專利名稱：：非天然氨基酸復(fù)制依賴性微生物和疫苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及疫苗。在一些實(shí)施例中，本發(fā)明涉及通過使用非天然或非天然編碼氨基酸來制造具有有限的或無復(fù)制能力的疫苗(包括全生物體疫苗)的組合物和方法。
背景技術(shù)：
：迄今為止，相關(guān)技術(shù)進(jìn)展相對(duì)較慢，甚至在路易·巴斯德(LouisPasteur)去世后超過100年，他的“III”(分離、滅活、注射)方案仍在繼續(xù)應(yīng)用。然而，隨著分子生物學(xué)和重組蛋白質(zhì)技術(shù)的出現(xiàn)，人們已經(jīng)開始開發(fā)亞單位疫苗和遺傳工程化類全生物體(whole-organism-like)疫苗。近來，隨著免疫學(xué)的發(fā)展，已經(jīng)制造出數(shù)類可用的免疫增強(qiáng)劑，包括Toll樣受體(Toll-LikeReceptor,TLR)配體。一般說來，新生代疫苗和其佐劑在化學(xué)和遺傳學(xué)上已經(jīng)得到越來越明確的定義。針對(duì)例如病毒、細(xì)菌、原生動(dòng)物、真菌等病原體的治療劑，尤其是疫苗的開發(fā)正在進(jìn)行中。已證實(shí)，此類研究在預(yù)防動(dòng)物(包括人類)疾病傳播方面起到的作用是無法估量的。事實(shí)上，在現(xiàn)代醫(yī)學(xué)中，包括疫苗接種在內(nèi)的免疫療法已經(jīng)根除了天花，并且?guī)缀醺死缂顾杌屹|(zhì)炎、破傷風(fēng)、結(jié)核病、水痘和麻疹等疾病?？偟恼f來，理想的疫苗應(yīng)具有長(zhǎng)保存期；能夠誘導(dǎo)針對(duì)預(yù)先選擇的病原體和所有表型變異體的長(zhǎng)期免疫性；不會(huì)引起疫苗所針對(duì)的疾?。荒軌蛴行нM(jìn)行治療和預(yù)防；使用經(jīng)濟(jì)的標(biāo)準(zhǔn)方法容易制備，并且在相關(guān)領(lǐng)域中容易投予。市售疫苗主要存在4個(gè)主要類別。其包括去活性全生物體疫苗、減毒活疫苗、載體疫苗和亞單位疫苗。利用非活材料(例如蛋白質(zhì))進(jìn)行疫苗接種一般會(huì)引起抗體反應(yīng)或CD4+輔助T細(xì)胞反應(yīng)，而利用活材料(例如感染性病毒)進(jìn)行疫苗接種一般會(huì)引起CD8+細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(cytotoxicT-lymphocyte,CTL)反應(yīng)。CTL反應(yīng)對(duì)于抵抗如感染性病毒和細(xì)菌等病原體極為重要。由于獲得CTL反應(yīng)的唯一確定方式是使用本身具有致病性的活試劑，故此法會(huì)帶來實(shí)際問題。一般通過使用減毒病毒和細(xì)菌株，或通過殺死可用于疫苗接種的完整細(xì)胞，來避免這一問題的發(fā)生。這些策略已經(jīng)得到順利執(zhí)行，但使用減毒株始終帶有一定風(fēng)險(xiǎn)，即減毒試劑可能會(huì)在宿主中遺傳重組并變成毒力株。因此，需要能夠通過用非活材料(例如蛋白質(zhì))以特定方式進(jìn)行疫苗接種來產(chǎn)生CD8+CTL反應(yīng)的治療劑和方法。亞單位疫苗提供了一種處理某些所述問題的方式。此類疫苗一般包含來源于相關(guān)病原體的亞細(xì)胞組分。亞單位組分可由病原體的確定亞細(xì)胞部分產(chǎn)生，可以是純化的蛋白質(zhì)、核酸或多糖。所有這些成分都具有能夠刺激針對(duì)相關(guān)病原體的免疫反應(yīng)的抗原決定簇。一般說來，通過純化已破壞病原體的制劑，或使用眾所周知的程序合成，可獲得亞單位疫苗的亞細(xì)胞組分。然而，亞單位疫苗具有幾個(gè)局限性。第一，制造此類疫苗的一個(gè)要求是，必須表征和鑒別抗原決定簇。這一點(diǎn)限制了其應(yīng)用，尤其是針對(duì)高度可變的抗原決定簇。第二，亞單位疫苗一般不能有效刺激細(xì)胞毒性T細(xì)胞反應(yīng)。第三，亞單位疫苗所賦予的免疫性通常很短暫，因此需要連續(xù)的加強(qiáng)注射。據(jù)顯示，只有極少數(shù)重組表達(dá)的亞單位疫苗可在接種疫苗的動(dòng)物(包括人)中誘導(dǎo)強(qiáng)烈而持久的免疫性。一個(gè)值得注意的特例是用于人的重組表面抗原乙型肝炎疫苗。使用這些疫苗引起的一個(gè)問題似乎出現(xiàn)在將抗原準(zhǔn)確地呈遞到免疫系統(tǒng)，由此誘導(dǎo)強(qiáng)烈的體液免疫性和強(qiáng)烈的細(xì)胞介導(dǎo)免疫性之中。具體點(diǎn)說，現(xiàn)有的重組(亞單位)疫苗似乎不能引起強(qiáng)烈的“記憶性(memory)”反應(yīng)，以致接種疫苗的動(dòng)物在暴露于由病原體引起的自然感染時(shí)，不能很快速地反應(yīng)。舉個(gè)例子，當(dāng)前由如牛病毒性腹瀉病毒(bovineviraldiarrhoeavirus,BVDV)等瘟病毒制備的亞單位疫苗的不足之處已經(jīng)廣為報(bào)導(dǎo)。這些研究顯示，即使在疫苗中使用大量的重組蛋白，觀察到的不良保護(hù)率仍表明，這些疫苗無法抵抗活BVDV分離株的攻毒(同源性保護(hù)或異源性保護(hù))。針對(duì)許多感染性疾病的有效疫苗仍未開發(fā)出來，而且當(dāng)前可用的許多疫苗只能提供針對(duì)疾病的部分保護(hù)。此外，在疫苗領(lǐng)域還存在諸多缺口?；钜呙绠a(chǎn)生的免疫性比其它類型疫苗更強(qiáng)烈、更廣泛且更持久。需要一種更為安全的活疫苗載體，其甚至在免疫受抑制的個(gè)體中也不會(huì)引起疾病。還需要可誘導(dǎo)細(xì)胞介導(dǎo)的免疫性，而不僅僅是基于抗體的免疫性的疫苗。另外，還需要直接在身體的粘膜表面(大多數(shù)病原體進(jìn)入的地方)誘導(dǎo)保護(hù)性免疫反應(yīng)。因此，需要改良的疫苗。本發(fā)明旨在提供一種改進(jìn)現(xiàn)有技術(shù)至少某些缺點(diǎn)的改良型治療性疫苗。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明提供化學(xué)調(diào)節(jié)的復(fù)制依賴性全生物體。在一些實(shí)施例中，本發(fā)明提供一種具有某種修飾的化學(xué)調(diào)節(jié)全生物體，這種修飾使得其復(fù)制能力取決于非天然氨基酸的存在。在一些實(shí)施例中，本發(fā)明提供一種具有一個(gè)或一個(gè)以上修飾的全生物體，所述修飾使得生物體的復(fù)制能力取決于其在非天然氨基酸存在下進(jìn)行的培養(yǎng)。在一些實(shí)施例中，本發(fā)明提供一種具有一個(gè)或一個(gè)以上修飾的全生物體，所述修飾使得生物體的復(fù)制能力取決于其在一個(gè)或一個(gè)以上非天然氨基酸存在下進(jìn)行的培養(yǎng)。在一些實(shí)施例中，本發(fā)明提供一種具有兩個(gè)或兩個(gè)以上修飾的全生物體，所述修飾使得生物體的復(fù)制能力取決于其在一個(gè)或一個(gè)以上非天然氨基酸存在下進(jìn)行的培養(yǎng)。在本發(fā)明一些實(shí)施例中，全生物體是一種變形疫苗(mitigatedvaccine)，即通過位點(diǎn)特異性并入一個(gè)或一個(gè)以上非天然氨基酸調(diào)節(jié)的疫苗，其中免疫劑的復(fù)制或表達(dá)通過非天然氨基酸的存在或不存在來調(diào)節(jié)。在本發(fā)明一些實(shí)施例中，全生物體的復(fù)制或表達(dá)是通過經(jīng)單一遺傳修飾實(shí)現(xiàn)的非天然氨基酸的存在或不存在來調(diào)節(jié)。在本發(fā)明一些實(shí)施例中，全生物體的復(fù)制或表達(dá)是通過經(jīng)一個(gè)或一個(gè)以上遺傳修飾實(shí)現(xiàn)的非天然氨基酸的存在或不存在來調(diào)節(jié)。在本發(fā)明一些實(shí)施例中，全生物體的復(fù)制或表達(dá)是通過經(jīng)兩個(gè)遺傳修飾實(shí)現(xiàn)的非天然氨基酸的存在或不存在來調(diào)節(jié)。在本發(fā)明一些實(shí)施例中，全生物體的復(fù)制或表達(dá)是通過經(jīng)三個(gè)遺傳修飾實(shí)現(xiàn)的非天然氨基酸的存在或不存在來調(diào)節(jié)。在本發(fā)明一些實(shí)施例中，全生物體的復(fù)制或表達(dá)是通過經(jīng)四個(gè)遺傳修飾實(shí)現(xiàn)的非天然氨基酸的存在或不存在來調(diào)節(jié)。在本發(fā)明一些實(shí)施例中，全生物體的復(fù)制或表達(dá)是通過經(jīng)五個(gè)遺傳修飾實(shí)現(xiàn)的非天然氨基酸的存在或不存在來調(diào)節(jié)。在本發(fā)明一些實(shí)施例中，全生物體的復(fù)制或表達(dá)是通過經(jīng)四個(gè)或四個(gè)以上遺傳修飾實(shí)現(xiàn)的非天然氨基酸的存在或不存在來調(diào)節(jié)。選擇性誘導(dǎo)針對(duì)生物體、抗原、蛋白質(zhì)或自體蛋白的免疫反應(yīng)，或增加外來抗原特定表位的免疫原性的能力，對(duì)于制造針對(duì)多種病狀(包括(但不限于)癌癥和蛋白質(zhì)折疊疾病)和感染性疾病(例如細(xì)菌或病毒感染)的疫苗意義重大。本發(fā)明通過將非天然氨基酸并入生物體中來制造復(fù)制依賴性和/或復(fù)制缺陷性免疫原以用于全生物體疫苗接種，或制造抗體以用于被動(dòng)免疫。本發(fā)明還通過將非天然氨基酸并入蛋白質(zhì)、抗原和/或多肽中來制造免疫原以用于疫苗接種，或制造抗體以用于被動(dòng)免疫。在本發(fā)明中，添加有非天然氨基酸的免疫原對(duì)應(yīng)于欲接種疫苗/進(jìn)行免疫的個(gè)體體內(nèi)的目標(biāo)部分(例如，疾病相關(guān)部分)，或?qū)?yīng)于能夠出現(xiàn)在個(gè)體體內(nèi)的目標(biāo)部分(例如，疾病相關(guān)部分)。在對(duì)個(gè)體投予具有非天然氨基酸的免疫原的實(shí)施例中，非天然氨基酸的存在引發(fā)針對(duì)可與目標(biāo)(例如疾病相關(guān))部分交叉反應(yīng)的免疫原的免疫反應(yīng)。在第一方面中，本發(fā)明提供在個(gè)體體內(nèi)產(chǎn)生或增強(qiáng)針對(duì)目標(biāo)部分(例如多肽、碳水化合物或二者的組合)的免疫反應(yīng)(例如B細(xì)胞介導(dǎo)的反應(yīng)和/或T細(xì)胞介導(dǎo)的反應(yīng))的方法，所述目標(biāo)部分在個(gè)體體內(nèi)或能夠出現(xiàn)在個(gè)體體內(nèi)。所述方法包括提供遺傳修飾的非天然氨基酸依賴性生物體，和投予個(gè)體所述生物體。所述方法還包括提供包含一個(gè)或一個(gè)以上非天然氨基酸的遺傳修飾非天然免疫原，和投予個(gè)體所述非天然免疫原。所述個(gè)體(例如人、猴、小鼠、大鼠、家畜、豬、奶牛、雞、籠鳥、禽鳥、家養(yǎng)寵物、狗、貓、爬行動(dòng)物和/或兩棲動(dòng)物)產(chǎn)生一個(gè)或一個(gè)以上針對(duì)非天然免疫原的抗體，所述抗體可與目標(biāo)部分交叉反應(yīng)(由此產(chǎn)生或增強(qiáng)針對(duì)目標(biāo)的免疫原性反應(yīng))。在某些實(shí)施例中，遺傳修飾的全生物體可以是需要使個(gè)體免疫所針對(duì)的任何全生物體，例如細(xì)菌、病毒、真菌、支原體、原生動(dòng)物、蠕蟲或朊病毒。全生物體疫苗可任選包括以下一者或一者以上細(xì)菌抗原、病毒抗原、真菌抗原、支原體抗原、原生動(dòng)物抗原、蠕蟲抗原、朊病毒抗原、HIV抗原、HIVgpl20、HIVgp41、HIVgag、HIVpol、HIVenv、HTVtat、HIVnef,HIVrev、杯狀病毒(caliciviius)衣殼抗原、乙型肝炎核心抗原、乙型肝炎表面抗原、丁型肝炎試劑、單純皰疹病毒糖蛋白、水痘-帶狀皰疹病毒糖蛋白、流感病毒血球凝集素、流感病毒神經(jīng)氨酸酶、流感病毒核蛋白、HPV衣殼蛋白、副流感病毒血球凝集素/神經(jīng)氨酸酶、脊髓灰質(zhì)炎病毒衣殼多肽、HepA抗原、痘苗病毒多肽、狂犬病病毒糖蛋白G、伯氏疏螺旋體(B.burgdorferi)OspA、乙型流感嗜血桿菌(H.influenzaetypeb)外膜蛋白、分枝桿菌脂阿拉伯甘露聚糖(Mycobacteriumlipoarabinomannan)、分枝桿菌mAPG、化膿性鏈球菌(S.pyogeneS)M蛋白、肺炎鏈球菌(S.pneumoniae)莢膜多糖、鼠疫耶爾森菌(Y.pestis)F1、鼠疫耶爾森菌V抗原、惡性瘧原蟲環(huán)子孢子蛋白(P.falciparumcircumsporozoite,PfCSP)、惡性瘧原蟲子孢子表面蛋白2(P.falciparumsporozoitesurfaceprotein,PfSSP2)、惡性瘧原蟲肝期抗原1羧基末端(P.falciparumcarboxylterminusofliverstateantigen1，PfLSAlc-term)、個(gè)生_帛&ft出胃白1(P.falciparumexportedprotein，PfExp-1)、Pfs48/45、Pfs28、Pfs25或Pfs230。遺傳修飾的非天然氨基酸復(fù)制依賴性生物體可以是以下一者或一者以上細(xì)菌、病毒、真菌、支原體、原生動(dòng)物、蠕蟲、朊病毒、放線菌屬(Actinomyces)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、類桿菌屬(Bacteroides)、包特氏菌屬(Bordetella)、巴爾通氏體屬(Bartonella)、疏螺旋體屬(Borrelia)、布氏桿菌屬(Brucella)、彎曲桿菌屬(Campylobacter)、二氧化碳噬纖維菌屬(Capnocytophaga)、衣原體屬(Chlamydia)、梭^M(Clostridium)ff^M(Corynebacterium)>M3TK#M(Coxiella)>Bf1屬(Dermatophilus),Ml^tMM(Enterococcus)>βM#K#M(Ehrlichia)>ft^屬(Escherichia)、弗朗西絲菌屬(Francisella)、梭形桿菌屬(Fusobacterium)、血巴爾(Haemobartonella)^Bfifilff^M(Haemophilus)>ilff^M(Helicobacter)>3雷伯氏菌屬(Klebsiella)、L型細(xì)菌(L-formbacteria)、鉤端螺旋體屬(Leptospira)、李斯特菌屬(Listeria)、分枝桿菌屬(Mycobacterium)、支原體屬(Mycoplasma)、奈瑟菌屬(Neisseria)、新立克次氏體屬(Neorickettsia)、諾卡菌屬(Nocardia)、巴氏桿菌屬(Pasteurella)、消化球菌屬(Peptococcus)、消化鏈球菌屬(Peptostreptococcus)、月市炎球菌屬(I^neumococcus)、變形菌屬(Proteus)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、立克次氏體屬(Rickettsia)、羅克利馬體屬(Rochalimaea)、沙門氏菌屬(Salmonella)、志賀氏菌屬(Siigella)、葡萄球菌屬Staphylococcus)、鏈球菌屬印tococcus)、密螺旋體屬(Treponema)、耳口爾森菌屬(Yersinia)、腺病毒(adenovirus)、甲病毒(alphavirus)、杯狀病毒(calicivirus)、冠狀病毒(coronavirus)、CMV、癌熱病毒(distempervirus)、埃博拉病毒(Ebolavirus)、腸病毒(enterovirus)、EBV、黃病毒(fiavivirus)、HepC、嗜月干DNA病毒(h印adnavirus)、H印B、丁型肝炎試劑(hepititusdeltaagent)>HepE或F病毒、GBV-C、皰疹病毒(herpesvirus)、單純皰疹病毒(herpessimplexvirus)、水痘-帶狀皰疫病毒(varicellazostervirus)、免疫缺陷病毒(immunodeficiencyvirus)、HIV、^!!!!^^(infectiousperitonitisvirus)(influenzavirus)>AΜΜ,^^Ι^(influenzaAvirus)>Sifil^(leukemiavirus)(Marburgvirus)、正粘病毒(orthomyxovirus)、乳頭瘤病毒(papillomavirus)、HPV、副流感病毒(parainfluenzavirus)、苜Ij粘病毒(paramyxovirus)、RSV、細(xì)小病毒(parvovirus)、癌病毒(pestivirus)、細(xì)小核糖核酸病毒(picornavirus)、脊髓灰質(zhì)炎病毒(poliovims)、痘病毒(poxvirus)、痘苗病毒(vacciniavirus)、狂犬病病毒(rabiesvirus)、呼腸孤病毒(reovirus)、反轉(zhuǎn)錄病毒(retrovirus)、輪狀病毒(rotavirus)、犁頭霉屬(Absidia)>I^TSiMM(Acremonium)(Alternaria)>ffi^M(Aspergillus)>蛙糞霉屬(Basidiobolus)、平臍蠕孢屬(Bipolaris)、芽生菌屬(Blastomyces)、念珠菌屬(Candida)、球孢子菌屬(Coccidioides)、耳霉屬(Conidiobolus)、隱球菌屬(Cryptococcus)、彎3β屬(Curvalaria)、表皮；菌屬(Epidermophyton)、夕卜瓶β屬(Exophiala)、地絲菌屬(Geotrichum)、組織胞漿菌屬(Histoplasma)、馬杜拉分支菌屬(Madurella)、giife—M(Malassezia),^l^TMM(Microsporum)、/]、iA才更3M(Moniliella)>1^1βM(Mortierella)(Mucor)>#βM(Paecilomyces)>青霉屬(Penicillium)、單胞瓶霉屬(Phialemonium)、瓶霉屬(Phialophora)、原壁菌屬(Prototheca)、假埃希氏菌屬(Pseudallescheria)、假小托菌屬(Pseudomicrodochium)、腐霉屬(Pythium)、鼻孢子蟲屬(Rhinosporidium)、根霉屬(Rhizopus)、線狀擔(dān)子菌屬(Scolecobasidium),I^iTMM(Sporothrix)>ft]βM(Stemphylium)、^M菌屬(Trichophyton)、毛孢子菌屬(jTrichosporon)、木絲霉屬(Xylohypha)、巴倍蟲屬(Babesia)、腸袋蟲屬(Balantidium)、貝諾孢子蟲屬(Besnoitia)、隱孢子蟲屬(Cryptosporidium)^^M(Eimeria)>HIfiJ^M(Encephalitozoon)>H7^E屬(Entamoeba)、賈弟蟲屬(Giardia)、哈蒙德蟲屬(Hammondia)、肝簇蟲屬(H印atozoon)、等孢屬(Isospora)、利什曼原蟲屬(Leishmania)、微孢子蟲屬(Microsporidia)、新孢子蟲屬(Neospora)、龍船草屬(Nosema)、五鞭毛滴蟲屬(Pentatrichomonas)、皰原蟲屬(Plasmodium)、惡性皰原蟲(P.falciparum)、肺孢子蟲屬(Pneumocystis)、肉孢子蟲屬(Sarcocystis)、裂體吸蟲屬(Schistosoma)、泰累爾犁漿蟲屬(Theileria)、弓形體屬(Toxoplasma)、錐體蟲屬(Trypanosoma)、棘唇屬(Acanthocheilonema)、圓線蟲屬(Aelurostrongylus)、鉤蟲屬(Ancylostoma)、管圓線蟲屬(Angiostrongylus)、蛔蟲屬(Ascaris)、布魯格氏絲蟲屬(Brugia)、仰口屬(Bunostomum)、毛細(xì)線蟲屬(Capillaria)、夏氏線蟲子屬(Chabertia)、古柏屬(Cooperia)、環(huán)體屬(Crenosoma)、網(wǎng)尾屬(Dictyocaulus)、膨結(jié)屬(Dioctophyme)、蓋頭屬(Dipetalonema)、裂頭屬(Diphyllobothrium)、復(fù)孔蟲屬(Diplydium)、惡絲蟲屬(Dirofilaria),龍線屬(Dracunculus)>蟲力&M(Enterobius)>M^-AM(Filaroides)>it^^t^M(Haemonchus)、兔唇蟲回屬(Lagochilascaris)、Loa多月太(Loapolypeptide)、曼森氏線蟲屬(Mansonella)、繆勒屬(Muellerius)、侏形吸蟲屬(Nanophyetus)、板口線蟲屬(Necator)、細(xì)頸屬(Nematodirus)、結(jié)節(jié)線蟲屬(Oesophagostomum)、盤尾屬(Onchocerca)、后睪吸蟲屬(Opisthorchis)、胃線蟲屬(Ostertagia)、副絲蟲屬(Parafilaria)、并殖吸蟲屬(Paragonimus)、副蟲回蟲屬(Parascaris)、泡翼線蟲屬(Physaloptera)、原圓線蟲屬(Protostrongylus)、狗尾草屬(Setaria)、旋尾線蟲屬(Spirocerca)、迭宮絳蟲屬(Spirometra)、冠絲蟲屬(印hanofilaria)、類圓線蟲屬(Strongyloides)、圓線蟲屬(Strongylus)、吸吮線蟲屬(Thelazia)、弓蛔線蟲屬(Toxascaris)、弓首蛔屬(Toxocara)、毛線蟲屬(Trichinella)、毛圓線蟲屬(Trichostrongylus)、鞭蟲屬(Trichuris)、鉤蟲屬(Uncinaria)或吳策線蟲屬(Wuchereria)。在另一方面中，本發(fā)明提供例如通過在個(gè)體體內(nèi)產(chǎn)生B細(xì)胞介導(dǎo)的反應(yīng)和/或T細(xì)胞介導(dǎo)的反應(yīng)來預(yù)防性或治療性治療個(gè)體病狀的方法。在各種實(shí)施例中，所述病狀可以是(但不限于)以下一者或一者以上細(xì)菌感染、病毒感染、真菌感染、支原體感染、朊病毒感染、原生動(dòng)物感染或蠕蟲感染。這一方面的一組方法包括對(duì)個(gè)體，例如人、猴、小鼠、大鼠、豬、奶牛、雞、籠鳥、禽鳥、爬行動(dòng)物或兩棲動(dòng)物，投予遺傳修飾的全生物體。由此，遺傳修飾的全生物體刺激個(gè)體體內(nèi)產(chǎn)生抗體。在這一方面的另一組方法中，本發(fā)明包含通過產(chǎn)生針對(duì)一種或一種以上疾病、病況或涉及產(chǎn)生抗體反應(yīng)的生物體的抗體，和分離一種或一種以上所述抗體，隨后將其投予個(gè)體，來預(yù)防性或治療性治療個(gè)體的病狀。利用終極的蛋白質(zhì)工程化工具Ambrx公司的技術(shù)，位點(diǎn)特異性并入非天然氨基酸為疫苗開發(fā)提供了廣闊的前景。其可通過將抗原與免疫增強(qiáng)劑組合而產(chǎn)生化學(xué)上明確確定的納米結(jié)構(gòu)。這些納米結(jié)構(gòu)具有抗原信息和免疫增強(qiáng)功能，可用于開發(fā)亞單位疫苗。此外，也可以使用Ambrx技術(shù)產(chǎn)生新穎的減毒類全生物體疫苗，其中非天然氨基酸將充當(dāng)在致病性生物體中表達(dá)必需基因的開關(guān)，從而代替媒劑，將非天然官能團(tuán)引入蛋白質(zhì)中。所得生物體將模仿野生型生物體，但只能夠在自然界中不存在的Ambrx非天然氨基酸存在下復(fù)制。亞單位疫苗由于亞單位疫苗的功效較低，使得需要佐劑來刺激免疫反應(yīng)。常見的做法是，將佐劑與抗原調(diào)配成混合物。投藥后，抗原將被樹突狀細(xì)胞(dendriticcell,DC)吸收，并呈遞給T細(xì)胞。佐劑將刺激樹突狀細(xì)胞釋放細(xì)胞因子、增強(qiáng)抗原呈遞和使樹突狀細(xì)胞成熟。當(dāng)抗原呈遞和免疫活化這兩個(gè)獨(dú)立的過程集中于同一DC上時(shí)，將獲得有效的抗原特異性免疫反應(yīng)。所需劑量相對(duì)較大。然而，較大劑量的佐劑會(huì)引起抗原非依賴性免疫活化，這是一種不希望的副反應(yīng)。因此，這種方法必然是不理想的，并且會(huì)使疫苗具有低功效和高毒性。與例如明礬等傳統(tǒng)佐劑不同，許多新發(fā)現(xiàn)的佐劑的分子組成是明確確定的。Ambrx技術(shù)獨(dú)特的位點(diǎn)特異性非天然氨基酸并入和位點(diǎn)特異性結(jié)合能力，使得我們具備了產(chǎn)生具有高效力和低毒性的新生代疫苗的必需工具。Ambrx亞單位疫苗的關(guān)鍵特征是，將抗原與免疫增強(qiáng)劑組合于一個(gè)化學(xué)上確定的納米結(jié)構(gòu)中。當(dāng)其被DC吸收時(shí)，抗原呈遞和免疫活化兩個(gè)過程集中于同一DC上。位點(diǎn)特異性并入非天然氨基酸是一種能夠?qū)⒕哂懈呙庖咴圆糠?例如單硝基苯基、二硝基苯基)的非天然氨基酸直接并入蛋白質(zhì)抗原中的技術(shù)。近來，例如Toll樣受體7(TLR7)配體咪唑并喹啉等小分子免疫增強(qiáng)劑變得可用。利用這些小分子免疫增強(qiáng)劑作為側(cè)鏈來設(shè)計(jì)非天然氨基酸，并將其并入到蛋白質(zhì)抗原上，是可行的。Ambrx的位點(diǎn)特異性結(jié)合技術(shù)提供甚至更高的靈活性。此項(xiàng)技術(shù)不僅能夠?qū)⑸衔奶岬降男》肿优c蛋白質(zhì)抗原表面結(jié)合，而且還能將多種其它免疫增強(qiáng)劑(例如脂質(zhì)、脂肽、多糖、DNA、RNA和納米粒子)與蛋白質(zhì)抗原表面結(jié)合。將單鏈DNA位點(diǎn)特異性結(jié)合到蛋白質(zhì)表面上，為疫苗設(shè)計(jì)提供了另一個(gè)自由發(fā)揮的空間。帶有未甲基化CpG的DNA是TLR-9配體，有趣的是，其不是存在于細(xì)胞表面上，而是存在于細(xì)胞內(nèi)部。結(jié)合于抗原的DNA不僅可以充當(dāng)免疫增強(qiáng)劑，而且還能充當(dāng)構(gòu)造單元(buildingblock)，以通過序列特異性雜交過程建立一維到三維的多價(jià)抗原(multi-antigenvalent)納米結(jié)構(gòu)。這個(gè)一般性方案也可用于組合抗原與其它元件，例如APC靶向試劑和其它TLR配體。已經(jīng)顯示，APC靶向(抗體或肽)可增強(qiáng)疫苗功效，并促進(jìn)交叉呈遞。組合兩種不同的TLR配體將具有較高的協(xié)同作用。Ambrx位點(diǎn)特異性結(jié)合允許進(jìn)行疫苗的精確設(shè)計(jì)和優(yōu)化。如果不利用Ambrx技術(shù)，那么非特異性結(jié)合過程對(duì)于蛋白質(zhì)抗原上的修飾位點(diǎn)僅具有有限或無控制作用。非特異性結(jié)合可能會(huì)改變T和B表位。也可能會(huì)修飾對(duì)于抗體識(shí)別至關(guān)重要的抗原3維構(gòu)象。此外，一些修飾也可能會(huì)妨礙抗原加工。所有這些因素使得非特異性結(jié)合的疫苗具有較低有效性。全生物體疫苗疫苗學(xué)是從全生物體疫苗開始的，并且直到現(xiàn)在，這些疫苗也是最成功的疫苗，可歸為活減毒疫苗或死疫苗。全生物體疫苗的本質(zhì)在于，這種疫苗應(yīng)盡可能接近于致病性生物體本身，以便激發(fā)保護(hù)性免疫反應(yīng)，但在宿主中具有極其有限的復(fù)制能力或無復(fù)制能力。因此，如果需要有限的復(fù)制，或不需要復(fù)制，那么是否有可能使用小分子來控制微生物的生命周期，從而產(chǎn)生更好、更安全的疫苗？使用了Ambrx技術(shù)，這個(gè)問題的答案現(xiàn)在是肯定的。如果將非天然氨基酸并入細(xì)菌、病毒或甚至寄生蟲中對(duì)于微生物復(fù)制不可或缺的基因中，那么這些生物體的生命將取決于非天然氨基酸的存在。由于并入的非天然氨基酸在自然界中不存在，那么結(jié)果將是，例如病毒和細(xì)菌等生物體具有幾乎精確的病毒和細(xì)胞組分與結(jié)構(gòu)，但沒有在宿主中復(fù)制的能力。此外，經(jīng)Ambrx技術(shù)修飾過的病毒或細(xì)菌不僅可充當(dāng)疫苗本身，而且還可充當(dāng)基因和抗原傳遞的載體。