專利名稱：制備光學活性胺衍生物的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及通過立體選擇地還原亞胺衍生物來制備光學活性胺衍生物的方法，該光學活性胺衍生物用作合成藥物等的原料或中間體。
背景技術：
本領域技術人員已經(jīng)了解參與氨基酸(例如1-吡咯啉-2-羧酸或1-吡咯啉-5-羧酸)代謝的酶，和具有特定結構與功能的、可還原亞胺衍生物的酶，例如二氫葉酸還原酶。然而，除了下述報道之外，對可通過立體選擇地還原簡單的亞胺化合物(例如2-甲基-ι-吡咯啉)來制備光學活性胺衍生物的酶或微生物知之甚少。非專利文獻1 =Tetrahedron, 60，753-758，2004Reduction of N-benzylidenebenzylamine by Acetobacterium woodi非專利文獻 2 =Tetrahedron Asymmetry, 19，93-96 (2008)Reduction of N-((E)_N_ (1-phenylethylidene)ani1ine derivatives by Candida parapsilosis然而，由于N-亞芐基苯甲胺(N-benzylidenebenzylamine)的還原產(chǎn)物沒有手性， 所以還不清楚該反應的立體選擇性。此外，近平滑假絲酵母(Candida parapsilosis)還原 N-((E)-N-(1-苯基亞乙基)苯胺衍生物的效率非常低，因此并不適于工業(yè)應用。另外，還沒有鑒別出負責所述亞胺還原的酶。另一方面，已知下面的方法可用于制備2-甲基吡咯烷非專利文獻3 :Acta. Pharm. Suec.，15，255-263,1978使用酒石酸，通過光學拆分外消旋2-甲基吡咯烷來制備手性2-甲基吡咯烷的方法，其中，外消旋2-甲基吡咯烷是使用硼氫化鈉還原2-甲基-1-吡咯啉來制備的。非專利文獻4 J. Org. Chem. ,54,209-216,1989制備2-甲基吡咯烷的方法，其中，使用亞硫酰氯將L-脯氨酸衍生的L-脯氨醇(L-prolinol)的羥基轉變?yōu)槁然鶊F；用芐氧基羰基保護氮原子；然后使用三正丁基氫錫(tributyltin hydride)，通過基于自由基(radical)的還原來制備(R)-I-芐氧基羰基-2-甲基吡咯烷，然后進行脫保護。專利文獻1 :W02005/073388制備(R)-2_甲基吡咯烷的方法，其中，光學活性(S)-l，4_戊二醇轉變?yōu)槎撬狨?，以及與苯甲胺的反應來進行環(huán)化，從而合成(R)-1-芐基-2-甲基-1-吡咯烷，然后進行
脫芐基。然而，所有這些方法均具有下面的問題-過程長；-使用危險的氫化物試劑；-使用昂貴的光學活性二醇作為原料；以及-由于通過光學拆分方法制備產(chǎn)物，因此產(chǎn)率不超過50%
[現(xiàn)有技術文獻][非專利文獻][非專利文獻 1] Tetrahedron, 60，753-758 (2004)[非專利文獻 2] Tetrahedron Asymmetry, 19，93-96 (2008)[非專利文獻 3] Acta. Pharm. Suec.，15，255-263 (1978)[非專利文獻 4] J. Org. Chem.，54，209-216 (1989)[專利文獻 l]W02005/073388

發(fā)明內(nèi)容
