專利名稱：生產(chǎn)2-脫氧蟹肌醇(doi)的細菌及使用其生產(chǎn)2-脫氧蟹肌醇(doi)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種由蔗糖生產(chǎn)2-脫氧蟹肌醇Q-deoxy-scyllo-inosose ；D0I)的細菌和使用其生產(chǎn)DOI的方法。
背景技術(shù)：
2-脫氧蟹肌醇(以下也稱作D0I)為可用作藥物原料和化學(xué)工業(yè)資源的有用物質(zhì)。 例如，根據(jù)日本特開2000-236881號公報可知，2-脫氧蟹肌醇可以使用重組DOI合成酶由葡糖-6-磷酸(G-6-P)通過短工序生產(chǎn)，其中，所述重組DOI合成酶是使用大腸桿菌得到的。 進而，例如如國際公開2006/109479號說明書所述，也已經(jīng)開發(fā)了使用表達DOI合成酶的大腸桿菌由葡萄糖以一步法生產(chǎn)DOI的方法。由此，可以由來自植物的資源得到葡萄糖，再由該葡萄糖來生產(chǎn)DOI。但是，根據(jù)Journal of Biotechnology,Vol. 129,pp. 502-509(2007)可知，國際公開2006/109479號說明書中記載的生產(chǎn)DOI的方法中，在使用葡萄糖作為原料的同時，為了菌體的增殖/生長，還需要甘露糖醇，而甘露糖醇是一種稀少且昂貴的糖。根據(jù)Journal of Biotechnology, Vol. 129，pp. 502-509 (2007)，可知在野生型大腸桿菌中表達DOI合成酶時 DOI的生產(chǎn)率僅為1.5g/L，為了達到高生產(chǎn)率5g/L)，需要同時破壞大腸桿菌所具有的下述3個酶的基因，即磷酸葡糖異構(gòu)酶(pgi)、葡糖-6-磷酸-1-脫氫酶(ZWf)及葡糖磷酸變位酶(Pgm)。由此可以得到下述結(jié)論葡萄糖進入糖酵解系統(tǒng)的代謝途徑被完全阻斷，因此為了菌體的增殖/生長，還需要可用于糖酵解系統(tǒng)的糖(例如甘露糖醇)。另外，還可知為了得到同樣高的DOI生產(chǎn)率，雖然也可以僅同時破壞pgi基因和zwf基因2個基因，但由于此時如果以葡萄糖作為唯一的碳源則菌體也不能增殖，所以用于菌體增殖/生長的甘露糖醇也是必需的。另一方面，已知蔗糖為比葡萄糖還廉價的糖原料。蔗糖為廢糖蜜的主成分，人們期待同化蔗糖生產(chǎn)DOI的大腸桿菌在生產(chǎn)可用于工業(yè)的廉價的DOI方面是有用的。但是，同化蔗糖生產(chǎn)DOI的細菌到目前為止還完全不存在。例如，根據(jù)日本特開2001-346578號公報，微生物同化蔗糖的機制大致分為蔗糖 PTS (Phosphoenolpyruvate :Carbohydrate Phosphotransferase System)禾口蔴糖非 PTS 兩種。經(jīng)由蔗糖非PTS的情況下，微生物直接攝入蔗糖，然后分解成葡萄糖和果糖。另一方面， 經(jīng)由蔗糖PTS的情況下，微生物攝入蔗糖時將蔗糖磷酸化，轉(zhuǎn)化為蔗糖-6-磷酸。然后在微生物內(nèi)部分解成葡糖-6-磷酸和果糖。S卩，即使經(jīng)由任意機制，來自蔗糖的果糖也首先以未被磷酸化的形式出現(xiàn)在微生物內(nèi)部。并且為了使上述未被磷酸化的果糖(以下稱作非磷酸化果糖)進入糖酵解系統(tǒng)，需要將果糖異構(gòu)化為葡萄糖或?qū)⑵淞姿峄５?，F(xiàn)EMS Yeast Res, Vol.5, pp.1055-1062 (2005)、PNAS, Vol. 98(26)，pp.15257-15259(2001)、及 J Bacteriology, Vol. 184(19)，pp. 5307-5316(2002)指出，該微生物為大腸桿菌時，將非磷酸化果糖異構(gòu)化為葡萄糖的活性、將果糖磷酸化的活性均非常低。因此，即使成功地使大腸桿菌內(nèi)部出現(xiàn)非磷酸化果糖，但只要不采用特別的方法，則不能期待該大腸桿菌同化非磷酸化果糖。Can. J. Microbiol.，Vol. 45，pp. 418-422 (1999)公開了通過在大腸桿菌中只導(dǎo)入蔗糖水解酶基因(cscA)而能夠使大腸桿菌以蔗糖為原料進行增殖。另一方面，以蔗糖為原料由大腸桿菌生產(chǎn)DOI中重要的一點是利用來自蔗糖的果糖實現(xiàn)菌體的增殖/生長。因此上述文獻中自始至終只公開了蔗糖和葡萄糖被攝入菌體內(nèi)的信息，完全沒有公開來自蔗糖的果糖以何種程度被同化的數(shù)據(jù)。

發(fā)明內(nèi)容
如上所述，由于需要葡萄糖來生產(chǎn)D0I，另外還需要作為高價糖的甘露糖醇等來使菌體增殖，所以現(xiàn)有已知的生產(chǎn)DOI的大腸桿菌在工業(yè)生產(chǎn)DOI方面存在問題。因此，本發(fā)明的目的在于提供一種生產(chǎn)DOI的大腸桿菌及使用其生產(chǎn)DOI的方法， 所述生產(chǎn)DOI的大腸桿菌能夠由作為廉價糖的蔗糖有效地生產(chǎn)D0I。本發(fā)明是鑒于上述情況完成的，本發(fā)明的生產(chǎn)DOI的大腸桿菌及生產(chǎn)DOI的方法如下。[1] 一種生產(chǎn)DOI的大腸桿菌，所述大腸桿菌在蔗糖非PTS基因組中，至少具有編碼蔗糖水解酶(CscA)的基因，同時被賦予2-脫氧蟹肌醇(DOI)生產(chǎn)系統(tǒng)或具有被增強的 2-脫氧蟹肌醇(DOI)生產(chǎn)系統(tǒng)。[2]如[1]所述的生產(chǎn)DOI的大腸桿菌，其中，所述大腸桿菌在蔗糖非PTS基因組中只具有編碼蔗糖水解酶(CscA)的基因。[3]如[1]或[2]所述的生產(chǎn)DOI的大腸桿菌，所述生產(chǎn)DOI的大腸桿菌具有糖攝入能力增強系統(tǒng)。[4]如[3]所述的生產(chǎn)DOI的大腸桿菌，所述生產(chǎn)DOI的大腸桿菌中，選自由該大腸桿菌本身具有的磷酸葡糖異構(gòu)酶(Pgi)、葡糖-6-磷酸-1-脫氫酶(Zwf)、葡糖磷酸變位酶(Pgm)及負責(zé)穩(wěn)定期中蛋白質(zhì)合成修飾的核糖體修飾因子(Rmf)組成的組中的至少1種活性失活或活性降低。[5]如[1] [4]中任一項所述的生產(chǎn)DOI的大腸桿菌，其中，上述生產(chǎn)DOI的系統(tǒng)來自DOI合成酶(BtrC)活性。[6]如[3] [5]中任一項所述的生產(chǎn)DOI的大腸桿菌，其中，上述糖攝入能力增強系統(tǒng)為葡萄糖轉(zhuǎn)運促進蛋白質(zhì)(glucose facilitator, Glf)活性的增強。[7]如[1] W]中任一項所述的生產(chǎn)DOI的大腸桿菌，其中，上述編碼蔗糖水解酶(CscA)的基因來自大腸桿菌細菌。[8]如[7]所述的生產(chǎn)DOI的大腸桿菌，其中，上述大腸桿菌細菌是大腸桿菌 0-157細菌。[9]如[6] [8]中任一項所述的生產(chǎn)DOI的大腸桿菌，其中，上述葡萄糖轉(zhuǎn)運促進蛋白質(zhì)(Glf)來自發(fā)酵單胞菌屬細菌。[10]如[9]所述的生產(chǎn)DOI的大腸桿菌，其中，上述發(fā)酵單胞菌屬細菌為運動發(fā)酵單胞菌細菌。[11]如[1] [10]中任一項所述的生產(chǎn)DOI的大腸桿菌，其中，上述生產(chǎn)DOI的大腸桿菌是本身不具有蔗糖同化能力的種類的大腸桿菌。[12]如[11]所述的生產(chǎn)DOI的大腸桿菌，其中，上述生產(chǎn)DOI的大腸桿菌是B株或其衍生株。[13] 一種生產(chǎn)DOI的方法，包括使用[1] [12]中任一項所述的生產(chǎn)DOI的大腸桿菌由含有蔗糖的來自植物的原料生產(chǎn)D0I。根據(jù)本發(fā)明，能夠提供一種以蔗糖作為唯一碳源有效地生產(chǎn)DOI的生產(chǎn)DOI的大腸桿菌及使用其生產(chǎn)DOI的方法。


