專利名稱：培養(yǎng)細(xì)胞、增殖和純化病毒的方法
培養(yǎng)細(xì)胞、增殖和純化病毒的方法1.對在聯(lián)邦資助研究與開發(fā)下作出的發(fā)明的權(quán)利聲明本文所述的一項(xiàng)或多項(xiàng)發(fā)明在衛(wèi)生與公眾服務(wù)部(Health and Human Services) 授予的合約號HHS0100200600010C的政府支持下完成。因此，政府可享有本發(fā)明的某些權(quán)利。
2.發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及新的細(xì)胞培養(yǎng)基和培養(yǎng)細(xì)胞，具體為非致瘤性MDCK細(xì)胞的方法。本發(fā)明還涉及在細(xì)胞培養(yǎng)物中產(chǎn)生病毒(例如，流感病毒、RSV)的方法。本發(fā)明還提供從生物反應(yīng)器中培養(yǎng)的貼壁細(xì)胞純化細(xì)胞相關(guān)病毒以供開發(fā)疫苗的方法。3.
背景技術(shù)：
接種疫苗是預(yù)防由病毒感染引起的疾病的最重要的公共衛(wèi)生措施。疫苗的有效應(yīng)用依賴于能夠從穩(wěn)定和易于培養(yǎng)的來源迅速產(chǎn)生大量疫苗材料(例如病毒)。疫苗的迅速開發(fā)和有豐富的疫苗可用對于抵御多種人類和動物疾病至關(guān)重要。疫苗生產(chǎn)的延遲及其產(chǎn)量不足可導(dǎo)致疾病爆發(fā)方面的問題。例如，近期的研究顯示對產(chǎn)生針對大流行流感的疫苗所需的交付時間長的擔(dān)憂是有原因的。參見例如，Wood，J. Μ.，2001，Philos. Trans. R. Soc. Lond. B.Biol.Sci.，356 :1953。因此，近期生產(chǎn)疫苗的努力集中于在細(xì)胞培養(yǎng)物中培養(yǎng)用于疫苗的病毒。3. 1流感病毒具體而言，采用馬丁-達(dá)比狗腎(MDCK)細(xì)胞已受到多個研究組的推行。參見例如， U. S. 6，455，298、U. S. 2005/0118140、U. S. 2005/0118698、U. S. 6，825，306、W02005/113758 和 Radaeva，I. F.等 Vopr. Virusol. 0005)50:43-6。然而，多個現(xiàn)存 MDCK 細(xì)胞系具有一種
或多種缺陷，包括致瘤性、細(xì)胞培養(yǎng)中需要動物血清以及適用于疫苗的流感病毒產(chǎn)率低。此外，已開發(fā)的用于從這些細(xì)胞系生產(chǎn)疫苗材料的多種細(xì)胞培養(yǎng)方法常需要大量操作，包括培養(yǎng)基交換步驟和使用大量病毒接種。此外，由于不斷出現(xiàn)(或重現(xiàn))不同流感毒株，各季根據(jù)流行的流感毒株產(chǎn)生新的流感疫苗。不幸的是，一些流感疫苗毒株更難以生長達(dá)到高產(chǎn)率。各批次細(xì)胞培養(yǎng)物衍生材料的產(chǎn)率不僅決定生產(chǎn)能力，還影響制備產(chǎn)物的成本，因此希望提高病毒產(chǎn)率(即峰病毒效價)。近期已開發(fā)了可培養(yǎng)疫苗毒株達(dá)到非常高效價的新的無血清培養(yǎng)基和非致瘤性細(xì)胞系和在一次性生物反應(yīng)器中生產(chǎn)病毒材料的方法(參見U. S. 2006/0188977和2007年 9月14日提交的U. S. S. N. 11/855，769)。本發(fā)明拓展了該研究并提供了新的細(xì)胞培養(yǎng)基和在生物反應(yīng)器中從MDCK細(xì)胞，具體為非致瘤性細(xì)胞系生產(chǎn)大量疫苗材料而不需進(jìn)行培養(yǎng)基交換的高再現(xiàn)性有效可升級方法，以及高度純化減毒活疫苗生產(chǎn)的可靠下游純化方法。 本發(fā)明提供的方法可靠，需要最小量的操作，并可節(jié)約成本。3. 2呼吸道合胞病毒(RSV)人呼吸道合胞病毒(RSV)是造成嬰兒和兒童中嚴(yán)重下呼吸道感染(LRTI)的主要原因，引起相當(dāng)大的發(fā)病率和死亡率。七個主要市場(美國、日本、法國、德國、意大利、西班牙、英國)中每年總共有1800萬人感染，包括300萬成人和約400，000早產(chǎn)嬰兒。僅在美國，每年估計(jì)有70，000-125, 000個住院治療病例由RSV LRTI造成。人群中存在兩種抗原性不同的RSV亞群A和B。RSV還被視作免疫應(yīng)答受損成人和老年人中的重要感染因子。由于天然感染誘導(dǎo)的對RSV再感染的抗性不完整，RSV可在兒童時期和生命期中進(jìn)行多次感染。RSV免疫預(yù)防的目的是誘導(dǎo)足夠的抗性以預(yù)防可能與RSV感染相關(guān)的嚴(yán)重疾病。目前開發(fā)RSV疫苗的策略主要圍繞給予純化的病毒抗原或開發(fā)鼻內(nèi)給予的減毒活RSV。然而，迄今為止尚未出現(xiàn)獲批準(zhǔn)的RSV疫苗。病毒基因組RNA采用裸RNA形式時不具有感染性。RSV的RNA基因組由主要核殼體(N)蛋白緊密包殼，與磷蛋白(P)和大(L)聚合酶亞基相關(guān)聯(lián)。這些蛋白質(zhì)形成核蛋白核心，被視作感染性的最小單位(Brown等，1967，J. Virol. 1 :368-373)。盡管經(jīng)過數(shù)十年的研究，但尚未開發(fā)出市售的安全有效的RSV疫苗以供預(yù)防與 RSV感染相關(guān)的嚴(yán)重發(fā)病率和致死率。福爾馬林滅活病毒疫苗無法提供針對RSV感染的保護(hù)作用，并實(shí)際上導(dǎo)致嬰兒在隨后感染野生型病毒期間癥狀加劇(Kapikian等，1969， Am. J. Epidemiol. 89 :405-21 ；Chin 等，1969，Am. J. Epidemiol. 89 :449-63)。自那以后的努力集中在通過重組方法、化學(xué)誘變和將野生型RSV冷傳代為溫度敏感性突變體來開發(fā)活的減毒突變體(Gharpure 等，1969，J. Virol. 3 :414-21 ；Crowe 等，1994，Vaccine 12 :691-9)。 然而，目前仍難以從病毒的細(xì)胞相關(guān)蛋白質(zhì)純化符合管理指南的減毒活病毒以便用于RSV 感染的有效預(yù)防性治療。與流感病毒類似，RSV在穩(wěn)定細(xì)胞系中生長，其中所述病毒與宿主細(xì)胞緊密相關(guān)聯(lián)，使得難以在保持感染性最小單位的同時從細(xì)胞相關(guān)聯(lián)蛋白質(zhì)純化所述病毒。RSV脆弱 (例如具有剪切敏感性)更增加了復(fù)雜性。所述病毒主要跟宿主細(xì)胞相關(guān)聯(lián)和脆弱等因素使得難以從宿主細(xì)胞提取物(例如，DNA和蛋白質(zhì))純化所述病毒而產(chǎn)生臨床上可接受的包含減毒活病毒的免疫原性組合物。正是部分由于這些原因造成尚未出現(xiàn)市售RSV疫苗。 因此，需要可用于純化RSV和其它細(xì)胞相關(guān)病毒的純化方法以供制備和配制免疫原性組合物。
4.

