有延伸酶活性的特定多肽的考慮包括，但不限于，多肽的最佳PH值，多肽是否是限速酶或其部分，使用的延伸酶是否是期望的PUFA的合成所必需的，和/或所述多肽是否需要輔助因子。表達的多肽優(yōu)選地具有與它在宿主細胞中的位置的生物化學環(huán)境相容的特征。例如，所述多肽可以不得不競爭底物?！氨磉_”是指一種過程，基因的編碼信息通過它被轉變?yōu)樵诩毎写嬖诓⑦\作的結構。表達的基因包括被轉錄成RNA、然后被翻譯成蛋白質(zhì)的那些，以及被轉錄成RNA但不翻譯成蛋白質(zhì)的那些(例如，轉運RNA和核糖體RNA)。如在此使用的，“基因”是指表達特定蛋白質(zhì)的核酸片段，包括在編碼序列之前(5’非編碼序列)和之后(3’非編碼序列)的調(diào)節(jié)序列?！疤烊换颉笔侵冈谧匀恢写嬖诘摹⒕哂衅渥陨淼恼{(diào)節(jié)序列的基因?！扒逗匣颉笔侵钙洳皇翘烊换虻娜魏位?，包含在自然中不在一起存在的調(diào)節(jié)和編碼序列。因而，嵌合基因可以包含來自不同來源的調(diào)節(jié)序列和編碼序列，或來自相同來源但以不同于自然中存在的方式排列的調(diào)節(jié)序列和編碼序列。“內(nèi)源”基因是指在生物體的基因組中在其自然位置的天然基因。“外源”基因或“轉基因”是指通過轉化過程導入到基因組中的基因。轉基因包括通過轉化過程導入的基因組DNA(例如，與其活性啟動子連接的基因組DNA)?！爱愒础笔侵竵碜圆煌瑏碓吹?或多種核酸或蛋白序列之間的關系。例如，如果這樣的組合不是自然中通常存在的，啟動子對于編碼序列是異源的。此外，如果在特定的細胞或生物體中不會天然發(fā)生，特定的核酸序列對于它所插入的細胞或生物體可以是“異源的”?！靶蛄邢嗨菩浴笔侵冈趦蓚€或更多核酸或氨基酸序列之間就位置同一性的百分比而言的相似性水平。術語“同源性”被用于指出不同的核酸或蛋白質(zhì)之間，例如，由于共有的進化起源，相似的功能性質(zhì)的概念。“雜交”是指當核酸鏈具有充分的序列互補性時核酸的第一鏈與第二鏈經(jīng)由氫鍵堿基配對結合的能力。如在此使用的，如果核酸分子顯示出完全的互補性，則稱核酸分子是另一個核酸分子的“互補物”。如此處使用的，當一個分子的每一個核苷酸與另一個分子的核苷酸互補時，稱為分子顯示出“完全的互補性”。因而，當它們的相互雜交具有足夠的穩(wěn)定性以允許它們在合適的條件下保持相互的退火時，稱兩個核酸鏈具有充分的互補性。術語“雜交”一般涉及核酸分子通過互補堿基鏈配對來接合的能力。當核酸分子在合適的條件下接觸時，可以發(fā)生這樣的雜交。“特異性雜交”是指兩個核酸分子形成反平行的、雙鏈的核酸結構的能力。如果核酸分子展現(xiàn)了“完全的互補性”，即一個分子中的每個核苷酸與另一個分子中它的堿基配對配體核苷酸互補，核酸分子被稱作是另一個核酸分子的“互補物”。如果它們的相互雜交具有足夠的穩(wěn)定性以允許它們在至少常規(guī)的“低嚴格”條件下保持相互的退火，稱兩個分子是“最低度互補的”。類似地，如果分子的相互雜交具有足夠的穩(wěn)定性以允許它們在常規(guī)的“高嚴格”條件下保持相互的退火，稱所述分子是“互補的”?！半s交嚴格度”是指核酸分子之間氫鍵鍵合的條件?！案邍栏瘛睏l件耐受核酸和目標鏈之間很小的錯配。這樣的條件是本領域技術人員公知的，優(yōu)選的用于需要高度選擇性的應用。中度嚴格條件可以包括相對低的鹽和/或相對高溫度的條件，例如，由約IXSSC和65°C提供的。高嚴格度可以是例如定義為0.02M到0.IOMNaCl和50°C到70°C；5XSSC,50%甲酰胺和42°C；或0.2XSSC和65°C。這樣的條件的具體實例包括0.02MNaCl和50°C；0.02MNaCl和60°C；以及0.02MNaCl和70°C。與其他核酸分子雜交的核酸分子(例如，至少在低嚴格條件下)，被稱為是另一個核酸分子的“可雜交的同類”。在此和由Sambrook等人(MolecularCloning:ALaboratoryManual2ndEd.,ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)(在此稱為Sambrook等人，1989))以及由Haymes等人，1985描述了常規(guī)的低嚴格和高嚴格條件。因而從完全互補的偏離是可允許的，只要這種偏離沒有完全地排除了分子形成雙鏈結構的能力。用語“分離的”意指已經(jīng)從其自然環(huán)境移除，不考慮它的最終分布。例如，“分離”自水稻的核酸序列，例如通過從水稻細胞克隆，當被插入到玉米細胞的基因組時保持了“分離的”。用語“可操作地連接”是指兩種或多種核酸區(qū)域或核酸序列的空間排列，從而它們發(fā)揮它們相互的合適效果。例如，啟動子區(qū)域可以相對于核酸序列放置，從而所述核酸序列的轉錄被所述啟動子區(qū)域指導。啟動子區(qū)域和核酸序列是“可操作地連接的”?！吧嫌?，，和“下游，，是對于核苷酸序列的位置以及編碼序列的轉錄或翻譯方向所使用的位置術語，其通常在5’到3’方向上進行。術語“啟動子”或“啟動子區(qū)域”是指核酸序列，通常存在于編碼序列的上游(5’)，其能夠指導核酸序列成為RNA分子的轉錄。啟動子或啟動子區(qū)域一般提供了RNA聚合酶的識別位點以及適當?shù)霓D錄起始所必需的其他因素。如在此期待的，啟動子或啟動子區(qū)域包括通過插入或刪除調(diào)節(jié)區(qū)、使啟動子經(jīng)歷隨機或定點誘變等等所衍生的啟動子變體。啟動子的活性或強度可以通過就它產(chǎn)生的RNA數(shù)量、或在細胞或組織中積累的蛋白質(zhì)數(shù)量，相對于類似地測量的第二啟動子來定量。用語“3’非編碼序列”是指位于編碼序列的下游的核苷酸序列，包括多聚腺苷酸化識別序列和編碼能夠影響mRNA加工或基因表達的調(diào)節(jié)信號其他序列。這些通常被稱為3’非翻譯區(qū)域或3’-UTR。多腺苷酸化信號通常以影響多聚腺苷酸束向mRNA前體的3’末端的添加為特征。不同的3’非編碼序列的用途由Ingelbrecht等人(1989)例證?！胺g前導序列”或“5’非翻譯區(qū)”或“5’UTR”都是指位于基因的啟動子序列和編碼序列之間的核苷酸序列。5’-UTR存在于翻譯起始序列上游的完整加工的mRNA中。5’-UTR可以影響向mRNA的主要轉錄本的加工、mRNA穩(wěn)定性或翻譯效力。已經(jīng)描述了翻譯前導序列的實例(Turner和Foster,1995)。"RNA轉錄本”是指由RNA聚合酶催化的DNA序列轉錄產(chǎn)生的產(chǎn)物。當RNA轉錄本是DNA序列的理想互補拷貝時，它被稱為原始轉錄本。來自原始轉錄本的轉錄后加工的RNA序列被稱為成熟RNA。“信使RNA”(mRNA)是指沒有內(nèi)含子并且可以被細胞翻譯成多肽的RNA。"DNA構建體”是指相互可操作地連接的、構成重組DNA分子的異源遺傳元件，可以包含提供DNA多核苷酸分子在宿主細胞中表達的元件，以及提供維持構建體的元件。