[圖1]為表示本發(fā)明的實施例11中所得的細菌株的DOI生產(chǎn)率的圖。[圖2]為表示本發(fā)明的實施例12中所得的細菌株的DOI生產(chǎn)率的圖。
具體實施例方式本發(fā)明的生產(chǎn)DOI的大腸桿菌是在蔗糖非PTS基因組中至少具有編碼蔗糖水解酶 (CscA)的基因、并且被賦予2-脫氧蟹肌醇(DOI)生產(chǎn)系統(tǒng)或具有被增強的2-脫氧蟹肌醇 (DOI)生產(chǎn)系統(tǒng)的生產(chǎn)DOI的大腸桿菌。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)利用下述生產(chǎn)DOI的大腸桿菌，能夠同化來自蔗糖的果糖，以蔗糖為唯一的碳源且以極高的生產(chǎn)效率生產(chǎn)DOI，所述生產(chǎn)DOI的大腸桿菌在蔗糖非PTS基因組中至少具有編碼蔗糖水解酶(CscA)的基因、同時被賦予2-脫氧蟹肌醇(DOI)生產(chǎn)系統(tǒng)或具有被增強的2-脫氧蟹肌醇(DOI)生產(chǎn)系統(tǒng)。其結(jié)果，能夠由來自植物、廉價且工業(yè)上經(jīng)常使用的蔗糖有效地獲得DOI。即，本發(fā)明的生產(chǎn)DOI的大腸桿菌能夠?qū)碜哉崽堑墓橇姿峄z入菌體內(nèi)， 同時能夠使用糖酵解系統(tǒng)將該果糖轉(zhuǎn)化為用于菌體增殖/生長的能量。如上所述，還沒有將來自蔗糖的果糖用作菌體增殖的營養(yǎng)源、同時利用大腸桿菌生產(chǎn)DOI的報告例。如果進一步對其進行說明，蔗糖水解酶(CscA)被認為是在大腸桿菌的細胞膜上幾乎不存在的酶(參見 Can. J. Microbiol.，Vol. 45，pp. 418-422 (1999))，另一方面，生產(chǎn) DOI的大腸桿菌作為不能將非磷酸化果糖攝取進入糖酵解系統(tǒng)、僅能利用磷酸化果糖用于其生長的生產(chǎn)DOI的大腸桿菌而被構(gòu)建(參見W02006/109479號說明書)。在上述生產(chǎn) DOI的大腸桿菌中，在蔗糖非PTS基因組中至少導(dǎo)入編碼蔗糖水解酶(CscA)的基因，賦予了 CscA活性，結(jié)果與預(yù)想大大相反，能夠得到可將果糖用作營養(yǎng)源的生產(chǎn)DOI的大腸桿菌。 結(jié)果所得到的本發(fā)明的生產(chǎn)DOI的大腸桿菌，盡管在作為對大腸桿菌而言是最易利用的糖的葡萄糖的存在下，也能有效地同化蔗糖或作為其分解產(chǎn)物的果糖來生產(chǎn)D0I，因此可以不需要使葡萄糖減少或枯竭而生產(chǎn)DOI，是更有效的。已知蔗糖被分解時生成等量的葡萄糖和果糖，但一般來說大腸桿菌通常與果糖相比優(yōu)先攝入葡萄糖，在葡萄糖的存在下果糖不能被充分代謝。因此，令人驚訝的是，例如通過調(diào)節(jié)菌體培養(yǎng)時的PH，可以不受由葡萄糖引起的代謝抑制(分解代謝物阻抑)的影響，在大腸桿菌的生長中有效地利用果糖。以下詳細說明本發(fā)明。本說明書中用“ ”表示的數(shù)值范圍，表示包括分別以“ ”前后記載的數(shù)值作為最小值及最大值的范圍。
本發(fā)明中所謂“蔗糖的同化”，是指將蔗糖直接、低分子化或高分子化后、優(yōu)選低分子化后引入生物體內(nèi)的能力，或者代謝性地轉(zhuǎn)化為其他物質(zhì)的能力。另外，本發(fā)明中，所謂同化包括將蔗糖進一步低分子化的分解。具體而言，包括將蔗糖分解為D-葡萄糖和D-果糖。本發(fā)明中所謂“蔗糖非PTS基因組”，是指微生物的蔗糖同化途徑中與非PTS系統(tǒng)有關(guān)的基因組。具體而言，是由編碼阻抑蛋白(CscR)的基因(cscR)、編碼蔗糖水解酶 (CscA)的基因(cscA)、編碼果糖激酶(CscK)的基因(cscK)、編碼蔗糖透過酶(CscB)的基因(cscB)組成的基因組。本發(fā)明中，只要至少含有其中的cscA即可，例如可以舉出僅有 cscA、cscA 與 cscK 的組合、cscA 與 cscB 的組合、cscA 與 cscR 的組合、cscA 與 cscB 與 cscR 的組合、cscA與cscK與cscR的組合、cscA與cscK與cscB的組合、cscA與cscK與cscB 與cscR的組合。其中，從更有效地生產(chǎn)DOI的觀點考慮，優(yōu)選只含有cscA，不含其它的基因。本發(fā)明中所謂“蔗糖水解酶(CscA) ”，是指基于國際生物化學(xué)聯(lián)合(I.U.B.)酶委員會報告被歸屬于酶編號3. 2. 1.沈、催化由蔗糖生成D-葡萄糖和D-果糖的反應(yīng)的酶的總稱。需要說明的是，K-12株及B株等大腸桿菌本身不具有該酶。本發(fā)明中，通過在大腸桿菌中至少導(dǎo)入蔗糖非PTS基因組中的cscA而賦予CscA 活性，特別是通過在大腸桿菌中僅導(dǎo)入蔗糖非PTS基因組中的cscA而僅賦予CscA活性，由此將存在于菌體外的蔗糖在細胞膜上分解為葡萄糖和果糖并向細胞外釋放，通過大腸桿菌本身具有的葡萄糖PTS及果糖PTS將其一邊進行磷酸化一邊攝入細胞質(zhì)內(nèi)。其結(jié)果，存在于細胞外的果糖以果糖-1-磷酸的形式出現(xiàn)在菌體內(nèi)，然后，利用菌體內(nèi)存在的果糖-1-磷酸激酶(FruK)轉(zhuǎn)化為果糖-1，6-磷酸，進入糖酵解系統(tǒng)。作為本發(fā)明的導(dǎo)入宿主細菌的蔗糖水解酶(CscA)的基因(cscA)，可以利用從具有該酶的生物中得到的、具有編碼蔗糖水解酶(CscA)的基因的堿基序列的DNA， 或者利用基于其公知的堿基序列合成的合成DNA序列。作為優(yōu)選例，可以舉出來自歐文菌屬菌(Erwinia)、變形桿菌屬菌(ftOteus)、弧菌屬菌(Vibrio)、農(nóng)桿菌屬菌 (Agrobacterium)、根瘤菌屬菌(Rhizobium)、葡萄球菌屬菌(Staphylococcus)、雙歧桿菌屬菌(Bifidobacterium)、埃希氏菌屬菌Escherichia)的基因，例如可以舉出具有來自大腸桿菌0-157株的基因的堿基序列的DNA。特別優(yōu)選為具有來自大腸桿菌0-157株的基因的堿基序列的DNA。另外優(yōu)選在cscA中添加用于使CscA向菌體的外周胞質(zhì)轉(zhuǎn)移的信號序列。作為本發(fā)明的能夠被導(dǎo)入宿主細菌的阻抑蛋白(CscR)的基因，可以利用從具有該酶的生物中得到的、具有編碼阻抑蛋白(CscR)的基因的堿基序列的DNA，或者利用基于其公知的堿基序列合成的合成DNA序列。