Ambrx亞單位疫苗平臺(tái)可廣泛應(yīng)用于感染性疾病和治療性癌癥疫苗領(lǐng)域。當(dāng)前的癌癥疫苗一般是無效的。人們已經(jīng)提出了系統(tǒng)性T細(xì)胞活化和負(fù)調(diào)控路徑抑制的方法，并且其中一些正處于臨床試驗(yàn)中。T細(xì)胞活化與抗原識(shí)別的解耦(decoupling)會(huì)引起嚴(yán)重的副作用。癌癥疫苗無效是因?yàn)槿狈φT導(dǎo)強(qiáng)烈的腫瘤特異性免疫反應(yīng)，而不會(huì)引起嚴(yán)重副作用的技術(shù)。Ambrx提供的技術(shù)可產(chǎn)生能夠引起強(qiáng)烈的癌癥特異性免疫反應(yīng)(包括T細(xì)胞和B細(xì)胞反應(yīng))的納米結(jié)構(gòu)，并由此開創(chuàng)了在治療與預(yù)防兩方面都具有有益可能性的新領(lǐng)域。全生物體疫苗平臺(tái)可廣泛應(yīng)用于感染性疾病領(lǐng)域?？梢耘囵B(yǎng)并且具有能夠突變的基因組的病毒、細(xì)菌或者甚至是寄生蟲，都是良好的候選物。本發(fā)明疫苗將改善疫苗開發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)管理，并且這些疫苗在化學(xué)和遺傳學(xué)上都得到了較為明確的確定，可提供前所未有的功效。為了擴(kuò)充遺傳密碼，本發(fā)明提供制造正交tRNA的組合物和方法。氨?；?tRNA合成酶利用非天然編碼氨基酸使本發(fā)明的tRNA氨?；？墒褂眠@些翻譯組件對(duì)tRNA所識(shí)別的選擇密碼子反應(yīng)，而將所選氨基酸并入正在生長(zhǎng)的多肽鏈(在核酸翻譯的過程中)的特定位置中。在細(xì)胞中產(chǎn)生在特定位置具有所選氨基酸的蛋白質(zhì)的方法也為本發(fā)明的特征。舉例來說，一種方法包括在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基中使細(xì)胞生長(zhǎng)，其中所述細(xì)胞包含一種核酸，這種核酸包含至少一個(gè)選擇密碼子并且編碼蛋白質(zhì)；以及提供所選氨基酸。所述細(xì)胞進(jìn)一步包含正交tRNA(Ο-tRNA)，其在細(xì)胞中起作用并識(shí)別選擇密碼子；和正交氨酰基-tRNA合成酶(O-RS)，其優(yōu)先利用所選氨基酸使Ο-tRNA氨?；?。通常，Ο-tRNA在同源合成酶(cognatesynthetase)存在下包含抑制活性。由本方法制造的蛋白質(zhì)也為本發(fā)明的特征。圖1-繪示具有TU/C莖突變位點(diǎn)的J17tRNA的三葉草結(jié)構(gòu)。圖2-繪示使用J17或J17突變體(F12、F13、F14)抑制人生長(zhǎng)激素中的琥珀突變。借助SDSPAGE分析各樣品的總細(xì)胞溶解產(chǎn)物。圖3-繪示在不同細(xì)胞系中使用F13抑制人生長(zhǎng)激素中的琥珀突變。圖4-繪示含有Ambrx抑制系統(tǒng)的pVK10_camR載體的圖。圖5-繪示含有λRed組件(bet、gam、核酸外切酶)的pKD46載體的圖。圖6-繪示重疊引物和實(shí)例5中所用方法的方案。引物由箭頭和數(shù)字標(biāo)識(shí)符指示，舉例來說，Y31和N51克隆體的引物1分別為SEQIDNO18和沈；Y31和N51克隆體的引物2分別為SEQIDNO19和27；Y31和N51克隆體的引物3分別為SEQIDNO20和28；Y31和N51克隆體的引物4分別為SEQIDNO21和29；Y31和N51克隆體的引物5分別為SEQIDNO22和30；Y31和N51克隆體的引物6分別為SEQIDNO23和31；Y31和N51克隆體的引物7分別為SEQIDNO24和32；Y31和N51克隆體的引物8分別為SEQIDNO25和33。PCR產(chǎn)物由字母標(biāo)識(shí)。含有琥珀位點(diǎn)的甲硫氨酸氨基肽酶是通過在琥珀突變(A和B)上重疊PCR而產(chǎn)生，這使得其對(duì)于大腸桿菌全生物體是條件致死的。隨后將突變體甲硫氨酸氨基肽酶融合到完整基因(C)中，并與選擇性標(biāo)記物(D)和一部分突變體甲硫氨酸氨基肽酶(E)組合，以供下游選擇。圖7-繪示針對(duì)人工氨基酸依賴性進(jìn)行篩選的方案。顯示的三個(gè)步驟為1)通過處理板來挑取轉(zhuǎn)化株，例如KanR、AmpR陽性轉(zhuǎn)化株；2)培養(yǎng)在KanR、AmpR+非天然氨基酸中存活者；和3)在非天然氨基酸存在和不存在下，使個(gè)別集落在板上長(zhǎng)出，并選出在非天然氨基酸存在下生長(zhǎng)且在無非天然氨基酸情況下培養(yǎng)時(shí)死亡的那些集落。圖8-繪示兩個(gè)大腸桿菌細(xì)胞培養(yǎng)板，其用于針對(duì)TOl處的甲硫氨酸氨基肽酶基因琥珀突變的篩選，各自涂有LB瓊脂和含有50μg/mL氨芐青霉素(Ampicilin)和50μg/mL卡那霉素(Karmamycin)的培養(yǎng)基，左側(cè)的板另外含有2mM對(duì)乙?；奖彼?，而右側(cè)的板不含。A12、C5和E3是化學(xué)調(diào)節(jié)的復(fù)制依賴性大腸桿菌的實(shí)例。圖9-繪示兩個(gè)大腸桿菌細(xì)胞培養(yǎng)板，其用于針對(duì)N51處的甲硫氨酸氨基肽酶基因琥珀突變的篩選，各自涂有LB瓊脂和含有50μg/mL氨芐青霉素和50μg/mL卡那霉素的培養(yǎng)基，左側(cè)的板另外含有2mM對(duì)乙酰基苯丙氨酸，而右側(cè)的板不含。A12、C5和E3是化學(xué)調(diào)節(jié)的復(fù)制依賴性大腸桿菌的實(shí)例。圖IOA和IOB-繪示在許可(permissive)和不許可(nonpermissive)培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)。將過夜培養(yǎng)物以每圖右上角中所示的最佳稀釋比接種到葡萄糖(菱形)或阿拉伯糖(圓形)培養(yǎng)基中。37°C下，在振蕩的Spectramax讀板器中，通過定期取出樣品進(jìn)行顯微鏡檢查，并接種到阿拉伯糖板上，來監(jiān)測(cè)96孔板的0D600。使用CFU濃度除以0D600進(jìn)行歸一化，由此計(jì)算出成活力的改變，提供于右軸上(三角形)。對(duì)于每個(gè)時(shí)間點(diǎn)，將所述值除以T=0時(shí)的值，并在此處提供所述值的對(duì)數(shù)。由飽和接種物測(cè)量并針對(duì)稀釋度校正的T=0時(shí)每OD單位每毫升CFU的數(shù)量如下野生型(WT),4.6XIO9；frr突變體，3.2XIO9；gcpE突變體，3.4XIO9；IpxC突變體，2.2XIO9；map突變體，2.9XIO9；murA突變體，8.7XIO8；ppa突變體，1.5XIO9；rpsA突變體，1.2X109。OD以線性而非對(duì)數(shù)標(biāo)度顯示，以便更好地顯示搖晃中培養(yǎng)物的動(dòng)力學(xué)，而IpxC右軸的標(biāo)度不同并繪制成防止趨勢(shì)線發(fā)生重疊。對(duì)于murA測(cè)量的最后兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)，沒有集落生長(zhǎng)。參見赫林格(Herring)和伯特納(Blattner)細(xì)菌學(xué)雜志(JOURNALOFBACTERIOLOGY)，2004，第沈73-2681頁，以引用的方式并入本文中。圖11-繪示表征回復(fù)率(reversionrate)的示意圖，其中遺傳修飾的非天然氨基酸復(fù)制依賴性細(xì)胞在加有非天然氨基酸的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)到1.0光學(xué)密度，隨后將這些細(xì)胞的連續(xù)稀釋液接種到加有非天然氨基酸的培養(yǎng)基中，以計(jì)算集落形成單位，并且在不存在非天然氨基酸情況下培養(yǎng)剩余細(xì)胞以檢測(cè)回復(fù)突變體(revertant)。圖12-繪示誘變策略的示意圖。線性DNA片段是借助于重疊延伸PCR由野生型模板基因組DNA產(chǎn)生。引物的位置由單側(cè)箭頭指示。通過電穿孔將PCR融合產(chǎn)物引入細(xì)胞中，并選擇由雙重重組事件得到的整合體(integration)。在鑒別出帶有后續(xù)(tagalong)琥珀終止密碼子的克隆體后，誘導(dǎo)HceI基因，由此去除編碼Camr的基因。在短復(fù)制區(qū)(duplicatedregion)內(nèi)的重組引起產(chǎn)生另外不留痕跡的(scarless)琥珀突變體。圖13-繪示后續(xù)(tagalong)誘變中所用的質(zhì)粒。圖14-繪示在大腸桿菌中產(chǎn)生條件致死性突變體的步驟的示意圖，從上面開始，包括1)產(chǎn)生條件突變體模板；幻轉(zhuǎn)化到λRED重組體(琥珀抑制型感受態(tài)株)中；和3)誘導(dǎo)λRED重組。圖15-繪示在大腸桿菌中表征條件致死性突變體的示意圖，從上面開始，包括1)表征在成功轉(zhuǎn)化的生物體所依賴的非天然氨基酸存在或不存在下進(jìn)行的生長(zhǎng)；幻將突變表征為殺菌性的或抑菌性的；和幻表征回復(fù)突變體的頻率。圖16-繪示MAP殘基挑取的結(jié)構(gòu)圖。10圖17-繪示MAP殘基挑取的結(jié)構(gòu)圖。具體實(shí)施例方式定義在詳細(xì)描述本發(fā)明之前，應(yīng)了解，本發(fā)明不局限于特定生物系統(tǒng)，這當(dāng)然可以變化。還應(yīng)了解，本文中使用的術(shù)語只是出于描述特定實(shí)施例的目的，而不是打算限制本發(fā)明的范圍，本發(fā)明的范圍應(yīng)僅受隨附權(quán)利要求書限制。除非上下文另作明確指出，否則如本文和隨附權(quán)利要求中使用的單數(shù)形式“一”和“所述”包括多個(gè)參考物。因此，例如提到“一細(xì)胞”包括兩個(gè)或兩個(gè)以上細(xì)胞的組合，并且包括所屬一般領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其等效物等。提到的“細(xì)菌”包括細(xì)菌的混合物等。除非本文和下文說明書的剩余部分中另作定義，否則本文中使用的所有科技術(shù)語的含義與本發(fā)明所屬領(lǐng)域技術(shù)人員通常所了解的含義相同。本文中提到的所有出版物和專利都以引用的方式并入本文中，以達(dá)到描述和揭示例如出版物中所述的可能與當(dāng)前所述的發(fā)明結(jié)合使用的構(gòu)造和方法學(xué)的目的。本文中所討論的出版物只提供處在本申請(qǐng)案的申請(qǐng)日期之前的揭示內(nèi)容。本文決不應(yīng)解釋為承認(rèn)本發(fā)明者無權(quán)由于先前發(fā)明或任何其它原因而使所述揭示案的日期提前。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)和/或蛋白質(zhì)序列是天然地或以人工方式從共同的祖先蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)序列得到時(shí)，其為“同源”的。類似地，當(dāng)核酸和/或核酸序列是天然地或以人工方式從共同的祖先核酸或核酸序列得到時(shí)，其為同源的。舉例來說，可借助任何可用的誘變方法來修飾任何天然存在的核酸，以使其包括一個(gè)或一個(gè)以上選擇密碼子。當(dāng)?shù)玫奖磉_(dá)時(shí)，這一誘變的核酸編碼包含一個(gè)或一個(gè)以上所選氨基酸(例如，非天然氨基酸)的多肽。當(dāng)然，突變過程可另外改變一個(gè)或一個(gè)以上標(biāo)準(zhǔn)密碼子，從而也使所得突變蛋白中的一個(gè)或一個(gè)以上標(biāo)準(zhǔn)氨基酸改變。所述一個(gè)或一個(gè)以上標(biāo)準(zhǔn)氨基酸可變?yōu)榉翘烊话被峄蛱烊话被?。同源性一般是由兩個(gè)或兩個(gè)以上核酸或蛋白質(zhì)(或其序列)之間的序列相似性推定?？捎糜诖_定同源性的序列之間相似性的確切百分比隨所討論核酸和蛋白質(zhì)而變化，但通常使用僅25%的序列相似性來確定同源性。更高的序列相似性水平(例如，30%、35%、40%、45%、50%,55%,60%,65%,70%,75%,80%,85%,90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%、98%或99%，或99%以上)也可用于確定同源性。本文中將描述測(cè)定序列相似性百分比的方法(例如，使用默認(rèn)參數(shù)的BLASTP和BLASTN)并且一般可用。本文中使用的術(shù)語“正交”是指分子(例如，正交tRNA(O-tRNA)和/或正交氨酰基tRNA合成酶(O-RS))是以較低效率被相關(guān)系統(tǒng)(例如，翻譯系統(tǒng)，例如細(xì)胞)所使用。正交是指正交tRNA和/或正交RS無能力或以較低效率(例如，低于20%的效率、低于10%的效率、低于5%的效率，或例如低于的效率)在相關(guān)翻譯系統(tǒng)中起作用。舉例來說，當(dāng)與通過內(nèi)源性RS將內(nèi)源性tRNA氨?；啾容^時(shí)，相關(guān)翻譯系統(tǒng)中的任何內(nèi)源性RS以較低效率或甚至為零的效率將相關(guān)翻譯系統(tǒng)中的正交tRNA氨?；Ｔ诹硪粚?shí)例中，當(dāng)與通過內(nèi)源性RS將內(nèi)源性tRNA氨酰基化相比較時(shí)，正交RS以較低效率或甚至為零的效率將相關(guān)翻譯系統(tǒng)中的任何內(nèi)源性tRNA氨?；??？蓪⒌诙环肿右爰?xì)胞中，從而與第一正交分子一起起作用。舉例來說，正交tRNA/RS對(duì)包括所引入的在細(xì)胞中相對(duì)于相應(yīng)內(nèi)源性tRNA/RS對(duì)以一定效率(例如，約50%效率、約60%效率、約70%效率、約75%效率、約80%效率、約85%效率、約90%效率、約95%效率，或者約99%或更高效率)一起起作用的互補(bǔ)組件?！罢恍缘母牧肌笔侵刚恍韵啾仍匣蛱烊淮嬖诘膖RNA或RS有所增強(qiáng)。術(shù)語“同源物(cognate)”是指一起起作用的組件，例如tRNA和氨?；?tRNA合成酶。這些組件也可稱為互補(bǔ)的。術(shù)語“優(yōu)先氨酰基化”是指與O-RS將天然存在的tRNA或用于產(chǎn)生0_tRNA的原料氨?；啾容^，O-RS利用所選氨基酸(例如，非天然氨基酸)將Ο-tRNA氨酰基化的效率，例如約70%效率、約75%效率、約80%效率、約85%效率、約90%效率、約95%效率，或者約99%或更高效率。隨后，將非天然氨基酸以高保真度，例如以對(duì)指定選擇密碼子大于約70%的效率、對(duì)指定選擇密碼子大于約75%的效率、對(duì)指定選擇密碼子大于約80%的效率、對(duì)指定選擇密碼子大于約85%的效率、對(duì)指定選擇密碼子大于約90%的效率、對(duì)指定選擇密碼子大于約95%的效率或?qū)χ付ㄟx擇密碼子大于約99%的效率，并入正在生長(zhǎng)的多肽鏈中?！邦A(yù)防性治療”是對(duì)未展現(xiàn)疾病、病理或醫(yī)學(xué)病癥的病征或癥狀，或者只展現(xiàn)疾病、病理或病癥的早期病征或癥狀的個(gè)體投予的治療，投予這種治療將達(dá)到減輕、防止或降低發(fā)展疾病、病理或醫(yī)學(xué)病癥的風(fēng)險(xiǎn)的目的。預(yù)防性治療起到防止性治療疾病或病癥的作用?！邦A(yù)防活性”是某種試劑(例如，非天然免疫原和/或抗體，或其組合物)在投予未展現(xiàn)病理、疾病或病癥的病征或癥狀(或只展現(xiàn)病理、疾病或病癥的早期病征或癥狀)的個(gè)體時(shí)減輕、防止或降低個(gè)體發(fā)展病理、疾病或病癥的風(fēng)險(xiǎn)的活性。本發(fā)明的“適用于預(yù)防的”試劑或化合物(例如非天然免疫原和/或抗體)是指可用于減輕、防止、治療或減少病理、疾病或病癥的發(fā)展的試劑或化合物。治療、疫苗和/或預(yù)防性治療可投予有需要的患者。治療、疫苗和/或預(yù)防性治療也可以投予各種各樣的動(dòng)物，包括(但不限于)家畜，例如奶牛、豬、山羊、綿羊、雞，和/或其它常見的農(nóng)場(chǎng)動(dòng)物和常見的家養(yǎng)寵物，例如貓、狗、鸚鵡、長(zhǎng)尾鸚鵡等。術(shù)語“選擇密碼子”是指在翻譯過程中由Ο-tRNA識(shí)別且不被內(nèi)源性tRNA識(shí)別的密碼子。Ο-tRNA反密碼子環(huán)識(shí)別mRNA上的選擇密碼子，并且在多肽中的這一位點(diǎn)并入其氨基酸，例如所選氨基酸，如非天然氨基酸。選擇密碼子可例如包括(但不限于)無義密碼子，例如終止密碼子，包括(但不限于)琥珀密碼子、赭石密碼子和蛋白石密碼子；四個(gè)或四個(gè)以上堿基密碼子；稀有密碼子；從天然或非天然堿基對(duì)獲得的密碼子等。對(duì)于指定系統(tǒng)，選擇密碼子也可以包括一個(gè)天然三堿基密碼子，其中內(nèi)源性系統(tǒng)不使用(或極少使用)這一天然三堿基密碼子。舉例來說，這一內(nèi)源性系統(tǒng)包括缺乏識(shí)別天然三堿基密碼子的tRNA的系統(tǒng)，和/或天然三堿基密碼子是稀有密碼子的系統(tǒng)。抑制性tRNA(suppressortRNA)是例如通過提供對(duì)選擇密碼子反應(yīng)而將氨基酸并入多肽鏈中的機(jī)制，來改變指定翻譯系統(tǒng)中信使RNA(mRNA)的閱讀的tRNA。舉例來說，抑制性tRNA可通讀包括(但不限于)終止密碼子、四堿基密碼子或稀有密碼子在內(nèi)的密碼子。術(shù)語“抑制活性”是指tRNA(例如，抑制性tRNA)通讀選擇密碼子的能力?；钚钥梢员硎緸橛^察到的活性相對(duì)于對(duì)照組(例如缺乏同源合成酶)活性的百分比。術(shù)語“翻譯系統(tǒng)”是指將天然存在的氨基酸并入正在生長(zhǎng)的多肽鏈(蛋白質(zhì))所需的組件。翻譯系統(tǒng)的組件可包括例如核糖體、tRNA、合成酶、mRNA等。本發(fā)明組件可加到體外或體內(nèi)翻譯系統(tǒng)中。翻譯系統(tǒng)的實(shí)例包括(但不限于)非真核細(xì)胞，例如細(xì)菌(例如大腸桿菌)；真核細(xì)胞，例如酵母細(xì)胞、哺乳動(dòng)物細(xì)胞、植物細(xì)胞、藻類細(xì)胞、真菌細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞；無細(xì)胞翻譯系統(tǒng)，例如細(xì)胞溶解產(chǎn)物，等。翻譯系統(tǒng)可為細(xì)胞翻譯系統(tǒng)或無細(xì)胞翻譯系統(tǒng)，并且可以是原核或真核翻譯系統(tǒng)。細(xì)胞翻譯系統(tǒng)包括(但不限于)全細(xì)胞制劑，例如可將所需核酸序列轉(zhuǎn)錄成mRNA并且翻譯mRNA的滲透化細(xì)胞或細(xì)胞培養(yǎng)物。無細(xì)胞翻譯系統(tǒng)在市面上有售，并且眾所周知許多不同類型和系統(tǒng)。無細(xì)胞系統(tǒng)的實(shí)例包括(但不限于)原核細(xì)胞溶解產(chǎn)物，例如大腸桿菌溶解產(chǎn)物；和真核細(xì)胞溶解產(chǎn)物，例如麥胚提取物、昆蟲細(xì)胞溶解產(chǎn)物、兔網(wǎng)織紅細(xì)胞溶解產(chǎn)物、兔卵母細(xì)胞溶解產(chǎn)物和人細(xì)胞溶解產(chǎn)物。當(dāng)將所得蛋白質(zhì)糖基化、磷酸化，或以其它方式進(jìn)行修飾時(shí)，由于許多此類修飾只可能在真核系統(tǒng)中發(fā)生，故優(yōu)選真核提取物或溶解產(chǎn)物。這些提取物和溶解產(chǎn)物中有一些在市面上有售(普洛麥格公司(Promega)Ji于威斯康星州麥迪遜(Madison，Wis.)；賽特杰公司(Mratagene)，位于加利福尼亞州拉荷亞(LaJolla,Calif.)；安瑪西亞生物技術(shù)公司(Amersham)，位于伊利諾伊州阿靈頓海茨(ArlingtonHeights,111.)；GIBC0/BRL公司，位于紐約州格蘭德島(GrandIsland,N.Y.))。也有膜提取物(例如含有微粒體膜的犬胰腺提取物)可用，其適用于翻譯分泌蛋白質(zhì)。還可使用重構(gòu)的翻譯系統(tǒng)。已經(jīng)成功地使用純化的翻譯因子混合物，以及溶解產(chǎn)物或補(bǔ)充有純化翻譯因子(例如起始因子-l(IF-l)、IF-2、IF-3(α或β)、延伸因子T(elongationfactorΤ,EF-Tu)或終止因子)的溶解產(chǎn)物的組合，將mRNA翻譯成蛋白質(zhì)。無細(xì)胞系統(tǒng)也可為偶聯(lián)的轉(zhuǎn)錄/翻譯系統(tǒng)，其中如現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)(CurrentProtocolsinMolecularBiology)(F.Μ.奧斯貝爾(F.Μ·Ausubel)等人編輯，威立出版公司(WileyInterscience)，1993)(以引用的方式清楚地并入本文中)中所述，將DNA引入所述系統(tǒng)中，轉(zhuǎn)錄成mRNA并翻譯mRNA。在真核轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)中轉(zhuǎn)錄的RNA可為異核RNA(hnRNA)或者5'端戴帽(7-甲基鳥苷)且3'端加多聚腺苷酸尾的成熟mRNA形式，這在某些翻譯系統(tǒng)中可為有利條件。舉例來說，在網(wǎng)織紅細(xì)胞溶解產(chǎn)物系統(tǒng)中，以高效率翻譯戴帽的mRNA。術(shù)語“所選氨基酸，，是指任何所需的天然存在氨基酸或非天然氨基酸。本文中使用的術(shù)語“非天然氨基酸”或“非天然編碼氨基酸”是指不為20種常見的天然存在氨基酸中的一種或者硒代半胱氨酸或吡咯賴氨酸的任何氨基酸、經(jīng)修飾氨基酸和/或氨基酸類似物。可與術(shù)語“非天然編碼氨基酸”和“非天然氨基酸(unnaturalaminoacid)”同義使用的其它術(shù)語為“非天然氨基酸(non-naturalaminoacid)”、“非天然存在氨基酸”以及其各種帶連字符和不帶連字符的型式。術(shù)語“非天然編碼氨基酸”也包括(但不限于)通過修飾(例如，翻譯后修飾)天然編碼氨基酸(包括(但不限于)20種常見氨基酸，或吡咯賴氨酸和硒代半胱氨酸)而產(chǎn)生，但本身未通過翻譯復(fù)合物天然地并入到正在生長(zhǎng)的多肽鏈中的氨基酸。所述非天然存在氨基酸的實(shí)例包括(但不限于)N-乙酰葡糖胺基-L-絲氨酸、N-乙酰葡糖胺基-L-蘇氨酸和0-磷酸酪氨酸。非天然氨基酸本文中使用的非天然氨基酸是指除硒代半胱氨酸和/或吡咯賴氨酸和以下20種正規(guī)的遺傳編碼α-氨基酸外的任何氨基酸、經(jīng)修飾氨基酸或氨基酸類似物丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、組氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、色氨酸、酪氨酸、纈氨酸。在本發(fā)明各種實(shí)施例中，并入非天然免疫原中的一個(gè)或一個(gè)以上非天然氨基酸可以是任何非天然氨基酸。因此，應(yīng)理解，本文中陳述的特定非天然氨基酸當(dāng)然不應(yīng)視作對(duì)本發(fā)明的限制。已經(jīng)通過例如使用包含正交元件的翻譯系統(tǒng)，在體內(nèi)編碼多種非天然氨基酸，來將其并入蛋白質(zhì)中。相關(guān)綜述，例如參見劉(Liu)等人Q007)“在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中將非天然氨基酸遺傳并入蛋白質(zhì)中(Geneticincorporationofunnaturalaminoacidsintoproteinsinmammaliancells)”自然方法(NatMethods)4:239-244；王(Wang)等人(2006)“擴(kuò)充遺傳密碼(Expandingthegeneticcode)”生物物理學(xué)與生物分子結(jié)構(gòu)年評(píng)(AnnuRevBiophysBiomolStruct)35:225-249；謝(Xie)和查魯茲(Schultz)(2006)“蛋白質(zhì)的化學(xué)工具箱一擴(kuò)充的遺傳密碼(Achemicaltoolkitforproteins—anexpandedgeneticcode)”自然評(píng)論分子細(xì)胞生物學(xué)(NatRevMolCellBiol)7:775-782；王和查魯茲“擴(kuò)充遺傳密碼(ExpandingtheGeneticCode)，”德國(guó)應(yīng)用化學(xué)雜志(AngewandteChemieInt.Ed),44(1)=34-66(2005)；和秦(Chin)等人(2003)“擴(kuò)充的真核遺傳密碼(Anexpandedeukaryoticgeneticcode)，，禾斗學(xué)(Science)301:964_967。在本發(fā)明一些實(shí)施例中，需要使用的非天然氨基酸不是20種常見的天然存在氨基酸中的任一種或稀有的天然存在氨基酸，例如硒代半胱氨酸或吡咯賴氨酸。舉例來說，在本文中各種實(shí)施例中可以使用非天然氨基酸對(duì)硝基苯丙氨酸、對(duì)磺基酪氨酸和對(duì)羧基苯丙氨酸。在一些實(shí)施例中，非天然氨基酸可包括(但不限于)對(duì)硝基苯丙氨酸；鄰硝基苯丙氨酸；間硝基苯丙氨酸；對(duì)硼羰基苯丙氨酸(p-boronylphenylalanine)；鄰硼羰基苯丙氨酸；間硼羰基苯丙氨酸；對(duì)氨基苯丙氨酸；鄰氨基苯丙氨酸；間氨基苯丙氨酸；對(duì)?；奖彼幔秽忰；奖彼?；間?；奖彼?；對(duì)OMe苯丙氨酸；鄰OMe苯丙氨酸；間OMe苯丙氨酸；對(duì)磺基苯丙氨酸；鄰磺基苯丙氨酸；間磺基苯丙氨酸；5-硝基His；3-硝基Tyr；2-硝基Tyr；硝基取代的Leu；硝基取代的His；硝基取代的De；硝基取代的Trp；2-硝基Trp；4-硝基Trp；5-硝基Trp；6-硝基Trp；7-硝基Trp；3-氨基酪氨酸、2-氨基酪氨酸、0-磺基酪氨酸、2-磺基氧基苯丙氨酸、3-磺基氧基苯丙氨酸或?qū)︳然奖彼?、鄰羧基苯丙氨酸和間羧基苯丙氨酸。另外，應(yīng)理解，本發(fā)明不限于特定非天然氨基酸。此外，在本發(fā)明各種實(shí)施例中，可例如使用生物合成方法，在體外將非天然氨基酸并入免疫原中，在所述方法中利用所需非天然氨基酸將抑制性tRNA化學(xué)酰基化，并添加到能夠支持免疫原生物合成的體外提取物中。有關(guān)所述體外合成方法的描述，例如參見V.W.柯尼西(V.W.Cornish),D.孟德爾(D.Mendel)和P.G.查魯茲(P.G.Schultz),德國(guó)應(yīng)用化學(xué)(英文版)(Angew.Chem.Int.Ed.Engl.)1995，34:621(1995)；C.J.諾倫(C.J.Noren)，S.J.安托尼-卡黑爾(S.J.Anthony-Cahi11)，Μ·C.格雷夫斯(Μ.C.Griffith)，P.G.查魯茲(P.G.Schultz)，“用于將非天然氨基酸位點(diǎn)特異性并入蛋白質(zhì)中的一般方法(Ageneralmethodforsite-specificincorporationofunnaturalaminoacidsintoproteins)，，，科學(xué)(Science)244182—188(1989)；禾口J.D.貝恩(J.D.Bain)，C.G.格雷布(C.G.Glabe)，Τ.Α.迪克斯(Τ.A.Dix)，A.R.查桕林(A.R.Chamberlin),Ε.S.迪阿拉(Ε.S.Diala)，“用于將非天然氨基酸位點(diǎn)特異性并入多月太中白勺生物合成方法(Biosyntheticsite-specificincorporationofanon-naturalaminoacidintoapolypeptide)，，，美國(guó)化學(xué)協(xié)會(huì)雜志(J.Am.Chem.Soc.)1118013-8014(1989)。也可以借助可用的合成肽化學(xué)(此類方法也可將天然氨基酸轉(zhuǎn)化成非天然氨基酸)或翻譯后加工，將非天然氨基酸添加到天然或合成產(chǎn)生的蛋白質(zhì)中。