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供在生物反應(yīng)器，包括單用途生物反應(yīng)器和標(biāo)準(zhǔn)可重復(fù)使用生物反應(yīng)器 (例如，不銹鋼和玻璃容器生物反應(yīng)器)中生產(chǎn)大量疫苗材料的無血清細(xì)胞培養(yǎng)基和高重復(fù)性有效可升級方法。在一個方面，本發(fā)明提供富集無血清細(xì)胞培養(yǎng)基，其支持MDCK細(xì)胞(例如非致瘤性MDCK細(xì)胞)增殖達(dá)到高細(xì)胞密度并不需培養(yǎng)基交換步驟以獲得高病毒效價。具體而言，本發(fā)明提供在MDCK細(xì)胞中復(fù)制流感病毒(例如，冷適應(yīng)和/或穩(wěn)定敏感性和/或減毒)達(dá)到高效價，例如至少約7. 4、至少約7. 6、至少約7. 8、至少約8. 0、至少約9. 0或至少約10. 0的Iog1JCID5ciAiL和/或log1(1FFU/mL，而在感染前不進(jìn)行培養(yǎng)基交換步驟的方法。在另一個方面，本發(fā)明提供在微載體上增殖非致瘤性細(xì)胞的改進(jìn)方法，包括珠粒對珠粒轉(zhuǎn)移方法。在另一個方面，本發(fā)明的富集無血清細(xì)胞培養(yǎng)基保持用于初始接種的非致瘤性MDCK細(xì)胞的非致瘤性特征。在其它方面，本發(fā)明的富集無血清細(xì)胞培養(yǎng)基用于建立和維持非致瘤性MDCK細(xì)胞系。在其它方面，本發(fā)明提供從在細(xì)胞培養(yǎng)物(例如，MDCK、Vero細(xì)胞培養(yǎng)物)中培養(yǎng)的貼壁細(xì)胞純化細(xì)胞相關(guān)活病毒(例如，流感病毒、RSV)產(chǎn)生至少30%的總病毒回收率的方法，其中所述純化病毒在每7. 0士0. 51og1(1FFU的病毒中包含少于0. Ing HCD、少于0. 3yg HCP和少于0. 0050ng非特異性核酸酶。5.附圖簡要說明

圖1是培養(yǎng)第0天到第4天的生物反應(yīng)器中活細(xì)胞密度(V⑶)和細(xì)胞活力 (V% )的曲線圖。采用表7詳示的種子反應(yīng)器(Seed Reactor) (SR)工藝條件培養(yǎng)所述生物反應(yīng)器。未提供SR4的2dps數(shù)據(jù)。圖2顯示對3x2L種子反應(yīng)器(SR)實(shí)驗(yàn)1、3和4在B2B胰蛋白酶消化期間在0_40 分鐘之間的中間取樣時間所攝的照片(放大IOX所攝)。生物反應(yīng)器中的胰蛋白酶消化根據(jù)珠粒對珠粒轉(zhuǎn)移方案進(jìn)行。圖3是1&2L最終生產(chǎn)反應(yīng)器(FPR)中活細(xì)胞密度(VCD)和細(xì)胞活力(V% )的曲線圖。在5dps (約120hps)感染實(shí)驗(yàn)3的生物反應(yīng)器(FPR3.X.X)，在4dps感染其它實(shí)驗(yàn)的生物反應(yīng)器。未提供實(shí)驗(yàn)4的感染后VCD和細(xì)胞活力數(shù)據(jù)。圖4顯示對所有實(shí)驗(yàn)的1&2L最終生產(chǎn)反應(yīng)器在4dps所攝的照片(放大IOOx所攝)。圖5顯示對所有實(shí)驗(yàn)的最終生產(chǎn)反應(yīng)器(FPR)在3dps所攝的照片(放大 IOOx所攝)。圖6顯示對所有實(shí)驗(yàn)中起初在種子反應(yīng)器中培養(yǎng)、然后于感染后在1&2L 最終生產(chǎn)反應(yīng)器(FPR)中培養(yǎng)的細(xì)胞而言，冷適應(yīng)(ca) A/^ruguay (A/U)、ca A/South Dakota(A/S)和ca B/Florida(B/F)病毒效價隨時間變化的曲線圖。注各數(shù)據(jù)點(diǎn)表示三次重復(fù)試驗(yàn)的平均值。未記錄檢測界限以下的病毒效價(< 6. 41og10FFU/mL或如果稀釋， < 2. 41og10FFU/mL)。圖7顯示采用67 %培養(yǎng)基交換過程(67 % MX)相對無培養(yǎng)基交換過程(0 % MX)產(chǎn)生的毒株的隨時間變化的病毒產(chǎn)生曲線。毒株ca A/Wisconsin/67/05和ca A/^ruguay的曲線圖分別見圖8A的左圖和右圖所示，ca A/South Dakota和ca B/Florida的曲線圖分別見圖8B的左圖和右圖所示。圖8顯示珠粒對珠粒轉(zhuǎn)移過程的流程圖。圖A所示過程利用兩個洗滌步驟，各采用包含螯合劑(EDTA)和終濃度剛達(dá)到0. 05X以便在約30分鐘內(nèi)實(shí)現(xiàn)細(xì)胞脫離的蛋白酶 (TrypLE )的緩沖鹽溶液(DPBQ。圖B所示過程利用2_3個洗滌步驟，采用緩沖鹽溶液 (DPBS)，之后與終濃度剛達(dá)到約0. 5mM可在缺乏任何蛋白酶的情況下在約60分鐘內(nèi)實(shí)現(xiàn)細(xì)胞脫離的螯合劑(EDTA)溫育。圖9顯示用于直流過濾(DFFl)過濾器器材(圖A，上部)、GE醫(yī)療保健公司(GE Healthcare)的Uniflux滑道(skid)管道器材(圖A，下部)、GE醫(yī)療保健公司的AKTA過程滑道管道器材(圖B，上部)和直流過濾2 (DIFF2)過濾器器材(圖B，下部)的過濾器和管道器材的圖片。圖10在圖A中顯示初始純化方法Ia連同改進(jìn)的純化方法Ib的示意圖。其它改動在圖B所示的示意圖中詳示。各方法的細(xì)節(jié)見實(shí)施例3和4提供。
圖11顯示TFF 1輪次#8的流量痕跡曲線。圖12顯示BPG 100和BPG 200 CS柱壓力流特征。圖13顯示輪次#9的CS柱洗脫色譜。圖14顯示TFF2 8XDF方法輪次#8的流量痕跡曲線。圖15顯示以下細(xì)胞在約432小時的培養(yǎng)過程中每毫升(mL)的活細(xì)胞(實(shí)心符號 /實(shí)線)和活力百分比(空心符號/虛線)的曲線圖缺乏蛋白酶的情況下連續(xù)分離和增殖的細(xì)胞(菱形和正方形)、采用EDTA/蛋白酶混合物連續(xù)分離和增殖的細(xì)胞(三角形)以及采用標(biāo)準(zhǔn)蛋白酶方法獨(dú)立分離和增殖的細(xì)胞(圓形)。圖16表示獲自以下細(xì)胞各代的ca A/ffisconsin/67/07 (上部)，ca B/ Malaysia/2506/04(下部)的效價的曲線圖在缺乏蛋白酶的情況下依次分離和增殖的細(xì)胞(菱形和正方形)、采用EDTA/蛋白酶混合物依次分離和增殖的細(xì)胞(三角形)以及采用標(biāo)準(zhǔn)蛋白酶方法獨(dú)立分離和增殖的細(xì)胞(空心正方形)。所述曲線圖顯示采用無蛋白酶和 EDTA/蛋白酶方法分離和增殖的細(xì)胞可獲得至少8. OlogiciFFUAiL的效價。圖17顯示三個生產(chǎn)模擬試驗(yàn)(圖A和圖B，頂部)的每mL活細(xì)胞(實(shí)心符號/實(shí)線)和活力百分比(空心符號/虛線)的曲線圖。包括于各曲線圖的是種子反應(yīng)器、采用 ATF的模擬生產(chǎn)反應(yīng)器試驗(yàn)和不采用ATF的對照生產(chǎn)試驗(yàn)。