作為優(yōu)選例，可以舉出來自歐文菌屬菌(Erwinia)、 變形桿菌屬菌(Proteus)、弧菌屬菌(Vibrio)、農(nóng)桿菌屬菌(Agrobacterium)、根瘤菌屬菌 (Rhizobium)、葡萄球菌屬菌(Staphylococcus)、雙歧桿菌屬菌(Bifidobacterium)、埃希氏菌屬菌(Escherichia)的基因，例如可以舉出具有來自大腸桿菌0-157株的基因的堿基序列的DNA。特別優(yōu)選為具有來自大腸桿菌0-157株的基因的堿基序列的DNA。作為本發(fā)明的能夠被導(dǎo)入宿主細菌的果糖激酶(CscK)的基因，可以利用從具有該酶的生物中得到的、具有編碼果糖激酶(CscK)的基因的堿基序列的DNA，或者利用基于其公知的堿基序列合成的合成DNA序列。作為優(yōu)選例，可以舉出來自歐文菌屬菌(Erwinia)、 變形桿菌屬菌(Proteus)、弧菌屬菌(Vibrio)、農(nóng)桿菌屬菌(Agrobacterium)、根瘤菌屬菌 (Rhizobium)、葡萄球菌屬菌(Staphylococcus)、雙歧桿菌屬菌(Bifidobacterium)、埃希氏菌屬菌(Escherichia)的基因，例如可以舉出具有來自大腸桿菌0-157株的基因的堿基序列的DNA。特別優(yōu)選為具有來自大腸桿菌0-157株的基因的堿基序列的DNA。作為本發(fā)明的能夠被導(dǎo)入宿主細菌的蔗糖透過酶(CscB)的基因，可以利用從具有該酶的生物中得到的、具有編碼蔗糖透過酶(CscB)的基因的堿基序列的DNA， 或者利用基于其公知的堿基序列合成的合成DNA序列。作為優(yōu)選例，可以舉出來自歐文菌屬菌(Erwinia)、變形桿菌屬菌(ftOteus)、弧菌屬菌(Vibrio)、農(nóng)桿菌屬菌 (Agrobacterium)、根瘤菌屬菌(Rhizobium)、葡萄球菌屬菌(Staphylococcus)、雙歧桿菌屬菌(Bifidobacterium)、埃希氏菌屬菌(Escherichia)的基因，例如可以舉出具有來自大腸桿菌0-157株的基因的堿基序列的DNA。特別優(yōu)選為具有來自大腸桿菌0-157株的基因的堿基序列的DNA。需要說明的是，本發(fā)明中所謂“宿主細菌”，是指接收從菌體外導(dǎo)入的一個以上的基因，結(jié)果成為本發(fā)明的生產(chǎn)DOI的大腸桿菌的該大腸桿菌。本發(fā)明中所謂“D0I生產(chǎn)系統(tǒng)”，是指用于賦予DOI生產(chǎn)能力的結(jié)構(gòu)，所述結(jié)構(gòu)是通過基因重組被導(dǎo)入或改變而得到的。上述的DOI生產(chǎn)系統(tǒng)可以為使用作對象的大腸桿菌中 DOI生產(chǎn)量增加的系統(tǒng)中的任意系統(tǒng)。可以優(yōu)選舉出與DOI生產(chǎn)有關(guān)的酶活性的賦予或增強或它們的組合。如上所述， 與上述的CscA活性組合，即使為本身不具有蔗糖同化能力的大腸桿菌，也能有效地由蔗糖生產(chǎn)DOI。本發(fā)明中所謂“賦予”或“增強”，是指除了將編碼酶的基因從宿主細菌的菌體外導(dǎo)入菌體內(nèi)之外，還包括通過將宿主細菌基因組上具有的酶基因的啟動子活性增強或者將其取代為其他啟動子而增強酶基因的表達。本發(fā)明中“利用基因重組”的用語，包括全部通過在原有基因的堿基序列中插入其他DNA、或基因的某部分的取代、缺失或它們的組合而產(chǎn)生的堿基序列上的改變，該改變例如可以是通過突變產(chǎn)生的。本發(fā)明中的DOI生產(chǎn)系統(tǒng)，從DOI的生產(chǎn)效率的觀點考慮，優(yōu)選為來自DOI合成酶 (BtrC)活性的系統(tǒng)，可以通過導(dǎo)入DOI合成酶基因(btrC)而賦予大腸桿菌上述DOI合成酶。已知DOI合成酶(BtrC)為催化由葡糖_6_磷酸生成2_脫氧蟹肌醇(DOI)的反應(yīng)的酶，是42kDa和23kDa的二聚體肽，在鈷離子的存在下酶活性被促進，在鋅、銅離子的存在下酶活性被抑制，以NAD+為輔酶進行反應(yīng)(例如參見日本特開2000-236881號、 W02006/109479號)。btrC基因可以使用來自具有該基因的生物的基因中的任意基因，例如可以舉出來自桿菌屬細菌的btrC基因。作為btrC基因，其中，從DOI的生產(chǎn)效率的觀點考慮，可以優(yōu)選使用來自環(huán)狀芽胞桿菌(環(huán)狀芽胞桿菌)的編碼42kDa亞單位的基因 (GenBank 檢索號 AB066276)。本發(fā)明中的生產(chǎn)DOI的大腸桿菌，優(yōu)選為具有糖攝入能力增強系統(tǒng)的大腸桿菌。本發(fā)明中所謂糖攝入能力，是指通過生物體膜的糖輸送能力，該能力也包括對從生物體膜的外側(cè)向內(nèi)側(cè)的糖輸送或從生物體膜的內(nèi)側(cè)向外側(cè)的糖輸送的作用。作為糖輸送中的糖，包括五碳糖或六碳糖。具體而言，可以舉出葡萄糖、甘露糖、阿拉伯糖、半乳糖、果糖等，可以優(yōu)選舉出葡萄糖。本發(fā)明中所謂“具有糖攝入能力增強系統(tǒng)”，是指上述糖從菌體外到菌體內(nèi)的攝入增加的狀態(tài)。本發(fā)明中所謂“糖攝入能力增強系統(tǒng)”，優(yōu)選指用于使葡萄糖的攝入能力提高的結(jié)構(gòu)。更優(yōu)選為，該糖攝入能力增強系統(tǒng)與PTS系統(tǒng)或非PTS系統(tǒng)不同，例如為將菌體外的葡萄糖以其原形攝入菌體內(nèi)的系統(tǒng)。被攝入的葡萄糖之后被菌體具有的葡糖激酶(Glk) 等磷酸化酶磷酸化，成為可用作物質(zhì)生產(chǎn)的基質(zhì)。如上所述，大腸桿菌除了具有本身具有的 PTS系統(tǒng)或非PTS系統(tǒng)的糖攝入系統(tǒng)之外，還變得具有新的糖攝入系統(tǒng)。本發(fā)明中的糖攝入能力增強系統(tǒng)，從DOI的生產(chǎn)率的觀點考慮，優(yōu)選為葡萄糖轉(zhuǎn)運促進蛋白質(zhì)(Glf)活性增強的系統(tǒng)。本發(fā)明中所謂葡萄糖轉(zhuǎn)運促進蛋白質(zhì)(Glf)，是指具有將D-葡萄糖或D-果糖等從生物體膜的外側(cè)輸送到內(nèi)側(cè)的作用的蛋白質(zhì)的總稱。已知導(dǎo)入了 glf基因的大腸桿菌中甘露糖醇的生產(chǎn)率提高的技術(shù)(例如參見日本特表2006-503559號)、或L-苯基丙氨酸或莽草酸的生產(chǎn)率提高(日本特表2002-512802號公報、Applied Microbiology and Biotechnology (2004)，64，333-339)，但是完全不知道葡萄糖轉(zhuǎn)運促進蛋白質(zhì)基因(glf) 的導(dǎo)入在生產(chǎn)DOI的大腸桿菌中是否也顯示出生產(chǎn)率提高的效果。需要說明的是，如下所述，導(dǎo)入glf基因?qū)μ岣呷樗岬纳a(chǎn)率沒有效果。因此，導(dǎo)入glf基因在以糖為原料的物質(zhì)生產(chǎn)中并不是有效的通用技術(shù)，本發(fā)明中能夠通過導(dǎo)入glf基因有效地生產(chǎn)DOI是出乎意料之外的。作為本發(fā)明的導(dǎo)入至宿主細菌中的葡萄糖轉(zhuǎn)運促進蛋白質(zhì)的基因(glf)，可以利用來自具有該蛋白質(zhì)的生物的具有編碼葡萄糖轉(zhuǎn)運促進蛋白質(zhì)(Glf)的基因的堿基序列的DNA或基于其公知的堿基序列合成的合成DNA序列。