植物表達盒包含遺傳元件的可操作的連接，當轉移到植物細胞中時提供期望的基因產(chǎn)物的表達?！爸亟M載體”是指這樣的任何試劑，通過它或在它之中，目標核酸被擴增、表達或保存，例如質(zhì)粒、粘粒、病毒、自主復制序列、噬菌體或線性單鏈的、環(huán)形單鏈的、線性雙鏈的或環(huán)形雙鏈的DNA或RNA核苷酸序列。重組載體可以被合成，或來自于任何來源，并能夠基因組整合或自主復制?！罢{(diào)節(jié)序列”是指位于編碼序列或內(nèi)含子的上游(5’)、之中或下游(3’)的核苷酸序列，它的存在或缺乏影響所述編碼序列的轉錄和表達?！盎旧贤吹摹笔侵冈谛蛄猩现辽偌s90%相同的兩個序列，如通過例如DNAStar(DNAStar，Madison,ffl)中的CLUSTALW算法所測量的?！盎旧霞兓摹笔侵笍脑谄涮烊粻顟B(tài)通常與其相關的基本上所有其他分子分離的分子。更優(yōu)選的，基本上純化的分子是在制品中存在的優(yōu)勢種類。基本上純化的分子可以是大于約60%地沒有、優(yōu)選的約75%地沒有、更優(yōu)選的約90%地沒有、以及最優(yōu)選的約95%地沒有天然混合物中存在的其他分子(不包括溶劑)。用語“基本上純化的”不意圖涵蓋以它們的天然狀態(tài)存在的分子。優(yōu)選的，本發(fā)明的核酸分子和多肽是基本上純化的。術語“轉化”是指核酸導入接受者宿主中。術語“宿主”是指細菌細胞、真菌、動物或動物細胞、植物或種子、或任何植物部分或組織，包括植物細胞、原生質(zhì)體、愈傷組織、根、塊莖、種子、莖、葉、幼苗、胚芽和花粉。如在此使用的，“轉基因植物”是具有被穩(wěn)定導入其基因組，例如核或質(zhì)體基因組中的外源核酸的植物。術語“同基因的”作為具有或缺乏轉基因的植物或植物系之間的比較性術語，是指除了所討論的轉基因之外植物或株系具有相同或相似的遺傳背景。例如，代表來自相同親本F2群體的表型相似或相同選集的所謂的姐妹系被認為是“同基因的”。當使用未轉化的親本作為回交親本、使穩(wěn)定的轉化植物的子代與未轉化的親本株系雜交或回交3至6代(或更多代)，同時針對類型(通過分子標記物分析的基因型，或通過田間觀察的表型，或兩種)和轉基因來選擇時，產(chǎn)生的轉基因株系被認為是與其未轉化的親本系是高度“同基因的”。術語“種子”、“籽?！焙汀肮攘！北焕斫鉃樵诤x上是等價。術語籽粒通常用于描述玉米或水稻植物的種子。在所有植物中，種子是由種皮、胚芽、糊粉和胚乳組成的成熟的胚珠。編碼Δ5脫飽和酶的核酸在一個實施方式中，本發(fā)明提供了編碼來自半片藻屬物種的Δ5脫飽和酶的新的核酸。在特定的實施方式中，所述核酸分離自Hemiselmisvirescens.株CCMP442和Hemiselmisrufescens株CCMP439(可從CCMP，海洋浮游植物培養(yǎng)中心；WestBoothbayHarbor,Maine,USA獲得)。在某些實施方式中，所述核酸包含SEQIDNO:1或3。本發(fā)明還提供了使用這樣的核酸(包括SEQIDN0:1和3)的方法。在一個實施方式中，這些核酸分子在本發(fā)明的環(huán)境中被用于改變來自植物的種子中的油組成。這些核酸分子可以使用cDNA、mRNA或基因組DNA作為模板和合適的寡核苷酸引物根據(jù)標準PCR擴增技術來擴增。作為選擇，它們可以使用標準的合成技術，例如自動化的DNA合成儀來合成。編碼期望的Δ5脫飽和酶的多核苷酸可以以多種方式鑒定。舉例來說，期望的Δ5脫飽和酶的來源，例如，來自半片藻屬物種的文庫，用可檢測的酶或化學合成的探針來篩選，所述探針可以從DNA、RNA或非天然發(fā)生的核苷酸，或其混合物制成。探針可以從已知的Δ5脫飽和酶的多核苷酸酶合成，用于正常的或降低嚴格度的雜交方法。寡核苷酸探針還可以用于篩選來源，并可以基于已知的△5脫飽和酶的序列(包括在已知的Δ脫飽和酶之中保守的序列)或基于獲自期望的純化的蛋白質(zhì)的肽序列?；诎被嵝蛄械墓押塑账崽结樋梢允呛啿⒌模院w遺傳密碼的簡并性，或可以是對于來源生物體中優(yōu)選的密碼子偏愛性的。寡核苷酸還可以用作引物用于來自已知或疑似來源的逆轉錄的mRNA的PCR;PCR產(chǎn)物可以是全長的cDNA，或可以用于產(chǎn)生探針來獲得期望的全長cDNA。作為選擇，期望的蛋白質(zhì)可以被完全測序，進行編碼該多肽的DNA的完全合成。一旦分離了期望的基因組或cDNA，可以通過已知的方法來測序。本領域公認的是，這樣的方法具有誤差，因而同一區(qū)域的多次測序是常規(guī)的，并且仍然預計在產(chǎn)生的推定序列中產(chǎn)生可測量的錯誤率，特別是在具有重復結構域、廣泛的二級結構或異常堿基組成的區(qū)域中，例如，具有高GC堿基含量的區(qū)域。當偏差出現(xiàn)時，可以進行重新測序，可以采用專門的方法。專門方法可以包括通過利用如下方式來改變測序條件不同溫度；不同的酶；改變寡核苷酸形成更高級結構的能力的蛋白質(zhì)；改變的核苷酸，例如ITP或甲基化的dGTP；不同的凝膠組成，例如，添加甲酰胺；不同的引物或位于與問題區(qū)域不同距離處的引物；或不同的模板，例如單鏈DNA。也可以采用mRNA的測序。如果希望，編碼Δ5脫飽和酶的核酸的序列可以被修飾而不改變表達的蛋白質(zhì)的最終氨基酸序列，使得所述序列在植物宿主或其他宿主細胞中更易于表達。編碼序列可以是人工的DNA。如在此使用的人工DNA是指非天然發(fā)生的DNA多核苷酸分子。人工DNA分子可以通過各種方法來設計，例如，基于取代第一多核苷酸的密碼子來產(chǎn)生等效的、乃至改進的第二代人工多核苷酸的本領域中已知的方法，其中這種新的人工多核苷酸對于轉基因植物中增強的表達是有用的。設計方面通常采用密碼子使用頻率表(codonusagetable),該表格通過編選分離自植物、植物型、科或?qū)俚木幋a序列集合中密碼子出現(xiàn)頻率來產(chǎn)生。其他設計方案包括降低多腺苷酸化信號、內(nèi)含子剪接位點、或序列的長的AT或GC延伸的出現(xiàn)(美國專利5，500,365)。全長編碼序列或其片段可以使用本領域技術人員已知的方法從人工DNA產(chǎn)生。維持此處期待的功能的、在此公開的核苷酸序列或調(diào)節(jié)元件的修飾處在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。這樣的修飾包括插入、取代和刪除，特別是反映遺傳密碼的簡并性的取代。發(fā)明人分離了產(chǎn)生具有Δ5脫飽和酶活性的多肽、來自半片藻屬物種的DNA序列。編碼Δ5脫飽和酶的序列可以在轉基因植物、微生物或動物中表達來修飾脂肪酸含量。也可以使用基本上相同于在此提供的△5脫飽和酶多核苷酸其他多核苷酸、或編碼基本上相同于△5脫飽和酶多肽的多肽的其他多核苷酸?！盎旧舷嗤凇笔侵赴被嵝蛄谢蚝怂嵝蛄姓宫F(xiàn)了按照遞增的優(yōu)先度的、與SEQIDN0:2、SEQIDNO:4中的Δ5脫飽和酶多肽序列、或編碼這些多肽的序列的至少75%、80%、82%、85%、87%、90%、92%、95%、98或99%的同一性。