圖B (下部)還顯示在兩個生產(chǎn)模擬試驗(yàn)過程中獲得的ca B/Malaysia/2506/04的效價的曲線圖，表明采用ATF和不采用 ATF進(jìn)行的試驗(yàn)的效價相當(dāng)。圖18顯示從采用ATF工藝的生物反應(yīng)器移出的液體的照片，表明它們不含微載體。左圖顯示在微載體滅菌過程中采用ATF洗滌移出的微載體，右圖顯示在MDCK細(xì)胞培養(yǎng)的66%培養(yǎng)基交換步驟過程中采用ATF移出的培養(yǎng)基。圖19顯示用IM NaCl洗脫的測試樹脂A-D柱試驗(yàn)的洗脫色譜(分別為圖A_D)。 這些色譜表明，測試樹脂A和B看來顯示具有較小早期峰(見圖B中的箭頭)的多個獨(dú)立的洗脫峰，而測試樹脂C和D顯示具有峰肩和非均相特征(見圖D中的箭頭)的單峰。圖20顯示采用2M NaCl洗脫的測試樹脂C和D柱試驗(yàn)的洗脫色譜(分別為圖A 和B)，顯示采用2M NaCl洗脫的洗脫峰更尖銳。圖 21 顯示 ca A/Wisconsin、ca A/Solomon Islands 禾口 ca B/Malaysia 的測試豐對脂C柱試驗(yàn)的洗脫色譜，分別為圖A、B和C，表明所述峰特征類似并保持一致。圖22顯示柱試驗(yàn)的洗脫色譜。圖A和B分別顯示ca A/Wisconsin和ca B/ Malaysia的測試樹脂D柱的洗脫，表明所述峰特征類似并保持一致。圖C顯示XK-50柱規(guī)格下的測試樹脂D的洗脫峰色譜。圖 23 顯示來自 A)未處理細(xì)胞和用 B) 0. 5mM EDTA、C) ImM EDTA、D) 2mM EDTA、E) 5mM EDTA和F) IOmM EDTA處理60分鐘的細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)物圖片。圖對顯示來自用2mM EDTA預(yù)處理、之后用0. 0125X TrypLE (圖A和D)、0. 025X TrypLE (圖B和E)和0. 05X TrypLE (圖C和F)處理的細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)物圖片。圖片為加 Λ TrypLE 0分鐘時(圖A、B和C)和加入TrypLE60分鐘后(圖D、E和F)所攝。6.發(fā)明詳述本發(fā)明提供在生物反應(yīng)器中從貼壁細(xì)胞(例如，MDCK細(xì)胞，具體為非致瘤性細(xì)胞系或Vero細(xì)胞)生產(chǎn)大量病毒(例如，流感病毒或RSV)或病毒抗原以供預(yù)防、診斷、免疫治療或治療應(yīng)用的高再現(xiàn)性有效可升級方法。具體而言，本發(fā)明提供生產(chǎn)達(dá)到高效價的冷適應(yīng)和/或溫度敏感性和/或減毒流感或呼吸道合胞病毒而不需任何培養(yǎng)基交換的可靠方法。此外，本發(fā)明提供支持MDCK細(xì)胞(例如非致瘤性MDCK細(xì)胞)培養(yǎng)和支持包括但不限于流感病毒(例如，冷適應(yīng)和/或溫度敏感性和/或減毒流感病毒)的病毒復(fù)制達(dá)到高效價而不需任何培養(yǎng)基交換的培養(yǎng)基。此外，本發(fā)明還提供從MDCK細(xì)胞(例如非致瘤性MDCK細(xì)胞)制備疫苗材料(例如流感病毒)的方法，以及利用MDCK細(xì)胞中產(chǎn)生的疫苗材料預(yù)防流感感染的方法。任何細(xì)胞相關(guān)病毒(例如流感病毒和RSV)均可通過本文所述方法純化和/或包含于本文所述免疫原性組合物中。本文所用的“細(xì)胞相關(guān)病毒”指根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何技術(shù)測定發(fā)現(xiàn)約60%或更多的病毒效價與病毒感染貼壁細(xì)胞相關(guān)的病毒。本發(fā)明的方法特別可用于生產(chǎn)冷適應(yīng)/溫度敏感性/減毒(ca/ts/att)流感毒株(例如FluMist 中的毒株)和 RSV (例如，rA2cp248/404/1030 Δ SH)?？稍诜侵铝鲂訫DCK細(xì)胞和/或Vero細(xì)胞中生長的病毒包括但不限于負(fù)鏈RNA病毒，其包括但不限于流感病毒、RSV、副流感病毒1、2和3以及人肺炎后病毒 (metapneumovirus)；以及其它病毒，包括DNA病毒，逆轉(zhuǎn)錄病毒，正鏈RNA病毒，負(fù)鏈RNA病毒，雙鏈RNA病毒，包括但不限于乳多空病毒、水泡性口炎病毒、牛痘病毒、柯薩奇病毒、呼腸孤病毒、微小病毒、腺病毒、脊髓灰質(zhì)炎病毒、麻疹病毒、狂犬病毒和皰疹病毒。6. 1 定義本文所用的致瘤性具有本領(lǐng)域技術(shù)人員賦予該術(shù)語的一般含義。在一個實(shí)施方式中，致瘤性由成年裸小鼠模型確定(例如，Stiles等，1976，Cancer Res, 36 :1353和以下實(shí)施例5)。致瘤性也可通過其它試驗(yàn)，例如通過注射到雞胚和/或局部施用于尿囊絨膜進(jìn)行測試(Leighton 等，1970，Cancer, 26 :1024)。術(shù)語“重組”表示通過人為干涉人工或合成(非天然)地改變所述材料(例如，核酸或蛋白質(zhì))。所述改變可在其天然環(huán)境或狀態(tài)中或從其天然環(huán)境或狀態(tài)取出的材料上進(jìn)行。具體而言，在提到病毒例如流感病毒時，在所述病毒通過重組核酸表達(dá)產(chǎn)生時，其即為重組的。重組病毒還可將一個或多個突變引入基因組。在重組病毒包含來自多于一種的親本病毒毒株的組分時，其也可以是重配病毒。指病毒時，術(shù)語“重配株”表示所述病毒包括來自多于一種親本病毒毒株或來源的遺傳和/或多肽組分。例如，7:1重配株包括7個來自第一親本病毒的病毒基因組區(qū)段(或基因區(qū)段)和1個來自第二親本病毒的，例如編碼血凝素或神經(jīng)氨酸酶的互補(bǔ)病毒基因組區(qū)段。6:2重配株包括6個來自第一親本病毒的基因組區(qū)段，通常為6個內(nèi)部基因，以及2 個來自不同親本病毒的互補(bǔ)區(qū)段，例如血凝素和神經(jīng)氨酸酶。除非另外說明，本文所用的術(shù)語“約，，指不超過該術(shù)語修飾數(shù)值上下10 %的數(shù)值。 例如，術(shù)語“約5 μ g/kg”指4. 5 μ g/kg到5. 5 μ g/kg的范圍。再例如，“約1小時”指54分鐘到66分鐘的范圍。術(shù)語“溫度敏感性”、“冷適應(yīng)”和“減毒”為本領(lǐng)域熟知。例如，術(shù)語“溫度敏感性”(“ts”)表示，就流感毒株A而言，所述病毒在較高溫度例如39°C下，相對于較低溫度例如33°C顯示效價降低100倍或更多，就流感毒株B而言，所述病毒在較高溫度例如37°C下相對于較低溫度例如33°C顯示效價降低100倍或更多。例如，術(shù)語“冷適應(yīng)”(“ca”)表示所述病毒在較低溫度例如25°C的生長速率比其在較高溫度例如33°C的生長速率高100 倍以內(nèi)。例如，術(shù)語“減毒”(“att”)表示所述病毒在白鼬的上呼吸道復(fù)制但在肺組織中卻檢測不到，且并不在動物中引起流感樣疾病。應(yīng)理解，具有中間表型的病毒，即顯示效價在39°C (Α株病毒)或37°C (B株病毒)降低小于100倍、顯示在25°C的生長比其在33°C 的生長高100倍以上(例如，200倍以內(nèi)、500倍、1000倍、小于10，000倍)和/或肺部生長相對在白鼬上呼吸道的生長降低(即部分減毒)和/或動物中流感樣疾病減少的病毒，也是本發(fā)明所包括的可用病毒。生長表示由效價、蝕斑大小或形態(tài)學(xué)特征、顆粒密度或本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它度量表示的病毒量。6. 2 細(xì)胞本文所述的細(xì)胞相關(guān)病毒可在能使所述病毒生長達(dá)到允許使用病毒的效價的任何貼壁細(xì)胞中增殖。在一個實(shí)施方式中，所述貼壁細(xì)胞能使細(xì)胞相關(guān)病毒生長達(dá)到與從相應(yīng)野生型病毒測定的效價相當(dāng)?shù)男r。在一個具體實(shí)施方式