可以優(yōu)選舉出來自酵母或發(fā)酵單胞菌屬細菌的基因，較優(yōu)選為來自發(fā)酵單胞菌屬細菌的基因，例如可以舉出具有來自運動發(fā)酵單胞菌的基因的堿基序列的DNA。特別優(yōu)選為具有來自運動發(fā)酵單胞菌的基因的堿基序列的DNA。作為本發(fā)明的較優(yōu)選方案的生產(chǎn)DOI的大腸桿菌，從蔗糖的分解能力的觀點考慮，蔗糖水解酶(CscA)活性可以通過導(dǎo)入對來自埃希氏菌屬細菌的各蛋白質(zhì)進行編碼的基因而得到，從提高DOI的生產(chǎn)率的觀點考慮，葡萄糖轉(zhuǎn)運促進蛋白質(zhì)(Glf)活性可以通過導(dǎo)入對來自發(fā)酵單胞菌屬細菌的各蛋白質(zhì)進行編碼的基因而得到。較優(yōu)選為，上述蔗糖水解酶(CscA)可以通過導(dǎo)入對來自大腸桿菌0-157細菌的各蛋白質(zhì)進行編碼的基因而得到， 葡萄糖轉(zhuǎn)運促進蛋白質(zhì)(Glf)可以通過導(dǎo)入對來自運動發(fā)酵單胞菌細菌的各蛋白質(zhì)進行編碼的基因而得到。通過使用來自上述細菌的基因，可以確實地表達上述基因的功能。作為本發(fā)明中用于使各種基因表達的啟動子，只要為可以控制上述任意基因表達的啟動子即可，但通常為在微生物內(nèi)發(fā)揮作用的強啟動子，并且優(yōu)選為即使在葡萄糖存在下表達也不易受到抑制的啟動子，具體而言可以舉出甘油醛-3-磷酸脫氫酶(以下有時稱作GAPDH)的啟動子或絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶的啟動子。本發(fā)明中所謂賦予各活性的大腸桿菌，是指利用從菌體外到菌體內(nèi)的任何方法基于酶或蛋白質(zhì)賦予了活性的大腸桿菌。上述大腸桿菌可以使用下述方法制備例如使用基因重組技術(shù)將編碼該酶及蛋白質(zhì)的基因從菌體外導(dǎo)入菌體內(nèi)等方法。從菌體外向菌體內(nèi)導(dǎo)入基因時所需要的基因組DNA的制備、DNA的切斷及連接、轉(zhuǎn)化、PCR(Polymerase Chain Reaction)、用作引物的寡核苷酸的設(shè)計、合成等方法，可以利用本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的一般方法進行。上述方法記載在 Sambrook, J. , et. al. ,"Molecular Cloning A Laboratory Manual, Second Edition", Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1989)等中。為了以盡可能高的收率生產(chǎn)DOI，本發(fā)明的優(yōu)選方案中，選自由宿主細菌具有的與葡糖-6-磷酸的代謝有關(guān)的以下的酶和與控制穩(wěn)定期中蛋白合成有關(guān)的核糖體修飾因子 (Rmf)組成的組中的至少1種的活性失活或降低，所述與葡糖-6-磷酸的代謝有關(guān)的酶為磷酸葡糖異構(gòu)酶(Pgi)、葡糖-6-磷酸-1-脫氫酶(Zwf)及葡糖磷酸變位酶(Pgm)。上述方案中，或者分別單獨對分別編碼上述各酶的基因(分別為Pgi基因、zwf基因及Pgm基因)進行基因破壞、或者同時對2種基因(pgi基因和zwf基因、pgi基因和pgm基因)進行基因破壞、或者同時對3種基因進行基因破壞，并且，或者單獨對編碼與穩(wěn)定期中的蛋白合成的控制有關(guān)的RMF蛋白質(zhì)的基因(rmf基因)進行基因破壞，或者對上述與葡糖-6-磷酸的代謝有關(guān)的酶進行編碼的基因被破壞了的各種基因破壞株進行rmf基因的破壞。如上所述，能夠抑制因菌而引起的作為用于生產(chǎn)DOI的直接基質(zhì)的葡糖-6-磷酸的分解代謝，另外通過穩(wěn)定期中的蛋白質(zhì)合成能夠提高生產(chǎn)DOI的能力。上述生產(chǎn)DOI的細菌，例如記載于國際公開2006/109479號說明書中。作為本發(fā)明中生產(chǎn)DOI的大腸桿菌，更優(yōu)選為磷酸葡糖異構(gòu)酶(Pgi)及葡糖-6-磷酸-1-脫氫酶(Zwf)的活性同時失活或降低的大腸桿菌。最優(yōu)選為磷酸葡糖異構(gòu)酶O^gi)及葡糖-6-磷酸-1-脫氫酶(Zwf)及葡糖磷酸變位酶(Pgm)的活性同時失活或降低的大腸桿菌。作為用于使各種酶失活的方法，只要為出于上述目的通常使用的方法即可，可以沒有特殊限制地使用，例如可以舉出通過編碼酶的基因的同源重組等引起的基因破壞。上述基因的破壞可以為染色體上的基因的破壞，也可以為質(zhì)粒基因的破壞。另外，本發(fā)明中的大腸桿菌，考慮到DOI的合成，可以使用破壞各種染色體/質(zhì)?；蛩玫降钠茐闹?。本發(fā)明中所謂“失活”，是指利用現(xiàn)有的測定系統(tǒng)測定的該酶的活性在檢測限以下的狀態(tài)。本發(fā)明中所謂“降低”，是指通過編碼該酶的基因的基因重組，與進行上述處理前的狀態(tài)相比，該酶的活性顯著下降的狀態(tài)。本發(fā)明中的酶的活性，可以為利用現(xiàn)有的測定系統(tǒng)中的任一種測定得到的活性。本發(fā)明中所謂“基因破壞”，是指為了使某基因的功能不能發(fā)揮而在該基因的堿基序列中引入突變、插入其他的DNA或者使基因的某部分缺失。基因破壞的結(jié)果為該基因不能轉(zhuǎn)錄為mRNA，而使結(jié)構(gòu)基因不被翻譯；或者被轉(zhuǎn)錄的mRNA不完全，而使被翻譯的結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)的氨基酸序列中產(chǎn)生突變或缺失，不能發(fā)揮原有的功能。基因破壞株的制備可以使用任意方法，只要能得到該酶或蛋白質(zhì)不表達的破壞株即可。已經(jīng)報道了多種基因破壞的方法(自然育種、突變劑添加、紫外線照射、放射線照射、隨機突變、轉(zhuǎn)座子、部位特異性基因破壞)，但從能夠僅破壞某種特定基因的方面考慮，優(yōu)選利用同源重組進行基因破壞。利用同源重組的方法記載于J. Bacteriol.，161，1219-1221 (1985)或 J. Bacteriol.，177，1511-1519 (1995)或 Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A, 97,6640-6645(2000)中，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以利用上述方法及其應(yīng)用容易地實施。本發(fā)明中使用的大腸桿菌，可以為能導(dǎo)入及改變上述各基因的任意大腸桿菌。較優(yōu)選為本身不具有蔗糖同化能力的種類的大腸桿菌，作為上述大腸桿菌，可以舉出埃希氏菌屬Escherichia)細菌等，特別優(yōu)選使用便利性高、工業(yè)上使用的實際成果豐富的大腸桿菌(Escherichia coli 大腸桿菌)。例如可以舉出K-12株、B株、C株及其衍生株等。如上所述，可以擴大本身不具有蔗糖同化能力的種類的大腸桿菌的用途。本發(fā)明的生產(chǎn)DOI的大腸桿菌，優(yōu)選使用本身不具有蔗糖同化能力的種類的大腸桿菌中的B株及其衍生株。