然而，也應(yīng)理解，所述翻譯后和化學(xué)修飾通常是與在分子合成期間并入一個(gè)或一個(gè)以上非天然氨基酸(例如直接并入，如正交翻譯、固相合成等)結(jié)合進(jìn)行或另外進(jìn)行。因此，氨基酸的翻譯后添加或化學(xué)修飾通常只是(如果進(jìn)行的話)對(duì)在分子合成期間已經(jīng)添加了非天然氨基酸的分子進(jìn)行。下文將提供有關(guān)將非天然氨基酸非正交并入免疫原中的其它信息。本文中使用的術(shù)語“源自”是指從特定分子或生物體分離或者使用來自特定分子或生物體的信息制造的組件?！爸亟M宿主細(xì)胞”或“宿主細(xì)胞”是指包括外源多聚核苷酸的細(xì)胞，不管用于插入的方法如何，例如直接攝取、轉(zhuǎn)導(dǎo)、f配對(duì)，或此項(xiàng)技術(shù)中已知用于產(chǎn)生重組宿主細(xì)胞的其它方法。外源多聚核苷酸可以保持為非整合載體(例如質(zhì)粒)的形式，或者可被整合到宿主基因組中。本文中使用的術(shù)語“培養(yǎng)基”包括任何培養(yǎng)基、溶液、固體、半固體或剛性支撐物，其可支撐或含有任何宿主細(xì)胞，包括細(xì)菌宿主細(xì)胞、酵母宿主細(xì)胞、昆蟲宿主細(xì)胞、植物宿主細(xì)胞、真核生物宿主細(xì)胞、哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞、CHO細(xì)胞、原核生物宿主細(xì)胞、大腸桿菌或假單胞菌屬宿主細(xì)胞和細(xì)胞內(nèi)容物。因此，這一術(shù)語涵蓋已經(jīng)生長(zhǎng)了宿主細(xì)胞的培養(yǎng)基，例如正在生長(zhǎng)培養(yǎng)物或者全生物體或細(xì)胞的培養(yǎng)基，并且所述培養(yǎng)基中可包括非天然氨基酸以支持復(fù)制缺陷型生物體或細(xì)胞的生長(zhǎng)，包括增殖步驟之前或之后的培養(yǎng)基。這一術(shù)語還可涵蓋含有宿主細(xì)胞溶解產(chǎn)物的緩沖液或試劑，例如抗原是在細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生并且宿主細(xì)胞溶解或破裂而釋放所述抗原或重組抗原的情形。本文中提到蛋白質(zhì)再折疊時(shí)使用的“還原劑”定義為使硫氫基保持還原態(tài)，并且還原分子內(nèi)或分子間二硫鍵的任何化合物或材料。適當(dāng)還原劑包括(但不限于)二硫蘇糖醇(DTT)、2_巰基乙醇、二硫赤蘚醇、半胱氨酸、半胱胺(2-氨基乙硫醇)和還原型谷胱甘肽。所屬領(lǐng)域技術(shù)人員易于了解，多種還原劑適用于本發(fā)明的方法和組合物中。本文中提到蛋白質(zhì)再折疊時(shí)使用的“氧化劑”定義為能夠從所氧化的化合物中去除電子的任何化合物或材料。適當(dāng)氧化劑包括(但不限于)氧化型谷胱甘肽、胱氨酸、胱胺、氧化的二硫蘇糖醇、氧化的赤蘚醇和氧。所屬領(lǐng)域技術(shù)人員易于了解，多種氧化劑適用于本發(fā)明的方法中。本文中使用的“再折疊”是關(guān)于二硫鍵，其描述將含有二硫鍵的多肽從未適當(dāng)折疊或展開狀態(tài)轉(zhuǎn)變成天然或適當(dāng)折疊的構(gòu)象的任何過程、反應(yīng)或方法。本文中使用的“共折疊”是指使用至少兩個(gè)多肽的再折疊過程、反應(yīng)或方法，這些多肽彼此相互作用，并且使展開或不恰當(dāng)折疊的多肽轉(zhuǎn)變成天然的適當(dāng)折疊的多肽?！鞍被┒诵揎椈鶊F(tuán)”是指可與多肽的氨基末端連接的任何分子。類似地，“羧基末端修飾基團(tuán)”是指可與多肽的羧基末端連接的任何分子。末端修飾基團(tuán)包括(但不限于)各種水溶性聚合物、肽或蛋白質(zhì)(例如血清白蛋白)，或者增加肽的血清半衰期的其它部分。此項(xiàng)技術(shù)中和本文中使用的術(shù)語“官能團(tuán)”、“活性部分”、“活化基團(tuán)”、“離去基團(tuán)”、“反應(yīng)位點(diǎn)”、“化學(xué)反應(yīng)性基團(tuán)”和“化學(xué)反應(yīng)性部分”是指分子中截然不同、可定義的部分或單元。這些術(shù)語在某種程度上與在化學(xué)技術(shù)中的含義同義，且在本文中用于指示分子中執(zhí)行某種功能或活性并與其它分子反應(yīng)的部分。本文中使用的術(shù)語“鍵”或“連接子”是指通常由化學(xué)反應(yīng)形成的基團(tuán)或鍵結(jié)，且通常為共價(jià)鍵。水解穩(wěn)定性鍵是指，這些鍵在水中實(shí)質(zhì)上穩(wěn)定，并且在有用的PH值下(包括(但不限于)在生理?xiàng)l件下)可在一段較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)(可能甚至無限期)不與水反應(yīng)。水解不穩(wěn)定或可降解性鍵意思是指，這些鍵可在水或水溶液(包括例如血液)中降解。酶促不穩(wěn)定或可降解性鍵是指，這些鍵可經(jīng)一種或一種以上酶降解。此項(xiàng)技術(shù)中應(yīng)了解，PEG和相關(guān)聚合物可在聚合物主鏈中或在聚合物主鏈與聚合物分子的一個(gè)或一個(gè)以上末端官能團(tuán)之間的連接基團(tuán)中包括可降解的鍵。舉例來說，由PEG羧酸或活性PEG羧酸與生物活性劑上的醇基反應(yīng)而形成的酯鍵一般會(huì)在生理?xiàng)l件下水解，釋放出所述試劑。其它水解可降解鍵包括(但不限于)碳酸酯鍵；由胺與醛反應(yīng)產(chǎn)生的亞胺鍵；通過醇與磷酸基反應(yīng)形成的磷酸酯鍵；作為酰胼與醛的反應(yīng)產(chǎn)物的腙鍵；作為醛與醇的反應(yīng)產(chǎn)物的縮醛鍵；作為甲酸鹽與醇的反應(yīng)產(chǎn)物的原酸酯鍵；由(包括(但不限于))聚合物(諸如PEG)末端的胺基與肽的羧基形成的肽鍵；和由(包括(但不限于))聚合物末端的亞磷酰胺(phosphoramidite)基與寡核苷酸的5'羥基形成的寡核苷酸鍵。用于本文中時(shí)，術(shù)語“生物活性分子”、“生物活性部分”或“生物活性劑”是指可影響與生物體有關(guān)的生物系統(tǒng)、路徑、分子或相互作用的任何物理或生物化學(xué)特性的任何物質(zhì)，所述生物體包括(但不限于)病毒、細(xì)菌、噬菌體、轉(zhuǎn)座子、朊病毒、昆蟲、真菌、植物、動(dòng)物和人。具體說來，本文中使用的生物活性分子包括(但不限于)打算用于診斷、治愈、減輕、治療或預(yù)防人或其它動(dòng)物的疾病，或以其它方式增強(qiáng)人或動(dòng)物的身體或精神良好狀態(tài)的任何物質(zhì)。生物活性分子的實(shí)例包括(但不限于)肽、蛋白質(zhì)、酶、小分子藥物、疫苗、免疫原、硬藥(harddrug)、軟藥、碳水化合物、無機(jī)原子或分子、染料、脂質(zhì)、核苷、放射性核素、寡核苷酸、類毒素、毒素、原核生物和真核生物細(xì)胞、病毒、多糖、核酸和其得自或來源于病毒、細(xì)菌、昆蟲、動(dòng)物或任何其它細(xì)胞或細(xì)胞類型的部分，脂質(zhì)體、微粒和膠束。適用于本發(fā)明的生物活性劑的種類包括(但不限于)藥物、前藥、放射性核素、顯像劑、聚合物、抗生素、殺真菌齊IJ、抗病毒劑、消炎齊、抗腫瘤劑、心血管藥、抗焦慮齊、激素、生長(zhǎng)因子、類固醇藥、微生物來源的毒素等。除非另作規(guī)定，否則術(shù)語“芳基”是指可為單環(huán)或者為稠合在一起或共價(jià)連接的多個(gè)環(huán)(包括(但不限于)1到3個(gè)環(huán))的多不飽和、芳香烴取代基。術(shù)語“雜芳基”是指含有1到4個(gè)選自N、0和S的雜原子的芳基(或環(huán))，其中氮和硫原子任選經(jīng)氧化，且氮原子任選經(jīng)季銨化。雜芳基可經(jīng)由雜原子與分子的其余部分連接。芳基和雜芳基的非限制性實(shí)例包括苯基、1-萘基、2-萘基、4-聯(lián)苯基、1-吡咯基、2-吡咯基、3-吡咯基、3-吡唑基、2-咪唑基、4-咪唑基、吡嗪基、2-噁唑基、4-噁唑基、2-苯基-4-噁唑基、5-噁唑基、3-異噁唑基、4-異噁唑基、5-異噁唑基、2-噻唑基、4-噻唑基、5-噻唑基、2-呋喃基、3-呋喃基、2-噻吩基、3-噻吩基、2-吡啶基、3-吡啶基、4-吡啶基、2-嘧啶基、4-嘧啶基、5-苯并噻唑基、嘌呤基、2-苯并咪唑基、5-吲哚基、1-異喹啉基、5-異喹啉基、2-喹喔啉基、5-喹喔啉基、3-喹啉基和6-喹啉基。上述每一芳基和雜芳基環(huán)系統(tǒng)的取代基都選自下文所述的可接受取代基的群組。為簡(jiǎn)潔起見，術(shù)語“芳基”當(dāng)與其它術(shù)語(包括(但不限于)芳氧基、芳硫氧基、芳烷基)組合使用時(shí)，將包括上文所定義的芳基和雜芳基環(huán)。因此，術(shù)語“芳烷基”擬包括芳基與烷基連接的那些基團(tuán)(包括(但不限于)苯甲基、苯乙基、吡啶基甲基等)，所述烷基包括碳原子(包括(但不限于)亞甲基)已經(jīng)被例如氧原子置換的烷基(包括(但不限于)苯氧基甲基、2-吡啶氧基甲基、3-(1-萘氧基)丙基等)。上述每一術(shù)語(包括(但不限于)“烷基”、“雜烷基”、“芳基”和“雜芳基”)都打算包括所述基團(tuán)的經(jīng)取代和未取代形式。下文將提供各類基團(tuán)的例示性取代基。烷基和雜烷基(包括常常稱為亞烷基、烯基、亞雜烷基、雜烯基、炔基、環(huán)烷基、雜環(huán)烷基、環(huán)烯基和雜環(huán)烯基的那些基團(tuán))的取代基可為選自包括(但不限于)以下各基團(tuán)的多個(gè)基團(tuán)中的一個(gè)或一個(gè)以上基團(tuán)-OR'、=0、=NR',=N-OR',-NR'R〃、_SR'、-鹵素、-SiR‘R〃R〃‘、-OC(O)R‘、-C(O)R‘,-CO2R‘,-CONR‘R“、-OC(O)NR'R"、-NR〃C(O)R'、-NR'-C(O)NR"R"‘、-NR〃C(O)2R'、-NR-C(NR'R〃R"‘)=NR"“,-NR-C(NR'R〃)=NR"‘、-S(O)R'、-S(O)2R'、-S(O)2NR'R〃,-NRSO2R'、-CN和-NO2，其數(shù)量在0到Qm'+1)的范圍內(nèi)，其中m'為所述基團(tuán)中碳原子的總數(shù)。R'、R"、R〃‘和R"‘‘各獨(dú)立地指氫、經(jīng)取代或未經(jīng)取代的雜烷基、經(jīng)取代或未經(jīng)取代的芳基(包括(但不限于)經(jīng)1到3個(gè)鹵素取代的芳基)、經(jīng)取代或未經(jīng)取代的烷基、烷氧基或硫烷氧基，或芳基烷基。舉例來說，當(dāng)本發(fā)明化合物包括一個(gè)以上R基團(tuán)時(shí)，各R基團(tuán)是如各R'、R〃、R〃‘和R〃“基團(tuán)在存在超過一個(gè)時(shí)那樣獨(dú)立地選擇。當(dāng)R'與R"連接到同一氮原子時(shí)，其可與所述氮原子組合形成5元、6元或7元環(huán)。舉例來說，-NR'R"擬包括(但不限于)1-吡咯烷基和4-嗎啉基。所屬領(lǐng)域技術(shù)人員從上文有關(guān)取代基的論述將了解到，術(shù)語“烷基”擬包括碳原子與除氫基外的基團(tuán)結(jié)合的基團(tuán)，例如鹵烷基(包括(但不限于)-CF3和-CH2CF3)和?；?包括(但不限于)-C(0)CH3>-C(0)CF3>-C(0)CH2OCH3等)。與針對(duì)烷基所述的取代基類似，芳基和雜芳基的取代基可變化，并且選自(但不限于)鹵素、-OR‘、=0、=NR‘、=N-OR‘,-NR‘R〃、-SR‘、-鹵素、-SiR‘R〃R〃‘、-OC(O)R‘、-C(O)R‘、-C02R‘,-CONR‘R“、-OC(O)NR'R"、-NR〃C(O)R'、-NR'-C(O)NR"R"‘、-NR〃C(0)2R'、-NR-C(NR'R〃R"‘)=NR"“,-NR-C(NR'R〃)=NR"‘、-S(O)R'、-S(0)2R'、-S(0)2NR'R〃、-NRS02R'、-CN和-N02、-R'、-N3、-CH(Ph)2、氟(C1-C4)烷氧基和氟(C1-C4)烷基，其數(shù)量在0到芳香族環(huán)系統(tǒng)上開放價(jià)態(tài)的總數(shù)的范圍內(nèi)；且其中R'、R"、R"‘和"“獨(dú)立地選自氫、烷基、雜烷基、芳基和雜芳基。舉例來說，當(dāng)本發(fā)明化合物包括一個(gè)以上R基團(tuán)時(shí)，各R基團(tuán)是如各R'、R〃、R〃‘和R〃“基團(tuán)在存在超過一個(gè)時(shí)那樣獨(dú)立地選擇。術(shù)語“核酸”是指單鏈或雙鏈形式的脫氧核糖核苷酸、脫氧核糖核苷、核糖核苷或核糖核苷酸，以及其聚合物。除非特別限制，否則這一術(shù)語涵蓋含有天然核苷酸的已知類似物的核酸，這些核酸的結(jié)合特性與參考核酸類似，并且代謝方式也與天然存在的核苷酸類似。除非另作明確限制，否則所述術(shù)語還指寡核苷酸類似物，包括PNA(肽基核酸(peptidonucleicacid))、反義技術(shù)中使用的DNA類似物(硫代磷酸酯、氨基磷酸酯等)。除非另作指示，否則特定核酸序列也隱含地涵蓋其保守修飾變異體(包括(但不限于)簡(jiǎn)并密碼子取代)和互補(bǔ)序列，以及明確指出的序列。具體來說，可通過產(chǎn)生一個(gè)或一個(gè)以上所選(或所有)密碼子的第三位經(jīng)混合堿基和/或脫氧肌苷殘基取代的序列來實(shí)現(xiàn)簡(jiǎn)并密碼子取代(拜特澤(Batzer)等人，核酸研究(NucleicAcidRes.)19:5081(1991)；大冢(Ohtsuka)等人，生物化學(xué)雜志(J.Biol.Chem.)260=2605-2608(1985)；羅斯里尼(Rossolini)等人，分子與細(xì)胞探針(Mol.Cell.Probes)8:91-98(1994))。當(dāng)用從左向右書寫的常規(guī)化學(xué)式說明取代基時(shí)，這些取代基同樣涵蓋由從右向左書寫結(jié)構(gòu)所得到的化學(xué)上一致的取代基，例如，結(jié)構(gòu)CH20與結(jié)構(gòu)-0CH2等同。術(shù)語“取代基”包括(但不限于)“非干擾性取代基”?！胺歉蓴_性取代基”是得到穩(wěn)定化合物的那些基團(tuán)。適當(dāng)?shù)姆歉蓴_性取代基或基團(tuán)包括(但不限于)鹵基、Cl-ClO烷基、C2-C10烯基、C2-C10炔基、Cl-ClO烷氧基、C2-C12芳烷基、C1-C12烷芳基、C3-C12環(huán)烷基、C3-C12環(huán)烯基、苯基、經(jīng)取代苯基、甲苯?；?、二甲苯基、聯(lián)苯基、C2-C12烷氧基烷基、C2-C12烷氧基芳基、C7-C12芳氧基烷基、C7-C12氧基芳基、C1-C6烷基亞磺?；?、Cl-ClO烷基磺?；?、-(CH2)m-0-(Cl-C10烷基)(其中m為1到8)、芳基、經(jīng)取代芳基、經(jīng)取代烷氧基、氟烷基、雜環(huán)基、經(jīng)取代雜環(huán)基、硝基烷基、一N02、一CN、一NRC(O)--(Cl-ClO烷基)、一C(0)--(Cl-ClO烷基)、C2-C10燒基硫燒基、—C(0)0—(C1-C10烷基)、一OH、一S02、=S、一C00H、一NR2、羰基、--C(O)--O^l-ClO燒基)-CF3、一C⑴)-CF3、一C(0)NR2、一(C1-C10芳基)-S—(C6-C10芳基)、-C(0)—(C1-C10芳基)、一(CH2)m—0—(CH2)m—0—(CI-C10烷基)(其中各m為1到8)、一C(0)NR2、一C(S)NR2、一S02NR2、-NRC(0)NR2、-NRC(S)NR2，其鹽等。本文中使用的各R為H、烷基或經(jīng)取代烷基、芳基或經(jīng)取代芳基、芳烷基或烷芳基。術(shù)語“鹵素”包括氟、氯、碘和溴。除非另作規(guī)定，否則單獨(dú)或作為另一取代基的一部分的術(shù)語“烷基”意思是具有指定碳原子數(shù)(即，Cl-ClO意思是1到10個(gè)碳)的直鏈或支鏈或者環(huán)狀烴基或其組合，其可為完全飽和、單或多不飽和的，并且可包括二價(jià)和多價(jià)基團(tuán)。飽和烴基的實(shí)例包括(但不限于)例如以下基團(tuán)甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、叔丁基、異丁基、仲丁基、環(huán)己基、(環(huán)己基)甲基、環(huán)丙基甲基；例如正戊基、正己基、正庚基、正辛基的同系物和異構(gòu)體，等。不飽和烷基是具有一個(gè)或一個(gè)以上雙鍵或三鍵的烷基。不飽和烷基的實(shí)例包括(但不限于)乙烯基、2-丙烯基、巴豆基(crotyl)、2-異戊烯基、2-(丁二烯基)、2，4_戊二烯基、3-(1,4-戊二烯基)、乙炔基、1-和3-丙炔基、3-丁炔基，以及高級(jí)同系物和異構(gòu)體。除非另作說明，否則術(shù)語“烷基”還打算包括下文更為詳細(xì)地定義的那些烷基衍生物，例如“雜烷基”。局限于烴基的烷基稱為“同系烷基(homoalkyl)”。單獨(dú)或作為另一取代基的一部分的術(shù)語“亞烷基”是指衍生自烷烴的二價(jià)基團(tuán)，例如(但不限于)結(jié)構(gòu)-CH2CH2-和-CH2CH2CH2CH2-，且另外包括下文描述為“亞雜烷基”的那些基團(tuán)。通常，烷基(或亞烷基)將具有1到M個(gè)碳原子，其中具有10個(gè)或更少碳原子的那些基團(tuán)為本文所述方法和組合物的特定實(shí)施例?！暗吞紨?shù)烷基”或“低碳數(shù)亞烷基”是一般具有8個(gè)或更少碳原子的短鏈烷基或亞烷基。術(shù)語“烷氧基”、“烷基氨基”和“烷硫基”(或硫烷氧基)是以其常規(guī)含義使用，并且指分別經(jīng)由氧原子、氨基或硫原子與分子剩余部分連接的那些烷基。除非另作規(guī)定，否則單獨(dú)或與另一術(shù)語組合的術(shù)語“雜烷基”是指穩(wěn)定的直鏈或支鏈或者環(huán)狀烴基，或其組合，其是由規(guī)定數(shù)量的碳原子和至少一個(gè)選自由0、N、Si和S組成的群組的雜原子組成，并且其中氮和硫原子可任選經(jīng)氧化，且氮雜原子可任選經(jīng)季銨化。雜原子0、N以及S和Si可位于雜烷基的任一內(nèi)部位置或在烷基與分子其余部分連接的位置。實(shí)例包括(但不限于)-CH2-CH2-0CH3、-CH2-CH2-NH-CH3、-CH2-CH2-N_)-CH3、-CH2-S-CH2-CH3、-CH2-CH2、-S(0)-CH3、-CH2-CH2—S(0)2—CH3、-CH=CH-0—CH3、-Si(CH3)3、-CH2—CH=N-0CH3和-CH=CH-N(CH3)-CH3。至多兩個(gè)雜原子可為連續(xù)的，例如-CH2-NH-0CH3和-CH2-0-Si(CH3)30類似地，單獨(dú)或作為另一取代基的一部分的術(shù)語“亞雜烷基”是指衍18生自雜烷基的二價(jià)基團(tuán)，例如(但不限于)-CH2-CH2-S-CH2-CH2-和-CH2-S-CH2-CH2-NH-CH2-。對(duì)于亞雜烷基，相同或不同雜原子也可占據(jù)任一個(gè)或兩個(gè)鏈末端(包括(但不限于)亞烷基氧基、亞烷基二氧基、亞烷基氨基、亞烷基二氨基、氨氧基亞烷基等)。另外，對(duì)于亞烷基和亞雜烷基連接基團(tuán)，連接基團(tuán)的化學(xué)式的書寫方向并不表示連接基團(tuán)的定向。舉例來說,式-C(O)2R'表示-C(O)2R'和-R'C(0)2。除非另作說明，否則單獨(dú)或與其它術(shù)語組合時(shí)術(shù)語“環(huán)烷基”和“雜環(huán)烷基”分別表示“烷基”和“雜烷基”的環(huán)狀形式。因此，環(huán)烷基或雜環(huán)烷基包括飽和、部分不飽和與完全不飽和的環(huán)鍵。此外，對(duì)于雜環(huán)烷基，雜原子可占據(jù)雜環(huán)與分子其余部分連接的位置。環(huán)烷基的實(shí)例包括(但不限于)環(huán)戊基、環(huán)己基、1-環(huán)己烯基、3-環(huán)己烯基、環(huán)庚基等。雜環(huán)烷基的實(shí)例包括(但不限于)1_(1，2，5,6-四氫吡啶基)、1-哌啶基、2-哌啶基、3-哌啶基、4-嗎啉基、3-嗎啉基、四氫呋喃-2-基、四氫呋喃-3-基、四氫噻吩-2-基、四氫噻吩-3-基、1-哌嗪基、2-哌嗪基等。此外，這一術(shù)語還涵蓋雙環(huán)和三環(huán)結(jié)構(gòu)。類似地，單獨(dú)或作為另一取代基的一部分的術(shù)語“亞雜環(huán)烷基”是指衍生自雜環(huán)烷基的二價(jià)基團(tuán)，并且單獨(dú)或作為另一取代基的一部分的術(shù)語“亞環(huán)烷基”是指衍生自環(huán)烷基的二價(jià)基團(tuán)。術(shù)語“氨基酸”是指天然存在和非天然存在氨基酸，以及作用方式與天然存在氨基酸類似的氨基酸類似物和氨基酸模擬物。天然編碼氨基酸為20種常見氨基酸(丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、組氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、色氨酸、酪氨酸和纈氨酸)以及吡咯賴氨酸和硒代半胱氨酸。氨基酸類似物是指基礎(chǔ)化學(xué)結(jié)構(gòu)與天然存在氨基酸相同的化合物，即，α碳與氫、羧基、氨基和R基團(tuán)結(jié)合，例如高絲氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亞砜、甲硫氨酸甲基锍。這些類似物具有經(jīng)修飾的R基團(tuán)(例如，正亮氨酸)或經(jīng)修飾的肽主鏈，但仍保留與天然存在氨基酸相同的基礎(chǔ)化學(xué)結(jié)構(gòu)。提到氨基酸包括例如天然存在的成蛋白質(zhì)性(proteogenidL-氨基酸；D-氨基酸，化學(xué)修飾的氨基酸，例如氨基酸變異體和衍生物；天然存在的非成蛋白質(zhì)性(non-proteogenic)氨基酸，例如α-丙氨酸、鳥氨酸等；以及具有此項(xiàng)技術(shù)中已知為氨基酸特征的特性的化學(xué)合成化合物。非天然存在氨基酸的實(shí)例包括(但不限于)α-甲基氨基酸(例如α-甲基丙氨酸)、D-氨基酸、組氨酸樣氨基酸(例如2-氨基-組氨酸、α-羥基-組氨酸、高組氨酸(homohistidine)、α-氟甲基-組氨酸和α-甲基-組氨酸)、側(cè)鏈中具有額外亞甲基的氨基酸(“高”氨基酸)，以及側(cè)鏈中的羧酸官能團(tuán)經(jīng)磺酸基置換的氨基酸(例如磺基丙氨酸(cysteicacid))。氨基酸在本文中可以利用其普遍已知的三字母符號(hào)或IUPAC-IUB生物化學(xué)命名委員會(huì)(BiochemicalNomenclatureCommission)所推薦的單字母符號(hào)提及。同樣，核苷酸也可以利用其普遍認(rèn)可的單字母代碼提及?！氨Ｊ匦揎椬儺愺w”適用于氨基酸和核酸序列。對(duì)于特定核酸序列，“保守修飾變異體”是指編碼一致或基本上一致的氨基酸序列的那些核酸，或者當(dāng)核酸不編碼氨基酸序列時(shí)，是指基本上一致的序列。由于遺傳密碼具有簡(jiǎn)并性，使得大量功能一致的核酸可編碼任何指定蛋白質(zhì)。舉例來說，密碼子GCA、GCC、GCG和GCU都編碼氨基酸丙氨酸。因此，在由密碼子指定丙氨酸的每一位置，所述密碼子可變成任一所述的相應(yīng)密碼子，而不改變所編碼的多肽。此類核酸變異為“沉默變異(silentvariation)”，是保守修飾變異的一種。本文中編碼一種多肽的每一核酸序列也描述這一核酸的每一可能的沉默變異。所屬領(lǐng)域一般技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到，核酸中的每一密碼子(通常為甲硫氨酸唯一密碼子的AUG，和通常為色氨酸唯一密碼子的TGG除外)可經(jīng)修飾而得到功能一致的分子。因此，編碼多肽的核酸的各個(gè)沉默變異暗含于每一所述序列中。對(duì)于氨基酸序列，所屬領(lǐng)域一般技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到，改變、添加或缺失編碼序列中的單一氨基酸或小百分比氨基酸的核酸、肽、多肽或蛋白質(zhì)序列個(gè)別取代、缺失或添加為“保守修飾變異體”，其中所述改變引起氨基酸的缺失、氨基酸的添加或者化學(xué)上類似的氨基酸對(duì)某一氨基酸的取代。此項(xiàng)技術(shù)中眾所周知提供功能類似的氨基酸的保守取代表。所述保守修飾變異體除為多形態(tài)變異體外且不排除多形態(tài)變異體，還為本發(fā)明的種間同系物和等位基因。所屬領(lǐng)域一般技術(shù)人員已知可提供功能相似氨基酸的保守取代表。以下八個(gè)群組各自含有彼此互為保守取代的氨基酸1)丙氨酸(A)、甘氨酸(G)；2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；4)精氨酸(R)、賴氨酸(K)；5)異亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、纈氨酸(V)；6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)；7)絲氨酸(S)、蘇氨酸(T)；和8)半胱氨酸(C)、甲硫氨酸(M)，(例如參見科雷敦(Creighton)，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和分子特性(ProteinsStructuresandMolecularProperties)(WH弗雷曼出版社(WHFreeman&Co.)；第2版(1993年12月))。在兩個(gè)或兩個(gè)以上核酸或多肽序列的情況下，術(shù)語“一致”或“一致性”百分比是指兩個(gè)或兩個(gè)以上序列或子序列相同。當(dāng)使用以下序列比較算法(或所屬領(lǐng)域一般技術(shù)人員可用的其它算法)中的一者或通過手工比對(duì)和目測(cè)來測(cè)量，在比較窗或指定區(qū)域上比較和比對(duì)最大對(duì)應(yīng)性時(shí)，如果各序列具有一定百分比的相同氨基酸殘基或核苷酸(即，在指定區(qū)域內(nèi)約60%—致、約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%或約95%—致)，那么所述序列“實(shí)質(zhì)上一致”。此定義也指測(cè)試序列的互補(bǔ)性。一致性可存在于長(zhǎng)至少約50個(gè)氨基酸或核苷酸的區(qū)域，或長(zhǎng)75到100個(gè)氨基酸或核苷酸的區(qū)域，或者(未指定時(shí))跨越整個(gè)多聚核苷酸或多肽序列?？色@得編碼本發(fā)明多肽(包括來自除人外的物種的同系物)的多聚核苷酸的方法包含以下步驟在嚴(yán)格雜交條件下，用具有本發(fā)明多聚核苷酸序列或其片段的經(jīng)標(biāo)記探針篩選文庫，以及分離含有所述多聚核苷酸序列的全長(zhǎng)cDNA和基因組克隆體。所屬領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知所述雜交技術(shù)。對(duì)于序列比較，通常一個(gè)序列充當(dāng)參考序列，供與測(cè)試序列相比較。當(dāng)使用序列比較算法時(shí)，將測(cè)試序列和參考序列輸入計(jì)算機(jī)內(nèi)，必要時(shí)指定子序列坐標(biāo)，并指定序列算法程序參數(shù)。可使用默認(rèn)程序參數(shù)，或者可指定替代參數(shù)。隨后序列比較算法基于這些程序參數(shù)來計(jì)算測(cè)試序列相對(duì)于參考序列的序列一致性百分比。本文中使用的“比較窗”包括具有選自由20到600，通常約50到約200，更通常約100到約150組成的群組的相鄰位置數(shù)量中的任一者的區(qū)段，其中在最佳比對(duì)兩個(gè)序列后，序列可與相鄰位置數(shù)量相同的參考序列相比較。所屬領(lǐng)域一般技術(shù)人員已知供比較的序列比對(duì)方法。