中，本文所述細(xì)胞相關(guān)病毒在易受所述病毒感染的細(xì)胞中增殖。在一個實(shí)施方式中，本文所述細(xì)胞相關(guān)病毒在哺乳動物細(xì)胞中增殖。本文所述細(xì)胞相關(guān)病毒可于其中增殖的代表性哺乳動物細(xì)胞包括但不限于=Vero細(xì)胞、CHO細(xì)胞、 Hep-2細(xì)胞、MBCK細(xì)胞、MDCK細(xì)胞、MRC-5細(xì)胞、HeLa細(xì)胞和LLC-MK2細(xì)胞。在一個具體實(shí)施方式
中，包括呼吸道合胞病毒的本文所述細(xì)胞相關(guān)病毒在Vero細(xì)胞中增殖。在另一個具體實(shí)施方式
中，包括流感病毒的細(xì)胞相關(guān)病毒在MDCK細(xì)胞中增殖。6. 2. IMDCK 細(xì)胞已知MDCK細(xì)胞支持包括但不限于各種病毒的大量病毒的分離和復(fù)制，所述各種病毒包括但不限于正粘病毒、副粘病毒、彈狀病毒和黃病毒(flavovirus)。具體而言， MDCK細(xì)胞廣泛用于生產(chǎn)流感病毒。然而，如上所述，一些MDCK細(xì)胞系具有致瘤性。如果致瘤性是管理當(dāng)局關(guān)心的問題，本發(fā)明提供增殖非致瘤性MDCK細(xì)胞的方法和將其用于生產(chǎn)流感病毒的應(yīng)用。因此，在一個實(shí)施方式中，本發(fā)明的方法利用非致瘤性MDCK細(xì)胞。在另一個實(shí)施方式中，本發(fā)明的方法利用MDCK細(xì)胞，而不考慮致瘤性?？捎糜诒景l(fā)明方法的非致瘤性MDCK細(xì)胞系包括但不限于2005年1月5日保藏于美國典型培養(yǎng)物保藏中心(American Type Culture Collection)(弗吉尼亞州馬納薩斯大學(xué)大道 IO8Ol (IO8Ol University Boulevard,Manassas, Va.), 20110-2209)的 ATCC 保藏號為PTA-6500和PTA-6503 (分別表示MDCK-S和MDCK-SF103)的細(xì)胞系，以及2006年10月 5日保藏的ATCC保藏號為PTA-7909和PTA-7910 (分別表示亞克隆1-A和1-B)的細(xì)胞系。
可利用的其它MDCK細(xì)胞包括但不限于保藏于美國典型培養(yǎng)物保藏中心的ATCC保藏號為PTA-6501和PTA-6502 (分別表示MDCK-SF101和MDCK-SF102)的細(xì)胞，ATCC保藏號為 CRL-12042 (表示 MDCK. 5F1)的細(xì)胞和 ATCC 保藏號為 ATCC CCL34、CRL_2286 和 CRL-2285 的細(xì)胞。 在一個具體實(shí)施方式
中，用于本發(fā)明方法的非致瘤性MDCK細(xì)胞在成年裸小鼠模型中具有非致瘤性(參見^iles等)。在另一個具體實(shí)施方式
中，用于本發(fā)明方法的非致瘤性MDCK細(xì)胞在注射到雞胚和/或局部施用于尿囊絨膜時具有非致瘤性(參見Leighton 等)。在另一個實(shí)施方式中，用于本發(fā)明方法的非致瘤性MDCK細(xì)胞在成年裸小鼠模型中具有非致瘤性但在注射到雞胚和/或局部施用于尿囊絨膜時并非如此。在另一個實(shí)施方式中，用于本發(fā)明方法的非致瘤性MDCK細(xì)胞在成年裸小鼠模型中以及在注射到雞胚和/或局部施用于尿囊絨膜時具有非致瘤性。在另一個實(shí)施方式中，用于本發(fā)明的非致瘤性MDCK細(xì)胞在至少20次傳代后、至少30次傳代后、至少40次傳代后、至少50次傳代后、至少60次傳代后、至少70次傳代后、至少80次傳代后、至少90次傳代后或至少100次傳代后具有非致瘤性。在其它實(shí)施方式中，用于本發(fā)明的非致瘤性MDCK細(xì)胞在本發(fā)明的無血清培養(yǎng)基 (例如，MediV SFM 105+TE,MediV SFM 109 和 MediV SFMl 10)中進(jìn)行至少 20 次傳代后、至少30次傳代后、至少40次傳代后、至少50次傳代后、至少60次傳代后、至少70次傳代后、 至少80次傳代后、至少90次傳代后或至少100次傳代后具有非致瘤性。致瘤性可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的大量方法定量分析。常用的一種方法是測定"TD5tl”值，其定義為在50%測試動物中誘導(dǎo)腫瘤所需的細(xì)胞數(shù)量(參見例如，Hill R. “用于腫瘤細(xì)胞的TD5tl鑒定(The TD50 assay for tumor cells) ”刊于《細(xì)胞克隆(Cell clones)》，Potten C，Hendry J，編，倫敦丘吉爾-列溫斯頓出版社(London =Churchill Livingstone), 1985.第223頁)。在一個實(shí)施方式中，用于本發(fā)明方法的非致瘤性MDCK細(xì)胞的TD50值在約101°到約IO1之間、在約IO8到約IO3之間或在約IO7到約IO4之間。在一個具體實(shí)施方式
中，用于本發(fā)明方法的非致瘤性MDCK細(xì)胞的TD5tl值大于約101(1、大于約109、 大于約108、大于約107、大于約106、大于約105、大于約104、大于約103、大于約IO2或大于約 IO10在一個具體實(shí)施方式
中，用于本發(fā)明方法的非致瘤性MDCK細(xì)胞的TD5tl值為IO7或更大。還考慮到用于本發(fā)明方法的非致瘤性MDCK細(xì)胞也具有非致癌性。確定細(xì)胞是否具有致癌性的方法通常包括將細(xì)胞裂解物和/或DNA接種到新生嚙齒動物中并評價隨時間進(jìn)行的任何腫瘤形成(參見例如，Nowinski和Hays，1978，J. Virol. ,27 :13-8 ；Peeper等， 2002，Nat Cell Biol.，4 :148-53 ；聯(lián)邦法規(guī)條文(Code of Federal Regulation) (CFR)， “致癌性”，第40項(xiàng)，第8卷，第1章，第798. 330部分，第160-164頁)。例如，將來自至少IO7 個細(xì)胞等效物的細(xì)胞裂解物和/或DNA注射到通常小于4天齡的新生嚙齒動物(例如，倉鼠、裸小鼠、大鼠)中，然后對其監(jiān)測最多達(dá)5個月或更長時間。致癌性試驗(yàn)通過商業(yè)測試公司(例如，B-R公司(BioReliance)，參見方案#001031和#001030)以常規(guī)方式進(jìn)行。在一個實(shí)施方式中，來自至少105、至少IO6或至少IO7個用于本發(fā)明方法的非致瘤性MDCK細(xì)胞的細(xì)胞裂解物和/或DNA在注射到新生嚙齒動物中時在2個月、3個月、4個月、5個月、6 個月或更長時間內(nèi)不誘導(dǎo)腫瘤形成。在另一個實(shí)施方式中，來自用于本發(fā)明方法的非致瘤性 MDCK 細(xì)胞的 0. 01mg、0. 02mg、0. 03mg、0. 04mg、0. 05mg、0. 06mg、0. 07mg、0. 08mg、0. 09mg、 0. IOmg或更多DNA在注射到新生嚙齒動物中時在2個月、3個月、4個月、5個月、6個月或更長時間內(nèi)不誘導(dǎo)腫瘤形成?？紤]到用于本發(fā)明方法的MDCK細(xì)胞(例如非致瘤性MDCK細(xì)胞)支持包括但不限于正粘病毒(包括甲型和/或乙型流感毒株)、副粘病毒(包括RSV A和/或B、人肺炎后病毒和副流感病毒1、2和/或；3)、彈狀病毒和黃病毒的病毒復(fù)制。在一個具體實(shí)施方式