通過使用B株及其衍生株構(gòu)筑本發(fā)明的生產(chǎn)DOI的大腸桿菌， 可以使用作為常用工業(yè)培養(yǎng)基的玉米漿而得到高DOI生產(chǎn)率。大腸桿菌通常被分類為Κ-12 株、B株、C株。廣泛使用Κ-12衍生株和B衍生株作為工業(yè)上物質(zhì)生產(chǎn)的宿主，兩者均能通過基因重組表達異源蛋白質(zhì)，但是，到目前為止，有關(guān)B株在DOI的生產(chǎn)中為優(yōu)選的宿主方面的知識完全屬于未知。因此，在DOI的生產(chǎn)中B衍生株與Κ-12衍生株相比顯示出明顯高的生產(chǎn)率是無法預(yù)料的特異現(xiàn)象。本發(fā)明的生產(chǎn)DOI的方法包括使用上述生產(chǎn)DOI的大腸桿菌、由含有蔗糖的來自植物的原料生產(chǎn)2-脫氧蟹肌醇，即，包括使上述生產(chǎn)DOI的大腸桿菌與含有蔗糖的來自植物的原料接觸的工序、和對通過接觸所得到的DOI進行回收的回收工序。需要說明的是，本說明書中所說的用語“工序”，不僅指獨立的工序，即使在不能與其他工序明確區(qū)分的情況下，只要能實現(xiàn)該工序所期望的作用，也在該用語的范圍內(nèi)。上述DOI生產(chǎn)方法中使用的來自植物的原料，只要為從植物得到的碳源并且經(jīng)大腸桿菌代謝能夠轉(zhuǎn)化為DOI的原料即可，沒有特殊限制。本發(fā)明中，指根、莖、干、枝、葉、花、 種子等器官、含有它們的植物體、上述植物器官的分解產(chǎn)物，進而在由植物體、植物器官、或它們的分解產(chǎn)物得到的碳源中，能在微生物的培養(yǎng)中用作碳源的物質(zhì)也包含在來自植物的原料中。作為上述包含在來自植物的原料中的碳源，除蔗糖之外，作為一般物質(zhì)可以舉出淀粉、葡萄糖、果糖、木糖、阿拉伯糖等糖類，或大量含有上述成分的草木質(zhì)分解產(chǎn)物或纖維素水解物等。進而來自植物油的甘油或脂肪酸也屬于本發(fā)明中的碳源。本發(fā)明中作為來自植物的原料，可以優(yōu)選舉出糧食等農(nóng)作物，例如玉米、米、小麥、 大豆、甘蔗、甜菜、棉花等、或它們的組合，作為該原料的使用形式，可以為未加工品、榨汁、 粉碎物等，沒有特別限定。另外，也可以為只為上述碳源的形式。接觸工序中生產(chǎn)DOI的大腸桿菌和來自植物的原料的接觸通常通過在含有來自植物的原料的培養(yǎng)基中培養(yǎng)生產(chǎn)DOI的大腸桿菌而進行。來自植物的原料和生產(chǎn)DOI的大腸桿菌的接觸密度根據(jù)生產(chǎn)DOI的大腸桿菌的活性的不同而不同，通常情況下，作為培養(yǎng)基中的來自植物的原料的濃度，相對于混合物的總質(zhì)量，以換算為葡萄糖的量計，可以使初始的糖濃度為20質(zhì)量％以下，從大腸桿菌的耐糖性的觀點考慮，優(yōu)選使初始的糖濃度為15質(zhì)量％以下。其他的各成分只要以微生物的培養(yǎng)基中通常添加的量添加即可，沒有特殊限制。另外作為培養(yǎng)基中的生產(chǎn)DOI的大腸桿菌的含量，根據(jù)大腸桿菌的種類及活性的不同而不同，但通常情況下可以使初始菌濃度相對于培養(yǎng)液為0. 1質(zhì)量％ 30質(zhì)量％，從控制培養(yǎng)條件的觀點考慮，優(yōu)選為1質(zhì)量％ 10質(zhì)量％。本發(fā)明中的生產(chǎn)DOI的方法包括下述方法通過在含有生產(chǎn)DOI的大腸桿菌和來自植物的原料的混合物中培養(yǎng)生產(chǎn)DOI的大腸桿菌來同化來自植物的原料，一定時間后使用蒸餾、膜分離、提取等公知技術(shù)對培養(yǎng)液中分泌的DOI進行精制。生產(chǎn)DOI的方法中的混合物只要以細菌類的培養(yǎng)中通常使用的基本培養(yǎng)基為主體即可，可以使用根據(jù)生產(chǎn)DOI的大腸桿菌的種類而通常使用的培養(yǎng)基中的任一種。上述基本培養(yǎng)基只要是含有碳源、氮源、 無機離子及根據(jù)需要使用的其他微量成分的培養(yǎng)基即可，沒有特殊限制。作為碳源，只為上述蔗糖就已足夠，但從DOI的生產(chǎn)效率的觀點考慮，進而可以適當(dāng)追加使用葡萄糖、果糖、糖蜜等糖類；富馬酸、檸檬酸、琥珀酸等有機酸；甲醇、乙醇、甘油等醇類及其它。作為氮源，可以適當(dāng)使用有機銨鹽、無機銨鹽、氨氣、氨水等無機態(tài)氮源、及蛋白質(zhì)水解物等有機態(tài)氮源及其它。作為無機離子，根據(jù)需要可以適當(dāng)使用鎂離子、磷酸離子、鉀離子、鐵離子、錳離子及其它。作為有機微量成分，可以適當(dāng)使用維生素、氨基酸等及含有它們的酵母提取物、 胨、玉米漿、酪蛋白分解物及其它。需要說明的是，作為本發(fā)明中使用的培養(yǎng)基，如果考慮供應(yīng)于工業(yè)生產(chǎn)，則優(yōu)選液體培養(yǎng)基。作為培養(yǎng)條件，根據(jù)制成的菌體、培養(yǎng)裝置而改變，但通常情況下培養(yǎng)溫度為 20°C 40°C，從DOI的生產(chǎn)效率的觀點考慮，較優(yōu)選在25°C 35°C下進行培養(yǎng)。另外，可以使PH為pH4 pH9，優(yōu)選為pH5. 0 ρΗ7· 5，較優(yōu)選為pH6. 0 ρΗ7· 0，可以用NaOH、NH3等進行調(diào)節(jié)。培養(yǎng)時間為菌體充分增殖、且DOI生成所需要的時間，沒有特殊限制。培養(yǎng)時通常使用能控制溫度、ρΗ、通氣條件、攪拌速度的培養(yǎng)槽，但本發(fā)明培養(yǎng)時不限于使用培養(yǎng)槽。使用培養(yǎng)槽進行培養(yǎng)時，根據(jù)需要也可以預(yù)先進行作為預(yù)培養(yǎng)的種培養(yǎng)，將其必要量接種到預(yù)先配制的培養(yǎng)槽內(nèi)的培養(yǎng)基中。培養(yǎng)本發(fā)明中得到的微生物生產(chǎn)DOI時，可以完全不進行通氣，但為了得到較理想結(jié)果，優(yōu)選進行通氣。此處所謂的通氣條件下，未必是必須將空氣通過培養(yǎng)液中，也包括根據(jù)培養(yǎng)槽的形狀一邊適度地攪拌培養(yǎng)液一邊將培養(yǎng)液上的空氣層進行換氣之類的上部通氣，是指使含有氧的氣體流入培養(yǎng)槽的內(nèi)部。通氣到液體中時，由于根據(jù)內(nèi)壓、攪拌槳位置、攪拌槳形狀、攪拌速度的組合使得溶存的氧濃度發(fā)生變化，所以可以以DOI的生產(chǎn)率及除DOI之外的有機酸量等為指標如下求出最適條件。例如，使用500g的培養(yǎng)液利用ABLE公司制培養(yǎng)裝置BMJ-Ol等較小型的培養(yǎng)槽進行培養(yǎng)時，通過能夠達到使空氣在常壓下0. 005L/分鐘 2L/分鐘、攪拌速度50rpm 2000rpm，較優(yōu)選能夠達到使空氣在常壓下0. 05L/分鐘 IL/分鐘、攪拌速度 IOOrpm IOOOrpm的通氣條件，可以得到理想結(jié)果。上述的通氣條件不需要從培養(yǎng)初期到結(jié)束一直進行，即使在培養(yǎng)工序的一部分中進行也能得到理想結(jié)果?；厥展ば蚴腔厥胀ㄟ^該接觸而獲得的DOI的工序，通常情況下從利用上述培養(yǎng)所得的培養(yǎng)物中回收DOI。本發(fā)明中所謂的培養(yǎng)物，是指利用上述方法生產(chǎn)的菌體、培養(yǎng)液及它們的處理物。