[本發(fā)明要解決的問題]本發(fā)明的目的是提供由亞胺衍生物來制備光學活性胺衍生物的方法。本發(fā)明的另一個目的是提供微生物和酶，這些微生物和酶能夠使用亞胺衍生物作為底物來制備光學活性胺衍生物。本發(fā)明的另一個目的是通過分離編碼具有目標性質的酶的DNA來獲得重組體。本發(fā)明的又一個目的是提供使用重組體來制備光學活性胺衍生物的方法。[解決問題的方法]本發(fā)明人等探索了能夠使用亞胺衍生物作為底物來制備光學活性胺衍生物的微生物，成功地發(fā)現(xiàn)了具有目標活性的微生物。本發(fā)明人等鑒定了所得到微生物，并確定下述微生物均屬于鏈霉菌屬(Str印tomyces)。本發(fā)明人鑒定的微生物可以通過2_甲基-1-吡咯啉的不對稱還原來制備例如(R)-2-甲基吡咯烷。鏈霉菌(Streptomyces sp.)GF3587 ；鏈霉菌(Sti^ptomyces sp.)GF3501;鏈霉菌(Sti^ptomycessp.)GF3585 ；和鏈霉菌(Sti^ptomyces sp.)GF4415。這些微生物當中，顯示出最強活性的鏈霉菌GF3587用于分析可通過2-甲基-1-吡咯啉的不對稱還原來制備(R)-2-甲基吡咯烷的酶的性質。該酶顯示是NADPH-依賴亞胺還原酶。本發(fā)明人還通過大量GF3587培養(yǎng)物來制備無細胞提取物、然后進行下述步驟成功地純化了亞胺還原酶-硫酸銨分級；-使用DEAE-葡聚糖纖維素(S^hacel)的離子交換色譜；-使用苯基瓊脂糖凝膠(Wienylwpharose)的疏水色譜；和-使用2',5' -ADP瓊脂糖凝膠4B的親和色譜。此外，本發(fā)明人分離了編碼該酶的DNA，并且構建了高水平表達該酶的重組細菌。同時，使用BLAST程序，進行SEQ ID NO 6的氨基酸序列的同一性檢索(相對于 SWISS-PR0T)，發(fā)現(xiàn)與本發(fā)明的亞胺還原酶同樣的蛋白質。具體來說，它是一個被命名為 Q1EQE0的推定蛋白，其通過卡那霉素鏈霉菌(Sti^ptomyces kanamyceticus)的基因組分析來鑒定。該蛋白質的功能是未知的。制備高水平表達Q1EQE0的重組細菌，并評價Q1EQE0 的性質。結果表明Q1EQE0具有亞胺還原活性。如上所述，已知涉及立體選擇地還原亞胺衍生物的生物合成的酶。然而，所有已知的酶與氨基酸或葉酸代謝有關。
因此，當酶用于制備藥物的中間體或諸如此類物質時，不能預期工業(yè)應用需要的底物特異性和活性。尤其是，沒有利用還原環(huán)狀烷基亞胺衍生物(例如2-甲基-1-吡咯啉)來制備光學活性環(huán)狀烷基胺衍生物的合適方法。因此，令人非常驚訝的是發(fā)現(xiàn)了具有底物特異性和催化活性的微生物，其適于制備藥物等的中間體。更意外的是，微生物的立體選擇地還原亞胺的能力十分地高，并且滿足工業(yè)應用的需要。此外，本發(fā)明人分離了編碼亞胺還原酶的DNA，然后制備了高水平表達該酶的重組細菌，由此完成了本發(fā)明。具體來說，本發(fā)明提供了制備光學活性胺的方法，如下所述。本發(fā)明還涉及可用于該方法的微生物和亞胺還原酶，包含編碼這種酶的DNA的多核苷酸，制備該酶的方法和其用途。[1] 一種亞胺還原酶，其具有下面物理化學性質(1) (5)(1)活性以還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(在下文簡寫為NADPH)-依賴方式還原2-甲基-1-吡咯啉從而產(chǎn)生(R)-2-甲基吡咯烷；(2)輔酶依賴性使用NADPH作為輔酶；(3)最適 pH 值6.0 7.0;(4)最適溫度40 55°C ；以及(5)分子量利用十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(在下文簡寫為SDS-PAGE) 約為32000，以及利用凝膠過濾法約為65000 70000。[2] [1]項所述的亞胺還原酶，其來源于屬于鏈霉菌屬的微生物。[3] [2]項所述的亞胺還原酶，其中，屬于鏈霉菌屬的微生物選自下述中的任意微生物鏈霉菌NITE BP-594 ；鏈霉菌NITE BP-595 ；鏈霉菌NITE BP-596 ；以及鏈霉菌NITE BP-597。