中，用于本發(fā)明方法的MDCK細(xì)胞(例如非致瘤性MDCK細(xì)胞) 支持冷適應(yīng)、溫度敏感性、減毒流感病毒如FluMist (Belshe等，1998，N Engl J Med 338 1405 ；Nichol 等，1999, JAMA 282 :137 Jackson 等，1999, Vaccine, 17 :1905)中發(fā)現(xiàn)的病毒和/或包含這些病毒骨架(例如，其余基因區(qū)段)或包含具有冷適應(yīng)、減毒和溫度敏感性特征中一種或多種的流感病毒的骨架(例如一種或多種vRNA區(qū)段)的重配病毒的復(fù)制。細(xì)胞支持病毒復(fù)制的能力的一個指示是獲自感染細(xì)胞培養(yǎng)物的感染病毒的產(chǎn)率。 病毒產(chǎn)率可通過設(shè)計(jì)用來測定病毒感染和/或生長的大量試驗(yàn)來確定。例如，病毒產(chǎn)率可通過根據(jù)測定感染病毒體的中值組織培養(yǎng)感染劑量(TCID5tl)試驗(yàn)和檢測細(xì)胞培養(yǎng)物單層中感染細(xì)胞內(nèi)病毒抗原的熒光聚焦試驗(yàn)(FFA)方法確定樣品中存在的病毒濃度來定量分析。TCID5tl值常以l0g1QTCID5Q/mL形式報道，F(xiàn)FA值常以log1(1FFU/mL (熒光聚焦單位/mL) 形式報道。可用于生產(chǎn)流感病毒的方法包括但不限于專利公開W008/105931中公開的方法 (具體參見實(shí)施例12)。在一個具體實(shí)施方式
中，用于本發(fā)明方法的MDCK細(xì)胞(例如非致瘤性MDCK細(xì)胞) 支持流感病毒(例如ca/ts毒株)復(fù)制達(dá)到的IogiciTCID5tlAiL和/或log1(1FFU/mL為至少約
7.6、至少約7. 8、至少約8. O、至少約8. 2、至少約8. 4、至少約8. 6、至少約8. 8、至少約9. O、 至少約9. 2、至少約9. 4、至少約9. 6、至少約9. 8、至少約10. O。在另一個具體實(shí)施方式
中， 用于本發(fā)明方法的MDCK細(xì)胞支持流感病毒(例如ca/ts毒株)復(fù)制達(dá)到的IogiciTCID5tZmL 和/或log1(1FFU/mL為至少約7. 6、至少7. 8、至少8. O、至少8. 2、至少8. 4、至少8. 6、至少
8.8、至少9. O、至少9. 2、至少9. 4、至少9. 6、至少9. 8、至少10. O。在某些具體實(shí)施方式
中， 用于本發(fā)明方法的MDCK細(xì)胞具有非致瘤性。疫苗禾口相關(guān)生物產(chǎn)品顧、問委員會(Vaccines and Related Biological Products Advisory Committee)每年向生物制品評估和研究中心(Centers for Biologies Evaluation and Research) (CBER)或世界衛(wèi)生組織(WHO)和歐洲藥品評估機(jī)構(gòu)(European Medicines Evaluation Agency) (EMEA)推薦用于制備用于年度疫苗接種以抵御流行性流感的疫苗毒株的野生型流感病毒，并由FDA或疾病控制和預(yù)防中心(Centers for Disease Control and Prevention)(⑶C)將其提供給制造商。然后可將這些毒株用于生產(chǎn)重配疫苗毒株，其通常將野生型病毒的NA和/或HA基因與來自具有某些所需特征的供體病毒(常稱為主供體病毒或MDV)的其余基因區(qū)段結(jié)合。例如，MDV毒株可為冷適應(yīng)和/或溫度敏感性和/或減毒毒株，和/或具有高生長速率。以下緊接著的實(shí)施方式涉及冷適應(yīng)和/或溫度敏感性和/或減毒形式的不同流感毒株(例如，由一個或多個衛(wèi)生組織推薦的野生型毒株)。這樣的冷適應(yīng)和/或溫度敏感性和/或減毒流感毒株可通過獲得包含來自感興趣毒株的HA和NA基因區(qū)段以及來自合適的冷適應(yīng)和/或溫度敏感性和/或減毒流感毒株如在 FluMist 中發(fā)現(xiàn)的冷適應(yīng)、溫度敏感性、減毒流感病毒(ca A/Ann Arbor/6/60 and ca B/ Ann Arbor/1/66)的其余基因區(qū)段(本文也稱為“冷適應(yīng)溫度敏感性減毒骨架”)的重組和 /或重配流感病毒來制備。本文所用的重組和/或重配病毒包含來自野生型流感病毒毒株的HA和NA基因區(qū)段和來自冷適應(yīng)和/或溫度敏感性和/或減毒流感病毒的其余基因區(qū)段。 也可在野生型毒株名稱前的一個或多個標(biāo)識“Ca”、“att”、“tS”指代重配和/或重組病毒， 例如，包含來自A/New Caledonia/20/99的HA和NA基因區(qū)段和來自冷適應(yīng)溫度敏感性減毒流感病毒(例如/Arm Arbor/6/60)的其余區(qū)段的重組和/或重排列病毒可簡單稱為“ca A/New Caledonia/20/99”。在某些實(shí)施方式中，用于本發(fā)明方法的MDCK細(xì)胞(例如非致瘤性MDCK細(xì)胞)支持每年由包括但不限于CBER、WHO、EMEA, FDA和CDC的一個或多個衛(wèi)生組織推薦和/或提供的冷適應(yīng)和/或溫度敏感性和/或減毒形式(例如重配)的至少一種流感毒株(例如， 甲型流感毒株、乙型流感毒株)復(fù)制達(dá)到lc^1(1TCID5(1/mL和/或log1(1FFU/mL至少約7. 6、 至少約7. 8、至少約8. 0、至少約8. 2、至少約8. 4、至少約8. 6、至少約8. 8、至少約9. 0、至少約9. 2、至少約9. 4、至少約9. 6、至少約9. 8、至少約10. 0。在另一個具體實(shí)施方式
中，用于本發(fā)明方法的MDCK細(xì)胞(例如非致瘤性MDCK細(xì)胞)支持每年由包括但不限于CBER、WH0、 EMEA、FDA和⑶C的一個或多個衛(wèi)生組織推薦和/或提供的冷適應(yīng)和/或溫度敏感性和/或減毒形式(例如重配)的至少一種流感毒株(例如，甲型流感毒株、乙型流感毒株)復(fù)制達(dá)到 log10TCID50/mL 和 / 或 log10FFU/mL 至少約 7. 6、至少 7. 8、至少 8. 0、至少 8. 2、至少 8. 4、 至少8. 6、至少8. 8、至少9. 0、至少9. 2、至少9. 4、至少9. 6、至少9. 8、至少10. 0。在某些具體實(shí)施方式