多肽或多核苷酸比較可以利用序列分析軟件進行，例如，GCGWisconsinPackage的序列分析軟件包(Accelrys，SanDiego,CA)和MEGAlign(DNAStar，Inc.，1228S.ParkSt.，Madison,Wis.53715)。這樣的軟件通過指定相似性或同一性的程度來匹配相似的序列。DNA構建體本發(fā)明提供了DNA構建體，其包含與此處描述的核酸可操作地連接的異源啟動子。啟動子的選擇，例如，可被描述為強表達、弱表達、可誘導表達、組織增強表達(即，在組織中特異地或優(yōu)先地表達)、器官增強表達(即，在器官中特異地或優(yōu)先地表達)和發(fā)育增強表達(即，在發(fā)育的特定階段特異地或優(yōu)先地表達)的啟動子，是在本領域技術人員的能力范圍內(nèi)。類似地，如上所述的核酸分子與啟動子的組合也在本領域技術人員能力范圍內(nèi)(參見，例如Sambrook等人，2001)。用于本發(fā)明的啟動子包括但不限于，在細菌、噬菌體、真菌或植物細胞中有功能的啟動子。用于細菌表達的有用啟動子有l(wèi)acZ、Sp6、T7、Τ5或大腸桿菌glgC啟動子。對真菌有用的啟動子包括釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)gall(West等人，1984)、裂殖性酵母菌(Saccharomycespombe)nmtl(Maundrell，1990)、粗糙鏈孢菌(Neurosporacrassa)ccg-1(Freitag禾口Selker,2005)和甲醇畢赤酵母(Pichiamethanolica)AUGl(Invitrogen)0對植物細胞有用的啟動子包括Y玉米醇溶蛋白(gammazein)Z27啟動子(參見，例如，PremDas等人，1991)、L3油質(zhì)蛋白(oleosin)啟動子(美國專利No.6，433，252，Kriz等人)、大麥PERl啟動子(Stacey等人，1996)、CaMV35S啟動子(美國專利No.5，530，196(Fraley等人))、nos啟動子(Ebert等人，1987)、水稻肌動蛋白啟動子(美國專利No.5,641,876)和PEPCase啟動子(Hudspeth等人，1989)。玄參花葉病毒(FMV)啟動子(美國專利N0.6，051，753(Comai等人))、arcelin、番茄E8、patatin、遍在蛋白、甘露堿合酶(mas)和微管蛋白啟動子是有用啟動子的其他實例。存在著各種各樣的植物啟動子序列，其可以用于驅(qū)動編碼Δ5脫飽和酶和其他脫飽和酶的多核苷酸在轉基因植物中的組織特異性表達。實際上，在本發(fā)明的特定實施方式中，使用的啟動子是種子增強啟動子。這樣的啟動子的實例包括來自這樣的基因的5’調(diào)節(jié)區(qū)域，如napin(Kridl等人，1991)、菜豆蛋白(Bustos等人，1989)、大豆β-伴球蛋白的α，亞基(P-Gm7Sα，，參見，例如，Chen等人，1986)、蠶豆(Viciafaba)USP(P-Vf.Usp，參見，例如，美國專利公開20030229918的SEQIDNO:1、2和3)、球蛋白啟動子(參見，例如Belanger和Kriz，1991)和大豆β-伴球蛋白的α亞基(7Sa)(美國專利公開20030093828，通過引用來合并)。已知在玉米中和在其他植物中起作用的其他種子表達增強啟動子包括以下基因的啟動子Waxy(微粒結合的淀粉合酶)、Brittle和Shrunken2(ADP葡萄糖焦磷酸化酶)、Shrunken1(蔗糖合酶)、分支酶I和II、淀粉合成酶、脫支酶、油質(zhì)蛋白、谷蛋白和Betll(基礎胚乳轉移層)。本領域技術人員已知的在本發(fā)明的實踐中有用的其他啟動子也是本發(fā)明預期的。此外，轉錄增強子或增強子的復制可以用于提高來自特定啟動子的表達。這種增強子的實例包括但不限于Adh內(nèi)含子1(Callis等人，1987)、水稻肌動蛋白內(nèi)含子(McElroy等人，1991，U.S.PatentNo.5，641，876)、蔗糖合酶內(nèi)含子(Vasil等人，1989)、玉米HSP70內(nèi)含子(也稱為Zm.DnaK)(美國專利5，424，412，Brown等人)TMVco元件(Gallie等人，1999)、CaMV35S增強子(美國專利5，359，142&5，196，525，McPherson等人)或章魚堿合成酶增強子(美國專利5，290，924，Last等人)。由于轉錄起始位點和編碼序列的起點之間的DNA序列(即，非翻譯的前導序列)可以影響基因表達，人們也可以希望采用特定的前導序列。可以采用本領域技術人員可獲得的任何前導序列。優(yōu)選的前導序列指導連接的基因的最佳表達水平，例如，通過提高或維持mRNA穩(wěn)定性和/或通過防止不適當?shù)姆g起始(Joshi,1987)。這種序列的選擇處于本領域技術人員的處理能力之內(nèi)。本發(fā)明的DNA構建體可以包括靠近所述盒的3’末端的序列，其充當信號來終止異源核酸的轉錄，并指導產(chǎn)生的mRNA的多聚腺苷酸化。這些通常被稱為3’非翻譯區(qū)域或3’-UTR。一些可以作為轉錄終止信號的3’元件包括來自以下的那些，根癌土壤桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)的胭脂堿合成酶基因(nos)(Bevan等人，1983)、napin3，非翻譯區(qū)(Kridl等人，1991)、球蛋白3，非翻譯區(qū)(Belanger和Kriz，1991)、來自大豆的Adrl2基因的3’非翻譯區(qū)(生長素減量調(diào)節(jié)的)(Wang等人，PCTPublicationW0200250295)或來自玉米醇溶蛋白基因的，例如Z27(Lopes等人，1995)。本領域已知的其他3’調(diào)節(jié)元件也可以用于本發(fā)明的載體中。此處描述的核酸分子可以被克隆到任何適合的載體中，并可以用于轉化或轉染任何適合的宿主。載體的選擇和構建它們的方法是本領域熟知的，在技術文獻中一般地描述了(一般參見，RecombinantDNAPartD;Meth.Enzymol.1531-622，1987)。所述載體將優(yōu)選地包含調(diào)節(jié)序列，例如轉錄和翻譯起始密碼子以及終止密碼子，其特異于載體將要導入其中的宿主類型(例如，細菌、真菌或植物)，視情況地并考慮該載體是DNA還是RNA。可以制備環(huán)形或線形的載體，含有連接到在原核或真核宿主細胞中有功能的復制系統(tǒng)的如上所述的完整核酸序列或其部分。復制系統(tǒng)可以來自ColEl、2my質(zhì)粒、λ噬菌體，Π絲狀噬菌體、土壤桿菌屬物種(例如，農(nóng)桿菌(A.tumefaciens)和發(fā)根植物單胞菌(A.rhizogenes))等等。除了復制系統(tǒng)和插入的核酸序列之外，所述載體可以包括容許選擇轉化或轉染的宿主的一種或多種標記基因。