可利用(包括(但不限于))史密斯(Smith)和沃特曼(Waterman)(1970)應(yīng)用數(shù)學(xué)進(jìn)展(Adv.Appl.Math.)2:482c的局部同源性算法；尼德爾曼(Needleman)和伍思奇(Wunsch)(1970)分子生物學(xué)雜志(J.Mol.Biol.)48:443的同源性比對(duì)算法；皮爾森(Pearson)和利普曼(Lipman)(1988)美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊(Proc.Nat‘1.Acad.Sci.USA)85:2444的相似性搜索方法；這些算法的計(jì)算機(jī)實(shí)施(WisconsinGenetics軟件包中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA,遺傳學(xué)計(jì)算機(jī)組(GeneticsComputerGroup)，575位理學(xué)博士，威斯康星州麥迪遜(Madison，WI))；或者手工比對(duì)和目測(cè)(例如參見奧蘇貝爾(Ausubel)等人，現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)(CurrentProtocolsinMolecularBiology)(1995增補(bǔ)版))，來進(jìn)行供比較序列的最佳比對(duì)。適用于測(cè)定序列一致性和序列相似性百分比的算法的一個(gè)實(shí)例為BLAST和BLAST2.O算法，其分別描述于奧特查爾(Altschul)等人(1997)核酸研究(Nuc.AcidsRes.)253389-3402；和奧特查爾等人(1990)分子生物學(xué)雜志(J.Mol.Biol.)215:403-410中。進(jìn)行BLAST分析的軟件可通過萬維網(wǎng)ncbi.nlm.nih.gov可見的美國(guó)生物技術(shù)信息中心(NationalCenterforBiotechnologyInformation)公共可用。BLAST算法參數(shù)W、T和X決定比對(duì)的敏感性和速度。BLASTN程序(用于核苷酸序列)使用如下默認(rèn)參數(shù)字長(zhǎng)(W)為11，期望值(E)為10肩=5力=-4，和比較兩條鏈。對(duì)于氨基酸序列，BLASTP程序使用如下默認(rèn)參數(shù)字長(zhǎng)為3且期望值(E)為10，和BL0SUM62計(jì)分矩陣(參見赫尼霍夫(HenikofT)和赫尼霍夫(1992)美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊(Proc.Natl.AcacUci.USA)89:10915)，比對(duì)值⑶為50，期望值(E)為10，M=5，N=-4，以及比較兩條鏈。在進(jìn)行BLAST算法時(shí)通常關(guān)閉“低復(fù)雜度”過濾器。BLAST算法還進(jìn)行兩個(gè)序列之間相似性的統(tǒng)計(jì)分析(例如參見卡爾琳(Karlin)和奧特查爾(Altschul)(1993)美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)905873-5787)。BLAST算法所提供的一種相似性度量為最小和概率(smallestsumpr0bability，P(N))，其可指示兩個(gè)核苷酸或氨基酸序列之間偶然出現(xiàn)的匹配的概率。舉例來說，如果在測(cè)試核酸與參考核酸的比較中，最小總和概率小于約0.2，或小于約0.01，或小于約0.001，那么認(rèn)為所述核酸與參考序列類似。短語“與……選擇性(或特異性)雜交”是指當(dāng)特定核苷酸序列存在于復(fù)雜混合物(包括(但不限于)全細(xì)胞或者DNA或RNA文庫)中時(shí)，分子只與所述序列在嚴(yán)格雜交條件下結(jié)合、形成雙鏈體或雜交。短語“嚴(yán)格雜交條件”是指DNA、RNA、PNA或其它核酸模擬物或其組合的序列在此項(xiàng)技術(shù)中已知的低離子強(qiáng)度和高溫條件下雜交。通常，在嚴(yán)格條件下，探針將與其在復(fù)雜核酸混合物(包括(但不限于)全細(xì)胞或者DNA或RNA文庫)中的目標(biāo)子序列雜交，而不與在這一復(fù)雜混合物中的其它序列雜交。嚴(yán)格條件與序列相關(guān)，并且會(huì)隨環(huán)境不同而不同。較長(zhǎng)的序列在較高溫度下特異性雜交。有關(guān)核酸雜交的詳盡指導(dǎo)可見于迪杰森(Tijssen)，生物化學(xué)和分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)一核酸探針雜交(LaboratoryTechniquesinBiochemistryandMolecularBiology—HybridizationwithNucleicProbes),“雜交原理禾口核酸分析策略綜述(Overviewofprinciplesofhybridizationandthestrategyofnucleicacidassays)"(1993)中。通常，在指定離子強(qiáng)度pH值下，選擇的嚴(yán)格條件比特定序列的熱21熔點(diǎn)(Tm)低約5-10°C。Tm為平衡時(shí)有50%與目標(biāo)互補(bǔ)的探針與目標(biāo)序列雜交的溫度(在指定離子強(qiáng)度、PH值和核酸濃度下)(當(dāng)目標(biāo)序列過量存在時(shí)，在Tm下，平衡時(shí)有50%探針被占據(jù))。嚴(yán)格條件可為在PH7.0到8.3下鹽濃度小于約1.OM鈉離子，通常為約0.01到1.OM鈉離子濃度(或其它鹽)且溫度對(duì)于短探針(包括(但不限于)10到50個(gè)核苷酸)為至少約30°C而對(duì)于長(zhǎng)探針(包括(但不限于)大于50個(gè)核苷酸)為至少約60°C的條件。嚴(yán)格條件也可通過添加例如甲酰胺等去穩(wěn)定劑來實(shí)現(xiàn)。對(duì)于選擇性或特異性雜交，正信號(hào)可為背景雜交的至少兩倍，任選為背景雜交的10倍。例示性嚴(yán)格雜交條件如下50%甲酰胺、5XSSC和SDS，在42°C下培育；或5XSSC、1%SDS，在65°C下培育，且在65°C下于0.2XSSC和0.1%SDS中洗滌。所述洗滌可進(jìn)行5、15、30、60、120分鐘或更長(zhǎng)時(shí)間。本文中使用的術(shù)語“真核生物”是指屬于真核系統(tǒng)發(fā)生域的有機(jī)體，例如動(dòng)物(包括(但不限于)哺乳動(dòng)物、昆蟲、爬行動(dòng)物、鳥類等)、纖毛蟲、植物(包括(但不限于)單子葉植物、雙子葉植物、藻類等)、真菌、酵母、鞭毛蟲、小孢子蟲、原生生物等。本文中使用的術(shù)語“非真核生物”是指非真核生物體。舉例來說，非真核有機(jī)體可屬于真細(xì)菌系統(tǒng)發(fā)生域，包括(但不限于)大腸桿菌(Escherichiacoli)、極端嗜熱細(xì)菌(Thermusthermophilus)、嗜熱月旨肪芽抱桿菌(Bacillusstearothermophilus)、焚光假單胞桿菌(Pseudomonasfluoresceins)、銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)、惡臭假單胞菌O^eudomonasputida)等；或古菌系統(tǒng)發(fā)生域，包括(但不限于)詹氏甲；^球菌(Methanococcusjannaschii)、口耆熱自養(yǎng)甲燒桿菌(Methanobacteriumthermoautotrophicum)、嗜鹽菌(Halobacterium)(例如沃氏嗜鹽富饒菌(Haloferaxvolcanii)和嗜鹽菌屬NRC-1(HalobacteriumspeciesNRC-I)),超嗜熱古菌(Archaeoglobusfulgidus)、強(qiáng)烈嗜熱球菌(Pyrococcusfuriosus)、堀越火球菌(Pyrococcushorikoshii)、嗜熱泉生古細(xì)菌(Aeuropyrumpernix)等)。本文中使用的術(shù)語“個(gè)體”是指作為治療、觀察或?qū)嶒?yàn)的對(duì)象的動(dòng)物，在一些實(shí)施例中為哺乳動(dòng)物，而在其它實(shí)施例中為人。動(dòng)物可為伴侶動(dòng)物(例如狗、貓等)、家畜(例如奶牛、綿羊、豬、馬等)或?qū)嶒?yàn)動(dòng)物(例如大鼠、小鼠、豚鼠等)。本文中使用的術(shù)語“有效量”是指投予的經(jīng)修飾非天然氨基酸多肽的量，將在一定程度上緩解所治療的疾病、病況或病癥的一種或一種以上癥狀?？赏队韬斜疚闹兴龅慕?jīng)修飾非天然氨基酸多肽的組合物，以實(shí)現(xiàn)預(yù)防、增強(qiáng)和/或治療性治療。術(shù)語“增強(qiáng)”是指增加或延長(zhǎng)所需作用的效力或持續(xù)時(shí)間。因此，就增強(qiáng)治療劑的作用來說，術(shù)語“增強(qiáng)”是指增加或延長(zhǎng)其它治療劑對(duì)系統(tǒng)的作用效力或持續(xù)時(shí)間的能力。本文中使用的“增強(qiáng)有效量”是指足以增強(qiáng)所需系統(tǒng)中另一治療劑作用的量。用于患者時(shí)，適于此用途的有效量將取決于疾病、病癥或病況的嚴(yán)重程度和病程、先前療法、患者的健康狀態(tài)和對(duì)藥物的反應(yīng)，以及治療醫(yī)師的判斷。本文中使用的術(shù)語“陽性選擇”或“篩選標(biāo)記物”是指當(dāng)存在(例如，經(jīng)表達(dá)、經(jīng)活化等)時(shí)使得將具有陽性選擇標(biāo)記物的細(xì)胞從不具有陽性選擇標(biāo)記物的細(xì)胞中鑒別出來的標(biāo)記物。本文中使用的術(shù)語“陰性選擇”或“篩選標(biāo)記物”是指當(dāng)存在(例如，經(jīng)表達(dá)、經(jīng)活化等)時(shí)使得鑒別出不具有所需特性(例如，與具有所需特性的細(xì)胞相比較)的細(xì)胞的標(biāo)記物。本文中使用的術(shù)語“報(bào)告基因”是指可用于選擇相關(guān)系統(tǒng)中的目標(biāo)組件的組件。舉例來說，報(bào)告基因可包括賦予抗生素抗性或敏感性的蛋白質(zhì)，例如酶(包括(但不限于)β-內(nèi)酰胺酶、氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(chloramphenicolacetyltransferase,CAT)等)；熒光篩選標(biāo)記物(包括(但不限于)綠色熒光蛋白質(zhì)，例如GPP)；YFP；EGFP；RFP；發(fā)光標(biāo)記物(包括(但不限于)螢火蟲熒光素酶蛋白)；基于親和力的篩選標(biāo)記物；或陽性或陰性選擇性標(biāo)記基因，例如IacZ,β-gal/lacZ(i3-半乳糖苷酶)、ADH(醇脫氫酶)、hiS3、ura3、leu2、lys2等。本文中使用的術(shù)語“真核生物”是指屬于真核系統(tǒng)發(fā)生域的生物體，例如動(dòng)物(包括(但不限于)哺乳動(dòng)物、昆蟲、爬行動(dòng)物、鳥類等)、纖毛蟲、植物(包括(但不限于)單子葉植物、雙子葉植物、藻類等)、真菌、酵母、鞭毛蟲、小孢子蟲、原生生物等。本文中使用的術(shù)語“非真核生物”是指非真核生物體。非真核有機(jī)體可屬于真細(xì)菌系統(tǒng)發(fā)生域，包括(但不限于)大腸桿菌、極端嗜熱細(xì)菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌、熒光假單胞菌、銅綠假單胞菌、惡臭假單胞菌等；或古菌系統(tǒng)發(fā)生域，例如詹氏甲烷球菌、嗜熱自養(yǎng)甲烷桿菌、嗜鹽菌(如沃氏嗜鹽富饒菌和嗜鹽菌屬NRC-1)、超嗜熱古菌、強(qiáng)烈嗜熱球菌、堀越火球菌、嗜熱泉生古細(xì)菌等。還包括以下病毒包膜蛋白非限制性實(shí)例來自線狀病毒(filoviruses)(例如埃博拉病毒)、正粘病毒(orthomyxoviruses)(例如流感病毒)、VSV_G、α病毒(例如塞姆利基森林病毒(Semlikiforestvirus)和辛德畢斯病毒(Sindbisvirus))、沙粒病毒(arenavirus)(例如淋巴細(xì)胞脈絡(luò)叢腦膜炎病毒(lymphocyticchoriomeningitisvirus))、黃病毒(flaviviruses)(例如蝶傳腦炎病毒(tick-borneencephalitisvirus)禾口登革病毒(Denguevirus))、彈狀病毒(rhabdoviruses)(例如水泡性口炎病毒(vesicularstomatitisvirus)禾口狂犬病病毒)、莫洛尼氏白血病病毒(Moloneyleukemiavirus)>HSV、VZV、腮腺炎病毒(Mumpsvirus)、鼻病毒(Rhinovirus)、麻疹(Measles)、風(fēng)疹病毒(Rubella)、蟲媒病毒(Arbovirus)、腸病毒(Enteroviruses)(例如脊髓灰質(zhì)炎(Polio)、柯薩奇病毒(Coxsackie)、?？刹《?Echovirus))、脊髓灰質(zhì)炎病毒、柯薩奇病毒B、A和埃可病毒、鼻病毒、肝炎病毒、諾沃克病毒(Norwalkvirus)、星狀病毒(Astroviruses)、披衣病毒(Togavirus)、甲病毒屬(Alphaviruses)、瘟病毒(Pestiviruses)、冠狀病毒(Coronavirus)、副流感病毒、腮腺炎病毒、麻疹病毒、呼吸道合胞病毒(RespiratorySyncytialVirus,RSV)、布尼亞病毒(Bunyaviridae)、呼腸弧病毒(Reoviridue)、呼腸孤^(Reoviruse)(Rotaviruses)(Polyomaviruses)毒(Papillomaviruses)、腺病毒(Adenoviruses)、細(xì)小病毒(Adenoviruses)>EBV>CMV>/jC痘-帶狀皰疹病毒、皰疹病毒和痘病毒的包膜蛋白。保守變異體術(shù)語“保守變異體”是指功能與得到保守變異體的組件(例如0-tRNA或O-RQ類似但序列發(fā)生變異的翻譯組件，例如保守變異體Ο-tRNA或保守變異體0-RS。舉例來說，O-RS將利用例如非天然氨基酸等所選氨基酸將互補(bǔ)Ο-tRNA或保守變異體0-tRNA氨?；?，但所述Ο-tRNA和所述保守變異體Ο-tRNA不具有相同序列。舉例來說，互補(bǔ)O-RS或保守變異體O-RS將利用例如非天然氨基酸等所選氨基酸將tRNA氨?；?，但所述O-RS和所述保守變異體O-RS不具有相同序列。保守變異體的序列可具有例如一處變異、兩處變異、三處變異、四處變異或者五處或五處以上變異，只要保守變異體與相應(yīng)Ο-tRNA或O-RS互補(bǔ)即可。詵擇或篩詵劑本文中使用的術(shù)語“選擇或篩選劑”是指當(dāng)存在時(shí)允許從群體中選擇/篩選出某些組件的試劑。舉例來說，選擇或篩選劑例如包括(但不限于)養(yǎng)分、抗生素、光波長(zhǎng)、抗體、表達(dá)的多聚核苷酸等?？衫缤ㄟ^濃度、強(qiáng)度等來改變選擇劑。術(shù)語“未有效識(shí)別”是指一種生物體的RS將Ο-tRNA氨?；男?，例如低于約10%、低于約5%或低于約1%。詳細(xì)說明到目前為止，疫苗只限于利用死生物體或減毒生物體產(chǎn)生的疫苗。通過熱、UV、甲醛處理來殺死微生物將減少天然表位，并且減毒的病毒通常是通過基因缺失和截短所產(chǎn)生，而這引起極低但非零點(diǎn)復(fù)制，為免疫系統(tǒng)削弱的患者，尤其是年幼患者、年老患者帶來風(fēng)險(xiǎn)。在一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明提供全生物體修飾的疫苗。在另一實(shí)施例中，本發(fā)明提供復(fù)制依賴于一個(gè)或一個(gè)以上非天然氨基酸的遺傳修飾全生物體疫苗。本發(fā)明提供并有天然微生物的疫苗，其中可使用或不使用佐劑。這些另外可提供高密度的天然表位，而這些表位具有高免疫原性，并且會(huì)觸發(fā)體液和T細(xì)胞介導(dǎo)的反應(yīng)，由此提供更為有效的疫苗。本發(fā)明提供在病毒或細(xì)菌上的一個(gè)或一個(gè)以上位點(diǎn)中并有一個(gè)或一個(gè)以上非天然或非天然編碼氨基酸的疫苗。在本發(fā)明一些實(shí)施例中，在一部分微生物上包括復(fù)制所需的非天然編碼氨基酸，由此消除了與減毒病毒有關(guān)的風(fēng)險(xiǎn)，并且消除了對(duì)于殺死病毒/細(xì)菌的需求。并有非天然編碼氨基酸的疫苗將提供一種微生物，其結(jié)構(gòu)與天然微生物極其類似，但不能夠復(fù)制，或只能夠在自然環(huán)境中進(jìn)行有限的復(fù)制。對(duì)于微生物復(fù)制的絕對(duì)控制可使用位點(diǎn)特異性并入氨基酸(下文將作詳細(xì)描述)，以便使用終止密碼子抑制來控制必需基因表達(dá)(功能)來實(shí)現(xiàn)。對(duì)于病毒，宿主產(chǎn)生細(xì)胞系位點(diǎn)特異性地并入發(fā)育所需的非天然氨基酸。對(duì)于細(xì)菌，基因組經(jīng)工程改造以包括一個(gè)或一個(gè)以上位點(diǎn)特異性并入的非天然氨基酸。必需基因功能的控制可在遺傳和結(jié)構(gòu)功能水平上實(shí)現(xiàn)。舉例來說，表2，在遺傳水平上，全長(zhǎng)必需基因在非天然并入的氨基酸存在下得到表達(dá)。在結(jié)構(gòu)功能水平上，必需基因經(jīng)工程改造，以致只在特定位點(diǎn)的非天然氨基酸存在下才起作用。在此位點(diǎn)并入任何天然氨基酸將廢除其天然功能。非天然氨基酸的選擇自由度使得所屬領(lǐng)域技術(shù)人員能夠調(diào)節(jié)所需疫苗的免疫原性和過量或過度控制復(fù)制的自由度，其中按照慣例，需要在復(fù)制衰減與產(chǎn)量之間達(dá)到平衡，非天然氨基酸的位點(diǎn)特異性并入提供了在不存在非天然氨基酸的情況下具有零復(fù)制能力的疫苗的開發(fā)工具?？墒褂么思夹g(shù)用于開發(fā)疫苗的細(xì)菌和病毒包括已知病毒。在非限制性實(shí)例中，所述病毒包括影響上呼吸道的病毒，例如人鼻病毒(HRV)、腺病毒、柯薩奇病毒、流感病毒、副流感病毒、呼吸道合胞病毒(RSV)、愛潑斯坦-巴爾病毒(Epstein-BarrVirus,EBV)和細(xì)胞巨化病毒(CMV)；影響胃腸(GI)道的病毒，例如輪狀病毒、諾沃克病毒、甲型肝炎病毒(HAV)、脊髓灰質(zhì)炎病毒和其它細(xì)小核糖核酸病毒；性傳播病毒，包括(但不限于)人免疫缺陷病毒(HIV)、人乳頭瘤病毒(HPV)、單純皰疹病毒(HSV)l、HSV-2、VZV、CMV、EBV、HHV-6、HHV-7和HHV-8；CMV、乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)。細(xì)菌的非限制性實(shí)例包括革蘭氏陽性和革蘭氏陰性細(xì)菌，包括葡萄球菌屬、鏈球菌屬、分枝桿菌屬(例如鳥分枝桿菌(Mycobacteriumavium)和鳥分枝桿菌亞種副結(jié)核分枝桿菌(paratuberculosis))、腸球菌屬、棒桿菌屬、疏螺旋體屬、芽孢桿菌屬、衣原體屬、支原體屬等。適于制備包括一個(gè)或一個(gè)以上所選氨基酸(例如非天然氨基酸)的蛋白質(zhì)的翻譯系統(tǒng)描述于以下文獻(xiàn)中美國(guó)專利申請(qǐng)案10/1，931，標(biāo)題為“用于產(chǎn)生正交tRNA-氨酰基tRNA合成酶對(duì)的方法和組合物(METHODSANDCOMPOSITIONFORTHEPRODUCTIONOFORTHOGONALtRNA-AMINOACYLtRNASYNTHETASEPAIRS)”；和10/1,927，標(biāo)題為“非天然氨基酸的體內(nèi)并入(INVIVOINCORPORATIONOFUNNATURALAMINOACIDS)”。此外，還參見USSN10/825，867，標(biāo)題為“擴(kuò)充真核遺傳密碼(EXPANDINGTHEEUKARY0TICGENETICCODE)”。這些申請(qǐng)案各以全文引用的方式并入本文中。這些翻譯系統(tǒng)一般包含包括正交tRNA(O-tRNA)、正交氨?；鵷RNA合成酶(O-RS)，以及所選氨基酸(例如非天然氨基酸)的細(xì)胞，其中O-RS利用所選氨基酸將Ο-tRNA氨酰基化。本發(fā)明的正交對(duì)是由例如抑制性tRNA、移框tRNA等Ο-tRNA和O-RS構(gòu)成。Ο-tRNA識(shí)別第一個(gè)選擇密碼子，并且在同源合成酶存在下對(duì)選擇密碼子反應(yīng)而具有抑制活性。細(xì)胞使用這些組件來將所選氨基酸并入正在生長(zhǎng)的多肽鏈中。舉例來說，也可存在包含編碼相關(guān)多肽的多聚核苷酸的核酸，其中所述多聚核苷酸包含可被Ο-tRNA識(shí)別的選擇密碼子。翻譯系統(tǒng)也可以是體外系統(tǒng)。本發(fā)明的tRNA分子適用于任何翻譯系統(tǒng)中，包括在翻譯過程中利用核糖體的系統(tǒng)。翻譯系統(tǒng)也可以是無細(xì)胞(體外)翻譯系統(tǒng)。在這些可包括mRNA作為模板(體外翻譯)或DNA作為模板(組合的體外轉(zhuǎn)錄與翻譯)的系統(tǒng)中，體外合成是由核糖體所引導(dǎo)。曾進(jìn)行過相當(dāng)多的嘗試來開發(fā)無細(xì)胞蛋白質(zhì)表達(dá)系統(tǒng)。例如參見，肯姆D.M.(Kim,D.M.)和J.R.斯沃茲(J.R.Swartz)，生物技術(shù)與生物工程(BiotechnologyandBioengineering),74=309-316(2001)；肯姆D.Μ.和J.R.斯沃茲，生物技術(shù)通訊(BiotechnologyLetters)，22，1537-1542，(2000)；肯姆D.Μ.和J.R.斯沃茲，生物技術(shù)進(jìn)展(BiotechnologyProgress)，16，385-390，(2000)；肯姆D.Μ.和J.R.斯沃茲，生物技術(shù)與生物工程，66，180-188，(1999)；以及帕特耐克R.(Patnaik,R.)和J.R.斯沃茲，生物技術(shù)(Biotechniques)24，862-868，(1998)；美國(guó)專利第6，337，191號(hào)；美國(guó)專利公開案第2002/0081660號(hào)；WO00/55353；WO90/05785，都是以引用的方式并入本文中。另一種可用的方法包括mRNA-肽融合技術(shù)。例如參見R.羅伯特(R.Roberts)和J-斯佐塔克(J.Szostak)，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.(USA))9412297-12302(1997)；Α.弗蘭克爾(A.Frankel)等人，化學(xué)與生物學(xué)(Chemistry&Biology)101043-105(^2003)。在本方法中，在核糖體上將連接嘌呤霉素(puromycin)的mRNA模板翻譯成肽。如果已對(duì)一個(gè)或一個(gè)以上tRNA分子進(jìn)行修飾，那么也可將非天然氨基酸并入肽中。在讀取了最后一個(gè)mRNA密碼子后，嘌呤霉素捕獲肽的C末端。如果發(fā)現(xiàn)所得mRNA-肽結(jié)合物在體外分析中具有引人關(guān)注的特性，那么可容易地由mRNA序列揭示其身份。以此方式，可篩選出包含一個(gè)或一個(gè)以上非天然編碼氨基酸的多肽文庫，以鑒別具有所需特性的多肽。最近，已報(bào)導(dǎo)利用純化組分進(jìn)行的體外核糖體翻譯，其允許合成經(jīng)非天然編碼氨基酸取代的肽。例如參見A.福斯特(AJorster)等人，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.(USA))100:6353(2003)。在某些實(shí)施例中，本發(fā)明提供一種細(xì)胞，在這種細(xì)胞中，已經(jīng)將非天然氨基酸并入必需基因產(chǎn)物中。在本發(fā)明其它實(shí)施例中，已經(jīng)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行遺傳修飾，以使其在基因產(chǎn)物中包括復(fù)制所需的非天然氨基酸。在某些實(shí)施例中，本發(fā)明提供一種細(xì)菌，在這種細(xì)菌中，已經(jīng)將非天然氨基酸并入必需基因產(chǎn)物中。在本發(fā)明其它實(shí)施例中，已經(jīng)對(duì)細(xì)菌進(jìn)行遺傳修飾，以使其在基因產(chǎn)物中包括復(fù)制所需的非天然氨基酸。在某些實(shí)施例中，本發(fā)明提供一種病毒，在這種病毒中，已經(jīng)將非天然氨基酸并入必需基因產(chǎn)物中。在本發(fā)明其它實(shí)施例中，已經(jīng)對(duì)病毒進(jìn)行遺傳修飾，以使其在基因產(chǎn)物中包括復(fù)制所需的非天然氨基酸。在某些實(shí)施例中，本發(fā)明提供一種鳥分枝桿菌亞種副結(jié)核分枝桿菌細(xì)胞，在這種細(xì)胞中，已經(jīng)將非天然氨基酸并入必需基因產(chǎn)物中。在本發(fā)明其它實(shí)施例中，已經(jīng)對(duì)鳥分枝桿菌亞種副結(jié)核分枝桿菌細(xì)胞進(jìn)行遺傳修飾，以使其在基因產(chǎn)物中包括復(fù)制所需的非天然氨基酸。在某些實(shí)施例中，本發(fā)明提供一種腦膜炎細(xì)胞，在這種細(xì)胞中，已經(jīng)將非天然氨基酸并入必需基因產(chǎn)物中。在本發(fā)明其它實(shí)施例中，已經(jīng)對(duì)腦膜炎細(xì)胞進(jìn)行遺傳修飾，以使其在基因產(chǎn)物中包括復(fù)制所需的非天然氨基酸。在某些實(shí)施例中，本發(fā)明提供一種狂犬病細(xì)胞，在這種細(xì)胞中，已經(jīng)將非天然氨基酸并入必需基因產(chǎn)物中。在本發(fā)明其它實(shí)施例中，已經(jīng)對(duì)狂犬病細(xì)胞進(jìn)行遺傳修飾，以使其在基因產(chǎn)物中包括復(fù)制所需的非天然氨基酸。在某些實(shí)施例中，本發(fā)明提供一種藻類細(xì)胞，在這種細(xì)胞中，已經(jīng)將非天然氨基酸并入必需基因產(chǎn)物中。在本發(fā)明其它實(shí)施例中，已經(jīng)對(duì)藻類細(xì)胞進(jìn)行遺傳修飾，以使其在基因產(chǎn)物中包括復(fù)制所需的非天然氨基酸。在某些實(shí)施例中，本發(fā)明提供一種病毒細(xì)胞，在這種細(xì)胞中，已經(jīng)將非天然氨基酸并入必需基因產(chǎn)物中。在本發(fā)明其它實(shí)施例中，已經(jīng)對(duì)病毒細(xì)胞進(jìn)行遺傳修飾，以使其在基因產(chǎn)物中包括復(fù)制所需的非天然氨基酸。在某些實(shí)施例中，本發(fā)明提供一種細(xì)菌細(xì)胞，在這種細(xì)胞中，已經(jīng)將非天然氨基酸并入必需基因產(chǎn)物中。在本發(fā)明其它實(shí)施例中，已經(jīng)對(duì)細(xì)菌細(xì)胞進(jìn)行遺傳修飾，以使其在基因產(chǎn)物中包括復(fù)制所需的非天然氨基酸。在某些實(shí)施例中，本發(fā)明提供一種真菌細(xì)胞，在這種細(xì)胞中，已經(jīng)將非天然氨基酸并入必需基因產(chǎn)物中。在本發(fā)明其它實(shí)施例中，已經(jīng)對(duì)真菌細(xì)胞進(jìn)行遺傳修飾，以使其在基因產(chǎn)物中包括復(fù)制所需的非天然氨基酸。在某些實(shí)施實(shí)例中，本發(fā)明提供一種脊髓灰質(zhì)炎細(xì)胞，在這種細(xì)胞中，已經(jīng)將非天然氨基酸并入必需基因產(chǎn)物中。在本發(fā)明其它實(shí)施例中，已經(jīng)對(duì)脊髓灰質(zhì)炎細(xì)胞進(jìn)行遺傳修飾，以使其在基因產(chǎn)物中包括復(fù)制所需的非天然氨基酸。在某些實(shí)施例中，本發(fā)明提供一種大腸桿菌細(xì)胞，在這種細(xì)胞中，已經(jīng)將非天然氨基酸并入必需基因產(chǎn)物中。在本發(fā)明其它實(shí)施例中，已經(jīng)對(duì)大腸桿菌細(xì)胞進(jìn)行遺傳修飾，以使其在基因產(chǎn)物中包括復(fù)制所需的非天然氨基酸。在某些實(shí)施例中，本發(fā)明提供一種分枝桿菌細(xì)胞，在這種細(xì)胞中，已經(jīng)將非天然氨基酸并入必需基因產(chǎn)物中。在本發(fā)明其它實(shí)施例中，已經(jīng)對(duì)分枝桿菌細(xì)胞進(jìn)行遺傳修飾，以使其在基因產(chǎn)物中包括復(fù)制所需的非天然氨基酸。在某些實(shí)施例中，本發(fā)明的遺傳修飾非天然氨基酸依賴性細(xì)胞可用來制造疫苗。