中，用于本發(fā)明方法的MDCK細(xì)胞具有非致瘤性。 在某些其它實(shí)施方式中，用于本發(fā)明方法的MDCK細(xì)胞(例如非致瘤性MDCK細(xì)胞) 支持冷適應(yīng)和/或溫度敏感性和/或減毒形式的至少一種甲型流感毒株復(fù)制。考慮到所述甲型流感毒株可屬于任何亞型(例如，H1N1,H3N2,H7N7,H5N1,H9N2,H1N2,H2N2)。目前在甲型流感病毒中已鑒定出至少16種不同的HA亞型和9種不同的NA亞型。因此，所述甲型流感毒株可包含目前已知或?qū)龛b定的HA和NA亞型的任何組合，和/或可以是重配株。在某些具體實(shí)施方式
中，用于本發(fā)明方法的MDCK細(xì)胞具有非致瘤性。在某些其它實(shí)施方式中，用于本發(fā)明方法的MDCK細(xì)胞(例如非致瘤性MDCK細(xì)胞) 支持冷適應(yīng)和/或溫度敏感性和/或減毒形式的至少一種流感毒株B的復(fù)制。目前未根據(jù)血凝素和神經(jīng)氨酸酶蛋白將乙型流感病毒分為亞型，而是通過譜系進(jìn)行分類。目前將乙型流感病毒毒株分為B/Yamagata和B/Victoria兩個譜系，它們具有大量亞譜系。因此，所述乙型流感毒株可來自目前已知或?qū)龛b定的任何譜系和/或亞譜系，和/或可以是重配株。 在某些具體實(shí)施方式
中，用于本發(fā)明方法的MDCK細(xì)胞具有非致瘤性。6. 3細(xì)胞培養(yǎng)基和培養(yǎng)方法本發(fā)明提供在生物反應(yīng)器，包括單用途生物反應(yīng)器和標(biāo)準(zhǔn)可重復(fù)使用生物反應(yīng)器 (例如，不銹鋼和玻璃容器生物反應(yīng)器)中生產(chǎn)大量疫苗材料的無血清細(xì)胞培養(yǎng)基和高再現(xiàn)性有效可升級方法。具體而言，本發(fā)明提供使流感病毒(例如，泠適應(yīng)和/或穩(wěn)定敏感性和/或減毒的)復(fù)制達(dá)到高效價的方法，例如Ic^1JCID5ciAiL和/或log1(1FFU/mL至少約 7. 4、至少約7. 6、至少約7. 8、至少約8. 0、至少約9. 0或至少約10. 0。在一個方面，本發(fā)明提供富集無血清細(xì)胞培養(yǎng)基，其支持MDCK細(xì)胞(例如非致瘤性MDCK細(xì)胞)增殖達(dá)到高細(xì)胞密度并不需培養(yǎng)基交換步驟以獲得高病毒效價。除去培養(yǎng)基交換步驟提供若干優(yōu)點(diǎn)，如過程時間和培養(yǎng)基使用量減少。此外，其減少制備過程中所需的操作數(shù)量，從而降低污染可能性。在另一個方面，本發(fā)明提供在微載體上增殖非致瘤性細(xì)胞的改進(jìn)方法，包括珠粒對珠粒轉(zhuǎn)移方法。在另一個方面，本發(fā)明的富集無血清細(xì)胞培養(yǎng)基保持非致瘤性MDCK細(xì)胞的非致瘤性特征。6. 3. 1富集無血清培養(yǎng)基本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解，用于增殖細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)基可影響一種或多種細(xì)胞特征，包括但不限于非致瘤性、非致癌性、以貼壁細(xì)胞形式生長、以非貼壁細(xì)胞形式生長、具有上皮樣形態(tài)學(xué)特征、在培養(yǎng)時支持各種病毒復(fù)制和支持流感病毒復(fù)制達(dá)到本文所述高效價。為降低被外來物質(zhì)(例如，支原體、病毒和朊病毒)污染的風(fēng)險，應(yīng)最大程度減少或甚至去除在組織培養(yǎng)應(yīng)用中將血清或動物提取物用于生產(chǎn)治療(例如疫苗)材料。此外，最大程度減少細(xì)胞培養(yǎng)過程中所需操作數(shù)量可顯著降低污染的可能性。因此，本發(fā)明提供可用于采用分批培養(yǎng)方法增殖MDCK細(xì)胞(例如非致瘤性MDCK細(xì)胞)和生產(chǎn)疫苗材料的富集無血清培養(yǎng)基。具體而言，本發(fā)明的富集無血清培養(yǎng)基(本文也稱為“本發(fā)明的無血清培養(yǎng)基”和“本發(fā)明的培養(yǎng)基”)可用于不采用培養(yǎng)基交換或補(bǔ)充的分批培養(yǎng)方法。因此，開發(fā)和使用本發(fā)明的無血清培養(yǎng)基可克服基于細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)疫苗材料(例如流感病毒)中最具挑戰(zhàn)性的操作問題之一，即需要培養(yǎng)基交換/補(bǔ)充。在一個實(shí)施方式中，本發(fā)明的無血清培養(yǎng)基支持非致瘤性MDCK細(xì)胞的增殖，其中所述細(xì)胞在培養(yǎng)基中增殖后(即傳代后)保持非致瘤性。在一個具體實(shí)施方式
中，所述MDCK 細(xì)胞在本發(fā)明的無血清培養(yǎng)基中進(jìn)行至少20次傳代后、至少30次傳代后、至少40次傳代后、至少50次傳代后、至少60次傳代后、至少70次傳代后、至少80次傳代后、至少90次傳代后或至少100次傳代后具有非致瘤性。在另一個實(shí)施方式中，本發(fā)明的無血清培養(yǎng)基支持MDCK細(xì)胞(例如非致瘤性MDCK 細(xì)胞)增殖達(dá)到高密度。在一個具體實(shí)施方式
中，本發(fā)明的無血清培養(yǎng)基支持MDCK細(xì)胞增殖達(dá)到的密度為至少切105個細(xì)胞/mL、至少6xl05個細(xì)胞/mL、至少7xl05個細(xì)胞/mL、至少 8xl05個細(xì)胞/mL、至少虹105個細(xì)胞/mL、至少IxlO6個細(xì)胞/mL、至少1. 2xl06個細(xì)胞/mL、 至少1. 4xl06個細(xì)胞/mL、至少1. 6xl06個細(xì)胞/mL、至少1. 8xl06個細(xì)胞/mL、至少2. OxlO6 個細(xì)胞/mL、至少2. 5xl06個細(xì)胞/mL、至少切106個細(xì)胞/mL、至少7. 5xl06個細(xì)胞/mL或至少IxlO7個細(xì)胞/mL。在另一個具體實(shí)施方式
中，本發(fā)明的無血清培養(yǎng)基支持非致瘤性MDCK 細(xì)胞增殖。在另一個實(shí)施方式中，本發(fā)明的無血清培養(yǎng)基支持MDCK細(xì)胞(例如非致瘤性MDCK 細(xì)胞)增殖達(dá)到高密度和隨后流感病毒復(fù)制達(dá)到高效價而不需培養(yǎng)基交換步驟。在一個具體實(shí)施方式
中，本發(fā)明的無血清培養(yǎng)基支持MDCK細(xì)胞增殖達(dá)到高密度和隨后流感病毒(例如ca/ts毒株)復(fù)制達(dá)到log1(1TCID5(1/mL和/或log1(1FFU/mL為至少約6. 0、至少約6. 2、至少約6. 4、至少約6. 6、至少約6. 8、至少約7. 0、至少約7. 2、至少約7. 4、至少約7. 6、至少約 7. 8、至少約8. 0、至少約8. 2、至少約8. 4、至少約8. 6、至少約8. 8、至少約9. 0、至少約9. 2、 至少約9. 4、至少約9. 6、至少約9. 8、至少約10. 0而不需培養(yǎng)基交換步驟。在其它具體實(shí)施方式