標記基因包括殺生體抗性(例如對抗生素、重金屬、除草劑等等的抗性)、營養(yǎng)缺陷的宿主中的互補物來提供原養(yǎng)，等等。本發(fā)明提供了包含任選地以載體形式的此處描述的核酸分子的宿主細胞。適合的宿主包括植物、細菌和真菌細胞，包括大腸桿菌、枯草芽胞桿菌(Bacillussubtilis)、根癌土壤桿菌、釀酒酵母和粗糙鏈孢霉。大腸桿菌宿主包括TB-1、TG-2、DH5α、XL-BlueMRF，(Stratagene,Austin,TX)、SA2821、Y1090和TG02。植物細胞包括但不限于，大豆、菜苔、芥花、含油種子油菜、油菜籽、海甘藍、芥菜、蓖麻子、花生、芝麻、棉籽、亞麻子、紅花、油棕、亞麻、葵花、苜蓿、玉米、小麥、大麥、燕麥、黑麥、粟、高粱和水稻。宿主細胞中的表達可以以短暫的或穩(wěn)定的方式實現(xiàn)。短暫的表達可以從導入的構建體發(fā)生，所述構建體含有在宿主細胞中有功能的表達信號，但是所述構建體不能復制和很少整合到宿主細胞中，或其中所述宿主細胞不能增殖。短暫的表達還可以通過誘導與感興趣的基因可操作地連接的可調(diào)節(jié)的啟動子的活性來實現(xiàn)，雖然這樣的可誘導系統(tǒng)常常展現(xiàn)低基礎水平的表達。穩(wěn)定的表達可以通過可以整合到宿主基因組中或在宿主細胞中自主復制的構建體的導入來實現(xiàn)。感興趣基因的穩(wěn)定表達可以通過使用位于表達構建體上或用表達構建體轉染的選擇性標記、隨后選擇表達所述標記的細胞來選擇。當穩(wěn)定的表達來自整合時，構建體的整合可以在宿主基因組內(nèi)隨機地發(fā)生，或可以通過使用含有與宿主基因組同源的區(qū)域的構建體被靶向，其足以將重組靶向宿主基因座。當構建體被靶向內(nèi)源基因座時，全部或某些轉錄和翻譯調(diào)節(jié)區(qū)域可以由內(nèi)源基因座提供。宿主細胞中的表達可以涉及本領域技術人員已知的發(fā)酵技術。發(fā)酵的宿主細胞可以是原核生物(例如，大腸桿菌)、或真核生物(例如，酵母菌釀酒酵母或粗糙鏈孢霉)、絲狀真菌。通過發(fā)酵生產(chǎn)PUFA的實例包括被孢霉屬(美國專利6，319，698)和Thraustrochytriales(美國專利6，451，567)。期待的是，通過使用游離的或整合的表達載體，超過一種基因可以被導入宿主細胞中并在宿主細胞中增殖。當兩種或更多種基因從獨立的復制載體表達時，期望的是每個載體具有不同的復制方式。每個導入的構建體，無論是否是整合的，應當具有不同的選擇方式，并且應當缺乏與另一個構建體的同源性，以維持穩(wěn)定的表達和防止構建體之間元件的重配。導入的構建體的調(diào)節(jié)區(qū)域、選擇方式和增殖方法的明智選擇可以實驗地確定，從而所有導入的多核苷酸以必需的水平表達以提供期望的產(chǎn)物的合成。多月太本發(fā)明提供了由此處描述的核酸分子編碼的Δ5脫飽和酶。Δ5脫飽和酶是可以脫飽和或催化一個或更多個脂肪酸的5位置處連續(xù)的碳之間雙鍵形成、來產(chǎn)生單不飽和脂肪酸或多不飽和脂肪酸或其前體的酶。所述多肽可以包含D-氨基酸、L-氨基酸，或D-與L-氨基酸的混合物。天然氨基酸序列產(chǎn)生變體多肽的改變可以通過本領域普通技術人員已知的各種方法來制備。例如，通過在合成時改變核酸分子的序列可以方便地將氨基酸替換引入所述多肽中。通過將包含修飾的序列的合成寡核苷酸連接到表達載體中，也可以引入位點特異性突變。作為選擇，可以使用寡核苷酸指導的、位點特異性誘變步驟，例如在Walder等人(1986)；Bauer等人(1985)；和美國專利4，518，584和4，737，462中公開的。在本領域普通技術人員能力范圍內(nèi)的是選擇合成的和天然發(fā)生的氨基酸，其作為對任何特定的天然發(fā)生氨基酸的保守性或中性替換。普通技術人員理想地將考慮進行任何特定氨基酸替換的環(huán)境，還考慮側鏈的疏水性或極性、側鏈的一般大小，和在生理條件下具有酸性或堿性的側鏈的PK值。例如，賴氨酸、精氨酸和組氨酸通常適合相互替換，更通常地是精氨酸和組氨酸。本領域已知的是，這是因為所有三個氨基酸都具有堿性側鏈，而賴氨酸和精氨酸的側鏈的ρΚ值相互之間比與組氨酸(約6)更接近(約10和12)。類似地，甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸通常適當?shù)叵嗷ト〈?，條件是甘氨酸通常不適合替代該組的其他成員。這是因為當摻入到多肽中時這些氨基酸的每一個都是相對疏水性的，但是甘氨酸缺乏α碳容許了旋轉的Phi和psi角(在α碳周圍)有這樣大的構象自由度，從而甘氨酸殘基可能觸發(fā)在其他氨基酸相互替換時通常不發(fā)生的構象或二級結構中的改變。通常適合相互替換的其他氨基酸組包括但不限于，由谷氨酸和天冬氨酸構成的組；由苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸構成的組；以及由絲氨酸、蘇氨酸和任選的酪氨酸構成的組。另夕卜，普通技術人員可以容易地分類合成氨基酸和天然發(fā)生的氨基酸。如果期望，所述多肽可以被修飾，例如，通過糖基化、酰胺化、羧化作用或磷酸化，或通過加酸鹽、酰胺、酯、特別是C-末端酯以及本發(fā)明的多肽的N-酰基衍生物的生成。通過根據(jù)本領域已知的方法與其他部分形成共價或非共價復合物，所述多肽還可以被修飾來產(chǎn)生蛋白衍生物。共價結合的復合物可以通過將化學部分連接到包括多肽的氨基酸的側鏈的功能基團上，或連接到N-或C-末端來制備。理想地，這種修飾和結合不會有害地影響多肽(和其變體)的活性。雖然這種修飾和結合可能具有更大或更小的活性，所述活性期望地不是消極的，并且是未改變的多肽的特征。所述多肽(和片段、變體和融合蛋白)可以通過多種常規(guī)技術的任何一種來制備。所述多肽可以是從天然發(fā)生的來源或從重組來源分離的或基本上純化的。例如，對于重組蛋白來說，編碼期望的蛋白質(zhì)的DNA片段可以使用公知的分子遺傳技術(參見，例如，Maniatis等人，1989，和在此處的“實施例”中引用的其他參考文獻)亞克隆到合適的載體中。片段可以被轉錄，蛋白隨后在體外翻譯。也可以采用商業(yè)上可獲得的試劑盒(例如，由Clontech,MountainView,CA；AmershamLifeSciences,Inc.,ArlingtonHeights,IL；Invitrogen,Carlsbad,CA等等生產(chǎn)的)。任選的，可以在核酸的操作中采用聚合酶鏈式反應。多肽也可以根據(jù)本領域已知的方法使用自動化肽合成儀來合成。作為選擇，所述多肽(和片段、變體和融合蛋白)可以使用本領域普通技術人員公知的標準肽合成技術(例如，如BodanSzky，1984中概述的)來合成。特別地，所述多肽可以使用固相合成的步驟來合成(參見，例如，Merrifield,1963；Barany等人，1987和美國專利5，424，398)。如果期望，這可以使用自動化肽合成儀來進行。