作為從培養(yǎng)物中回收DOI的方法，例如從培養(yǎng)液中回收時，可以利用通常已知的方法。例如，利用離心分離等除去菌體后，將培養(yǎng)上清液添加到離子交換樹脂中，用蒸餾水進行洗脫?？梢砸贿厹y定折射率、PH、傳導(dǎo)率一邊分離得到不含雜質(zhì)的部分，除去其水溶液回收D0I。另外，由于利用本發(fā)明的方法生產(chǎn)的菌體生產(chǎn)了適合DOI生產(chǎn)的酶組，所以利用菌體進一步生產(chǎn)、回收DOI也被認為是從培養(yǎng)物回收DOI的方法的一部分。利用本發(fā)明，能夠以廉價的來自植物的糖為原料以極高的水平生產(chǎn)D0I。本發(fā)明對碳中和(carbon neutral)的DOI的普及極為有用。[實施例]以下記載本發(fā)明的實施例，但本發(fā)明并不受這些實施例的限制。另外，只要沒有特殊說明，實施例中的“ ％，，為質(zhì)量基準。[實施例1]<大腸桿菌pgi基因附近區(qū)域的克隆>大腸桿菌的基因組DNA的全部堿基序列是公知的(GenBank檢索號U00096)，編碼大腸桿菌的磷酸葡糖異構(gòu)酶(以下有時稱作pgi)的基因的堿基序列也已被報道了。為了克隆編碼Pgi的基因(l，650bp)的堿基序列的附近區(qū)域，合成了四種具有下述堿基序列的寡核苷酸引物CAGGAATTCG CTATATCTGG CTCTGCACG (序列號 1)、CAGTCTAGAG CAATACTCTT CTGATTTTGAG(序列號 2)、CAGTCTAGAT CATCGTCGAT ATGTAGGCC(序列號；3)及 GACCTGCAGA TCATCCGTCA GCTGTACGC(序列號4)。序列號1的引物在5，末端側(cè)具有EcoRI識別位點，序列號2及3的引物在5’末端側(cè)具有^CbaI識別位點，序列號4的引物在5’末端側(cè)具有I^stI 識別位點。利用 Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons)記載的方法制備大腸桿菌MG1655株的基因組DNA，使用所得的基因組DNA Iyg和下述引物的DNA 各lOOpmol，在通常的條件下進行PCR，由此分別擴增約1. 01Λ (以下有時稱作pgi_L片段及 Pgi-R片段)的DNA片段，所述引物為具有序列號1的堿基序列的引物和具有序列號2的堿基序列的引物的組合、具有序列號3的堿基序列的引物和具有序列號4的堿基序列的引物的組合。利用瓊脂糖電泳分離上述DNA片段并回收，分別用EcoRI及^CbaI消化pgi-L片段， 用^CbaI及I^stI消化pgi-R片段。將上述2種消化片段與溫度感受性質(zhì)粒pTH18csl (GenBank 檢索號AB019610)的EcoRI及I^stI消化物混合，利用T4DNA連接酶反應(yīng)后，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5ci感受態(tài)細胞(TAKARA BIO公司制)中，得到含有編碼pgi的基因的5’上游附近片段和3’上游附近片段這2個片段的質(zhì)粒，將其命名為pTHApgi。[實施例2]<大腸桿菌MG1655 Δ pgi株的制備>將實施例1中得到的質(zhì)粒ρΤΗ Δ pgi轉(zhuǎn)化到大腸桿菌MG1655株中，將其于使細胞能夠保持溫度感受性質(zhì)粒的30°C下、在含有10 μ g/ml氯霉素的LB瓊脂平板上培養(yǎng)一夜，得到轉(zhuǎn)化體。將所得的轉(zhuǎn)化體于30°C下在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)3小時至一夜后，用LB液體培養(yǎng)基或生理鹽水稀釋，涂布到含有10 μ g/ml氯霉素的LB瓊脂平板上。在不能保持溫度感受性質(zhì)粒的42°C下對該LB瓊脂平板進行培養(yǎng)，得到作為通過基因組外-基因組間的同源重組將質(zhì)粒整體參入到大腸桿菌基因組中的菌株的生長的轉(zhuǎn)化體。從該菌株獲得基因組DNA，實施以其作為模板的PCR，確認了該菌株具有下述性質(zhì)pTH18Csl具有的氯霉素耐性基因存在于基因組上，與編碼pgi的基因的5’端附近區(qū)域及3’端附近區(qū)域分別相同的區(qū)域存在于基因組上，從而確認了質(zhì)粒整體被參入到大腸桿菌基因組中。將質(zhì)粒整體被參入到大腸桿菌基因組中的菌株接種到IOOml裝有20ml不含氯霉素的LB液體培養(yǎng)基的帶擋板的燒瓶中，將其于30°C下振蕩培養(yǎng)4小時。用不含氯霉素的 LB液體培養(yǎng)基稀釋該培養(yǎng)液，涂布到不含氯霉素的LB瓊脂培養(yǎng)基上。于42°C下對其培養(yǎng)， 任意挑選96個生長的菌落，使它們分別在不含氯霉素的LB瓊脂培養(yǎng)基上和含有氯霉素的 LB瓊脂培養(yǎng)基上生長，挑選氯霉素感受性的菌株。進而從挑選的菌株中獲得基因組DNA，實施以其為模板的PCR，挑選編碼pgi的基因缺失的菌株，將其命名為MG1655 Δ pgi株。[實施例3]<大腸桿菌zwf基因的附近區(qū)域的克隆>編碼大腸桿菌的葡糖-6-磷酸脫氫酶(以下有時稱作zwf)的基因的堿基序列也被報道。為了克隆編碼ZWf的基因(l，476bp)的堿基序列附近區(qū)域，合成了 4種具有下述堿基序列的寡核苷酸引物CAGGAATTCA TGCGTTGCAG CACGATATC(序列號 5)、CAGTCTAGAT AACCCGGTAC TTAAGCCAG (序列號 6)、CAGTCTAGAC TGCGCTTATC CTTTATGGT (序列號 7)及 GACCTGCAGT TACCGGTCAT GCGTGTAAC (序列號8)。序列號5的引物在5，末端側(cè)具有EcoRI 識別位點，序列號6及7的引物在5’末端側(cè)具有^CbaI識別位點，序列號8的引物在5’末端側(cè)具有PstI識別位點。使用大腸桿菌MG1655株的基因組DNA 1 μ g和下述引物的DNA各IOOpmol，在通常條件下進行PCR，由此分別擴增約0. 85kb (以下有時稱作zwf-L片段)的DNA片段和約 1. Okb (以下有時稱作zwf-R片段)的DNA片段，所述引物為具有序列號5的堿基序列的引物和具有序列號6的堿基序列的引物的組合、具有序列號7的堿基序列的引物和具有序列號8的堿基序列的引物的組合。利用瓊脂糖電泳分離上述DNA片段并回收，分別用EcoRI 及^CbaI消化zwf-L片段，用^CbaI及I^stI消化zwf-R片段。將上述2種消化片段與溫度感受性質(zhì)粒pTH18csl的EcoRI及I^stI消化物混合，利用T4DNA連接酶反應(yīng)后，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5ci感受態(tài)細胞(TAKARA BIO公司制)中，得到含有編碼zwf的基因的5’上游附近片段和3’下游附近片段這2個片段的質(zhì)粒，命名為ρΤΗΔ zwf。[實施例4]<大腸桿菌MG1655 Δ pgi Δ zwf株的制備>將實施例3中得到的質(zhì)粒pTHAzwf轉(zhuǎn)化到實施例2中得到的大腸桿菌 MG1655Apgi株中，將其于使細胞能夠保持溫度感受性質(zhì)粒的30°C下、在含有10 μ g/ml氯霉素的LB瓊脂平板上培養(yǎng)一夜，得到轉(zhuǎn)化體。