在某些實(shí)施例中，本發(fā)明的遺傳修飾非天然氨基酸依賴性細(xì)胞可用來制造可作為疫苗投予的抗體。在某些實(shí)施例中，本發(fā)明的遺傳修飾非天然氨基酸依賴性細(xì)胞可用于接種。在某些實(shí)施例中，本發(fā)明包含tRNA的大腸桿菌細(xì)胞包括所述翻譯系統(tǒng)。舉例來說，本發(fā)明大腸桿菌細(xì)胞包括正交tRNA(O-tRNA)，其中Ο-tRNA在同源合成酶存在下對(duì)選擇密碼子反應(yīng)而發(fā)揮抑制活性；正交氨?；?tRNA合成酶(0-舊)；所選氨基酸；和包含編碼相關(guān)多肽的多聚核苷酸的核酸，其中所述多聚核苷酸包含可由Ο-tRNA識(shí)別的選擇密碼子。本發(fā)明還提供處于細(xì)胞中的多個(gè)0-tRNA/0-RS對(duì)，其允許并入一個(gè)以上所選氨基酸。在某些實(shí)施例中，細(xì)胞可進(jìn)一步包括另一不同的0-tRNA/0-RS對(duì)和第二所選氨基酸，其中Ο-tRNA識(shí)別第二選擇密碼子，且O-RS優(yōu)先利用第二所選氨基酸將Ο-tRNA氨?；Ｅe例來說，細(xì)胞可進(jìn)一步包含例如來源于詹氏甲烷球菌的酪氨?；?tRNA合成酶的琥珀抑制性tRNA-氨?；鵷RNA合成酶對(duì)。Ο-tRNA和/或O-RS可為天然存在的，或者可通過使來自多種生物體的天然存在tRNA和/或RS突變得到，例如，由此可產(chǎn)生tRNA文庫和/或RS文庫。舉例來說，產(chǎn)生正交tRNA/氨酰基-tRNA合成酶對(duì)的一個(gè)策略涉及將來自例如除宿主細(xì)胞外的一個(gè)來源或多種來源的異源tRNA/合成酶對(duì)引入宿主細(xì)胞中。異源合成酶候選物的特性包括例如，其不會(huì)加載于任何宿主細(xì)胞tRNA，而異源tRNA候選物的特性包括例如，其不會(huì)被任何宿主細(xì)胞合成酶氨?；４送?，異源tRNA對(duì)于所有宿主細(xì)胞合成酶來說是正交的。另一產(chǎn)生正交對(duì)的策略涉及產(chǎn)生突變體文庫以便篩選和/或選擇Ο-tRNA或O-RS。這些策略也可以組合起來。在各個(gè)實(shí)施例中，Ο-tRNA和O-RS是源自至少一種生物體。在另一實(shí)施例中，Ο-tRNA源自第一物種的天然存在或突變的天然存在tRNA，而O-RS源自第二物種的天然存在或突變的天然存在RS。在一個(gè)實(shí)施例中，第一生物體與第二生物體不同。舉例來說，正交對(duì)可包括源自嗜熱自養(yǎng)甲烷桿菌的tRNA合成酶，和源自古細(xì)菌(archaeDtRNA(例如源自嗜鹽菌屬NRC-1)的tRNA?；蛘?，第一生物體與第二生物體相同。更多信息參見本文中標(biāo)題為“來源和宿主生物體”的部分。在本發(fā)明某些實(shí)施例中，本發(fā)明Ο-tRNA包含SEQIDNO.:1、2或3所述的多聚核苷酸序列，或其互補(bǔ)多聚核苷酸序列，或其保守變異體，或者是由其編碼。也參見本文中標(biāo)題為“核酸以及多肽序列和變異體”的部分。ιΗ交tRNA(0-tRNA)正交tRNA(Ο-tRNA)介導(dǎo)(例如在體內(nèi)或體外)將所選氨基酸并入蛋白質(zhì)中，這一蛋白質(zhì)是由包含Ο-tRNA所識(shí)別的選擇密碼子的多聚核苷酸編碼?？山柚魏畏椒ɑ蚣夹g(shù)，包括(但不限于)化學(xué)或酶促氨?；?，利用所需氨基酸將本發(fā)明的Ο-tRNA氨酰基化。本發(fā)明的氨?；?tRNA可直接加到翻譯系統(tǒng)中。RS可以在體外或體內(nèi)利用所選氨基酸將本發(fā)明Ο-tRNA氨?；?。此外，RS可以是0-RS。本發(fā)明的Ο-tRNA可直接提供給翻譯系統(tǒng)(例如，體外翻譯組件，或細(xì)胞)，或者通過提供編碼Ο-tRNA或其部分的多聚核苷酸提供給翻譯系統(tǒng)。舉例來說，Ο-tRNA或其部分是由如SEQIDNO.:1、2或3所述的多聚核苷酸序列或其互補(bǔ)多聚核苷酸序列，或其保守變異體編碼。本發(fā)明的Ο-tRNA包含在同源合成酶存在下對(duì)選擇密碼子反應(yīng)而產(chǎn)生的抑制活性。抑制活性可由此項(xiàng)技術(shù)中已知的多種分析中的任一種測(cè)定。舉例來說，可以使用β-半乳糖苷酶報(bào)告基因分析?？梢允褂迷趩?dòng)子控制下表達(dá)IacZ基因的質(zhì)粒衍生物，例如其中IacZ的肽VVLQRRDWEN中的Leu_25經(jīng)選擇密碼子(例如TAG、TGA、AGGA等密碼子)或者(對(duì)酪氨酸、絲氨酸、亮氨酸來說)有義密碼子(作為對(duì)照)置換。將衍生化IacZ質(zhì)粒連同包含本發(fā)明Ο-tRNA的質(zhì)粒一起引入適合生物體(例如，可以使用正交組件的生物體)的細(xì)胞中。也可以引入同源合成酶(呈多肽形式，或在表達(dá)時(shí)可編碼同源合成酶的多聚核苷酸形式)。使細(xì)胞在培養(yǎng)基中生長(zhǎng)到所需密度，例如達(dá)到0D_為約0.5，并例如使用BetaFluorβ-半乳糖苷酶分析試劑盒(諾杰公司(Novagen))，進(jìn)行半乳糖苷酶分析。抑制百分比計(jì)算為樣品活性相對(duì)于相當(dāng)?shù)膶?duì)照值的百分比，所述對(duì)照值為例如觀察衍生化IacZ構(gòu)建體得到的值，其中所述構(gòu)建體在所需位置具有相應(yīng)的有義密碼子而非選擇密碼子。在tRNA分子中，胸腺嘧啶(T)被尿嘧啶(U)置換。此外，也可能存在其它堿基修飾。本發(fā)明還包括Ο-tRNA的保守變異體。舉例來說，Ο-tRNA的保守變異體包括功能與所述Ο-tRNA類似且保持tRNA的L形結(jié)構(gòu)，但序列不同的那些分子(且不是野生型tRNA分子)。也參見本文中標(biāo)題為“核酸以及多肽序列和變異體”的部分。包含Ο-tRNA的組合物可進(jìn)一步包括正交氨?；?tRNA合成酶(0-舊)，其中所述O-RS優(yōu)先利用所選氨基酸(例如非天然氨基酸)將Ο-tRNA氨?；?。在某些實(shí)施例中，包括Ο-tRNA的組合物可進(jìn)一步包括翻譯系統(tǒng)(例如體外或體內(nèi)翻譯系統(tǒng))。在細(xì)胞或其它翻譯系統(tǒng)中也可存在包含編碼相關(guān)多肽的多聚核苷酸的核酸，其中所述多聚核苷酸包含一個(gè)或一個(gè)以上由Ο-tRNA識(shí)別的選擇密碼子，或者一個(gè)或一個(gè)以上所述密碼子的組合。也參見本文中標(biāo)題為“正交氨酰基-tRNA合成酶(O-RS)，，的部分。產(chǎn)生正交tRNA(Ο-tRNA;例如Ο-tRNA)的方法也是本發(fā)明的特征。由所述方法產(chǎn)生的tRNA，例如Ο-tRNA，也是本發(fā)明的特征。產(chǎn)生正交tRNA的方法包括使tRNA池中每一tRNA的反密碼子環(huán)突變，以允許識(shí)別選擇密碼子(例如琥珀密碼子、蛋白石密碼子、四堿基密碼子等)，由此提供多個(gè)潛在的Ο-tRNA；和分析所述多個(gè)潛在Ο-tRNA的成員的二級(jí)結(jié)構(gòu)，以鑒別出所述二級(jí)結(jié)構(gòu)中的非正規(guī)堿基對(duì)，以及任選使這些非正規(guī)堿基對(duì)突變(例如使非正規(guī)堿基對(duì)突變成正規(guī)堿基對(duì))。非正規(guī)堿基對(duì)可位于二級(jí)結(jié)構(gòu)的莖區(qū)。Ο-tRNA可具有一種或一種以上改良的特征或活性，例如與原料(例如多個(gè)tRNA序列)相比較，對(duì)所需生物體的正交性有所改良，同時(shí)仍保留對(duì)所需RS的親和力。另外，可通過使已知tRNA突變，以調(diào)節(jié)其與一個(gè)或一個(gè)以上影響翻譯或作為翻譯機(jī)器的組件的分子的相互作用或結(jié)合親和力，來開發(fā)Ο-tRNA。所述組件包括(但不限于)延伸因子。細(xì)菌延伸因子EF-Tu在蛋白質(zhì)合成的延伸步驟中起到關(guān)鍵作用。在tRNA合成酶將tRNA氨?；?，EF-Tu結(jié)合氨酰基化的tRNA，并將其運(yùn)送到核糖體A位點(diǎn)。所加載的氨基酸與tRNA之間的酯鍵因EF-Tu與氨?；痶RNA之間結(jié)合而受到保護(hù)，免于發(fā)生自發(fā)水解。斯圖奇維(Mortchevoi)等人研究了大腸桿菌TWC莖中起始tRNAfMetU50:G64搖擺堿基對(duì)(wAblebasepair)的突變體，因?yàn)榘l(fā)現(xiàn)這一堿基對(duì)是二級(jí)負(fù)性決定因素(secondarynegativedeterminant)，將阻斷在延伸過程中tRNA的活性，這可能是由EF-Tu.GTP與氨?；痶RNA間的弱相互作用引起(JBC2003278(20)17672-17679)。拉瑞文(LaRiviere)等人也在科學(xué)(Science)(2001年10月5日；294(5540)165-8)中描述了氨基酸和tRNA體(tRNAbody)對(duì)于針對(duì)EF-Tu的總體結(jié)合親和力在熱力學(xué)上的貢獻(xiàn)。他們指出，tRNA體與氨基酸的貢獻(xiàn)相互獨(dú)立，并且當(dāng)tRNA被正確氨酰基化時(shí)，兩者相互補(bǔ)償。EF-Tu.GTP與經(jīng)非天然氨基酸氨?；膖RNA之間相互作用的改變可能影響tRNA裝載到核糖體A位點(diǎn)的效率。通過分析tRNA與翻譯機(jī)器其它組件(例如EF-Tu)之間的復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)，也可能發(fā)現(xiàn)潛在的突變位點(diǎn)。舉例來說，尼森(Nissen)等人已經(jīng)指出，EF-Tu.GTP直接結(jié)合于酵母苯丙氨酰基-轉(zhuǎn)移RNA(Phe-tRNA)的TWC莖的磷酸酯主鏈(科學(xué)(Science)1995270(5M1)1464-1472)。這些方法任選包括分析tRNA和/或氨酰基-tRNA合成酶的序列同源性，以便確定看起來對(duì)特定生物體來說是正交的0-tRNA、0-RS和/或其對(duì)的潛在候選物。此項(xiàng)技術(shù)中已28知和本文中描述的計(jì)算機(jī)程序都可用于此項(xiàng)分析中。在一個(gè)實(shí)例中，為了選擇用于原核生物體中的潛在正交翻譯組件，選出的合成酶和/或tRNA不會(huì)呈現(xiàn)與原核生物體不尋常的同源性。也可借助共有性策略(consensusstrategy)產(chǎn)生tRNA池。舉例來說，通過比對(duì)多個(gè)tRNA序列；確定共有序列(consensussequence)；并使用至少一部分、大部分或完整共有序列產(chǎn)生tRNA文庫，來產(chǎn)生tRNA池。舉例來說，可以用計(jì)算機(jī)程序，例如GCG程序pileup，編制共有序列。任選將由這一程序測(cè)定的簡(jiǎn)并位置變?yōu)樵谶@些位置最頻繁出現(xiàn)的堿基。借助此項(xiàng)技術(shù)中已知的技術(shù)，使用共有序列合成文庫。舉例來說，可以通過重疊延伸寡核苷酸，基于共有序列來提供文庫，其中合成的tRNA基因的每一位點(diǎn)都為90%共有序列與10%其它3個(gè)堿基混合物的摻雜混合物。也可以使用其它混合物，例如75%共有序列與25%其它3個(gè)堿基混合物、80%共有序列與20%其它3個(gè)堿基混合物、95%共有序列與5%其它3個(gè)堿基混合物等。突變tRNA文庫可以使用此項(xiàng)技術(shù)中已知的各種誘變技術(shù)產(chǎn)生。舉例來說，可通過位點(diǎn)特異性突變、隨機(jī)點(diǎn)突變、同源重組、DNA改組或其它遞歸誘變方法、嵌合構(gòu)建或其任何組合，產(chǎn)生突變型tRNA。其它突變可引入到所需tRNA環(huán)或區(qū)域(例如反密碼子環(huán)、接受莖、D臂或環(huán)、可變環(huán)、TWC臂或環(huán)、tRNA分子的其它區(qū)域或其組合)中的特定位置，例如非保守性位置或保守性位置、隨機(jī)位置或其組合。突變可包括莖區(qū)中相配的堿基對(duì)。通常，通過使第一物種細(xì)胞群(其中所述細(xì)胞包含多個(gè)潛在Ο-tRNA的成員)經(jīng)歷陰性選擇來獲得Ο-tRNA。陰性選擇除去包含多個(gè)潛在Ο-tRNA的成員的細(xì)胞，所述0-tRNA成員由細(xì)胞內(nèi)源性氨酰基-tRNA合成酶(RQ氨?；?。這將提供與第一物種細(xì)胞正交的tRNA池。在陰性選擇的某些實(shí)施例中，將選擇密碼子引入編碼陰性選擇標(biāo)記物的多聚核苷酸中的非必需位置，所述陰性選擇標(biāo)記物為例如賦予抗生素抗性的酶，例如β-內(nèi)酰胺酶；賦予可檢測(cè)產(chǎn)物的酶，例如β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(CAT)，例如有毒產(chǎn)物，例如芽孢桿菌RNA酶(barnase)等。篩選/選擇可通過使細(xì)胞群在選擇劑(例如抗生素，如氨芐青霉素)存在下生長(zhǎng)來進(jìn)行。在一個(gè)實(shí)施例中，選擇劑的濃度不同。舉例來說，為了測(cè)量抑制性tRNA的活性，所用選擇系統(tǒng)是基于選擇密碼子的體內(nèi)抑制，例如將無義或移碼突變引入編碼陰性選擇標(biāo)記物的多聚核苷酸(例如內(nèi)酰胺酶基因，bla)中。舉個(gè)例子，構(gòu)建在某一位置具有例如TAG、AGGA和TGA的多聚核苷酸變異體，例如bla變異體。用這些多聚核苷酸轉(zhuǎn)化細(xì)胞，例如細(xì)菌。在內(nèi)源性大腸桿菌合成酶無法有效加載的正交tRNA的情況下，抗生素抗性，例如氨芐青霉素抗性，應(yīng)接近或低于未用質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的細(xì)菌。如果tRNA不是正交tRNA，或者如果在所述系統(tǒng)中共表達(dá)能夠加載于tRNA的異源合成酶，那么將觀察到較高的抗生素(例如氨芐青霉素)抗性水平。選擇的細(xì)胞(例如細(xì)菌)在抗生素濃度與未用質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的細(xì)胞大致相同的情況下，不能在LB瓊脂板上生長(zhǎng)。對(duì)于有毒產(chǎn)物(例如核糖核酸酶芽孢桿菌RNA酶)，當(dāng)內(nèi)源宿主(例如大腸桿菌)合成酶(即，其不與宿主正交，例如大腸桿菌合成酶)將多個(gè)潛在tRNA的成員氨?；瘯r(shí)，選擇密碼子受到抑制，且產(chǎn)生的有毒多聚核苷酸產(chǎn)物導(dǎo)致細(xì)胞死亡。帶有正交tRNA或非功能性tRNA的細(xì)胞存活。在一個(gè)實(shí)施例中，隨后使對(duì)所需生物體正交的tRNA池經(jīng)歷陽性選擇，其中將選擇密碼子放入例如由藥物抗性基因(如β-內(nèi)酰胺酶基因)編碼的陽性選擇標(biāo)記物中。對(duì)包含編碼或包含tRNA池的成員的多聚核苷酸、編碼陽性選擇標(biāo)記物的多聚核苷酸和編碼同源RS的多聚核苷酸的細(xì)胞執(zhí)行陽性選擇。這些多聚核苷酸在細(xì)胞中表達(dá)，并且細(xì)胞在選擇劑(例如氨芐青霉素)存在下生長(zhǎng)。隨后，針對(duì)tRNA被共表達(dá)的同源合成酶氨?；约皩?duì)選擇密碼子反應(yīng)而插入氨基酸的能力來選擇tRNA。通常，這些細(xì)胞的抑制效率相比帶有非功能性tRNA或不能被相關(guān)合成酶有效識(shí)別的tRNA的細(xì)胞有所增強(qiáng)。帶有非功能性或不能被相關(guān)合成酶有效識(shí)別的tRNA的細(xì)胞對(duì)抗生素敏感。因此，滿足以下條件的tRNA將在兩個(gè)選擇中存活(1)不是內(nèi)源宿主(例如大腸桿菌)合成酶的底物；(ii)可被相關(guān)合成酶氨?；缓?iii)在翻譯過程中起作用。在上文描述的方法中，選擇(例如陽性選擇、陰性選擇，或陽性選擇和陰性選擇二者)的嚴(yán)格度任選可變化。舉例來說，由于芽孢桿菌RNA酶是一種毒性極高的蛋白質(zhì)，故通過將不同數(shù)量的選擇密碼子引入芽孢桿菌RNA酶基因中和/或通過使用可誘導(dǎo)啟動(dòng)子，來控制陰性選擇的嚴(yán)格度。在另一個(gè)實(shí)例中，選擇劑或篩選劑的濃度不同(例如氨芐青霉素)。在一方面中，由于在前幾輪選擇期間所需活性較低，以致嚴(yán)格度有所變化。因此，在前幾輪選擇中應(yīng)用不太嚴(yán)格的選擇標(biāo)準(zhǔn)，而在稍后幾輪選擇中應(yīng)用較嚴(yán)格的標(biāo)準(zhǔn)。在某些實(shí)施例中，陰性選擇、陽性選擇或陰性選擇與陽性選擇二者可重復(fù)多次?？梢允褂枚喾N不同的陰性選擇標(biāo)記物、陽性選擇標(biāo)記物或陰性和陽性選擇標(biāo)記物。在某些實(shí)施例中，陽性選擇標(biāo)記物與陰性選擇標(biāo)記物可相同。本發(fā)明中可以使用其它類型的選擇/篩選來產(chǎn)生正交翻譯組件，例如0-tRNA、O-RS和0-tRNA/0-RS對(duì)。舉例來說，陰性選擇標(biāo)記物、陽性選擇標(biāo)記物或陽性和陰性選擇標(biāo)記物可包括在適合反應(yīng)物存在下發(fā)熒光或催化發(fā)光反應(yīng)的標(biāo)記物。在另一實(shí)施例中，通過熒光活化的細(xì)胞分選(fluorescence-activatedcellsorting,FACS)或通過發(fā)光來檢測(cè)標(biāo)記物的產(chǎn)物。所述標(biāo)記物任選包括基于親和力的篩選標(biāo)記物。參見弗朗西斯科J.A.(Francisco,J.Α.)等人(1993)在外表面上表達(dá)功能性抗體片段的大腸桿菌的產(chǎn)^^P^7^Sgifi^it(Productionandfluorescence-activatedcellsortingofEscherichiacoliexpressingafunctionalantibodyfragmentontheexternalsurface).美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊(ProcNatlAcadSciUSA.)90:10444-8。其它產(chǎn)生重組正交tRNA的方法可見于例如以下文獻(xiàn)中美國(guó)專利申請(qǐng)案10/126，931，標(biāo)題為“用于產(chǎn)生正交tRNA-氨?；鵷RNA合成酶對(duì)的方法和組合物(MethodsandCompositionsfortheProductionofOrthogonaltRNA-AminoacyltRNASynthetasePairs)”；和10/1,127，標(biāo)題為“體內(nèi)并入非天然氨基酸(InvivoIncorporationofUnnaturalAminoAcids)”；和USSN10/825，867，標(biāo)題為“擴(kuò)充真核遺傳密碼(EXPANDINGTHEEUKARY0TICGENETICCODE)”。也參見福斯特(Forster)等人，Q003)通過翻譯從頭設(shè)計(jì)的遺傳密碼來設(shè)計(jì)模擬肽合成酶。(Programmingpeptidomimeticsynthetasesbytranslatinggeneticcodesdesigneddenovo.)美國(guó)國(guó)家禾斗學(xué)院院干丨J(PNAS)100(11):6353-6357；和馮(Feng)等人，(2003)，借助單氨基酸改變來擴(kuò)充tRNA合成Bl對(duì)tRNA的iR另Ij(ExpandingtRNArecognitionofatRNAsynthetasebyasingleaminoacidchange)，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊100(10):5676-5681。30可借助任何方法或技術(shù)，包括(但不限于)化學(xué)或酶促氨?；盟璋被釋⒈景l(fā)明的tRNA氨?；?。氨?；衫冒滨；鵷RNA合成酶或其它酶分子(包括(但不限于)核糖酶)實(shí)現(xiàn)。術(shù)語“核糖酶”可與“催化性RNA”互換?？似?Cech)和同事(克奇，1987，逝全(Science).236:1532-1539；麥克科勒(McCorkle)等人，1987,牛物化學(xué)概念(ConceptsBiochem.)64:221-226)證實(shí)存在可充當(dāng)催化劑的天然存在RNA(核糖酶)。不過，盡管僅顯示這些天然RNA催化劑對(duì)核糖核酸底物作用而實(shí)現(xiàn)裂解和剪接，但近來核糖酶人為進(jìn)化的發(fā)展已將催化譜系擴(kuò)充到各種化學(xué)反應(yīng)。多項(xiàng)研究已鑒別出可催化自身O')3'末端上氨?；?RNA鍵的RNA分子(愛蘭克卡爾(Illangakekare)等人，1995，科學(xué)(Science)267643-647)，以及可將氨基酸從一個(gè)RNA分子轉(zhuǎn)移到另一者的RNA分子(羅斯(Lohse)等人，1996，自然(Nature)381:442-444)。美國(guó)專利申請(qǐng)公開案2003/0228593(以引用的方式并入本文中)描述了構(gòu)建核糖酶的方法和其于利用天然編碼和非天然編碼氨基酸將tRNA氨?；械挠猛??？墒箃RNA氨酰基化的酶分子(包括(但不限于)核糖酶)的基質(zhì)固定形式(Substrate-immobilizedforms)能夠有效親和純化氨?；漠a(chǎn)物。適合基質(zhì)的實(shí)例包括瓊脂糖、瓊脂糖凝膠和磁珠。用于氨酰基化的基質(zhì)固定形式核糖酶的制備和使用描述于化學(xué)與生物學(xué)(ChemistryandBiology)2003,101077-1084和美國(guó)專利申請(qǐng)公開案2003/0228593中，其以引用的方式并入本文中?；瘜W(xué)氨?；椒ò?但不限于)以下文獻(xiàn)中介紹的避免在氨?；^程中使用合成酶的方法海奇特(Hecht)和同事(海奇特S.M.(Hecht,S.Μ.)化學(xué)研究述評(píng)(Ace.Chem.Res.)1992，25，545；海克勒Τ.G.(Heckler,Τ.G.)；羅塞爾J.R.(Roesser,J.R.)；徐C(Xu,C)；常P.(Chang,P.)；海奇特S.Μ.，生物化學(xué)(Biochemistry)1988，27，7254；海奇特S.M.；阿爾福德B.L.(Alford,B.L.)；黑田Y.(Kuroda,Y.)；北野S.(Kitano,S.)，生物化學(xué)雜志(J.Biol.Chem.)1978，253，4517)；和查魯茲(Schultz)，查柏林(Chamberlin),道赫提(Dougherty)等人(柯尼西V.W.(Cornish,V.W.)；孟德爾D.(Mendel,D.)；查魯茲P.G.(Schultz,P.G.)德國(guó)應(yīng)用化學(xué)(英文版)(Angew.Chem.Int.Ed.Engl.)1995，34，621；羅賓森S.A.(Robertson,S.Α.)；埃爾曼J.A.(ElIman,J.A.)；查魯茲P.G.，美國(guó)化學(xué)協(xié)會(huì)雜志(J.Am.Chem.Soc.)1991，113，2722；諾倫C.J.(Noren,C.J.)；安托尼-卡黑爾S.J.(Anthony-Cahill,S.J.)；格雷夫斯Μ.C.(Griffith,Μ.C.)；查魯茲P.G.，科學(xué)(Science)1989，244，182；貝恩J.D.(Bain,J.D.)；格雷布C.G.(Glabe,C.G.)；迪克斯T.A.(Dix,Τ.Α.)；查柏林A.R.(Chamberlin,A.R.)，美國(guó)化學(xué)協(xié)會(huì)雜志1989，111，8013;貝恩J.D.等人，自然(Nature)1992，356，537；蓋里梵J.P.(Gallivan,J.P.)；萊斯特H.A.(Lester,H.Α.)；道赫提D.A(Dougherty，D.Α)化學(xué)與生物學(xué)(Chem.Biol.)1997,4，740;特卡提(Turcatti)等人，生物化學(xué)雜志(J.Biol.Chem.)1996，271，19991；諾瓦克M.W.(Nowak,M.W.)等人科學(xué)，1995，268,439；薩克斯M.E.(Saks,Μ.Ε.)等人生物化學(xué)雜志1996，271，23169；村上T.(Hohsaka，Τ.)等人美國(guó)化學(xué)協(xié)會(huì)雜志1999，121，34)。這些方法或其它化學(xué)氨?；椒ǘ伎捎糜趯⒈景l(fā)明的tRNA分子氨酰基化。采用化學(xué)修飾的氨酰基-tRNA的生物合成方法已被用于將數(shù)種生物物理探針并入在體外合成的蛋白質(zhì)中。參見以下出版物和其中引用的參考文獻(xiàn)布倫納J.(Brurmer，J.)新的光標(biāo)記禾口交聯(lián)方法(NewPhotolabelingandcrosslinkingmethods),牛物化學(xué)年評(píng)(Annu.RevBiochem),62:483-514(1993)；和克雷格U.C.(Krieg,U.C.)，沃特P.(Walter,P.)，霍恩森A.E.(Hohnson,Α.E.)信號(hào)識(shí)別粒子的54kDa多肽新生催乳激素前體白勺信號(hào)序歹Ij白勺光交聯(lián)(Photocrosslinkingofthesignalsequenceofnascentpreprolactinofthe54-kilodaltonpolypeptideofthesignalrecognitionparticle)，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci),83(22):8604-8608(1986)。先前已證實(shí)，在體外通過將以化學(xué)方式氨酰基化的抑制性tRNA添加到經(jīng)含有所需琥珀無義突變的基因編程的蛋白質(zhì)合成反應(yīng)中，可將非天然氨基酸位點(diǎn)特異性地并入蛋白質(zhì)中。使用這些方法，可使用對(duì)于特定氨基酸來說為營(yíng)養(yǎng)缺陷型的菌株，用密切結(jié)構(gòu)同源物取代20種常見氨基酸中的多種氨基酸，例如，用氟苯丙氨酸取代苯丙氨酸。例如參見諾倫C.J.(Noren,C.J.)，安托尼-卡黑爾(Anthony-Cahill)，格雷夫斯M.C.(Griffith,見(.)，查魯茲？.6.(Schultz,P.G.)用于將非天然氨基酸位點(diǎn)特異性并入蛋白質(zhì)中的一般方法(Ageneralmethodforsite-specificincorporationofunnaturalaminoacidsintoproteins),科學(xué)(Science),244:182-188(1989)；M.W.諾瓦克(Μ·W.Nowak)等人，科學(xué)，268=439-42(1995)；貝恩J.D.(Bain,J.D.)，格雷布C.G.(Glabe,C.G.)，迪克斯T.A.(Dix,Τ.A.)，查柏林A.R.(Chamberlin,A.R.)，迪阿拉E.S.(Diala,E.S.)將非天然氨基酸位點(diǎn)特異性并入多肽中的生物合成方法(Biosyntheticsite-specificIncorporationofanon-naturalaminoacidintoapolypeptide)，美國(guó)化學(xué)協(xié)會(huì)雜志(.LAmChemSoc),111:8013-8014(1989)；N.鮑里斯(N.Budisa)等人,美國(guó)實(shí)驗(yàn)牛物學(xué)聯(lián)合會(huì)會(huì)刊(FASEBT.)13:41-51(1999)；埃爾曼J.A.(Ellman,J.A.)，孟德爾D.(Mendel,D.)，安托尼-卡黑爾S.(Anthony-Cahill,S.)，諾倫C.J.，查魯茲P.G.，用于將非天然氨基酸位點(diǎn)特異性引入蛋白質(zhì)中的生物合成方法(Biosyntheticmethodforintroducingunnaturalaminoacidssite-specificallyintoproteins),酶學(xué)方法(MethodsinEnz.)第202卷，301-336(1992)；以及孟德爾D.，柯尼西V.W.(Cornish,V.W.)和查魯茲P.G.