t-丁氧羰基(t-BOC)或9-芴甲氧羰基(Fmoc)氨基酸保護基團的去除和蛋白質(zhì)從樹脂上分離可以通過例如在降低的溫度下的酸處理進行。含多肽的混合物任何可以被提取，例如，使用二乙醚，來除去非肽有機化合物，合成的蛋白質(zhì)可以從樹脂粉未中提取(例如，使用約25%w/v乙酸)。在多肽的合成之后，任選地可以進行進一步的純化(例如，使用HPLC)來消除任何不完整的蛋白質(zhì)、多肽、肽或游離氨基酸。氨基酸和/或HPLC分析可以對合成的多肽進行來驗證其身份。對于根據(jù)本發(fā)明的其他應用，優(yōu)選的是通過化學結合，或通過本領域已知的遺傳學方法，來產(chǎn)生所述多肽來作為更大的融合蛋白的部分。就此來說，本發(fā)明還提供了包含所述多肽(或其片段)或其變體以及具有任何期望的性質(zhì)或效應物功能的一種或多種其他多肽/蛋白的融合蛋白。對于特定蛋白質(zhì)的生產(chǎn)和鑒定的分析是基于各種物理-化學的、結構的、功能的，或蛋白質(zhì)的其他性質(zhì)。獨特的物理_化學或結構性質(zhì)容許通過電泳步驟，例如天然或變性凝膠電泳或等電聚焦，或者通過色譜技術，例如離子交換或凝膠排阻色譜法來分離和鑒定。單獨蛋白質(zhì)的獨特結構提供了使用特異性抗體來以例如ELISA分析的形式檢測它們存在的機會。方法的組合可以用于實現(xiàn)更高的特異性，例如Western印跡，其中抗體被用于定位已經(jīng)通過電泳技術分離的單獨基因產(chǎn)物。其他技術可以用于確切地確認目標產(chǎn)物的身份，例如通過純化后的氨基酸測序來評估。雖然這些是最常見的，也可以使用其他步驟。分析過程可以通過蛋白質(zhì)的功能來鑒定蛋白質(zhì)的表達，特別是當表達的蛋白質(zhì)是能夠催化涉及特定底物和產(chǎn)物的化學反應的酶時。例如，在植物提取物中，這些反應可以通過物理和/或化學過程通過提供和測定反應的底物損失或產(chǎn)物生成來測量。在很多情況下，基因產(chǎn)物的表達通過評估其表達的表型結果來確定。這種評估可以僅僅是視覺觀察，或可以包括分析。這種分析可以采取許多形式，例如，分析植物的化學成分、形態(tài)學或生理性質(zhì)方面的改變。通過表達編碼酶或改變氨基酸組成的儲存蛋白質(zhì)的基因可以改變化學組成，且這些改變可以通過氨基酸分析或通過改變淀粉數(shù)量的酶來檢測，其可通過近紅外的反射光譜學或通過改變油組成的酶來分析，可通過氣相色譜法來檢測。形態(tài)改變可以包括更大的身材或更厚的莖桿。本發(fā)明的核酸分子、DNA構建體和多肽可以用于農(nóng)業(yè)方法和各種篩選分析中。例如，核酸分子可以用于在宿主細胞中經(jīng)由載體表達Δ5脫飽和酶，用于檢測生物樣品中編碼Δ5脫飽和酶的mRNA轉錄本，用于經(jīng)由Southern印跡來檢測編碼Δ5脫飽和酶的基因中的遺傳改變，用于抑制△5脫飽和酶，或用于增量調(diào)節(jié)Δ5脫飽和酶。所述多肽可以用于在植物中補償△5脫飽和酶的缺失，或補償具有降低的活性或無活性的突變Δ5脫飽和酶的存在，或用于在植物中處理△5脫飽和酶的過多的底物水平，不管是直接還是間接的。作為選擇，所述多肽可以用于根據(jù)調(diào)節(jié)它們活性的能力來篩選試劑?？贵w可以用于檢測和分離相應的多肽，以及降低這些多肽在體內(nèi)的可用性。植物轉化在本發(fā)明的優(yōu)選的實施方式中，產(chǎn)生表達期望的蛋白質(zhì)的轉基因植物。向植物細胞中導入編碼期望的蛋白質(zhì)的期望的多核苷酸序列的各種方法是本領域已知的，包括(1)物理方法，例如顯微注射、電穿孔和微粒介導的遞送(生物射彈(biolistics)或基因槍技術)；(2)病毒介導的遞送；或(3)根瘤菌介導的(例如，土壤桿菌屬介導的)轉化。植物細胞轉化的最常用的方法是土壤桿菌介導的DNA轉移方法，以及生物射彈或微注射微粒轟擊介導的方法。一般地，核轉化是期望的，但當專門地轉化質(zhì)體(例如葉綠體或淀粉體)是期望的時，可以利用期望的多核苷酸的微粒介導的遞送來轉化植物質(zhì)體。土壤桿菌介導的轉化通過使用屬于土壤桿菌屬的遺傳工程化的土壤細菌來實現(xiàn)。帶有Ti或Ri質(zhì)粒的根癌土壤桿菌和根花土壤桿菌(Agrobacteriumrhizogenes)的許多野生型和去攻擊的菌株可以用于植物的基因轉移。通過稱為“T-DNA”的特定DNA的轉移來進行向許多植物品種中的基因轉移，所述特定DNA可以被遺傳工程化來攜帶任何期望的DNA片段，如在例如Bidney等人的美國專利6，265，638中進一步詳細描述的，通過引用將其公開內(nèi)容合并在此。土壤桿菌介導的植物的遺傳轉化涉及幾個步驟。第一步一般稱為“接種”，其中強毒土壤桿菌和植物細胞首先相互接觸。接種優(yōu)選地伴隨著某些對一些植物細胞的損傷方法，其釋放植物細胞成分，例如豆香醇類(coumarylalcohol)、sinapinate(其被還原為乙酰丁香酮)、芥子醇和松柏醇，它們活化土壤桿菌屬中的致病因子。在接種之后，允許土壤桿菌和植物細胞/組織在適合生長和T-DNA轉移的條件下一起生長幾小時到幾天或更久的一段時間。這個步驟稱為“共培養(yǎng)”。在共培養(yǎng)和T-DNA遞送之后，用殺細菌或抑細菌試劑處理植物細胞來殺死保持與外植體接觸的和/或在含有外植體的器皿中的土壤桿菌。如果在缺乏任何選擇性試劑的情況下進行這個步驟，以促進轉基因植物細胞相對于非轉基因植物細胞的優(yōu)勢生長，則這一般稱為“延遲”步驟。如果在存在偏愛轉基因植物細胞的選擇壓力的情況下進行這個步驟，則它被稱為“選擇”步驟。當使用“延遲”時，一般跟隨著一個或多個“選擇”步驟。對于微粒轟擊(美國專利No.5，550，318(Adams等人)；美國專利No.5，538，880(Lundquist等人)、美國專利No.5，610,042(Chang等人)；和PCT公開WO95/06128(Adams等人)；通過完全引用將它們每一個特別地合并在此)，用核酸包被微粒子，并通過推力遞送到細胞中。示范性的顆粒包括由鎢、鉬和優(yōu)選的金組成的那些。通過加速將DNA遞送到植物細胞中的方法的說明性實施方式是Biolistics⑧顆粒遞送系統(tǒng)(Bi0Rad，HerCules，CA)，其可以用于將包被有DNA或細胞的顆粒通過篩子(例如不銹鋼篩或Nytex篩)推進到用懸浮液中培養(yǎng)的單子葉植物細胞覆蓋的過濾器表面上。微粒轟擊技術是廣泛可用的，可以用于轉化實際上任何植物物種。已經(jīng)通過微粒轟擊轉化的物種的實例包括單子葉植物物種，例如玉米(國際公開NO.WO95/06128(Adams等人))、大麥、小麥(美國專利NO.5，563，055(Townsend等人，通過完全引用合并在此)、水稻、燕麥、黑麥、甘蔗和高粱；以及許多雙子葉植物，包括煙草、大豆(美國專利NO.5，322，783(Tomes等人)，通過完全引用合并在此)、葵花、花生、棉花、番茄和一般的豆莢(美國專利No.5，563，055(Townsend等人)，通過完全引用合并在此)。