將所得的轉(zhuǎn)化體于30°C下在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)3小時至一夜后，用LB液體培養(yǎng)基或生理鹽水稀釋，涂布到含有10 μ g/ml氯霉素的LB 瓊脂平板上。在不能保持溫度感受性質(zhì)粒的42°C下對該LB瓊脂平板進行培養(yǎng)，得到作為通過基因組外-基因組間的同源重組將質(zhì)粒整體參入到大腸桿菌基因組中的菌株的生長的轉(zhuǎn)化體。從該菌株獲得基因組DNA，實施以其作為模板的PCR，確認了該菌株具有下述性質(zhì)具有pTH18csl的氯霉素耐性基因存在于基因組上，與編碼zwf的基因的5’端附近區(qū)域及3’端附近區(qū)域分別相同的區(qū)域存在于基因組上，從而確認了質(zhì)粒整體被參入到大腸桿菌基因組中。將質(zhì)粒整體被參入到大腸桿菌基因組中的菌株接種到IOOml裝有20ml不含氯霉素的LB液體培養(yǎng)基的帶擋板的燒瓶中，將其于30°C下振蕩培養(yǎng)4小時。用不含氯霉素的 LB液體培養(yǎng)基稀釋該培養(yǎng)液，涂布到不含氯霉素的LB瓊脂培養(yǎng)基上。將其在42°C下培養(yǎng)， 任意挑選96個生長的菌落，使它們分別在不含氯霉素的LB瓊脂培養(yǎng)基上和含有氯霉素的 LB瓊脂培養(yǎng)基上生長，挑選氯霉素感受性菌株。進而從挑選的菌株中獲得基因組DNA，實施以其為模板的PCR，挑選編碼zwf的基因缺失的菌株，將其命名為MG1655 Δ pgi Δ zwf株。[實施例5]<在GAPDH啟動子控制下的DOI合成酶基因(btrC)表達載體的構(gòu)建>大腸桿菌的GAPDH基因的堿基序列已經(jīng)被報道。為了獲得甘油醛_3_磷酸脫氫酶 (GAPDH)啟動子，分別合成了具有下述堿基序列的寡核苷酸引物CGAGCTACAT ATGCAATGAT TGACACGATT CCG (序列號鍆、及 CCAAGCTTCT GCAGGTCGAC GGATCCGAGC TCAGCTATTT GTTAGTGAAT AAAAGG(序列號10)。序列號9的引物在其5’末端側(cè)具有NdeI識別位點，序列號10的引物從其5’末端側(cè)依次分別具有HindIII、PstI、MlI、BamHUacI識別位點。使用上述2種引物和大腸桿菌MG1655株的基因組DNA作為模板，在通常條件下進行PCR法，擴增DNA片段。用限制酶NdeI和HindIII消化所得的DNA片段，由此得到約 IOObp的編碼GAPDH啟動子的片段。然后將上述DNA片段與用Ndel、HindIII消化的大腸桿菌用克隆載體PBR322 (GenBank檢索號J01749)混合，使用連接酶連接后，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5a感受態(tài)細胞(TAKARA BIO公司制)中，得到在含有50 μ g/mL氨芐西林的LB瓊脂平板上生長的轉(zhuǎn)化體。將所得的菌落于30°C下在含有50 μ g/mL氨芐西林的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)一夜，從所得的菌體中回收質(zhì)粒。將該質(zhì)粒命名為PGAP。環(huán)狀芽胞桿菌((Bacilluscirculans)ATCC 4513)具有的DOI 合成酶基因(btrC) 的堿基序列已經(jīng)被報道(GenBank檢索號AB066276)。為了獲得btrC基因，分別合成了具有下述堿基序列的寡核苷酸引物CACTGGAGCT CGCTGGTGGA ATATATGACG ACTAAACAAA TTTG(序列號 11)、及 CAGGATCCTT ACAGCCCTTC CCGGATC(序歹Ij號 12)。序列號 11 的引物從其5’末端側(cè)開始依次具有McI識別位點和13個堿基的GAPDH基因的核糖體結(jié)合序列。序列號12的引物在其5’末端側(cè)具有BamHI識別位點。以上述2種引物和環(huán)狀芽胞桿菌的基因組DNA為模板，在通常條件下進行PCR法， 用限制酶MeI及BamHI消化所得的DNA片段，由此得到約1. Ikbp的DOI合成酶基因(btrC) 片段。將該DNA片段與利用限制酶Mcl及BamHI消化質(zhì)粒pGAP所得的片段進行混合，使用連接酶連接后，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細胞(TAKARA BIO公司制)中，得到在含有 50 μ g/mL氨芐西林的LB瓊脂平板上生長的轉(zhuǎn)化體。將所得菌落于30°C下在含有50 μ g/mL 氨芐西林的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)一夜，從所得的菌體中回收質(zhì)粒pGAP-btrC，構(gòu)建DOI合成酶基因(btrC)表達載體。[實施例6]<在GAPDH啟動子控制下的DOI合成酶基因(btrC)及蔗糖水解酶基因(cscA)表達載體的構(gòu)建>大腸桿菌0-157株具有的蔗糖水解酶基因(cscA)的堿基序列已經(jīng)被報道。即，記載于GenBank檢索號AE005174中記載的大腸桿菌0-157株基因組序列的3274383-3275816 中。為了獲得cscA基因，分別合成了具有下述堿基序列的寡核苷酸引物GCGGATCCGC TGGTGGAATA TATGACGCAA TCTCGATTGC (序列號 13)、及 GACGCGTCGA CTTAACCCAG TTGCCAGAGT GC(序列號14)。序列號13的引物從其5’末端側(cè)開始依次具有BamHI識別位點和13個堿基的GAPDH基因的核糖體結(jié)合序列。序列號14的引物在其5’末端側(cè)具有MlI識別位點。以上述2種引物和大腸桿菌0-157株的基因組DNA(SIGMA-ALDRICH:IRMM449)為模板，在通常條件下進行PCR法，利用限制酶BamHI及MlI消化所得的DNA片段，由此得到約1. 4kbp的蔗糖水解酶基因(cscA)片段。將該DNA片段與利用限制酶BamHI及McI消化質(zhì)粒pGAP-btrC所得的片段進行混合，使用連接酶連接后，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細胞(TAKARA BIO公司制)中，得到在含有50 μ g/mL氨芐西林的LB瓊脂平板上生長的轉(zhuǎn)化體。將所得的菌落于30°C下在含有氨芐西林50 μ g/mL的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)一夜，從所得的菌體中回收質(zhì)粒pGAP-btrC-cscA，構(gòu)建DOI合成酶基因(btrC)及蔗糖水解酶基因 (cscA)表達載體。[實施例7]〈在GAPDH啟動子控制下的DOI合成酶基因(btrC)、蔗糖水解酶基因(cscA)及葡萄糖轉(zhuǎn)運促進蛋白質(zhì)基因(glf)表達載體的構(gòu)建〉運動發(fā)酵單胞菌((Zymomonas mobilis)ATCC 29191)具有的葡萄糖轉(zhuǎn)運促進蛋白質(zhì)基因(glf)的堿基序列已經(jīng)被報道(GenBank檢索號M60615)。