中，本發(fā)明的無血清培養(yǎng)基支持非致瘤性MDCK細(xì)胞增殖達(dá)到高密度和隨后的流感病毒，包括但不限于上述流感病毒復(fù)制。在一個實(shí)施方式中，本發(fā)明的無血清培養(yǎng)基包含植物水解產(chǎn)物。植物水解產(chǎn)物包括但不限于來自以下一種或多種植物的水解產(chǎn)物玉米、棉籽、豌豆、大豆、麥芽、馬鈴薯和小麥。植物水解產(chǎn)物可通過酶水解產(chǎn)生，通常包含肽、游離氨基酸和生長因子的混合物。植物水解產(chǎn)物易于從多個商業(yè)來源包括例如馬可開發(fā)公司(Marcor Development)、?？寺」?HyClone)和有機(jī)技術(shù)公司(Organo Technie)獲得。還考慮到也可采用酵母水解產(chǎn)物代替植物水解產(chǎn)物或與之結(jié)合。酵母水解產(chǎn)物易于從多個商業(yè)來源包括例如西格瑪-奧德里奇公司(Sigma-Aldrich)、USB公司、吉布可(Gibco)/BRL公司和其它公司獲得。在某些實(shí)施方式中，除植物或酵母水解產(chǎn)物以外可采用合成水解產(chǎn)物，或采用合成水解產(chǎn)物代替植物或酵母水解產(chǎn)物。在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明的無血清培養(yǎng)基包含的植物水解產(chǎn)物的終濃度為約0. lg/L到約5. Og/L之間、約0. 5g/L到約4. 5g/L之間、約1. Og/L到約4. Og/L之間、約1. 5g/L到約3. 5g/L之間或約2. Og/L到約3. Og/L之間。在一個具體實(shí)施方式
中， 本發(fā)明的無血清培養(yǎng)基包含終濃度為2. 5g/L的植物水解產(chǎn)物。在另一個具體實(shí)施方式
中， 本發(fā)明的無血清培養(yǎng)基包含終濃度為2. 5g/L的小麥水解產(chǎn)物。在另一個實(shí)施方式中，本發(fā)明的無血清培養(yǎng)基包含液體補(bǔ)充物?？捎糜谘a(bǔ)充培養(yǎng)基的液體包括但不限于化學(xué)成分確定的動物和植物來源的液體補(bǔ)充物以及合成來源的液體?？纱嬖谟谝后w補(bǔ)充物中的液體包括但不限于膽固醇、飽和和/或不飽和脂肪酸(例如，花生四烯酸、亞油酸、亞麻酸、肉豆蔻酸、油酸、棕櫚酸和硬脂酸)。膽固醇可以0. IOmg/ ml-0. 40mg/ml的濃度存在于液體補(bǔ)充物的100X儲備液中。脂肪酸可以1 μ g/ml-20 μ g/ml 的濃度存在于液體補(bǔ)充物的100X儲備液中。適用于培養(yǎng)基制劑的液體易于從多個商業(yè)來源包括例如海克隆公司、吉布可/BRL公司和西格瑪-奧德里奇公司獲得。在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明的無血清培養(yǎng)基包含的化學(xué)成分確定的液體濃縮物的終濃度在約0. IX到約2X 之間、約0. 2X到約1. 8X之間、約0. 3X到約1. 7X之間、約0. 4X到約1. 6X之間、約0. 5X到約1. 5X之間、約0. 6X到約1. 4X之間、約0. 7X到約1. 3X之間或約0. 8X到約1. 2X之間。在一個具體實(shí)施方式
中，本發(fā)明的無血清培養(yǎng)基包含終濃度為IX的化學(xué)成分確定的液體濃縮物(CDCL)溶液。在另一個具體實(shí)施方式
中，本發(fā)明的無血清培養(yǎng)基包含終濃度為IX的化學(xué)成分確定的液體濃縮物(CDCL)溶液(表5)。在另一個實(shí)施方式中，本發(fā)明的無血清培養(yǎng)基包含痕量元素?？刹捎玫暮哿吭匕ǖ幌抻贑uSO4 AH2CKZnSO4 ·7H20、亞硒酸·2Na、檸檬酸鐵、MnSO4 'H2O^Na2SiO3 ·9Η20、 鉬酸-銨鹽、NH4V03、NiSO4 MH2CKSnCl2 (無水)、AlCl3 · 6H20、AgN03、Ba (C2H3O2) 2、KBr、CdCl2、 CoCl2 · 6H20、CrCl3(無水)、NaF、GeO2, ΚΙ、RbCl、ZrOCl2 · 8Η20。痕量元素的濃縮儲備溶液易于從多個商業(yè)來源包括例如細(xì)胞生長公司(Cell Grow)(參見目錄號99-182、99-175和 99-176)獲得。在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明的無血清培養(yǎng)基包含的痕量元素溶液A、B和C(表 4)的終濃度在約0. IX到約2X之間、約0. 2X到約1. 8X之間、約0. 3X到約1. 7X之間、約0. 4X 到約1. 6X之間、約0. 5X到約1. 5X之間、約0. 6X到約1. 4X之間、約0. 7X到約1. 3X之間或約0. (到約1.2X之間。在一個具體實(shí)施方式
中，本發(fā)明的無血清培養(yǎng)基包含終濃度為IX 的痕量元素溶液A、B和C (表4)。在另一個實(shí)施方式中，本發(fā)明的無血清培養(yǎng)基包含一種或多種激素、生長因子和/ 或其它生物分子。激素包括但不限于三碘甲腺原氨酸(triiodothyronine)、胰島素和皮質(zhì)醇。生長因子包括但不限于表皮生長因子(EGF)、胰島素生長因子(IGF)、轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)和成纖維細(xì)胞生長因子(FGF)。在一個具體實(shí)施方式
中，本發(fā)明的無血清培養(yǎng)基包含表皮生長因子(EGF)。其它生物分子包括細(xì)胞因子(例如，粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)、干擾素、白介素、TNF)、趨化因子(例如，調(diào)解活化正常T細(xì)胞表達(dá)和分泌的趨化因子(Rantes)、嗜伊紅粒細(xì)胞趨化蛋白、巨噬細(xì)胞炎性蛋白(MIP))和前列腺素(例如， 前列腺素El和E2)。在一個實(shí)施方式中，本發(fā)明的無血清培養(yǎng)基包含的生長因子的終濃度為約 0. 0001 到約 0. 05mg/L 之間、約 0. 0005 到約 0. 025mg/L 之間、約 0. 001 到約 0. 01mg/L 之間、約0. 002到約0. 008mg/L之間或約0. 003mg/L到約0. 006mg/L之間。在一個具體實(shí)施方式
中，本發(fā)明的無血清培養(yǎng)基包含終濃度為0. 005mg/L的EGF。在一個實(shí)施方式中，本發(fā)明的無血清培養(yǎng)基包含的三碘甲腺原氨酸的終濃度在約IxlO42M到約10xl0M之間、約 2x1 (T12M 到約 9x1 (T12M 之間、約 3x1 (T12M 到約 7x1 (T12M 之間或約 4x1 (T12M 到約 6x1 (T12M 之間。在一個具體實(shí)施方式
中，本發(fā)明的無血清培養(yǎng)基包含終濃度為^10-1 的三碘甲腺原氨酸。 在一個實(shí)施方式中，本發(fā)明的無血清培養(yǎng)基包含的胰島素的終濃度在約lmg/L到約10mg/L 之間、約2. Omg/L到約8. Omg/L之間或約:3mg/L到約6mg/L之間。在一個具體實(shí)施方式