為了對轉化的植物細胞進行選擇或記分而不考慮轉化方法，被導入細胞中的DNA含有基因，其在可再生的植物組織中起作用來產(chǎn)生為植物組織賦予對其他有毒化合物的抗性的化合物。用作可選擇、可篩選或可記分標記物的感興趣的基因?qū)ǖ幌抻讦?葡糖醛酸糖苷酶(GUS)、綠色熒光蛋白(GFP)、熒光素酶(LUX)、抗生素或除草劑耐受性基因?？股乜剐曰虻膶嵗ㄇ嗝顾亍⒖敲顾?和新霉素、G418、博來霉素)；氨甲蝶呤(和三甲氧芐二氨嘧啶)；氯霉素；卡那霉素和四環(huán)素。編碼涉及除草劑耐受性的蛋白質(zhì)的多核苷酸分子是本領域已知的，包括但不限于關于草甘膦耐受性的美國專利No.5，627，061(Barry,等人)、美國專利No5，633，435(Barry,等人)和美國專利No6，040，497(Spencer，等人)中描述的編碼5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶(EPSPS)的多核苷酸分子和美國專利No.5，094，945(Comai)中描述的aroA；關于溴苯腈耐受性的美國專利No.4，810，648(Duerrschnabel等人)中描述的編碼溴苯腈腈水解酶(Bxn)的多核苷酸分子；關于達草滅耐受性的在Misawa等人(1993)和Misawa等人(1994)中描述的編碼八氫番茄紅素脫飽和酶(crtl)的多核苷酸分子；關于對磺酰脲除草劑的耐受性在Sathasiivan等人(1990)中描述的編碼乙酰羥基酸合成酶(AHAS，akaALS)的多核苷酸分子；以及各自提供了草銨膦和雙丙氨瞵耐受性的Wohlleben等人(1988)中描述的pat基因和DeBlock等人(1987)中描述的bar基因。來自各種轉化的外植體的植物的再生、發(fā)育和培養(yǎng)是本領域中充分記載了的。這種再生和生長過程一般包括選擇轉化的細胞和培養(yǎng)那些個體化的細胞的步驟，從一般的胚胎發(fā)育階段到生根的植物苗階段。類似地再生轉基因胚芽和種子。然后將產(chǎn)生的轉基因的生根的芽種植到合適的植物生長培養(yǎng)基，例如土壤中。在對選擇性試劑的暴露下幸存的細胞，或在篩選分析中記分為陽性的細胞，可以在支持植物再生的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。在轉移到溫室或生長箱發(fā)育成熟之前，將發(fā)育的植物苗轉移到少土的植物生長混合物中，并鍛煉得耐寒本發(fā)明可以使用任何可轉化的細胞或組織。在此使用的可轉化是指細胞或組織能夠進一步增殖來產(chǎn)生植物。本領域技術人員認識到，許多植物細胞或組織是可轉化的，其中在外源DNA的插入和合適的培養(yǎng)條件之后，植物細胞或組織可以形成分化的植物。適合于這些目的的組織可以包括但不限于不成熟的胚芽、鱗片組織、懸浮細胞培養(yǎng)物、不成熟的18花序、芽分生組織、結節(jié)外植體、愈傷組織、胚軸組織、籽葉、根和葉。以上引述的Tomes等人‘783專利描述了一種方法，用細胞分裂素處理、隨后孵育一段時期，足以允許子葉節(jié)組織中的未分化細胞分化成分生組織細胞，并允許細胞進入發(fā)育的Gl和分裂期之間的階段，聲稱其改善了轉化的敏感性。根據(jù)本發(fā)明，可以使用任何適合的植物培養(yǎng)基。適合的培養(yǎng)基包括但不限于，基于MS的培養(yǎng)基(Murashige和Skoog，1962)或基于N6的培養(yǎng)基(Chu等人，1975)，其補充有植物生長調(diào)節(jié)劑，該植物生長調(diào)節(jié)劑包括但不限于發(fā)育素、細胞分裂素、ABA和赤霉素。本領域技術人員熟悉組織培養(yǎng)基的品種，當適當?shù)匮a充時，其支持了植物組織生長和發(fā)育，并適合于植物轉化和再生。這些組織培養(yǎng)基可以作為商業(yè)產(chǎn)品購買，或常規(guī)地制備和修改。本領域技術人員知道，用于轉化和再生的培養(yǎng)基和培養(yǎng)基添加劑例如營養(yǎng)物和生長調(diào)節(jié)劑，以及其他培養(yǎng)條件，例如孵育期間的光強度、PH值和孵育溫度，可以根據(jù)特定的感興趣的品種來優(yōu)化。在DNA構建體被穩(wěn)定地摻入到轉基因植物中并被確認是可操作的之后，它可以通過有性雜交導入到相同或另一種有性相容物種的其他植物中。取決于要雜交的物種，可以使用許多標準育種技術的任一種。因而，本發(fā)明不僅涵蓋直接轉化的植物或從根據(jù)本發(fā)明轉化的細胞再生的植物，還涵蓋這樣的植物的子代。如在此使用的，術語“子代”是指根據(jù)本發(fā)明制備的親本植物的任何世代的后代，其中所述子代包含根據(jù)本發(fā)明制備的選定的DNA構建體。如在此公開的，“雜交”植物來提供具有與起始植物系相對的一個或更多個添加的轉基因或等位基因的植物系，被定義為一類技術，通過將起始系與包含本發(fā)明的轉基因或等位基因的供體植物系雜交，其使得特定的序列被導入到植物系中。為了實現(xiàn)這一點，例如，人們可以進行如下步驟(a)種植第一(起始系)和第二(包含期望的轉基因或等位基因的供體植物系)親本植物的種子；(b)將所述第一和第二親本植物的種子生長成帶有花的植物；(c)用來自第二親本植物的花粉給來自第一親本植物的花授粉；和(d)收獲在帶有授粉的花的親本植物上產(chǎn)生的種子?；亟辉诖吮欢x為包括以下步驟的過程(a)將含有期望的基因、DNA序列或元件的第一基因型的植物與缺乏所述期望的基因、DNA序列或元件的第二基因型的植物雜交；(b)選擇含有所述期望的基因型、DNA序列或元件的一個或更多個子代植物；(c)將所述子代植物與所述第二基因型的植物雜交；和(d)重復步驟(b)和(c)以將來自第一基因型的植物的期望的DNA序列轉移到第二基因型的植物中。DNA元件向植物基因型的基因滲入被定義為回交轉化過程的結果。其中DNA序列已經(jīng)基因滲入的植物基因型可以稱為回交轉化的基因型、系、近交種或雜交種。類似地，缺乏所述期望的DNA序列的植物基因型可以被稱為未轉化的基因型、系、近交種或雜交種。種子、粗粉、油和包含種子、粗粉和油的產(chǎn)品本發(fā)明還提供了超過約1000、更優(yōu)選的約20，000、再更優(yōu)選的約40，000個種子的容器，其中超過約10%、更優(yōu)選的約25%、更優(yōu)選的約50%、再更優(yōu)選的約75%，或更優(yōu)選的約90%的種子是來自本發(fā)明的植物的種子。本發(fā)明還提供了超過約10kg、更優(yōu)選的約25kg、再更優(yōu)選的約50kg種子的容器，其中超過約10%、更優(yōu)選的約25%、更優(yōu)選的約50%、再更優(yōu)選的約75%，或更優(yōu)選的約90%的種子是來自本發(fā)明的植物的種子。本發(fā)明的任何植物或其部分可以被收獲，以及任選的被加工來產(chǎn)生飼料、粗粉或油產(chǎn)品。