，利用擴(kuò)充的遺傳密碼進(jìn)行定點(diǎn)誘變(Site-DirectedMutagenesiswithanExpandedGeneticCode)，生物物理與生物大分子結(jié)構(gòu)評(píng)述(AnnuRevBiophys.BiomolStruct.)24,435-62(1995)。舉例來說，制備識(shí)別終止密碼子UAG的抑制性tRNA，并用非天然氨基酸以化學(xué)方式氨?；Ｊ褂贸Ｒ?guī)定點(diǎn)誘變?cè)诘鞍踪|(zhì)基因中的相關(guān)位點(diǎn)處引入終止密碼子TAG。例如參見賽爾J.R.(Sayers,J.R.)，斯奇米特W.(Schmidt,W.)，艾克斯坦F.(Eckstein,F.)5‘-3'核酸外切酶在基于硫代磷酸酯的寡核苷酸引導(dǎo)的誘變中的應(yīng)用(5‘-3‘Exonucleaseinphosphorothioate-basedoligonucleotide-directedmutagenesis)，核酸研究(NucleicAcidsRes),16(3):791-802(1988)。當(dāng)將?；种菩詔RNA和突變基因組合于體外轉(zhuǎn)錄/翻譯系統(tǒng)中時(shí)，對(duì)UAG密碼子反應(yīng)而并入非天然氨基酸，得到在指定位置含有所述氨基酸的蛋白質(zhì)。使用[3H]-Phe進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)和使用α-羥基酸進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)證實(shí)，僅在UAG密碼子指定的位置處并入所需氨基酸，并且未在蛋白質(zhì)中的任何其它位點(diǎn)并入此氨基酸。例如參見，諾倫(Noren)等人，同上文；小林(KcAayashi)等人，(2003)自然結(jié)構(gòu)生物學(xué)(NatureStructuralBiology)10(6):425-432;和埃爾曼J.A.(Ellman,J.A.)，孟德爾D.(Mendel,D.)，查魯茲P.G.(Schultz,P.G.)將新穎主鏈結(jié)構(gòu)位點(diǎn)特異性并入蛋白質(zhì)中(Site-specificincorporationofnovelbackbonestructuresintoproteins),科學(xué)(Science)，255(5041):197-200(1992)。產(chǎn)生催化性RNA的方法可涉及產(chǎn)生隨機(jī)化核糖酶序列的單獨(dú)池；對(duì)這些池進(jìn)行定向進(jìn)化；針對(duì)所需氨?；钚院Y選所述池；和選擇展現(xiàn)所需氨?；钚缘哪切┖颂敲傅男蛄?。核糖酶可包含促進(jìn)?；钚缘幕蚝?或區(qū)域，例如GGU基序和富集U的區(qū)域。舉例來說，已報(bào)導(dǎo)富集U的區(qū)域可促進(jìn)氨基酸底物的識(shí)別，而GGU基序可與tRNA的3'末端形成堿基對(duì)。GGU基序與富集U區(qū)域組合起來可促進(jìn)同時(shí)識(shí)別氨基酸與tRNA，并因此促進(jìn)tRNA3'末端的氨?；??？赏ㄟ^使用與tRNAAsn。ra結(jié)合的部分隨機(jī)化rf^iini進(jìn)行體外選擇，隨后系統(tǒng)地工程改造活性克隆體中所見的共有序列，來產(chǎn)生核糖酶。利用此方法獲得的示范性核糖酶稱為“Fx3核糖酶”，并且描述于美國(guó)公開申請(qǐng)案第2003/0228593號(hào)(其內(nèi)容以引用的方式并入本文中)中，所述核糖酶充當(dāng)合成載有同源非天然氨基酸的各種氨?；?tRNA的通用催化劑。在基質(zhì)上固定可用于促成氨?；痶RNA的有效親和純化。適合基質(zhì)的實(shí)例包括(但不限于)瓊脂糖、瓊脂糖凝膠和磁珠?？衫肦NA的化學(xué)結(jié)構(gòu)將核糖酶固定于樹脂上，例如，RNA核糖上的3'-順-二醇可經(jīng)高碘酸鹽氧化得到相應(yīng)的二醛，從而便利將RNA固定于樹脂上。可使用各種類型的樹脂，包括廉價(jià)的酰胼樹脂，其中還原胺化使得樹脂與核糖酶之間相互作用而形成不可逆鍵。借助于此種柱上氨?；夹g(shù)(on-columnaminoacylationtechnique)可顯著促進(jìn)氨?；?tRNA的合成?？_利斯(Kourouklis)等人，方法(Methods)2005；36:239-4中描述了一種基于柱的氨?；到y(tǒng)。氨?；痶RNA的分離可借助多種方式實(shí)現(xiàn)。一種適合的方法是利用緩沖液(例如含有IOmMEDTA的乙酸鈉溶液；含有50mMN-(2-羥乙基)哌嗪-N'-(3-丙烷磺酸)、12.5mMKCl(pH7.0)UOmMEDTA的緩沖液；或者簡(jiǎn)單的EDTA緩沖的水(pH7.0))從柱中洗脫出氨?；痶RNA。可將本發(fā)明的氨?；痶RNA加到翻譯反應(yīng)中，以便將使tRNA氨?；陌被岵⑷敕g反應(yīng)所產(chǎn)生的多肽中的所選位置中?？墒褂帽景l(fā)明的氨?；痶RNA的翻譯系統(tǒng)的實(shí)例包括(但不限于)細(xì)胞溶解產(chǎn)物。細(xì)胞溶解產(chǎn)物提供由輸入mRNA體外翻譯多肽必需的反應(yīng)組件。所述反應(yīng)組件的實(shí)例包括(但不限于)核糖體蛋白、rRNA、氨基酸、tRNA、GTP、ATP、翻譯起始因子和延伸因子以及其它與翻譯有關(guān)的因子。此外，翻譯系統(tǒng)也可為批fiili$(batchtranslation)ISlift.Il(compartmentalizedtrgmslgition)。ittfiffi!譯系統(tǒng)組合了單一區(qū)室中的反應(yīng)組件，而區(qū)室化翻譯系統(tǒng)使翻譯反應(yīng)組件與可能會(huì)抑制翻譯效率的反應(yīng)產(chǎn)物分開。這些翻譯系統(tǒng)在市面上都有銷售。此外，可使用偶聯(lián)的轉(zhuǎn)錄/翻譯系統(tǒng)。偶聯(lián)的轉(zhuǎn)錄/翻譯系統(tǒng)允許將輸入DNA轉(zhuǎn)錄成相應(yīng)的mRNA，而mRNA又由反應(yīng)組件翻譯。市售的偶聯(lián)轉(zhuǎn)錄/翻譯的實(shí)例為RapidTranslationSystem(RTS，羅氏公司(RocheInc.))。這一系統(tǒng)包括含有大腸桿菌溶解產(chǎn)物的混合物，用于提供例如核糖體和翻譯因子等翻譯組件。此外，還包括RNA聚合酶，用于將輸入DNA轉(zhuǎn)錄成mRNA模板，供翻譯使用。RTS可經(jīng)由插入反應(yīng)區(qū)室(包括供料/廢料區(qū)室和轉(zhuǎn)錄/翻譯區(qū)室)之間的膜來將反應(yīng)組件區(qū)室化?？衫冒?但不限于)轉(zhuǎn)移酶、聚合酶、催化性抗體、多功能蛋白等其它試劑將tRNA氨酰基化。ιΗ交氨酰基-tRNA合成酶(O-RS)O-RS在體外或體內(nèi)優(yōu)先利用所選氨基酸將本發(fā)明Ο-tRNA氨?；?。本發(fā)明的O-RS可通過包括O-RS的多肽和/或編碼O-RS或其部分的多聚核苷酸提供給翻譯系統(tǒng)(例如，體外翻譯組件，或細(xì)胞)。O-RS或其部分是由多聚核苷酸序列或其互補(bǔ)多聚核苷酸序列，或其保守變異體編碼。本發(fā)明的Ο-tRNA可由多種不同的O-RS分子(包括(但不限于)本文中揭示者)氨酰基化。用于鑒別正交氨?；?tRNA合成酶(0-RS，例如0-RS)供用于0_tRNA(例如Ο-tRNA)的方法也是本發(fā)明的特征。舉例來說，一種方法包括使第一物種的細(xì)胞群經(jīng)歷陽性選擇，其中所述細(xì)胞各包含1)多個(gè)氨?；?tRNA合成酶(!《)的成員，其中所述多個(gè)RS包含突變RS、源自除第一物種外的物種的RS，或突變RS和源自除第一物種外的物種的RS二者；2)來自第二物種的正交tRNA(Ο-tRNA)；和3)編碼陽性選擇標(biāo)記物且包含至少一個(gè)選擇密碼子的多聚核苷酸。選擇或篩選出細(xì)胞中抑制效率應(yīng)相比缺乏所述多個(gè)RS的成員或具有少量所述多個(gè)RS的成員的細(xì)胞有所增強(qiáng)的細(xì)胞。抑制效率增強(qiáng)的細(xì)胞包含可將Ο-tRNA氨?；幕钚訰S。將活性RS使來自第一物種的第一組tRNA氨?；?體外或體內(nèi))的水平與活性RS使來自第二物種的第二組tRNA氨?；?體外或體內(nèi))的水平相比較?？山柚诳蓹z測(cè)物質(zhì)(例如加標(biāo)記的氨基酸或非天然氨基酸)測(cè)定氨?；?。選出與第一組tRNA相比較，將第二組tRNA氨酰基化的效率較高的活性RS，由此提供正交氨?；?tRNA合成酶供用于Ο-tRNA。由所述方法鑒別的0-RS，例如0-RS，也是本發(fā)明的特征。可以使用多種分析中的任一種來測(cè)定氨?；?。這些分析可在體外或體內(nèi)進(jìn)行。舉例來說，體外氨?；治雒枋鲇诶缁舯綪.(Hoben,P.)和索伊爾D.(Soil,D.)(1985)酶學(xué)方法(MethodsEnzymol.),113:55-59；以及美國(guó)專利申請(qǐng)公開案第2003/0228593號(hào)中。也可以通過使用報(bào)告基因和正交翻譯組件，并在表達(dá)包含至少一個(gè)選擇密碼子且編碼蛋白質(zhì)的多聚核苷酸的細(xì)胞中檢測(cè)這一報(bào)告基因，來測(cè)定氨酰基化。也參見美國(guó)專利申請(qǐng)案10/1,927，標(biāo)題為“體內(nèi)并入非天然氨基酸(INVIVOINCORPORATIONOFUNNATURALAMINOACIDS)”；禾口USSN10/825，867，標(biāo)題為擴(kuò)充真核遺傳密碼“EXPANDINGTHEEUKARY0TICGENETICCODE”?？蛇M(jìn)一步操作鑒別的0-RS，以改變合成酶的底物特異性，由此只將所需非天然氨基酸，而非常見20種氨基酸中的任一者加載到Ο-tRNA上。產(chǎn)生對(duì)非天然氨基酸具有底物特異性的正交氨?；鵷RNA合成酶的方法包括通過組合合成酶的不同結(jié)構(gòu)域來使合成酶的不同位點(diǎn)突變，例如合成酶中的活性位點(diǎn)、合成酶中的編輯機(jī)制位點(diǎn)等；和應(yīng)用選擇過程。所用策略是基于陽性選擇隨后陰性選擇的組合。在陽性選擇中，抑制在陽性標(biāo)記物非必需位置引入的選擇密碼子，允許細(xì)胞在陽性選擇壓力下存活。因此，在天然和非天然氨基酸存在下，存活細(xì)胞編碼將天然或非天然氨基酸加載到正交抑制性tRNA的活性合成酶。在陰性選擇中，抑制在陰性標(biāo)記物非必需位置引入的選擇密碼子，將去除具有天然氨基酸特異性的合成酶。經(jīng)歷陰性選擇和陽性選擇而存活的細(xì)胞編碼只利用非天然氨基酸將正交抑制性tRNA氨酰基化(將非天然氨基酸加載到正交抑制性tRNA)的合成酶。接著，這些合成酶可再經(jīng)歷誘變，例如DNA改組或其它遞歸誘變方法。突變O-RS文庫可以使用此項(xiàng)技術(shù)中已知的各種誘變技術(shù)產(chǎn)生。舉例來說，可通過位點(diǎn)特異性突變、隨機(jī)點(diǎn)突變、同源重組、DNA改組或其它遞歸誘變方法、嵌合構(gòu)建或其任何組合，產(chǎn)生突變型RS。舉例來說，可由兩個(gè)或兩個(gè)以上其它(例如)較小、多樣性較低的“子文庫”產(chǎn)生突變型RS文庫。本發(fā)明中也包括嵌合RS文庫。應(yīng)注意，可任選構(gòu)建來自各種生物體(例如微生物，如真細(xì)菌或古細(xì)菌)的tRNA合成酶文庫，例如包含天然多樣性的文庫(例如參見肖特(Short)等人的美國(guó)專利第6，238，884號(hào)；斯查倫伯格(Schallenberger)等人的美國(guó)專利第5，756，316號(hào)；皮特森(Petersen)等人的美國(guó)專利第5，783，431號(hào)；湯姆森(Thompson)等人的美國(guó)專利第5，824，485號(hào)；肖特等人的美國(guó)專利第5，958，672號(hào))，并針對(duì)正交對(duì)進(jìn)行篩選。在合成酶經(jīng)歷陽性和陰性選擇/篩選策略后，隨后即可使這些合成酶再經(jīng)歷誘變。舉例來說，可分離出編碼O-RS的核酸；可由所述核酸產(chǎn)生一組編碼突變型O-RS的多聚核苷酸(例如，通過隨機(jī)誘變、位點(diǎn)特異性誘變、重組或其任何組合)；并且可重復(fù)所述個(gè)別步驟或這些步驟的組合，直到獲得優(yōu)先利用非天然氨基酸將Ο-tRNA氨?；耐蛔冃?-RS。在本發(fā)明一方面中，這些步驟進(jìn)行多次，例如至少2次。本發(fā)明方法中也可使用其它選擇/篩選嚴(yán)格度水平，以用于產(chǎn)生0-tRNA、O-RS或其對(duì)。在產(chǎn)生O-RS的方法的一個(gè)或兩個(gè)步驟中可改變選擇或篩選嚴(yán)格度。例如，這可包括改變選擇/篩選劑的用量等。還可再進(jìn)行數(shù)輪陽性和/或陰性選擇。選擇或篩選也可包含一次或一次以上陽性或陰性選擇或篩選，這些選擇或篩選包括例如氨基酸滲透性的改變、翻譯效率的改變、翻譯保真度的改變等。通常，這一種或一種以上改變是建立在使用正交tRNA-tRNA合成酶對(duì)產(chǎn)生蛋白質(zhì)的生物體中一個(gè)或一個(gè)以上基因突變的基礎(chǔ)上。在本發(fā)明中可以使用針對(duì)例如0-RS、Ο-tRNA和O-tRNA/O-RS對(duì)的其它類型選擇。陽性選擇標(biāo)記物可以是多種分子中的任一者，包括(但不限于)為生長(zhǎng)提供養(yǎng)分補(bǔ)充的產(chǎn)品，并且所述選擇可在缺乏所述養(yǎng)分補(bǔ)充的培養(yǎng)基上進(jìn)行。編碼陽性選擇標(biāo)記物的多聚核苷酸的實(shí)例包括(但不限于)例如基于補(bǔ)充細(xì)胞的氨基酸營(yíng)養(yǎng)缺陷的報(bào)告基因、his3基因(例如，his3基因編碼咪唑甘油磷酸酯脫水酶的情形，可通過提供3-氨基三唑(3-AT)來檢測(cè))、ura3基因、leu2基因、lys2基因、IacZ基因、adh基因等。例如參見G.M.卡斯霍(G.M-Kishore)和D.M.夏爾(D.M.Shah),(1988)，用作除草劑的氨基酸生物合成抑制劑(Aminoacidbiosynthesisinhibitorsasherbicides),生物化學(xué)年評(píng)(AnnualReviewofBiochemistry)57:627-663。在一個(gè)實(shí)施例中，通過鄰硝基苯基-β_D_半乳糖吡喃糖苷(ONPG)水解來檢測(cè)IacZ產(chǎn)生。例如參見I.G.塞雷布斯基(I.G.Serebriiskii)和Ε.A.格雷米斯(E.A.Golemis)，(2000)，使用IacZ研究基因功能評(píng)估酵母雙雜交系統(tǒng)中所用的β-半乳糖苷酶分析(UsesofIacZtostudygenefunction:evaluationofbeta-galactosidaseassaysemployedintheyeasttwo-hybridsystem)，分析生物化學(xué)(AnalyticalBiochemistry)285:1_15。其它陽性選擇標(biāo)記物包括例如熒光素酶、綠色熒光蛋白質(zhì)(GFP)、YFP、EGFP、RFP、抗生素抗性基因的產(chǎn)物(例如，氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(CAT))、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白(例如GAL4)等。編碼陽性選擇標(biāo)記物的多聚核苷酸任選包含選擇密碼子?？蓪⒕幋a陽性選擇標(biāo)記物的多聚核苷酸可操作性地連接到反應(yīng)元件。還可存在另一多聚核苷酸，其編碼調(diào)節(jié)由反應(yīng)元件進(jìn)行的轉(zhuǎn)錄的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白，并且包含至少一個(gè)選擇密碼子。通過經(jīng)非天然氨基酸氨?；摩?tRNA將非天然氨基酸并入轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白中，將引起編碼陽性選擇標(biāo)記物的多聚核苷酸(例如報(bào)告基因)的轉(zhuǎn)錄。選擇密碼子任選位于編碼轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的多聚核苷酸的一部分中或?qū)嵸|(zhì)上在其附近。還可將編碼陰性選擇標(biāo)記物的多聚核苷酸可操作性地連接到反應(yīng)元件，轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白將通過這一反應(yīng)元件介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄。例如參見A.J.德馬格(A.J.DeMaggio)等人，(2000)，酵母分裂雜交系統(tǒng)(Theyeastsplit-hybridsystem)，酶學(xué)方法(MethodEnzymol.)328128-137；H.Μ.夏爾(H.Μ.Shih)等人，(1996)，用于破壞蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的陽性遺傳選擇鑒別阻止與共活化劑CBP締合的CREB突變(Apositivegeneticselectionfordisruptingprotein-proteininteractionsidentificationofCREBmutationsthatpreventassociationwiththecoactivatorCBP)，美1515禾斗學(xué)院院干Ij(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.)93:13896-13901；Μ.維達(dá)(Μ.Vidal)等人，(1996)，通過使用酵母逆向雙雜交系統(tǒng)對(duì)哺乳動(dòng)物蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用結(jié)構(gòu)域的遺傳表征(Geneticcharacterizationofamammalianprotein-proteininteractiondomainbyusingayeastreversetwo-hybridsystem.)，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊，93:10321-103；和M.維達(dá)等人，(1996)，用于檢測(cè)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)和DNA-蛋白質(zhì)相互作用解離的逆向雙雜交和單雜交系統(tǒng)(Reversetwo-hybridandone-hybridsystemstodetectdissociationofprotein-proteinandDNA-proteininteractions.),美國(guó)國(guó)家禾斗學(xué)院院干丨J，93:10315-10320。通過經(jīng)天然氨基酸氨?；摩?tRNA將天然氨基酸并入轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白中，將引起陰性選擇標(biāo)記物的轉(zhuǎn)錄。陰性選擇標(biāo)記物任選包含選擇密碼子。本發(fā)明的陽性選擇標(biāo)記物和/或陰性選擇標(biāo)記物可包含至少兩個(gè)選擇密碼子，其各自或都可包含至少兩個(gè)不同的選擇密碼子或至少兩個(gè)相同的選擇密碼子。轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白是結(jié)合于(直接或間接)核酸序列(例如，反應(yīng)元件)并調(diào)節(jié)可操作性地連接到反應(yīng)元件的序列轉(zhuǎn)錄的分子。轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白可為轉(zhuǎn)錄活化蛋白(例如，GAL4、核激素受體、API、CREB,LEF/tcf家族成員、SMAD、VP16、SPl等)、轉(zhuǎn)錄阻遏蛋白(例如，核激素受體、Groucho/tle家族、Engrailed家族等)或可視環(huán)境而具有兩種活性的蛋白質(zhì)(例如LEF/tcf、同源異型盒(homobox)蛋白等)。反應(yīng)元件通常為由轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白所識(shí)別的核酸序列或與轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白協(xié)力作用的另一試劑。轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白的另一實(shí)例為轉(zhuǎn)錄活化蛋白GAL4。例如參見A.朗頓(A.Laughon)等人，(1984)，由釀酒酵母GAL4基因編碼的兩個(gè)蛋白質(zhì)的鑒別(IdentificationoftwoproteinsencodedbytheSaccharomycescerevisiaeGAL4gene),分子與細(xì)胞生物學(xué)(Molecular&CellularBiology)4:268-275；Α.朗頓和R.F.蓋斯特蘭(R.F.Gesteland)，(1984)，釀酒酵母GAL4基因的一級(jí)結(jié)構(gòu)(PrimarystructureoftheSaccharomycescerevisiaeGAL4gene)，分子與細(xì)胞生物學(xué)，4:260-267；L.克格(L.Keegan)等人(1986)，真核調(diào)控蛋白質(zhì)的DNA結(jié)合與轉(zhuǎn)錄活化功能的分離(S^arationofDNAbindingfromthetranscription-activatingfunctionofaeukaryoticregulatoryprotein)，禾斗學(xué)(Science)231:699-704;和Μ.帕塔西(Μ.Ptashne)，(1988)，真核轉(zhuǎn)錄活化子如何工作(Howeukaryotictranscriptionalactivatorswork),自然(Nature)335:683-689。這一具有881個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)的N末端147個(gè)氨基酸形成特異性結(jié)合DNA序列的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(DBD)。例如參見M.卡雷(M.Carey)等人，(1989)，GAL4的氨基末端片段結(jié)合DNA成36為二聚體(Anammo-terminalfragmentofGAL4bindsDNAasadimer),^^-^ΜΨ^志(J.Mol.Biol.)209:423-432；和Ε.格尼格(Ε.Giniger)等人，(1985)，酵母陽性調(diào)控蛋白質(zhì)GAL4的特異性DNA結(jié)合(SpecificDNAbindingofGAL4,apositiveregulatoryproteinofyeast)，細(xì)胞(Cell)40:767_774。DBD通過插入蛋白質(zhì)序列(interveningproteinsequence)連接到當(dāng)結(jié)合DNA時(shí)可活化轉(zhuǎn)錄的C末端113個(gè)氨基酸的活化結(jié)構(gòu)域(AD)。例如參見J.馬(J.Ma)和M.帕塔西(M.Ptashne)，(1987)，GAL4缺失分析界定兩個(gè)轉(zhuǎn)錄活化區(qū)段(DeletionanalysisofGAL4definestwotranscriptionalactivatingsegments)，細(xì)胞(Cell)48:847-853；和J.馬和M.帕塔西，(1987)，GAL80識(shí)別GAL4基因的^30yIvMSSt(Thecarboxy-terminal30aminoacidsofGAL4arerecognizedbyGAL80)，細(xì)胞，50:137-142。通過將琥珀密碼子朝向例如含有GAL4的N末端DBD和其C末端AD的單一多肽的N末端DBD放置，可將0-tRNA/0-RS對(duì)的琥珀抑制作用與GAL4的轉(zhuǎn)錄活化作用聯(lián)系起來。可使用GAL4活化的報(bào)告基因來進(jìn)行利用所述基因的陽性選擇和陰性選擇。用于陰性選擇的培養(yǎng)基可包含在陰性選擇標(biāo)記物作用下轉(zhuǎn)化成可檢測(cè)物質(zhì)的選擇或篩選劑。在本發(fā)明一方面中，可檢測(cè)物質(zhì)為有毒物質(zhì)。編碼陰性選擇標(biāo)記物的多聚核苷酸可例如為ura3基因。舉例來說，可將URA3報(bào)告基因置于含有GAL4DNA結(jié)合位點(diǎn)的啟動(dòng)子控制之下。當(dāng)例如通過翻譯具有選擇密碼子的編碼GAL4的多聚核苷酸來產(chǎn)生陰性選擇標(biāo)記物時(shí)，GAL4將活化URA3的轉(zhuǎn)錄。在包含5-氟乳清酸(5-F0A)的培養(yǎng)基上實(shí)現(xiàn)陰性選擇，所述5-F0A在ura3基因的基因產(chǎn)物作用下被轉(zhuǎn)化成可檢測(cè)物質(zhì)(例如，殺死細(xì)胞的有毒物質(zhì))。例如參見J.D.鮑可(J.D.Boeke)等人，(1984)，酵母中缺乏乳清酸核苷-5'-磷酸脫羧酶活性的突變體的陽性選擇5-氟乳清酸抗性(Apositiveselectionformutantslackingorotidine-5'-phosphatedecarboxylaseactivityinyeast:5-fluorooroticacidresistance),分子與普通遺傳學(xué)(Molecular&GeneralGenetics)197:345-346)；Μ.維達(dá)(Μ.Vidal)等人(1996)，通過使用酵母逆向雙雜交系統(tǒng)對(duì)哺乳動(dòng)物蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用結(jié)構(gòu)域的遺傳表征(Geneticcharacterizationofamammalianprotein-proteininteractiondomainbyusingayeastreversetwo-hybridsystem.),美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.Α.)9310321-10326;和Μ.維達(dá)等人(1996)，用于檢測(cè)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)和DNA-蛋白質(zhì)相互作用的逆向雙雜交禾口單雜交系統(tǒng)(Reversetwo-hybridandone-hybridsystemstodetectdissociationofprotein-proteinandDNA-proteininteractions.)，美國(guó)國(guó)家禾斗學(xué)院院刊，93:10315-10320。與陽性選擇標(biāo)記物相同，陰性選擇標(biāo)記物也可為多種分子中的任一個(gè)。陽性選擇標(biāo)記物和/或陰性選擇標(biāo)記物可以是在適當(dāng)反應(yīng)物存在下發(fā)熒光或催化發(fā)光反應(yīng)的多肽。舉例來說，陰性選擇標(biāo)記物包括(但不限于)例如熒光素酶、綠色熒光蛋白質(zhì)(GFP)、YFP、EGFP、RFP、抗生素抗性基因的產(chǎn)物(例如，氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(CAT))、IacZ基因的產(chǎn)物、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白等。陽性選擇標(biāo)記物和/或陰性選擇標(biāo)記物可借助熒光活化的細(xì)胞分選(FACS)或通過發(fā)光來檢測(cè)。陽性選擇標(biāo)記物和/或陰性選擇標(biāo)記物可包含基于親和力的篩選標(biāo)記物。同一多聚核苷酸可編碼陽性選擇標(biāo)記物和陰性選擇標(biāo)記物二者。