[4] [2]項所述的亞胺還原酶，其中屬于鏈霉菌屬的微生物選自下述中的任意微生物灰銹赤鏈霉菌(Sti^ptomyce s griseorubiginosus)；細黃鏈霉菌(Sti^ptomyces microflavus)；以及白綠鏈霉菌(Streptomyces alboviridis)。[5] [4]項所述的亞胺還原酶，其中灰銹赤鏈霉菌、細黃鏈霉菌和白綠鏈霉菌分別是下面的微生物菌株^clf ^1]! (Streptomyces griseorubiginosus)NBRC 13047 ；細黃鏈霉菌(Sti^ptomycesmicroflavus) NBRC 13062;以及白綠鏈霉菌(Sti^ptomyces alboviridis)NBRC 13013。[6] 一種亞胺還原酶，其具有[1]項的物理化學性質⑴和0)，并且其是由下面 (a) (e)中的任意多核苷酸編碼的(a)包括SEQ ID NO 5所述的核苷酸序列的多核苷酸；(b)編碼蛋白質的多核苷酸，其中該蛋白質包括SEQ ID NO :6所述的氨基酸序列；
(c)編碼蛋白質的多核苷酸，其中該蛋白質包括在SEQ ID NO :6所述的氨基酸序列中取代、缺失、插入和/或添加了一個或多個氨基酸的氨基酸序列；(d)在嚴格條件下與DNA雜交的多核苷酸，其中該DNA包括SEQ IDNO 5所述的核苷酸序列；以及(e)編碼氨基酸序列的多核苷酸，其中該氨基酸序列與SEQ ID NO :6所述的氨基酸序列具有80%或更高的序列同一性。[7] 一種亞胺還原酶，其包括具有[1]項的物理化學性質(1)和O)，且具有產(chǎn)生至少80% ee或更高光學純度的(R)-2-甲基吡咯烷的功能的蛋白質，并且該蛋白質通過下面(a) (e)中的任意多核苷酸進行編碼(a)包括SEQ ID NO 16所述的核苷酸序列的多核苷酸；(b)編碼蛋白質的多核苷酸，其中該蛋白質包括SEQ ID N0:17所述的氨基酸序列；(c)編碼蛋白質的多核苷酸，其中該蛋白質包括在SEQ ID N0:17所述的氨基酸序列中取代、缺失、插入和/或添加了一個或多個氨基酸的氨基酸序列；(d)在嚴格條件下與DNA雜交的多核苷酸，其中該DNA包括SEQ IDNO 16所述的核苷酸序列；以及(e)編碼氨基酸序列的多核苷酸，其中該氨基酸序列與SEQ ID NO :17所述的氨基酸序列具有80%或更高的序列同一性。[8]制備光學活性R-異構體胺衍生物的方法，該方法包括下述步驟使式(I)代表的亞胺衍生物與至少一種選自下述的酶活性物質接觸，所述酶活性物質為具有立體選擇地還原所述化合物能力的微生物的培養(yǎng)物；菌體；和其處理物；以及回收式(II)代表的光學活性R-異構體胺衍生物式⑴
權利要求
1.一種亞胺還原酶，其具有下述物理化學性質(1) (5)(1)活性以還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(在下文簡寫為NADPH)-依賴方式還原2-甲基-1-吡咯啉從而產(chǎn)生(R)-2-甲基吡咯烷；(2)輔酶依賴性使用NADPH作為輔酶；(3)最適pH 值6. 0 7. 0;(4)最適溫度40 55°C；以及(5)分子量利用十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(在下文簡寫為SDS-PAGE)約為32000，以及利用凝膠過濾法約為65000 70000。
2.權利要求1所述的亞胺還原酶，其來源于屬于鏈霉菌屬(Sti^ptomyces)的微生物。
3.權利要求2所述的亞胺還原酶，其中，屬于鏈霉菌屬的微生物選自下述中的任意微生物鏈霉菌(Sti^ptomyces sp. )NITE BP-594 ； 鏈霉菌(Sti^ptomyces sp. )NITE BP-595 ； 鏈霉菌(Sti^ptomyces sp. )NITE BP-596;以及鏈霉菌(Sti^ptomyces sp.)NITE BP-597。