為這個目的的特別優(yōu)選的植物部分是收獲的種子，但可以收獲植物的其他部分并用于干草或青貯飼料。產(chǎn)生飼料、粗粉和油產(chǎn)品的方法是本領域已知的。參見，例如，美國專利4，957，748；5，100，679；5，219，596；5，936，069；6，005，076；6，146，669；和6，156，227。本發(fā)明的谷?；虼址劭梢耘c其他谷?；虼址刍旌?。方法本發(fā)明提供了用于提供具有提高的EPA或ARA含量的轉基因植物的方法。這種方法可以包括，例如，將編碼△5脫飽和酶和任選地至少一種其他脫飽和酶的DNA導入到植物細胞中，并從所述轉基因細胞再生具有提高的EPA或ARA含量的植物。更具體地，本發(fā)明提供了生產(chǎn)食物或飼料的方法，包括步驟(a)獲得本發(fā)明的轉基因植物；和(b)產(chǎn)生所述食物或飼料。所述食物或飼料可以是油、青貯飼料、粗粉、谷粒、淀粉、細粉或蛋白質(zhì)。食物或飼料組合物被定義為包含本發(fā)明提供的可檢測的多核苷酸序列或可檢測的多肽。另外，本發(fā)明提供了包含EPA或ARA的動物飼料和人類食品組合物。對于膳食增補，純化的PUFA、轉化的植物或植物部分、或其衍生物，可被摻入到配制的烹調(diào)油、脂肪或人造黃油中，從而在正常使用中接受者將接受期望的數(shù)量。PUFA也可被摻入嬰兒配制食品、營養(yǎng)增補劑或其他食物產(chǎn)品中，并可以用作抗炎試劑或膽固醇降低試劑。如在此使用的，“可食用的組合物”被定義為可以由哺乳動物攝食的組合物，例如，糧食、營養(yǎng)物質(zhì)和藥物組合物。如在此使用的，“糧食”是指可以用作或制備用作哺乳動物的食物的物質(zhì)，包括可以在食物(例如，油炸油)或食品添加劑的制備中使用的物質(zhì)。例如，糧食包括用于人類消費的動物，或由此產(chǎn)生的任何產(chǎn)品，例如，蛋。典型的糧食包括但不限于，飲料(例如，軟飲料、碳酸飲料、即混(readytomix)飲料)、嬰兒配制食品、泡制的食物(例如，果實和蔬菜)、調(diào)味汁、調(diào)味品、色拉料、果汁、糖漿、甜品(例如，布丁、膠凍、糖霜和餡料、烤制食物和冷凍甜品，例如冰淇淋和冰糕)、軟冷凍產(chǎn)品(例如，軟凍奶油、軟凍冰淇淋和酸奶酪、軟凍配料，例如乳制或非乳制的人造稠黃油)、油和乳化的產(chǎn)品(例如，起酥油、人造黃油、蛋黃醬、黃油、食油和色拉料)以及半干食品(例如，米飯和狗食)。此外，此處描述的可食用的組合物也可以作為食物和飲料中含有的添加劑或補充物來攝食。這些可以與營養(yǎng)物質(zhì)，例如各種維生素和礦物質(zhì)一起配制，并摻入到基本上液體的組合物中，例如，營養(yǎng)飲料、豆奶和湯；基本上固體的組合物中；以及凝膠中，或以待摻入各種食物的粉劑形式使用。這樣的功能性或健康食品中有效成分的含量可以類似于典型的藥物制劑中含有的劑量。純化的PUFA、轉化的植物或植物部分也可以摻入到動物、特別是家畜飼料中。這樣，動物自己可以受益于富含PUFA的膳食，而從人類消費這樣的家畜產(chǎn)生的食物產(chǎn)品也同樣有益。對于藥物用途(人類或獸醫(yī)學)，所述組合物一般可以口服施用，但是也可以通過它們可以被成功地吸收的任何途徑來施用，例如胃腸外地(即，皮下地、肌肉內(nèi)或靜脈內(nèi)地)、直腸地、陰道地或局部地，例如，皮膚軟膏劑或洗液。本發(fā)明的PUFA、轉化的植物或植物部分可以單獨施用，或與藥學上可接受的載體或賦形劑組合地施用。當可用時，膠囊是優(yōu)選的口服施用形式。如以上闡述的膳食添加劑也可以提供口服的施用途徑。本發(fā)明的不飽和酸可以以偶聯(lián)的形式，或者以脂肪酸鹽、酯、酰胺或前藥的形式來施用。任何藥學上可接受鹽均包括在本發(fā)明內(nèi)，特別優(yōu)選的是鈉、鉀或鋰鹽。還包括的是N-烷基多羥基胺鹽，例如N-甲基葡糖胺，可參見在PCT公開WO96/33155。優(yōu)選的酯是乙酯。對于固體鹽，PUFA也可以以片劑形式施用。對于靜脈內(nèi)的施用，PUFA或其衍生物可以摻入到商售制劑中，例如Intralipids(Pharmacia-Upjohn,Peapack,N.J.)。實施例包括以下實例來說明本發(fā)明的實施方式。本領域的技術人員應當理解，在根據(jù)本發(fā)明人公開的當前技術的實施例中所公開的技術在本發(fā)明的實踐中良好地運作。然而，本領域的技術人員根據(jù)當前公開的內(nèi)容應當理解，可以在公開的特定的方案中進行許多變化，在不離開本發(fā)明的概念、精神和范圍的情況下仍獲得相同的或類似的結果。更具體地，顯而易見的是，可以用化學上和生理學上都相關的某些試劑替換在此描述的試劑，而達到相同的或相似的結果。對于本領域的技術人員顯而易見的，所有這種相似的替換和修改都認為處在由附隨的權利要求所定義的本發(fā)明的精神、范圍和概念之內(nèi)。實施例1半片藻屬Δ5脫飽和酶序列的克隆本發(fā)明的Δ5脫飽和酶克隆自Hemiselmisvirescens和Hemiselmisrufescens。為了克隆HemiselmisvirescensΔ5脫飽禾口酶(HvD5D),RNA從H.virescensCCMP442(CCMP,WestBoothbayHarbor，ME，USA)分離，隨后構建cDNA庫。測序了大約20，000個獨立的克隆。對脫飽和酶相關序列的檢索得到了推定的Δ5脫飽和酶編碼克隆LIB5446-048-A1-M1-G2。LIB5446-048-A1-M1-G2的克隆的插入物的DNA序列(SEQIDNO5)長度是1613bp，含有1326bp的開放閱讀框(ORF)(SEQIDNO:1)，編碼441個氨基酸的推斷的氨基酸序列(SEQIDNO2)。蛋白質(zhì)的計算的大小是48.9Kdal，具有估計的7.1的pi。稱為HvD5D的ORF含有保守的氨基酸序列HPGG(SEQIDNO:24)，其是融合到前端脫飽和酶的N-末端的細胞色素b5(cytb5)結構域的一部分。所有特征的前端脫飽和酶，包括Δ4-、Δ5_、Δ6-和Δ8-脫飽和酶都具有這個N-末端cytb5結構域。此外，LIB5446-048-A1-M1-G2的推斷的氨基酸序列具有三個保守的組氨酸框；最特別的是QXXHH(SEQIDNO:25)序列，其在第三個組氨酸框中存在，也是前端脫飽和酶的判斷特征(Napier等人，1997,Napier等人，2003，Sperling和Heinz，2001)。三個保守的組氨酸框是活性位點的一部分，被認為是結合活性所需要的二鐵輔助因子所需的。含有來自LIB5446-048-A1-M1-G2的推定的Δ5脫飽和酶編碼區(qū)域的1326bp區(qū)域通過PCR擴增，并連接到酵母菌表達載體pYES2.l-T0P0(Invitrogen,CarlsbadCA)，得到pM0N67056(附圖2)。