舉例來說，陽性選擇步驟、陰性選擇步驟或陽性和陰性選擇步驟二者可包括使用報(bào)告基因，其中所述報(bào)告基因可借助熒光活化的細(xì)胞分選(FACQ來檢測(cè)。舉例來說，陽性選擇可首先用陽性選擇標(biāo)記物進(jìn)行，例如用氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(CAT)基因，其中CAT基因在CAT基因中包含選擇密碼子，例如琥珀終止密碼子，隨后進(jìn)行陰性選擇篩選，這一步驟是基于不能抑制陰性選擇標(biāo)記物(例如T7RNA聚合酶基因)內(nèi)各個(gè)位置的選擇密碼子(例如兩個(gè)或兩個(gè)以上)。陽性選擇標(biāo)記物和陰性選擇標(biāo)記物可出現(xiàn)在同一載體(例如質(zhì)粒)上。陰性標(biāo)記物的表達(dá)驅(qū)動(dòng)報(bào)告基因(例如綠色熒光蛋白，GFP)的表達(dá)。選擇和篩選的嚴(yán)格度可發(fā)生變化，例如可以改變使報(bào)告基因發(fā)熒光所需的光強(qiáng)度。陽性選擇可以利用報(bào)告基因作為陽性選擇標(biāo)記物(可借助FACS篩選)來進(jìn)行，隨后進(jìn)行陰性選擇篩選，這一步驟是基于不能抑制陰性標(biāo)記物(例如芽孢桿菌RNA酶基因)內(nèi)各個(gè)位置的選擇密碼子(例如兩個(gè)或兩個(gè)以上)。報(bào)告基因任選展示于細(xì)胞表面上，例如展示于噬菌體上等。細(xì)胞表面展示，例如基于OmpA的細(xì)胞表面展示系統(tǒng)，依賴于特定表位(例如，與外膜孔蛋白OmpA融合的脊髓灰質(zhì)炎病毒C3肽)在大腸桿菌細(xì)胞表面上的表達(dá)。只有當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)信使中的選擇密碼子在翻譯期間受到抑制時(shí)，表位才展示于細(xì)胞表面上。隨后，展示的肽含有由文庫中的一種突變氨酰基-tRNA合成酶所識(shí)別的氨基酸，并且可以用針對(duì)含有特定非天然氨基酸的肽產(chǎn)生的抗體分離出含有相應(yīng)合成酶基因的細(xì)胞。作為噬菌體展示的替代技術(shù)，喬治歐(Georgiou)等人開發(fā)和優(yōu)化了基于OmpA的細(xì)胞表面展示系統(tǒng)。參見弗朗西斯科J.A.(Francisco,J.Α.)，坎貝爾R.(Campbell,R.)，艾維森B.L.(Iverson,B.L.)和喬治歐G.(Georgoiu,G.)在外表面上表達(dá)功能性抗體片段的大腸桿菌的產(chǎn)生和熒光活化細(xì)胞分選(Productionandfluorescence-activatedcellsortingofEscherichiacoliexpressingafunctionalantibodyfragmentontheexternalsurface).美國(guó)國(guó)家禾斗學(xué)院院干丨J(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)9010444-8(1993)。本發(fā)明其它實(shí)施例包括在體外執(zhí)行一個(gè)或一個(gè)以上選擇步驟。隨后可將所選組件，例如合成酶和/或tRNA，引入細(xì)胞中以用于在體內(nèi)并入非天然氨基酸。有關(guān)產(chǎn)生O-RS和改變合成酶的底物特異性的其它細(xì)節(jié)可見于美國(guó)專利申請(qǐng)案10/126，931，標(biāo)題為“用于產(chǎn)生正交tRNA-氨?；鵷RNA合成酶對(duì)的方法和組合物(MethodsandCompositionsfortheProductionofOrthogonaltRNA-AminoacyltRNASynthetasePairs)”；和USSN10/825，867，標(biāo)題為“擴(kuò)充真核遺傳密碼(EXPANDINGTHEEUKARY0TICGENETICCODE)”，都以引用的方式并入本文中。有關(guān)產(chǎn)生O-RS的其它細(xì)節(jié)可見于濱野高久(Hamano-Takaku)等人，Q000)突變型大腸桿菌酪氨?；?tRNA合成酶利用非天然氨基酸氮雜酪氨酸的效率比酪氨酸高(AmutantEscherichiacoliTyrosyl-tRNASynthetaseUtilizestheUnnaturalAminoAcidAzatyrosineMoreEfficientlythanTyrosine)，生物化學(xué)雜志(JournalofBiologicalChemistry),275(51):40324-40328;氣賀(Kiga)等人(2002)，用于在真核翻譯中將非天然氨基酸位點(diǎn)特異性并入蛋白質(zhì)中的工程化大腸桿菌酪氨?；?tRNA合成酶以及其在小麥胚芽無細(xì)胞系統(tǒng)中的應(yīng)用(AnengineeredEscherichiacolityrosyl-tRNAsynthetaseforsite-specificincorporationofanunnaturalaminoacidintoproteinsineukaryotictranslationanditsapplicationinawheatgermcell-freesystem),美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊(PNAS)99(15):9715-9723；和富蘭克林(Francklyn)等人(2002)，氨?；?tRNA合成酶改變翻譯過程的通用參與者(Aminoacyl-tRNAsynthetases=Versatileplayersinthechangingtheateroftranslation)；RNA，8:1363-1372，各自以引用的方式并入本文中。來源和宿主牛物體本發(fā)明的翻譯組件通常是源自非真核生物體。舉例來說，正交Ο-tRNA可源自非真核生物體，例如古細(xì)菌，例如詹氏甲烷球菌、嗜熱自養(yǎng)甲烷桿菌、嗜鹽古菌(例如沃氏嗜鹽富饒菌和嗜鹽古菌NRC-1)、閃爍古生球菌、強(qiáng)烈火球菌、掘越氏熱球菌、嗜熱泉生古細(xì)菌等；或真細(xì)菌，例如大腸桿菌、極端嗜熱細(xì)菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌等，而正交O-RS可源自非真核生物體，例如嗜熱自養(yǎng)甲烷桿菌、嗜鹽古菌(例如沃氏嗜鹽富饒菌和嗜鹽古菌NRC-1)、超嗜熱古菌、強(qiáng)烈熾熱球菌、極端嗜熱古菌、嗜熱泉生古細(xì)菌等；或真細(xì)菌，例如大腸桿菌、極端嗜熱細(xì)菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌等。在一個(gè)實(shí)施例中，也可使用真核來源，包括(但不限于)植物、藻類、原生生物、真菌、酵母、動(dòng)物(例如哺乳動(dòng)物、昆蟲、節(jié)肢動(dòng)物等)等。0-tRNA/0-RS對(duì)的個(gè)別組件可源自相同生物體或不同生物體。在一個(gè)實(shí)施例中，0-tRNA/0-RS對(duì)是來自相同生物體?；蛘?，0-tRNA/0-RS對(duì)的Ο-tRNA和O-RS是來自不同生物體。舉例來說，Ο-tRNA可源自例如嗜鹽菌屬NRC-I，而O-RS可源自例如嗜熱自養(yǎng)甲烷桿菌。0-tRNA、O-RS或0-tRNA/0-RS對(duì)可在體內(nèi)或體外選擇或篩選和/或用于細(xì)胞中(例如非真核細(xì)胞，如大腸桿菌細(xì)胞；或真核細(xì)胞)以產(chǎn)生具有所選氨基酸(例如非天然氨基酸)的多肽。非真核細(xì)胞可來自多種來源，例如古菌系統(tǒng)發(fā)生域，包括(但不限于)詹氏甲烷球菌、嗜熱自養(yǎng)甲烷桿菌、嗜鹽菌(例如沃氏嗜鹽富饒菌和嗜鹽菌屬NRC-1)、超嗜熱古菌、強(qiáng)烈嗜熱球菌、堀越火球菌、嗜熱泉生古細(xì)菌等；或者可屬于真細(xì)菌系統(tǒng)發(fā)生域(包括(但不限于)大腸桿菌、極端嗜熱細(xì)菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌、熒光假單胞桿菌、銅綠假單胞菌、惡臭假單胞菌等)等。真核細(xì)胞可來自多種來源，包括(但不限于)植物(例如復(fù)雜植物，如單子葉植物或雙子葉植物)、藻類、原生生物、真菌、酵母(包括(但不限于)釀酒酵母)、動(dòng)物(包括(但不限于)哺乳動(dòng)物、昆蟲、節(jié)肢動(dòng)物等)等。具有本發(fā)明翻譯組件的細(xì)胞的組合物也為本發(fā)明的特征。有關(guān)從一種物種中篩選Ο-tRNA和/或O-RS用于另一物種中的內(nèi)容，也參見USSN10/825，867，標(biāo)題為“擴(kuò)充真核遺傳密碼(ExpandingtheEukaryoticGeneticCode)，，。為了在宿主細(xì)胞中表達(dá)具有所選氨基酸的相關(guān)多肽，可以將編碼相關(guān)多肽的多聚核苷酸亞克隆到表達(dá)載體中，這一表達(dá)載體含有引導(dǎo)轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子、轉(zhuǎn)錄/翻譯終止子，并且如果對(duì)于編碼蛋白質(zhì)的核酸，還含有供起始翻譯的核糖體結(jié)合位點(diǎn)。此項(xiàng)技術(shù)中眾所周知適合的細(xì)菌啟動(dòng)子，并且例如描述于薩姆布魯克(Sambrook)等人和奧斯貝爾(Ausubel)等人中。用于表達(dá)相關(guān)多肽的細(xì)菌表達(dá)系統(tǒng)可從(包括(但不限于))大腸桿菌、芽孢桿菌屬、熒光假單胞菌、銅綠假單胞菌、惡臭假單胞菌和沙門氏菌獲得(帕爾瓦O^alva)等人，基因(Gene)22:229-235(1983)；莫斯貝奇(Mosbach)等人，自然(Nature)302543-545(1983))。這些表達(dá)系統(tǒng)的試劑盒在市面上有售。此項(xiàng)技術(shù)眾所周知哺乳動(dòng)物細(xì)胞、酵母和昆蟲細(xì)胞的真核表達(dá)系統(tǒng)，并且在市面上也有銷售?？梢栽诙喾N適合的表達(dá)系統(tǒng)(例如包括酵母、昆蟲細(xì)胞、哺乳動(dòng)物細(xì)胞和細(xì)菌)中利用和/或在其中表達(dá)本發(fā)明的tRNA和/或RS和/或相關(guān)多肽。下文將描述例示性表達(dá)系統(tǒng)。本文中使用的術(shù)語“酵母”包括能夠表達(dá)相關(guān)多肽的各種酵母中的任一種。這些酵母包括(但不限于)產(chǎn)子囊酵母(ascosporogenousyeast)(內(nèi)孢霉目(Endomycetales))、擔(dān)抱子酵母(basidiosporogenousyeast)禾口屬于半知菌(Fungiimperfecti)(芽孢綱(Blastomycetes))類的酵母。產(chǎn)子囊酵母分為兩個(gè)科蝕精霉科(Spermophthoraceae)和酵母菌科(Saccharomycetaceae)。酵母菌科是由四個(gè)亞科組成裂殖酵母亞科(Schizosaccharomycoideae)(例如，裂殖酵母屬(Schizosaccharomyces))>拿遜酵母亞科(Nadsonioideae)、油脂酵母亞科(Lipomycoideae)和酵母亞科(Saccharomycoideae)(例如，畢赤酵母屬(Pichia)、克魯維酵母屬(Kluyveromyces)和酵母屬(Saccharomyces))。擔(dān)孢子酵母包括白冬孢酵母屬(Leucosporidium)、紅冬孢酵母屬(Rhodosporidium)、鎖擲酵母屬(Sporidiobolus)、線黑粉酵母屬(Filobasidium)和香灰擬鎖擔(dān)菌屬(Filobasidiella)。屬于半知菌(芽孢綱)類的酵母分為兩個(gè)科擲孢酵母科(Sporobolomycelaceae)(例如，擲孢酵母屬(Sporoholomyces)和布勒擲孢酵母屬(Bullera))和隱球酵母科(Cryptococcaceae)(例如，假絲酵母屬(Candida))。供本發(fā)明使用的特別值得關(guān)注的為畢赤酵母屬、克魯維酵母屬、酵母菌屬(Saccharomyces)、裂殖酵母屬(Schizosaccharomyces)、漢遜酵母屬(Hansenula)、球擬酵母屬(Torulopsis)和假絲酵母屬內(nèi)的物種，其包括(但不限于)巴斯德畢赤酵母(P.pastoris)、谷勒氏酵母(P.guillerimondii)、釀酒酵母、卡爾斯伯酵母(S.carlsbergensis)、糖化酵母(S.diastaticus)、道格拉斯酵母(S.douglasii)、克魯維酵母(S.kluyveri)、諾本酵母(S.norbensis)、卵形酵母(S.oviformis)、乳酸克魯維酵母(K.Iactis)、脆壁克魯維酵母(K.fragilis)、白色念珠菌(C.albicans)、麥芽糖假絲酵母(C.maltosa)和漢森酵母(H.polymorpha)。酵母通常可從多種來源獲得，包括(但不限于)加利福尼亞大學(xué)生物物理和醫(yī)學(xué)物理系酵母基因保藏中心(加利福尼亞州伯克利)(YeastGeneticStockCenter,DepartmentofBiophysicsandMedicalPhysics,UniversityofCalifornia(Berkeley,CA))和美國(guó)典型菌種保藏中心(“ATCC”)(北弗吉尼亞州馬納薩斯)(AmericanTypeCultureCollection("ATCC")(Manassas,VA))。術(shù)語“酵母宿主”或“酵母宿主細(xì)胞”包括可用作或已用作重組載體或其它轉(zhuǎn)移DNA的受體的酵母。這一術(shù)語包括已接收重組載體或其它轉(zhuǎn)移DNA的原始酵母宿主細(xì)胞的后代。應(yīng)了解，由于意外或故意突變，單一母體細(xì)胞后代在形態(tài)學(xué)或基因組或總DNA補(bǔ)體上與原始母體可能未必完全相同。在此定義所指的后代中包括與欲借助相關(guān)特性(例如存在編碼相關(guān)多肽的核苷酸序列)表征的母體足夠類似的母體細(xì)胞后代。已經(jīng)開發(fā)出包括染色體外復(fù)制子或整合載體在內(nèi)的表達(dá)和轉(zhuǎn)化載體，用于轉(zhuǎn)化到許多酵母宿主中。舉例來說，已經(jīng)開發(fā)出用于以下各有機(jī)體的表達(dá)載體釀酒酵母(希寇斯基(Sikorski)等人，遺傳學(xué)(GENETICS)(1989)122:19；埃托(Ito)等人，應(yīng)用細(xì)菌學(xué)雜志(J.BACTERIOL.)(1983)153:163；海因倫(Hinnen)等人，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊(PR0C.NATL.ACAD.SCI.USA)(1978)75:1929)；白色念珠菌(科特茲(Kurtz)等人，分子細(xì)胞生物學(xué)(MOL.CELL.BIOL.)(1986)6:142)；麥芽糖假絲酵母(庫尼則(Kunze)等人，基礎(chǔ)微生物學(xué)雜志(J.BASICMICROBIOL.)(1985)25:141)；漢森酵母(格林森(Gleeson)等人，普通與應(yīng)用微生物學(xué)雜志(J.GEN.MICROBIOL.)(1986)132:3459；羅格坎普(Roggenkamp)等人，40分子遺傳學(xué)和基因組(MOL，GENETICSANDGENOMICS)(1986)202:302)；脆壁克魯維酵母(達(dá)斯(Das)等人，應(yīng)用細(xì)菌學(xué)雜志(1984)158:1165)；乳酸克魯維酵母(德拉文科特(DeLouvencourt)等人，應(yīng)用細(xì)菌學(xué)雜志(1983)154:737；范登伯格(VandenBerg)等人，生物技術(shù)(紐約)(BIOTECHNOLOGY(NY))(1990)8:135)；谷勒氏酵母(庫尼則等人，基礎(chǔ)微生物學(xué)雜志(19825:141)；巴斯德畢赤酵母(美國(guó)專利第5，3M，639號(hào)；第4，929，555號(hào)和第4，837，148號(hào)；克雷格(Cregg)等人，分子細(xì)胞生物學(xué)(1985)53376)；粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)(比奇(Beach)等人，自然(NATURE)(1982)300:706)；和解脂耶氏酵母(Y.Iipolytica)；構(gòu)巢曲霉(A.nidulans)(伯倫斯(Ballance)等人，生物化學(xué)與生物物理研究通訊(BI0CHEM.BI0PHYS.RES.C0MMUN)(1983)112:284-89；迪爾伯恩(Tilburn)等人，基因(GENE)(1983)26:205-221；和耶爾敦(Yelton)等人，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊(1984)81=1470-74)；黑曲霉(A.niger)(凱里(Kelly)和海因斯(Hynes)，歐洲分子生物學(xué)會(huì)雜志(ΕΜΒ0J.)(1982)4:475-479)；里氏木霉(T.reesia)(EPO244234)；和絲狀真菌，例如脈孢菌(Neurospora)、青霉菌(Penicillium)、彎頸霉(Tolypocladium)(WO91/00357)，各文獻(xiàn)以引用的方式并入本文中。所屬領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知用于酵母載體的控制序列，所述包括(但不限于)以下基因的啟動(dòng)子區(qū)例如醇脫氫酶(ADH)(EPO284044)；烯醇化酶；葡萄糖激酶；葡萄糖-6-磷酸異構(gòu)酶；甘油醛-3-磷酸-脫氫酶(GAP或GAPDH)；己糖激酶；磷酸果糖激酶；3-磷酸甘油酸變位酶；和丙酮酸激酶(PyK)(EPO329203)。編碼酸性磷酸酶的酵母PH05基因也可提供有用的啟動(dòng)子序列(宮之原(Miyanohara)等人，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊(PR0C.NATL.ACAD.SCI.USA)(1983)80:1)。適用于酵母宿主的其它啟動(dòng)子序列可包括3-磷酸甘油酸激酶(海澤曼(Hitzeman)等人，生物化學(xué)雜志(J.BIOL.CHEM)(1980)25512073)；和其它糖解酶(例如丙酮酸脫羧酶、磷酸丙糖異構(gòu)酶和磷酸葡萄糖異構(gòu)酶(霍蘭德(Holland)等人，生物化學(xué)(BIOCHEMISTRY)(1978)17:4900；海斯(Hess)等人，酶調(diào)控進(jìn)展雜志(J.ADV.ENZYMEREG.)(1969)7149))的啟動(dòng)子。具有由生長(zhǎng)條件控制的額外轉(zhuǎn)錄優(yōu)點(diǎn)的誘導(dǎo)性酵母啟動(dòng)子可包括醇脫氫酶2、異細(xì)胞色素C、酸性磷酸酶、金屬硫蛋白、甘油醛-3-磷酸脫氫酶、氮代謝相關(guān)性降解酶以及負(fù)責(zé)麥芽糖和半乳糖利用的酶的啟動(dòng)子區(qū)。適用于酵母表達(dá)中的載體和啟動(dòng)子進(jìn)一步描述于EPO073657中。酵母增強(qiáng)子也可與酵母啟動(dòng)子一起使用。另外，合成啟動(dòng)子也可充當(dāng)酵母啟動(dòng)子。舉例來說，酵母啟動(dòng)子的上游活化序列(upstreamactivatingsequence，UAS)可與另一酵母啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活化區(qū)連接，產(chǎn)生合成雜合啟動(dòng)子。所述雜合啟動(dòng)子的實(shí)例包括與GAP轉(zhuǎn)錄活化區(qū)連接的ADH調(diào)控序列。參見美國(guó)專利第4，880，734號(hào)和第4，876，197號(hào)，其以引用的方式并入本文中。雜合啟動(dòng)子的其它實(shí)例包括由ADH2、GAL4、GAL10或PH05基因的調(diào)控序列結(jié)合糖解酶基因(例如GAP或PyK)的轉(zhuǎn)錄活化區(qū)所組成的啟動(dòng)子。參見EPO164556。此外，酵母啟動(dòng)子可包括能夠結(jié)合酵母RNA聚合酶并起始轉(zhuǎn)錄的非酵母來源的天然存在啟動(dòng)子?？蓸?gòu)成酵母表達(dá)載體一部分的其它控制元件包括例如來自GAPDH或烯醇酶基因的終止子(霍蘭德(Holland)等人，生物化學(xué)雜志(J.BIOL.CHEM.)(1981)256:1385)。另外，來自2μ質(zhì)粒來源的復(fù)制起點(diǎn)也適用于酵母。適用于酵母中的選擇基因?yàn)榻湍纲|(zhì)粒中存在的trpl基因。參見迪斯查普(Tschumper)等人，基因(GENE)(1980)10:157；金戈斯曼41(Kingsman)等人，基因(1979)7:141。trpl基因可為不能在色氨酸中生長(zhǎng)的酵母突變株提供選擇標(biāo)記物。類似地，Leu2缺陷型酵母菌株(ATCC20，622或38，626)是由帶有Leu2基因的已知質(zhì)粒補(bǔ)充。所屬領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知將外源DNA引入酵母宿主中的方法，這些方法通常包括(但不限于)轉(zhuǎn)化原生質(zhì)球狀體或轉(zhuǎn)化經(jīng)堿金屬陽離子處理的完整酵母宿主細(xì)胞。舉例來說，可根據(jù)蕭(Hsiao)等人，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊(PROC.NATL.ACAD.SCI.USA)(1979)7638和范索里格(VanSolingen)等人，應(yīng)用細(xì)菌學(xué)雜志(J.BACT.)(1977)130:946中所述的方法來轉(zhuǎn)化酵母。然而，也可如薩姆布魯克(SAMBR00K)等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(cè)(MOLECULARCLONING=ALAB.MANUAL)(2001)中一般性描述，使用其它方法將DNA引入細(xì)胞中，例如核注射法、電穿孔法或原生質(zhì)體融合法。隨后，可使用所屬領(lǐng)域技術(shù)人員已知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)來培養(yǎng)酵母宿主細(xì)胞。所屬領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知在酵母宿主細(xì)胞中表達(dá)異源蛋白的其它方法。一般參見美國(guó)專利公開案第20020055169號(hào)；美國(guó)專利第6，361，969號(hào)、第6，312，923號(hào)、第6，183，985號(hào)、第6，083，723號(hào)、第6，017，731號(hào)、第5，674，706號(hào)、第5，629，203號(hào)、第5，602，034號(hào)和第5，089，398號(hào)；美國(guó)復(fù)審專利第RE37,343號(hào)和第RE35,749號(hào)；PCT公開專利申請(qǐng)案WO99/07862,WO98/37208和WO98/26080；歐洲專利申請(qǐng)案EP0946736,EP0732403、EP0480480、WO90/10277、EP0340986、EP0329203、EP0324274和EP0164556中。還參見格里森(Gellissen)等人，列文虎克(ΑΝΤ0ΝΙΕVANLEEUWENH0EK)(1992)62(1-2):79-93；羅曼諾斯(Romanos)等人，酵母(YEAST)(1992)8(6):423-488；格利德爾(Goeddel)，酶學(xué)方法(METHODSINENZYM0L0GY)(1990)185:3_7，各自以引用的方式并入本文中。在使用所屬領(lǐng)域技術(shù)人員已知的標(biāo)準(zhǔn)分批進(jìn)料發(fā)酵方法的擴(kuò)增階段期間，酵母宿主菌株可在發(fā)酵罐中生長(zhǎng)。發(fā)酵方法可適合用于解釋特定酵母宿主的碳利用路徑或表達(dá)控制模式的差異。舉例來說，酵母菌酵母宿主的發(fā)酵可能需要單一葡萄糖進(jìn)料、復(fù)合氮源(例如，酪蛋白水解產(chǎn)物)和多種維生素補(bǔ)充。相比之下，甲基營(yíng)養(yǎng)型酵母巴斯德畢赤酵母可能需要甘油、甲醇和微量礦物進(jìn)料，而只需要簡(jiǎn)單銨(氮)鹽以達(dá)最佳生長(zhǎng)和表達(dá)。參見例如美國(guó)專利第5，324，639號(hào)；埃利奧特(Elliott)等人，蛋白質(zhì)化學(xué)雜志(J.PROTEINCHEM.)(1990)9:95；和菲斯查克(Fieschko)等人，生物技術(shù)與生物工程(BIOTECH.BI0ENG.)(1987)29:1113,以引用的方式并入本文中。然而，這些發(fā)酵方法可能具有某些與所用酵母宿主菌株無關(guān)的常見特征。舉例來說，在擴(kuò)增期間，可將限制生長(zhǎng)的養(yǎng)分(通常為碳)添加到發(fā)酵罐中以允許最大生長(zhǎng)。另外，發(fā)酵方法一般使用的發(fā)酵培養(yǎng)基是設(shè)計(jì)成含有足量碳、氮、基本鹽、磷和其它微量養(yǎng)分(維生素、微量礦物和鹽等)。適用于畢赤酵母的發(fā)酵培養(yǎng)基的實(shí)例描述于美國(guó)專利第5，324，639號(hào)和第5，231，178號(hào)中，其以引用的方式并入本文中。感染桿狀病毒的昆蟲細(xì)胞術(shù)語“昆蟲宿主”或“昆蟲宿主細(xì)胞”是指可用作或已用作重組載體或其它轉(zhuǎn)移DNA的受體的昆蟲。這一術(shù)語包括經(jīng)過轉(zhuǎn)染的原始昆蟲宿主細(xì)胞的后代。應(yīng)了解，由于意外或故意突變，單一母體細(xì)胞后代在形態(tài)學(xué)或基因組或總DNA補(bǔ)體上與原始母體可能未必完全相同。在此定義所指的后代中包括與欲借助相關(guān)特性(例如存在編碼相關(guān)多肽的核苷酸序列)表征的母體足夠類似的母體細(xì)胞后代。所屬領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知適用于表達(dá)相關(guān)多肽的昆蟲細(xì)胞的選擇。此項(xiàng)技術(shù)中充分描述了數(shù)種昆蟲種類，并且可在市面上購得，包括埃及伊蚊(Aedesaegypti),(Bombyxmori)>HIl^M(Drosophilamelanogaster)>^^(Spodopterafrugiperda)和粉紋夜蛾(Trichoplusiani)。在選擇供表達(dá)的昆蟲宿主時(shí)，合適的宿主可包括顯示(尤其)良好分泌能力、低蛋白水解活性和總體穩(wěn)固性的宿主。昆蟲一般可從多種來源獲得，包括(但不限于)加利福尼亞大學(xué)生物物理和醫(yī)學(xué)物理系昆蟲基因保藏中心(力口禾1J福尼亞州伯克禾1J)(InsectGeneticStockCenter,DepartmentofBiophysicsandMedicalPhysics,UniversityofCalifornia(Berkeley,CA))；和美國(guó)典型菌種保藏中心(“ATCC”)(北弗吉尼亞州馬納薩斯)(AmericanTypeCultureCollection("ATCC")(Manassas,VA))。一般說來，感染桿狀病毒的昆蟲表達(dá)系統(tǒng)的組件包括轉(zhuǎn)移載體，通常為細(xì)菌質(zhì)粒，其含有桿狀病毒基因組的片段和供插入欲表達(dá)的異源基因的適宜限制性位點(diǎn)；序列與轉(zhuǎn)移載體中的桿狀病毒特異性片段同源的野生型桿狀病毒(這使得異源基因能同源重組到桿狀病毒基因組中)；以及適當(dāng)昆蟲宿主細(xì)胞，和生長(zhǎng)培養(yǎng)基。此項(xiàng)技術(shù)中已知用于構(gòu)建載體、轉(zhuǎn)染細(xì)胞、挑選斑塊、使細(xì)胞在培養(yǎng)物中生長(zhǎng)等的材料、方法和技術(shù)，并且可以使用描述這些技術(shù)的手冊(cè)。在將異源基因插入轉(zhuǎn)移載體中后，將載體和野生型病毒基因組轉(zhuǎn)染到昆蟲宿主細(xì)胞中，在宿主細(xì)胞中，載體和病毒基因組重組。