4.權利要求2所述的亞胺還原酶，其中，屬于鏈霉菌屬的微生物選自下述中的任意微生物灰繡赤鏈霉菌(Streptomyces griseorubiginosus)； 細黃鏈霉菌(Streptomyces microflavus)；以及白綠鏈霉菌(Streptomyces alboviridis)。
5.權利要求4所述的亞胺還原酶，其中，灰銹赤鏈霉菌、細黃鏈霉菌和白綠鏈霉菌分別是下面的微生物菌株灰銹赤鏈霉菌NBRC 13047 ； 細黃鏈霉菌NBRC 13062;以及白綠鏈霉菌NBRC 13013。
6.一種亞胺還原酶，其具有權利要求1的物理化學性質(1)和0)，并且其由下面 (a) (e)中的任意多核苷酸編碼(a)包括SEQID NO 5所述的核苷酸序列的多核苷酸；(b)編碼蛋白質的多核苷酸，其中該蛋白質包括SEQID NO :6所述的氨基酸序列；(c)編碼蛋白質的多核苷酸，其中該蛋白質包括在SEQID NO :6所述的氨基酸序列中取代、缺失、插入和/或添加了一個或多個氨基酸的氨基酸序列；(d)在嚴格條件下與DNA雜交的多核苷酸，其中該DNA包括SEQIDNO 5所述的核苷酸序列；以及(e)編碼氨基酸序列的多核苷酸，其中該氨基酸序列與SEQID NO :6所述的氨基酸序列具有80%或更高的序列同一性。
7.一種亞胺還原酶，其包括具有權利要求1的物理化學性質(1)和O)，且具有產(chǎn)生至少80% ee或更高光學純度的(R)-2-甲基吡咯烷功能的蛋白質，并且該蛋白質由下面 (a) (e)中的任意多核苷酸編碼(a)包括SEQ ID NO 16所述的核苷酸序列的多核苷酸；(b)編碼蛋白質的多核苷酸，其中該蛋白質包括SEQID NO :17所述的氨基酸序列；(c)編碼蛋白質的多核苷酸，其中該蛋白質包括在SEQID NO: 17所述的氨基酸序列中取代、缺失、插入和/或添加了一個或多個氨基酸的氨基酸序列；(d)在嚴格條件下與DNA雜交的多核苷酸，其中該DNA包括SEQIDNO 16所述的核苷酸序列；以及(e)編碼氨基酸序列的多核苷酸，其中該氨基酸序列與SEQID N0:17所述的氨基酸序列具有80%或更高的序列同一性。
8.制備光學活性R-異構體胺衍生物的方法，該方法包括下述步驟 使式(I)代表的亞胺衍生物與至少一種選自下述的酶活性物質接觸，所述酶活性物質為具有立體選擇地還原所述化合物能力的微生物的培養(yǎng)物、菌體、和其處理物；以及回收式(II)代表的光學活性R-異構體胺衍生物； 式⑴
9.權利要求8所述的方法，其中式(I)的化合物是下式(III)代表的亞胺衍生物，以及式(II)的化合物是式(IV)代表的胺衍生物， 式(III)
10.權利要求9所述的制備光學活性R-異構體胺衍生物的方法，其中，式(III)代表的化合物是2-甲基-1-吡咯啉，以及式(IV)代表的化合物是2-甲基吡咯烷。
11.權利要求8 10中任一項所述的制備光學活性R-異構體胺衍生物的方法，其中， 所述微生物屬于鏈霉菌屬。
12.權利要求11所述的制備光學活性R-異構體胺衍生物的方法，其中，所述屬于鏈霉菌屬的微生物是選自下述中的任意微生物鏈霉菌 NITE BP-594 ； 鏈霉菌 NITE BP-595 ； 鏈霉菌NITE BP-596 ；以及鏈霉菌 NITE BP-597。
13.權利要求11所述的制備光學活性R-異構體胺衍生物的方法，其中，所述屬于鏈霉菌屬的微生物選自下述中的任一種灰銹赤鏈霉菌； 細黃鏈霉菌；以及白綠鏈霉菌。
14.權利要求13所述的制備光學活性R-異構體胺衍生物的方法，其中，所述灰銹赤鏈霉菌、細黃鏈霉菌和白綠鏈霉菌分別是下面的微生物菌株灰銹赤鏈霉菌NBRC 13047 ； 細黃鏈霉菌NBRC 13062 ；以及白綠鏈霉菌NBRC 13013。