用于擴增的引物顯示如下HvD5M1G2Fl:5，-GTCGACAAACAATGCCTCCCAACAGTGGCG-3，(SEQIDNO6)HvD5M1G2Rl:5，-CCTGCAGGTCAGGCCGCCTTGACCCTC-3，(SEQIDNO7)SalI限制性位點和Kozak序列被添加到HvD5MlG2Fl寡核苷酸的5，末端，Sse8387I限制性位點被添加到HvD5MlG2Rl寡核苷酸的5，末端。為了克隆HemiselmisrufescensΔ5脫飽和酶(HrD5D)，RNA從H.rufescensCCMP439(CCMP,WestBoothbayHarbor,ME,USA)分離，隨后構建cDNA庫。篩選由23，790個克隆組成的EST文庫中含有如上所述的共有前端脫飽和酶的序列。鑒定了部分克隆，LIB5445-223-A1-M1-D4，其含有除cytb5區(qū)域(HPGG)之外的所有早先描述的保守序列。利用5’RACE反應來完成這種推定的前端脫飽和酶的0RF，其隨后連接到pYES2.1/V5-His-TOPO(Invitrogen,Carlsbad,CA)來得到pM0N104220(附圖3)。用于PCR擴增全長ORF的引物是H.ruf2235，-CAGTCGACAAACAATGCCCCCCAACAGCGGCGCGGGAG-3，(SEQIDNO8)禾口3'revH.Ruf2235，-CACCTGCAGGTCAGTCGGCTTTGACCTTCCCTTCG-3，(SEQIDNO9).這個克隆的ORF是1323bp(SEQIDNO:3；不包括終止密碼子)，編碼441個氨基酸的推斷的氨基酸序列(SEQIDNO4)。這個蛋白質(zhì)具有49Kdal的估計的大小，pi為8.2。來自Hemiselmisrufescens、Hemiselmisvirescens、畸雌腐霉、高山被孢霉、假微型海鏈藻和多甲藻屬物種CCMP626的Δ5脫飽和酶以及來自高山被孢霉的Δ6脫飽和酶的成對的比對在表1中顯示。兩種半片藻屬Δ5脫飽和酶是最相似的，顯示了86.9%的同一性。比較起來，來自浮游植物假微型海鏈藻和多甲藻屬物種CCMP626的兩種其他Δ5脫飽和酶的同一性為48.5%到50.9%。半片藻屬Δ5脫飽和酶與來自水霉-畸雌腐霉(卵菌)和產(chǎn)油真菌-高山被孢霉的Δ5脫飽和酶享有更少的同一性，為21.9%到23.4%。同源性的最高水平在cytb5結構域的兩個組氨酸框、Q框和保守的HPGG盒附近的區(qū)域中找到(附圖1)。表1:Δ5和Δ6脫飽和酶的推斷的氨基酸序列的成對比對的同一性百分比。權利要求1.一種多核苷酸分子，包含選自以下的核酸序列a)編碼SEQIDNO2或SEQIDNO4的多肽序列的核酸序列；b)SEQIDNO1或SEQIDNO3的核酸序列；c)在5XSSC、50%甲酰胺和42°C的條件下與SEQIDNO:1或SEQIDNO3或其互補物雜交，且編碼具有在碳5使脂肪酸分子脫飽和的脫飽和酶活性的多肽的核酸序列；和d)編碼與SEQIDNO:2或SEQIDNO:4的多肽序列具有至少75%的序列同一性、具有在碳5使脂肪酸分子脫飽和的脫飽和酶活性的多肽的核酸序列，其中所述多核苷酸分子與異源啟動子可操作地連接。2.權利要求1的多核苷酸分子，包含編碼SEQIDNO:2或SEQIDNO:4的多肽序列的核酸序列。3.權利要求1的多核苷酸分子，包含SEQIDNO:1或SEQIDNO3的核酸序列。4.權利要求1的多核苷酸分子，包含在5XSCC、50%甲酰胺和42°C下與SEQIDNO1或SEQIDNO:3或其互補物雜交、且編碼具有在碳5使脂肪酸分子脫飽和的脫飽和酶活性的多肽的核酸序列。5.權利要求1的多核苷酸分子，包含編碼與SEQIDNO:2或SEQIDNO4的多肽序列具有至少75%的序列同一性、具有在碳5使脂肪酸分子脫飽和的脫飽和酶活性的多肽的核酸序列。6.權利要求1的多核苷酸分子，包含編碼具有選自以下的至少一種氨基酸基序的多肽的核酸序歹Ij:SEQIDNO15,SEQIDNO16,SEQIDNO17,SEQIDNO18、SEQIDNO:19、SEQIDNO20,SEQIDN0:21、SEQIDNO22禾口SEQIDNO:23。7.權利要求1的多核苷酸分子，進一步包含編碼脂肪酸延伸酶或脫飽和酶的至少一種另外的多核苷酸序列。8.權利要求1的多核苷酸分子，其中異源啟動子是種子增強的啟動子。9.一種用權利要求1的多核苷酸分子轉化的宿主細胞。10.權利要求9的宿主細胞，其中所述宿主細胞是植物細胞、真菌細胞或細菌細胞。11.權利要求9的宿主細胞，其中所述宿主細胞展現(xiàn)改變的脂肪酸生物合成，這是相對于與所述宿主細胞相同基因型、但是缺少所述多核苷酸分子的細胞而言的。12.權利要求9的宿主細胞，其中所述細胞從所述細胞的祖代遺傳了所述多核苷酸分子。13.一種用權利要求1的多核苷酸分子轉化的轉基因植物或植物部分。14.權利要求13的轉基因植物或植物部分，所述植物選自芥花、菜苔、含油種子油菜、油菜籽、大豆、海甘藍、芥菜、蓖麻子、花生、芝麻、棉籽、亞麻子、紅花、油棕、亞麻、葵花、玉米、水稻、大麥、粟、黑麥、小麥、燕麥、苜蓿和高粱。15.權利要求13的轉基因植物或植物部分，進一步包含編碼脂肪酸脫飽和酶或延伸酶的至少一種另外的多核苷酸。16.權利要求15的轉基因植物或植物部分，進一步包含編碼Δ6脫飽和酶、Δ6延伸酶、Δ18延伸酶、Δ15脫飽和酶、Δ9延伸酶、Δ8脫飽和酶、Δ17脫飽和酶、Δ4脫飽和酶或C20延伸酶的多核苷酸。17.權利要求13的轉基因植物的子代植物，其中所述子代植物包含所述多核苷酸分子。18.權利要求13的轉基因植物的種子，其中所述種子包含所述多核苷酸分子。19.從權利要求13的植物或植物部分獲得的商業(yè)產(chǎn)品，其中所述產(chǎn)品包含所述多核苷酸分子或由所述多核苷酸分子編碼的多肽。20.權利要求19的商業(yè)產(chǎn)品，其中所述商業(yè)產(chǎn)品是食物或飼料。21.權利要求20的商業(yè)產(chǎn)品，其中所述食物或飼料是油、青貯飼料、粗粉、谷粒、淀粉、細粉或蛋白質(zhì)。22.權利要求19的商業(yè)產(chǎn)品，其中所述商業(yè)產(chǎn)品包含EPA、ARA和/或DHA。23.一種生產(chǎn)食物或飼料組合物的方法，包括步驟(a)獲得根據(jù)權利要求13的轉基因植物或植物部分；和(b)生產(chǎn)所述食物或飼料組合物。24.權利要求23的方法，其中所述食物或飼料是油、青貯飼料、粗粉、谷粒、淀粉、細粉或蛋白質(zhì)。全文摘要本發(fā)明涉及與脫飽和酶有關的方法和組合物，所述脫飽和酶調(diào)節(jié)長鏈多不飽和脂肪酸(LC-PUFA)中雙鍵的數(shù)量和位置。特別地，本發(fā)明涉及利用外源的脫飽和酶和編碼這樣的酶的核酸，來改善植物產(chǎn)品和部分中ω-3脂肪酸分布的方法和組合物。在特定的實施方式中，利用的外源脫飽和酶是半片藻屬物種Δ5脫飽和酶。還提供的是改善的大豆油組合物，其具有衍生自帶有感興趣基因的植物的EPA。文檔編號C12N15/82GK102186876SQ200980140691公開日2011年9月14日申請日期2009年10月14日優(yōu)先權日2008年10月14日發(fā)明者V·厄辛,B·弗羅曼,S·斯克瑞恩,L·勒曼申請人:孟山都技術公司