為了獲得glf基因，分別合成了具有下述堿基序列的寡核苷酸引物CCTGTCGACG CTGGTGGMT ATATGAGTTC TGMAGTAGT CAGG(序列號 15)、及 CTACTGCAGC TACTTCTGGG AGCGCCACA(序列號 16)。序列號 15 的引物從其5’末端側(cè)開始依次具有MlI識別位點和13個堿基的GAPDH基因的核糖體結(jié)合序列。 序列號16的引物在其5’末端側(cè)具有I^stI識別位點。以上述2種引物和運動發(fā)酵單胞菌的基因組DNA為模板，在通常條件下進行PCR 法，利用限制酶MlI及I3StI消化所得的DNA片段，由此得到約1. 4kbp的葡萄糖轉(zhuǎn)運促進蛋白質(zhì)基因(glf)片段。將該DNA片段與利用限制酶MlI及I^stI消化質(zhì)粒pGAP-btrC-cscA 所得的片段混合，使用連接酶連接后，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5ci感受態(tài)細胞(TAKARA BIO公司制)中，得到在含有50 μ g/mL氨芐西林的LB瓊脂平板上生長的轉(zhuǎn)化體。將所得的菌落于 30°C下在含有50 μ g/mL氨芐西林的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)一夜，從所得的菌體中回收質(zhì)粒 pGAP-btrC-cscA-glf，構(gòu)建DOI合成酶基因(btrC)、蔗糖水解酶基因(cscA)及葡萄糖轉(zhuǎn)運促進蛋白質(zhì)基因(glf)表達載體。[實施例8]<pGAP-btrC-cscA 及 pGAP-btrC-cscA-glf 向 MG1655 Δ pgi Δ zwf 株的導(dǎo)入 >將上述質(zhì)粒pGAP-btrC-cscA 及 pGAP-btrC-cscA-glf 分別轉(zhuǎn)化到 MG1655 Δ pgi Δ zwf株中，于37°C下在含有50 μ g/mL氨芐西林的LB瓊脂平板上培養(yǎng)一夜，由此得到 MG1655 Δ pgi Δ zwf/pGAP-btrC-cscA 株及 MG1655 Δ pgi Δ zwf/pGAP-btrC-cscA-glf 株。[實施例9]<使用MG1655 Apgi Δ zwf/pGAP-btrC-cscA株的DOI的生產(chǎn)率和由培養(yǎng)pH引起的 DOI的生產(chǎn)率的不同>
作為預(yù)培養(yǎng)，將大腸桿菌MG1655 Apgi Δ zwf/pGAP-btrC-cscA株接種到25ml裝入錐形瓶的LB Broth, Miller培養(yǎng)液(DifcoM4620)中，以120rpm進行攪拌培養(yǎng)一夜后，全部接種到裝有475g下述組成的培養(yǎng)基的IL容量的培養(yǎng)槽(ABLE公司制培養(yǎng)裝置BMJ-01) 中。培養(yǎng)在大氣壓下、通氣量1. Ovvm、攪拌速度SOOrpm、培養(yǎng)溫度30°C下進行。共使用4臺培養(yǎng)槽，使用12. 5%氨水和2N鹽酸將pH調(diào)至ρΗ7· 0、ρΗ6· 5、ρΗ6· 0。另外，通過測定660nm 處的吸光度測定菌體濃度。培養(yǎng)開始時的菌體濃度全部為0. 29。培養(yǎng)62小時后，利用HPLC 按照常規(guī)方法測定所得的培養(yǎng)液中的D0I、蔗糖、葡萄糖、果糖的量。另外，通過測定660nm 處的吸光度測定菌體濃度。培養(yǎng)中使用的培養(yǎng)基的組成記載于下述表1。結(jié)果示于表2。
權(quán)利要求
1.一種生產(chǎn)DOI的大腸桿菌，所述大腸桿菌在蔗糖非PTS基因組中至少具有編碼蔗糖水解酶(CscA)的基因，同時被賦予2-脫氧蟹肌醇(DOI)生產(chǎn)系統(tǒng)或具有被增強的2-脫氧蟹肌醇(DOI)生產(chǎn)系統(tǒng)。
2.如權(quán)利要求1所述的生產(chǎn)DOI的大腸桿菌，其中，所述大腸桿菌在蔗糖非PTS基因組中只具有編碼蔗糖水解酶(CscA)的基因。
3.如權(quán)利要求1所述的生產(chǎn)DOI的大腸桿菌，所述生產(chǎn)DOI的大腸桿菌具有糖攝入能力增強系統(tǒng)。
4.如權(quán)利要求3所述的生產(chǎn)DOI的大腸桿菌，所述生產(chǎn)DOI的大腸桿菌中，選自由所述大腸桿菌本身具有的磷酸葡糖異構(gòu)酶(Pgi)、葡糖-6-磷酸-1-脫氫酶(Zwf)、葡糖磷酸變位酶(Pgm)及負責(zé)穩(wěn)定期中蛋白質(zhì)合成的修飾的核糖體修飾因子(Rmf)組成的組中的至少 1種的活性失活或活性降低。
5.如權(quán)利要求1所述的生產(chǎn)DOI的大腸桿菌，其中，所述生產(chǎn)DOI的系統(tǒng)來自DOI合成酶(BtrC)活性。
6.如權(quán)利要求3所述的生產(chǎn)DOI的大腸桿菌，其中，所述糖攝入能力增強系統(tǒng)為葡萄糖轉(zhuǎn)運促進蛋白質(zhì)(Glf)活性的增強。
7.如權(quán)利要求1所述的生產(chǎn)DOI的大腸桿菌，其中，所述編碼蔗糖水解酶(CscA)的基因來自大腸桿菌細菌。
8.如權(quán)利要求7所述的生產(chǎn)DOI的大腸桿菌，其中，所述大腸桿菌細菌是大腸桿菌 0-157細菌。
9.如權(quán)利要求6所述的生產(chǎn)DOI的大腸桿菌，其中，所述葡萄糖轉(zhuǎn)運促進蛋白質(zhì)(Glf) 來自發(fā)酵單胞菌屬細菌。
10.如權(quán)利要求9所述的生產(chǎn)DOI的大腸桿菌，其中，所述發(fā)酵單胞菌屬細菌為運動發(fā)酵單胞菌細菌。
11.如權(quán)利要求1所述的生產(chǎn)DOI的大腸桿菌，其中，所述生產(chǎn)DOI的大腸桿菌是本身不具有蔗糖同化能力的種類的大腸桿菌。
12.如權(quán)利要求11所述的生產(chǎn)DOI的大腸桿菌，其中，所述生產(chǎn)DOI的大腸桿菌是B株或其衍生株。
13.—種生產(chǎn)DOI的方法，包括使用權(quán)利要求1所述的生產(chǎn)DOI的大腸桿菌由含有蔗糖的來自植物的原料生產(chǎn)DOI。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種生產(chǎn)DOI的大腸桿菌及使用所述大腸桿菌由含有蔗糖的來自植物的原料生產(chǎn)DOI的DOI生產(chǎn)方法，所述生產(chǎn)DOI的大腸桿菌在蔗糖非PTS基因組中至少具有編碼蔗糖水解酶(CscA)的基因，同時所述大腸桿菌被賦予2-脫氧蟹肌醇(DOI)生產(chǎn)系統(tǒng)或具有被增強的2-脫氧蟹肌醇(DOI)生產(chǎn)系統(tǒng)，優(yōu)選為進一步具有糖攝入能力增強系統(tǒng)的生產(chǎn)DOI的大腸桿菌。
文檔編號C12R1/19GK102197135SQ20098014311
公開日2011年9月21日 申請日期2009年10月30日 優(yōu)先權(quán)日2008年11月5日
發(fā)明者和田光史, 夏地智之, 安樂城正, 德田淳子, 森重敬, 高橋克幸, 高橋均 申請人:三井化學(xué)株式會社