中， 本發(fā)明的無血清培養(yǎng)基包含終濃度為5mg/L的胰島素。在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明的無血清培養(yǎng)基包含的前列腺素的終濃度在約0. 00lmg/L到約0. 05mg/L之間、約0. 005mg/L到約 0. 045mg/L 之間、約 0. 0lmg/L 到約 0. 04mg/L 之間、約 0. 015mg/L 到約 0. 035mg/L 之間或約 0. 02mg/L到約0. 03mg/L之間。在一個具體實(shí)施方式
中，本發(fā)明的無血清培養(yǎng)基包含終濃度為0. 025mg/L的前列腺素。在另一個具體實(shí)施方式
中，本發(fā)明的無血清培養(yǎng)基包含終濃度為0. 025mg/L的前列腺素E1。在另一個實(shí)施方式中，本發(fā)明的無血清培養(yǎng)基用一種或多種選自下組的培養(yǎng)基組分強(qiáng)化腐胺、氨基酸、維生素、脂肪酸和核苷。在具體實(shí)施方式
中，本發(fā)明的無血清培養(yǎng)基用一種或多種培養(yǎng)基組分強(qiáng)化，使所述培養(yǎng)基組分的濃度比在常規(guī)用于增殖細(xì)胞的培養(yǎng)基例如杜爾伯科改良伊格爾培養(yǎng)基/漢氏F12培養(yǎng)基(DMEM/F12)中通常發(fā)現(xiàn)的濃度高約1 倍、約2倍、約3倍、約4倍或約5倍或更多。DMEM/F12的標(biāo)準(zhǔn)組成在以下表1中提供作為參考。在一個具體實(shí)施方式
中，本發(fā)明的無血清培養(yǎng)基用腐胺強(qiáng)化。在另一個實(shí)施方式中， 本發(fā)明的無血清培養(yǎng)基用腐胺強(qiáng)化，使腐胺的濃度比在DMEM/F12中通常發(fā)現(xiàn)的濃度高約5 倍或更多?？蓮?qiáng)化的脂肪酸包括不飽和脂肪酸，包括但不限于亞油酸和α -亞麻酸(也稱為必需脂肪酸)以及肉豆蔻腦酸、棕櫚油酸、油酸、花生四烯酸、二十碳五烯酸、芥酸、二十二碳六烯酸；飽和脂肪酸，包括但不限于丁酸、己酸、辛酸、癸酸、十二烷酸、十四烷酸、十六烷酸、十八烷酸、二十烷酸、二十二烷酸、二十四烷酸；以及含硫脂肪酸，包括硫辛酸。在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明的無血清培養(yǎng)基用除由上述液體補(bǔ)充物提供的脂肪酸以外的額外脂肪酸強(qiáng)化。在一個具體實(shí)施方式
中，本發(fā)明的無血清培養(yǎng)基用亞油酸和亞麻酸強(qiáng)化。在另一個實(shí)施方式中，本發(fā)明的無血清培養(yǎng)基用亞油酸和亞麻酸強(qiáng)化，使亞油酸和亞麻酸的濃度比在DMEM/F12中通常發(fā)現(xiàn)的濃度高約5倍或更多。可強(qiáng)化的氨基酸包括20種標(biāo)準(zhǔn)氨基酸(丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、組氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、色氨酸、酪氨酸和纈氨酸)以及胱氨酸和非標(biāo)準(zhǔn)氨基酸。在某些實(shí)施方式中，強(qiáng)化通常稱為“必需氨基酸”的非致瘤性MDCK細(xì)胞不合成的一種或多種氨基酸。例如，通常將8種氨基酸視作人類必需苯丙氨酸、纈氨酸、蘇氨酸、色氨酸、異亮氨酸、甲硫氨酸、亮氨酸和賴氨酸。在一個具體實(shí)施方式
中，本發(fā)明的無血清培養(yǎng)基用胱氨酸和除谷氨酰胺以外的所有標(biāo)準(zhǔn)氨基酸強(qiáng)化(配制DMEM/F12通常不用谷氨酰胺，將其單獨(dú)加入)，使胱氨酸和標(biāo)準(zhǔn)氨基酸的濃度比在DMEM/F12中通常發(fā)現(xiàn)的濃度高約5倍或更多。 在某些具體實(shí)施方式
中，本發(fā)明的無血清培養(yǎng)基包含的谷氨酰胺的濃度在約146mg/L到約 1022mg/L之間、約^ang/L到約876mg/L之間或約438mg/L到約730mg/L之間。在另一個具體實(shí)施方式
中，本發(fā)明的無血清培養(yǎng)基包含終濃度為58%ig/L的谷氨酰胺?？蓮?qiáng)化的維生素包括但不限于抗壞血酸(維生素A)、d_生物素(維生素B7和維生素H)、D-泛酸鈣、膽鈣化留醇(維生素D3)、氯化膽堿、氰鈷胺素(維生素B12)、麥角鈣化固醇(維生素D2)、葉酸(維生素B9)、甲基萘醌類(維生素K2)、肌醇、煙酰胺(維生素 )、
15對氨基苯甲酸、泛酸(維生素、葉綠醌(維生素K1)、吡哆醇(維生素B6)、視黃醇(維生素A)、核黃素(維生素化)、α -生育酚(維生素Ε)和硫胺素(維生素B1)。在一個具體實(shí)施方式
中，本發(fā)明的無血清培養(yǎng)基用d-生物素、D-泛酸鈣、氯化膽堿、氰鈷胺素、葉酸、肌醇、煙酰胺、吡哆醇、核黃素和硫胺素進(jìn)行強(qiáng)化，使所述維生素的濃度比DMEM/F12中通常發(fā)現(xiàn)的濃度高約5倍或更多。可強(qiáng)化的核苷包括但不限于胞苷、尿苷、腺苷、鳥苷、胸苷和次黃嘌呤。在一個具體實(shí)施方式
中，本發(fā)明的無血清培養(yǎng)基用次黃嘌呤和胸苷強(qiáng)化，使次黃嘌呤和胸苷的濃度比在DMEM/F12中通常發(fā)現(xiàn)的濃度高約5倍或更多?？杉尤爰?xì)胞培養(yǎng)基的其它組分包括但不限于碳酸氫鈉、碳源(例如葡萄糖)和鐵結(jié)合試劑。在一個實(shí)施方式中，本發(fā)明的無血清培養(yǎng)基包含的碳酸氫鈉的終濃度在約 1200mg/L 到約 7200mg/L之間、約 M00mg/L 到約 6000mg/L之間或約 3600mg/L 到約 4800mg/ L之間。在一個具體實(shí)施方式
中，本發(fā)明的無血清培養(yǎng)基包含終濃度為4400mg/L的碳酸氫鈉。在一個實(shí)施方式中，本發(fā)明的無血清培養(yǎng)基包含葡萄糖作為碳源。在另一個實(shí)施方式中，本發(fā)明的無血清培養(yǎng)基包含的葡萄糖的終濃度在約lg/L到約10g/L之間、約2g/L到約 10g/L之間、約3g/L到約8g/L之間、約4g/L到約6g/L之間或約4. 5g/L到約9g/L之間。 在一個具體實(shí)施方式
中，本發(fā)明的無血清培養(yǎng)基包含終濃度為4. 5g/L的葡萄糖。特別考慮到可將額外的葡萄糖加入到用于增殖非致瘤性MDCK細(xì)胞達(dá)到高密度和隨后復(fù)制流感病毒的本發(fā)明無血清培養(yǎng)基中以避免碳源的耗盡。因此，在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明的無血清培養(yǎng)基包含額外加入的l_5g/L葡萄糖以使葡萄糖終濃度在約5. 5g/L到約10g/L之間?？衫玫蔫F結(jié)合試劑包括蛋白質(zhì)如運(yùn)鐵蛋白和化合物如托酚酮(參見例如，美國專利 5，045，454,5, 118，513,6, 593，140 和 PCT
發(fā)明者F·卡塔尼亞, J·劉, L·J·馬蘭加, M·湯普森, S·S·許 申請人:米迪繆尼有限公司