15.制備光學活性R-異構體胺衍生物的方法，該方法包括下述步驟使式(I)代表的亞胺衍生物與至少一種選自下述的酶活性物質接觸，所述酶活性物質為權利要求1 7中任一項所述的亞胺還原酶、產(chǎn)生該亞胺還原酶的微生物、和其處理物； 以及回收式(II)代表的光學活性R-異構體胺衍生物； 式⑴
16.權利要求15所述的方法，其中式(I)代表的化合物是下式(III)代表的亞胺衍生物，以及式(II)的化合物是式(IV)代表的胺衍生物 式(III)式(II)
17.一種多核苷酸，其編碼具有權利要求1的物理化學性質(1)和O)的亞胺還原酶， 且其是下面多核苷酸中的任意多核苷酸(a)包括SEQID NO 5所述的核苷酸序列的多核苷酸；(b)編碼蛋白質的多核苷酸，其中該蛋白質包括SEQID NO :6所述的氨基酸序列；(c)編碼蛋白質的多核苷酸，其中該蛋白質包括在SEQID NO :6所述的氨基酸序列中取代、缺失、插入和/或添加了一個或多個氨基酸的氨基酸序列；(d)在嚴格條件下與DNA雜交的多核苷酸，其中該DNA包括SEQID NO 5所述的核苷酸序列；以及(e)編碼氨基酸序列的多核苷酸，其中該氨基酸序列與SEQID NO :6所述的氨基酸序列具有80%或更高的序列同一性。
18.一種多核苷酸，其編碼亞胺還原酶，該亞胺還原酶具有權利要求1的物理化學性質 (1)和(2)和具有產(chǎn)生至少80% ee或更高光學純度的(R) _2_甲基吡咯烷的功能，并且其是下面多核苷酸中的任意多核苷酸(a)包括SEQID NO 16所述的核苷酸序列的多核苷酸；(b)編碼蛋白質的多核苷酸，其中該蛋白質包括SEQID NO :17所述的氨基酸序列；(c)編碼蛋白質的多核苷酸，其中該蛋白質包括在SEQID NO: 17所述的氨基酸序列中取代、缺失、插入和/或添加了一個或多個氨基酸的氨基酸序列；(d)在嚴格條件下與DNA雜交的多核苷酸，其中該DNA包括SEQID N0:16所述的核苷酸序列；以及(e)編碼氨基酸序列的多核苷酸，其中該氨基酸序列與SEQID NO :17所述的氨基酸序列具有80%或更高的序列同一性。
19.一種重組載體，其插入有權利要求17或18所述的多核苷酸。
20.權利要求19所述的重組載體，其還插入有編碼脫氫酶的多核苷酸，所述脫氫酶能夠催化以β-煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸作為輔酶的氧化還原反應。
21.權利要求20所述的載體，其中所述脫氫酶是葡糖脫氫酶。
22.權利要求21所述的重組載體，其中所述葡糖脫氫酶來源于枯草芽孢桿菌 (Bacillus subtilis)。
23.一種轉化體，其以能表達的方式保持權利要求17或18所述的多核苷酸或權利要求 19所述的載體。
24.制備由權利要求17或18所述的多核苷酸所編碼的蛋白質的方法，該方法包括培養(yǎng)權利要求23所述的轉化體并回收表達產(chǎn)物的步驟。
全文摘要
本發(fā)明分離和純化立體選擇地還原亞胺衍生物的新酶，并克隆編碼該酶的多核苷酸。利用可立體選擇地還原所述化合物的微生物的培養(yǎng)物、菌體或其處理物和/或其亞胺還原酶作用于亞胺衍生物，來制備光學活性胺衍生物，然后回收所產(chǎn)生的光學活性胺衍生物。本發(fā)明能夠制備例如式(IV)代表的光學活性化合物(式中，R基團代表具有1～3個碳原子的烷基；n代表1至4的整數(shù))。
文檔編號C12P17/10GK102203244SQ20098014319
公開日2011年9月28日 申請日期2009年9月1日 優(yōu)先權日2008年9月1日
發(fā)明者吉田豐和, 山本浩明, 木本訓弘, 石田浩一, 長澤透 申請人:大賽璐化學工業(yè)株式會社