表達(dá)經(jīng)包裝的重組病毒，并且鑒別和純化重組體斑塊。用于桿狀病毒/昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)的材料和方法可以試劑盒形式購自例如英杰公司(InvitrogenCorp.)(加利福尼亞州卡爾斯巴德(Carlsbad,CA))。所屬領(lǐng)域技術(shù)人員一般已知這些技術(shù)，且其完整描述于薩姆斯(SUMMERS)和史密斯(SMITH)，德克薩斯農(nóng)業(yè)實(shí)驗(yàn)站會(huì)刊(TEXASAGRICULTURALEXPERIMENTSTATIONBULLETIN)第1555期(1987)中，此文獻(xiàn)以引用的方式并入本文中。還參見理查德森(RICHARDSON)，39分子生物學(xué)方法桿狀病毒表達(dá)技術(shù)(METHODSINMOLECULARBIOLOGY:BACULOVIRUSEXPRESSIONPROTOCOLS)(1995)；奧斯貝爾(AUSUBEL)等人，現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)(CURRENTPROTOCOLSINMOLECULARBIOLOGY)16.9-16.11(1994)；金(KING)和普斯伊(POSSEE)，桿狀病毒系統(tǒng)實(shí)驗(yàn)指南(THEBACULOVIRUSSYSTEM:ALABORATORYGUIDE)(1992)；和奧雷利(0'REILLY)等人，桿狀病毒表達(dá)載體實(shí)驗(yàn)手冊(cè)(BACULOVIRUSEXPRESSIONVECTORS:ALABORATORYMANUAL)(1992)。事實(shí)上，所屬領(lǐng)域中眾所周知使用桿狀病毒/昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)來制備各種異源蛋白質(zhì)的方法。例如參見，美國(guó)專利第6，368，825號(hào)；第6，342，216號(hào)；第6，338，846號(hào)；第6，261，805號(hào)；第6，245，528號(hào)；第6，225，060號(hào)；第6，183，987號(hào)；第6，168，932號(hào)；第6，126，944號(hào)；第6，096，304號(hào)；第6，013，433號(hào)；第5，965，393號(hào)；第5，939，285號(hào)；第5，891，676號(hào)；第5，871，986號(hào)；第5，861，279號(hào)；第5，858，368號(hào)；第5，843，733號(hào)；第5，762，939號(hào)；第5，753，220號(hào)；第5，605，827號(hào)；第5，583，023號(hào)；第5，571，709號(hào)；第5，516，657號(hào)；第5，290,686號(hào)；WO02/06305；WO01/90390；WO01/27301；WO01/05956；WO00/55345；WO00/20032；WO99/51721；WO99/45130；WO99/31257；WO99/10515；WO99/09193；WO97/26332；WO96/29400；WO96/25496；WO96/06161；WO95/20672；WO93/03173；WO92/16619；WO92/02628；WO92/01801；WO90/14428；WO90/10078；WO90/02566；WO90/02186；WO90/01556；WO89/01038；WO89/01037；WO88/07082，其以引用的方式并入本文中。此項(xiàng)技術(shù)中已知可用于桿狀病毒/昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)中的載體且其包括例如從桿狀病毒苜蓿銀紋夜蛾(Autographacalifornica)核型多角體病毒(AcNPV)獲得的昆蟲表達(dá)和轉(zhuǎn)移載體，這是一種不依賴于輔助細(xì)胞的病毒表達(dá)載體。來源于此系統(tǒng)的病毒表達(dá)載體通常使用強(qiáng)病毒多角體蛋白基因啟動(dòng)子來驅(qū)動(dòng)異源基因的表達(dá)。一般參見奧雷利(0'Reilly)等人，桿狀病毒表達(dá)載體實(shí)驗(yàn)手冊(cè)(BACULOVIRUSEXPRESSIONVECTORS=ALABORATORYMANUAL)(1992)。在將外來基因插入桿狀病毒基因組中之前，通常將包含啟動(dòng)子、前導(dǎo)序列(必要時(shí))、相關(guān)編碼序列和轉(zhuǎn)錄終止序列的上述組件組裝到中間錯(cuò)位構(gòu)建體(intermediatetransplacementconstruct)(轉(zhuǎn)移載體)中。中間錯(cuò)位構(gòu)建體通常保持在能夠穩(wěn)定保持在宿主(例如細(xì)菌)中的復(fù)制子(例如染色體外元件，例如質(zhì)粒)中。復(fù)制子將具有復(fù)制系統(tǒng)，由此使其能保持在適于克隆和擴(kuò)增的宿主中。更具體來說，質(zhì)?？珊卸嘟求w蛋白多聚腺苷酸化信號(hào)(米勒(Miller)，微生物學(xué)年鑒(ANN.REV.MICROBIOL.)(1988)42:177)和用于在大腸桿菌中選擇和繁殖的原核氨芐青霉素抗性(amp)基因和復(fù)制起點(diǎn)。一種將外來基因引入AcNPV中的常用轉(zhuǎn)移載體為pAc373。也已經(jīng)設(shè)計(jì)出所屬領(lǐng)域技術(shù)人員已知的許多其它載體，包括例如PVL985，其中將多角體蛋白的起始密碼子由ATG變?yōu)锳TT，并將BamHI克隆位點(diǎn)引入ATT下游32個(gè)堿基對(duì)處。參見魯克諾(Luckow)和薩姆斯(Summers)，病毒學(xué)(VIROLOGY)170:31(1989)。其它市售載體包括例如PBlueBac4.5/V5-His、pBlueBacHis2、pMelBac、pBlueBac4.5(英杰公司(InvitrogenCorp.),力口利福尼亞州卡爾斯巴德(Carlsbad,CA))。在插入異源基因之后，將轉(zhuǎn)移載體和野生型桿狀病毒基因組共轉(zhuǎn)染到昆蟲細(xì)胞宿主中。此項(xiàng)技術(shù)中已知將異源DNA引入桿狀病毒中的所需位點(diǎn)中的方法。參見薩姆斯(SUMMERS)和史密斯(SMITH)，德克薩斯農(nóng)業(yè)實(shí)驗(yàn)站會(huì)刊(TEXASAGRICULTURALEXPERIMENTSTATIONBULLETIN)第1555期(1987)；史密斯(Smith)等人，分子細(xì)胞生物學(xué)(M0L.CELL.BIOL.)(1983)3:2156；魯克諾(Luckow)和薩姆斯(Summers),病毒學(xué)(VIROLOGY)(1989)17:31中。舉例來說，可通過同源雙交叉重組來插入例如多角體蛋白基因等基因中；也可插入所需桿狀病毒基因中經(jīng)工程改造的限制酶位點(diǎn)中。參見米勒(Miller)等人，生物學(xué)論文集(BI0ESSAYS)(1989)4:91?？衫秒姶┛追▉韺?shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)染。參見托特(TROTTER)和伍德(WOOD)，39分子生物學(xué)方法(METHODSINMOLECULARBIOLOGY)(1995)；曼恩(Mann)和金(King)，普通病毒學(xué)雜志(J.GEN.VIROL.)(1989)70:3501?；蛘?，可以使用脂質(zhì)體，利用重組表達(dá)載體和桿狀病毒轉(zhuǎn)染昆蟲細(xì)胞。例如參見，利伯曼(Liebman)等人，生物技術(shù)(BI0TECHNIQUES)(1999)26(1)36；格拉芙斯(Graves)等人，生物化學(xué)(BIOCHEMISTRY)(1998)37:6050；野村(Nomura)等人，生物化學(xué)雜志(J.BIOL.CHEM.)(1998)273(22):13570；斯奇米特(Schmidt)等人，蛋白質(zhì)表達(dá)和純化(PROTEINEXPRESSIONANDPURIFICATION)(1998)12323；西弗特(Siffert)等人，自然·遺傳(NATUREGENETICS)(1998)18:45；迪爾金斯(TILKINS)等人，細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)手冊(cè)(CELLBI0L0GY:ALABORATORYHANDBOOK)145-154(1998)；蔡(Cai)等人，蛋白質(zhì)表達(dá)和純化(PROTEINEXPRESSIONANDPURIFICATION)(1997)10:263；多夫林(Dolphin)等人，自然·遺傳(1997)17491；科斯特(Kost)等人，基因(GENE)(1997)190:139；杰克博森(Jakobsson)等人，生物化學(xué)雜志(1996)271:22203；洛韋思(Rowles)等人，生物化學(xué)雜志(1996)271(37):22376;雷沃瑞(Reverey)等人，生物化學(xué)雜志(1996)271(39)23607-10；斯坦利(Stanley)等人，生物化學(xué)雜志(1995)270:4121；西斯科(Sisk)等人，病毒學(xué)雜志(J.VIROL.)(1994)68(2):766；以及彭(Peng)等人，生物技術(shù)(BIOTECHNIQUES)(1993)14(2):2740市售脂質(zhì)體包括例如Cellfectim和Lipofectin(英杰公司(InvitrogenCorp.)，加利福尼亞州卡爾斯巴德(Carlsbad,CA))。另外，也可使用磷酸鈣轉(zhuǎn)染。參見托特(TROTTER)和伍德(WOOD)，39分子生物學(xué)方法(METHODSINMOLECULARBIOLOGY)(1995)；凱特(Kitts),NAR(1990)18(19):5667；以及曼恩(Mann)和金(King)，普通病毒學(xué)雜志(J.GEN.VIROL.)(1989)70:3501。桿狀病毒表達(dá)載體通常含有桿狀病毒啟動(dòng)子。桿狀病毒啟動(dòng)子是能夠結(jié)合桿狀病毒RNA聚合酶并起始編碼序列(例如結(jié)構(gòu)基因)下游(3‘)轉(zhuǎn)錄成mRNA的任何DNA序列。啟動(dòng)子將具有轉(zhuǎn)錄起始區(qū)，其通常接近編碼序列的5'端。此轉(zhuǎn)錄起始區(qū)通常包括RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)和轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)。桿狀病毒啟動(dòng)子也可具有稱作增強(qiáng)子的第二區(qū)域，當(dāng)存在時(shí)，其通常在結(jié)構(gòu)基因的末梢。此外，表達(dá)可為受調(diào)控或組成性的。在感染周期末期大量轉(zhuǎn)錄的結(jié)構(gòu)基因?qū)⑻峁┨貏e有用的啟動(dòng)子序列。實(shí)例包括來源于編碼病毒多面體蛋白的基因(弗雷森(FRIESEN)等人，桿狀病毒基因表達(dá)的調(diào)控(TheRegulationofBaculovirusGeneExpression),ff(THEMOLECULARBIOLOGYOFBACULOVIRUSES)(1986)；EPO127839和O155476)和編碼plO蛋白的基因(沃拉克(Vlak)等人，普通病毒學(xué)雜志(J.GEN.VIROL.)(1988)69:765)的序列。將新近形成的桿狀病毒表達(dá)載體包裝到感染性重組桿狀病毒中，隨后可利用所屬領(lǐng)域技術(shù)人員已知的技術(shù)來純化生長(zhǎng)的斑塊。參見米勒(Miller)等人，生物學(xué)論文集(BIOESSAYS)(1989)11(4)91；薩姆斯(SUMMERS)和史密斯(SMITH)，德克薩斯農(nóng)業(yè)實(shí)驗(yàn)站會(huì)刊(TEXASAGRICULTURALEXPERIMENTSTATIONBULLETIN)第1555期(1987)。已經(jīng)開發(fā)出了用于感染到數(shù)種昆蟲細(xì)胞中的重組桿狀病毒表達(dá)載體。舉例來說，已開發(fā)尤其用于埃及伊蚊(ATCC第CCL-125號(hào))、桑蠶(ATCC第CRL-8910號(hào))、黑腹果蠅(ATCC第1963號(hào))、草地貪夜蛾和粉紋夜蛾的重組桿狀病毒。參見懷特(Wright)，自然(NATURE)(1986)321:718；卡博耐爾(Carbonell)等人，病毒學(xué)雜志(J.VIROL.)(1985)56153；史密斯(Smith)等人，分子細(xì)胞生物學(xué)(MOL.CELL.BIOL.)(1983)3:2156。一般參見弗雷瑟(Fraser)等人，體外細(xì)胞和發(fā)育生物學(xué)(INVITROCELL.DEV.BIOL.)(1989)25:225。更具體來說，用于桿狀病毒表達(dá)載體系統(tǒng)的細(xì)胞系通常包括(但不限于)Sf9(草地貪夜蛾)(ATCC第CRL-1711號(hào))、Sf21(草地貪夜蛾)(InvitrogenCorp.，目錄號(hào)11497-013(Carlsbad,CA))、Tri-368(粉紋夜蛾)和High-FiveBTI-TN-5B1-4(粉紋夜蛾)?？稍谑忻嫔腺彽糜糜谠跅U狀病毒表達(dá)載體中直接和融合表達(dá)異源多肽的細(xì)胞和培養(yǎng)基，且所屬領(lǐng)域技術(shù)人員一般已知細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)。大腸桿菌、假單胞菌屬和其它原核牛物此項(xiàng)技術(shù)中已知細(xì)菌表達(dá)技術(shù)。有多種載體可用于細(xì)菌宿主中。這些載體可以是單拷貝或者低或高多拷貝載體。載體可用于克隆和/或表達(dá)。鑒于存在豐富的有關(guān)載體的文獻(xiàn)、許多載體在市面上有售以及甚至存在描述載體和其限制性圖譜及特征的手冊(cè)，故無需在這里深入討論。眾所周知，載體通常涉及允許選擇的標(biāo)記物，這些標(biāo)記物可提供細(xì)胞毒性劑抗性、原營(yíng)養(yǎng)或免疫性。常常會(huì)存在多個(gè)標(biāo)記物，其提供不同的特征。細(xì)菌啟動(dòng)子為能夠結(jié)合細(xì)菌RNA聚合酶且起始編碼序列(例如結(jié)構(gòu)基因)下游(3')轉(zhuǎn)錄成mRNA的任何DNA序列。啟動(dòng)子將具有轉(zhuǎn)錄起始區(qū)，其通常接近編碼序列的5'端。此轉(zhuǎn)錄起始區(qū)通常包括RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)和轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)。細(xì)菌啟動(dòng)子也可具有稱作操縱基因的第二區(qū)域，其可與開始RNA合成的相鄰RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)重疊。操縱基因允許負(fù)調(diào)控(誘導(dǎo)性)轉(zhuǎn)錄，這是因?yàn)榛蛞种频鞍卓山Y(jié)合操縱基因，并由此抑制特定基因的轉(zhuǎn)錄。在不存在負(fù)調(diào)控元件(例如操縱基因)的情況下，可發(fā)生組成性表達(dá)。另外，通過基因活化蛋白結(jié)合序列可實(shí)現(xiàn)正調(diào)控，當(dāng)存在這一序列時(shí)，其通常接近RNA聚合酶結(jié)合序列的(5')。基因活化蛋白的實(shí)例為代謝物活化蛋白(cataboliteactivatorprotein,CAP)，其有助于起始大腸桿菌中Iac操縱子的轉(zhuǎn)錄[雷波德(Raibaud)等人，遺傳學(xué)年鑒(ANNU.REV.GENET.)(1984)18:173]。因此，表達(dá)的調(diào)控可為正調(diào)控或負(fù)調(diào)控，由此增強(qiáng)或減弱轉(zhuǎn)錄。編碼代謝路徑酶的序列提供特別有用的啟動(dòng)子序列。實(shí)例包括來源于糖代謝酶(例如半乳糖、乳糖(Iac)[常(Chang)等人，自然(NATURE)(1977)198:1056]和麥芽糖)的啟動(dòng)子序列。其它實(shí)例包括來源于生物合成酶(例如色氨酸(trp))的啟動(dòng)子序列[古德爾(Goeddel)等人，核酸研究(Nuc.ACIDSRES.)(1980)8:4057；耶爾弗頓(Yelverton)等人，核酸研究(NUCL.ACIDSRES.)(1981)9:731；美國(guó)專利第4，738，921號(hào)；歐洲公開案第036776號(hào)和第121775號(hào)，其以引用的方式并入本文中]。β_半乳糖苷酶(bla)啟動(dòng)子系統(tǒng)[威瑟曼(Weissmann)(1981)“干擾素和其它錯(cuò)誤的克隆(Thecloningofinterferonandothermistakes.)”，干擾素(Interferon)3(I.格雷瑟(I.Gresser)編)]、噬菌體SPL[施馬塔克(Shimatake)等人，自然(NATURE)(1981)四2128]和T5[美國(guó)專利第4，689，406號(hào)，以引用的方式并入本文中]啟動(dòng)子系統(tǒng)也可提供有用的啟動(dòng)子序列?？梢允褂脧?qiáng)啟動(dòng)子(例如T7啟動(dòng)子)來誘導(dǎo)高水平的相關(guān)多肽。所屬領(lǐng)域技術(shù)人員已知這些載體的實(shí)例，且其包括來自諾杰公司(Novagen)的pED9系列，以及W099/05297(以引用的方式并入本文中)中所述的PPOP載體。這些表達(dá)系統(tǒng)在宿主中產(chǎn)生高水平多肽，同時(shí)不會(huì)損害宿主細(xì)胞生存能力或生長(zhǎng)參數(shù)。pET19(諾杰公司(Novagen))是此項(xiàng)技術(shù)中已知的另一載體。另外，自然界中不存在的合成啟動(dòng)子也可充當(dāng)細(xì)菌啟動(dòng)子。舉例來說，可將一個(gè)細(xì)菌或噬菌體啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活化序列與另一細(xì)菌或噬菌體啟動(dòng)子的操縱子序列連接，從而產(chǎn)生合成的雜合啟動(dòng)子[美國(guó)專利第4，551，433號(hào)，以引用的方式并入本文中]。舉例來說，tac啟動(dòng)子是由trp啟動(dòng)子與Iac操縱子序列構(gòu)成的雜合trp-lac啟動(dòng)子，其受Iac阻遏物調(diào)控[阿曼恩(Amann)等人，基因(GENE)(1983)25:167；德波爾(deBoer)等人，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊(PR0C.NATL.ACAD.SCI).(1983)80:21]。此外，細(xì)菌啟動(dòng)子可包括非細(xì)菌來源的天然存在啟動(dòng)子，其能夠與細(xì)菌RNA聚合酶結(jié)合并起始轉(zhuǎn)錄。也可將非細(xì)菌來源的天然存在啟動(dòng)子與相容性RNA聚合酶偶聯(lián)以便在原核生物中高水平表達(dá)一些基因。噬菌體T7RNA聚合酶/啟動(dòng)子系統(tǒng)為偶聯(lián)啟動(dòng)子系統(tǒng)的一個(gè)實(shí)例[斯蒂爾(Mudier)等人，分子生物學(xué)雜志(J.M0L.BIOL.)(1986)189:113；塔波(Tabor)等人，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊(ProcNatl.Acad.Sci.)(1985)82:1074]。另外，雜合啟動(dòng)子也可由噬菌體啟動(dòng)子和大腸桿菌操縱基因區(qū)組成(歐洲公開案第267851號(hào))。除功能性啟動(dòng)子序列之外，有效核糖體結(jié)合位點(diǎn)也可用于在原核生物中表達(dá)外來基因。在大腸桿菌中，核糖體結(jié)合位點(diǎn)稱作沙恩-達(dá)爾加諾(Shine-Dalgarno，SD)序列，且包括起始密碼子(ATG)和位于起始密碼子上游3-11個(gè)核苷酸處的3-9個(gè)核苷酸長(zhǎng)的序列[沙恩(Siine)等人，自然(NATURE)(1975)234]。據(jù)悉，SD序列通過SD序列與大腸桿菌16SrRNA的3'端之間的堿基配對(duì)來促進(jìn)mRNA與核糖體的結(jié)合[斯特茲(Steitz)等人，“信使RNA中的基因信號(hào)和核苷酸序列(GeneticsignalsandnucleotidesequencesinmessengerRNA)”，生物調(diào)控和發(fā)育基因表達(dá)(BiologicalRegulationandDevelopment=GeneExpression)(R.F.古德伯格(R.F.Goldberger)編，1979)]。為表達(dá)具有弱核糖體結(jié)合位點(diǎn)的真核基因和原核基因[薩姆布魯克(Sambrook)等人，“在大腸桿菌中表達(dá)克隆的基因(ExpressionofclonedgenesinEscherichiacoli)，，,分子克隆實(shí)驗(yàn)(MolecularCloning:ALaboratoryManual)，1989]。術(shù)語“細(xì)菌宿主”或“細(xì)菌宿主細(xì)胞”是指可用作或已用作重組載體或其它轉(zhuǎn)移DNA的受體的細(xì)菌。這一術(shù)語包括經(jīng)過轉(zhuǎn)染的原始細(xì)菌宿主細(xì)胞的后代。應(yīng)了解，由于意外或故意突變，單一母體細(xì)胞后代在形態(tài)學(xué)或基因組或總DNA補(bǔ)體上與原始母體可能未必完全相同。在此定義所指的后代中包括與欲借助相關(guān)特性(例如存在編碼相關(guān)多肽的核苷酸序列)表征的母體足夠類似的母體細(xì)胞后代。所屬領(lǐng)域技術(shù)人員已知適用于表達(dá)多肽的宿主細(xì)菌的選擇。在選擇供表達(dá)的細(xì)菌宿主時(shí)，合適宿主可包括顯示(尤其)具有良好包涵體形成能力、低蛋白水解活性和總體穩(wěn)固性的宿主。細(xì)菌宿主一般可從多種來源獲得，包括(但不限于)加利福尼亞大學(xué)生物物理和醫(yī)學(xué)物理系細(xì)菌基因保藏中心(加利福尼亞州伯克利)(BacterialGeneticStockCenter,DepartmentofBiophysicsandMedicalPhysics,UniversityofCalifornia(Berkeley,CA))和美國(guó)典型菌種保藏中心(“ATCC”)(北弗吉尼亞州馬納薩SjT)(AmericanTypeCultureCollection("ATCC")(Manassas,VA))。工業(yè)/醫(yī)藥發(fā)酵一般使用來源于K菌株(例如W3110)的細(xì)菌或來源于B菌株(例如BL21)的細(xì)菌。這些菌株因其生長(zhǎng)參數(shù)眾所周知且穩(wěn)定而特別有用。另外，這些菌株為非病原性的，而出于安全性和環(huán)境原因，其在商業(yè)上相當(dāng)重要。適當(dāng)大腸桿菌宿主的其它實(shí)例包括(但不限于)菌株BL21、DH10B或其衍生物。在本發(fā)明方法的另一個(gè)實(shí)施例中，大腸桿菌宿主為缺乏蛋白酶的菌株(proteaseminusstrain)，包括(但不限于)OMP-和L0N-。宿主細(xì)胞株可為假單胞菌屬細(xì)胞株，包括(但不限于)熒光假單胞菌、銅綠假單胞菌和惡臭假單胞菌。已知熒光假單胞菌生物型1(命名為菌株MB101)適用于重組制備，并且可用于治療性蛋白質(zhì)的制備工藝中。假單胞菌表達(dá)系統(tǒng)的實(shí)例包括從陶氏化學(xué)公司(DowChemicalCompany)得到的呈宿主菌株的系統(tǒng)(密歇根州米德蘭(Midland，MI)，可見于萬維網(wǎng)dow.com)0美國(guó)專利第4，755，465號(hào)和第4，859，600號(hào)(以引用的方式并入本文中)描述了假單胞菌菌株作為用于產(chǎn)生hGH的宿主細(xì)胞的用途。一旦建立了重組宿主細(xì)胞株(即，已將表達(dá)構(gòu)建體引入宿主細(xì)胞中，并分離出具有合適表達(dá)構(gòu)建體的宿主細(xì)胞)，就在適于產(chǎn)生相關(guān)多肽的條件下培養(yǎng)這一重組宿主細(xì)胞株。所屬領(lǐng)域技術(shù)人員將了解，培養(yǎng)重組宿主細(xì)胞株的方法將取決于所用表達(dá)構(gòu)建體的性質(zhì)和宿主細(xì)胞的身份。通常使用此項(xiàng)技術(shù)中眾所周知的方法來培養(yǎng)重組宿主菌株。重組47宿主細(xì)胞通常是在含有可吸收的(assimilatable)碳源、氮源和無機(jī)鹽源并任選含有維生素、氨基酸、生長(zhǎng)因子和所屬領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它蛋白質(zhì)培養(yǎng)補(bǔ)充物的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)。用于培養(yǎng)宿主細(xì)胞的液體培養(yǎng)基可任選含有抗生素或抗真菌劑以防止不需要的微生物和/或化合物生長(zhǎng)(包括(但不限于)用于選擇含有表達(dá)載體的宿主細(xì)胞的抗生素)。可使用將目標(biāo)核酸引入細(xì)胞中的數(shù)種眾所周知的方法，其中任一種都可用于本發(fā)明中。這些方法包括受體細(xì)胞與含有DNA的細(xì)菌原生質(zhì)體融合、電穿孔、基因槍法和經(jīng)病毒載體(在下文中進(jìn)一步論述)感染等。細(xì)菌細(xì)胞可用于擴(kuò)增含有本發(fā)明的DNA構(gòu)建體的質(zhì)粒的數(shù)目。使細(xì)菌生長(zhǎng)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期且可通過所屬領(lǐng)域中已知的多種方法分離細(xì)菌中的質(zhì)粒(例如參見薩姆布魯克(Sambrook))。另外，也可購買許多試劑盒來從細(xì)菌中純化質(zhì)粒(例如參見fesyft印TM、FlexiPi^p，都來自法瑪西亞生物技術(shù)公司(PharmaciaBiotech)；StrataClean，來自賽特杰公司(Stratagene)；和QIApr印，來自凱杰公司^liagen))。隨后進(jìn)一步操作經(jīng)分離和純化的質(zhì)粒以產(chǎn)生其它質(zhì)粒，來用于轉(zhuǎn)染細(xì)胞，或并入相關(guān)載體中以感染生物體。典型載體含有轉(zhuǎn)錄和翻譯終止子、轉(zhuǎn)錄和翻譯起始序列以及可用于調(diào)控特定目標(biāo)核酸表達(dá)的啟動(dòng)子。載體任選包含普通表達(dá)盒，其含有至少一個(gè)獨(dú)立的終止子序列、允許表達(dá)盒在真核細(xì)胞或原核細(xì)胞或兩者中復(fù)制的序列(包括(但不限于)穿梭載體)，以及用于原核系統(tǒng)與真核系統(tǒng)的選擇標(biāo)記物。載體適于在原核細(xì)胞、真核細(xì)胞或兩者中復(fù)制和整合。參見蓋里姆(Gillam)和史密斯(Smith)，基因(Gene)8=81(1979)；羅伯茨(Roberts)等人，自然(Nature.)328:731(1987)；斯奇尼德爾Ε.(Schneider,Ε.)等人，蛋白質(zhì)表達(dá)和純化(ProteinExpr.Purif.)6(1):10-14(1995)；奧斯貝爾(Ausubel)，薩姆布魯克(Sambrook)，伯格(Berger)(都同上文)。舉例來說，ATCC(例如由ATCC出版的細(xì)菌和0(TheATCCCatalogueofBacteriaandBacteriophage)(1992)納((iherna)等人(編))提供了可用于克隆的細(xì)菌和噬菌體的目錄。用于測(cè)序、克隆和分子生物學(xué)其它方面的其它基本程序以及基礎(chǔ)理論考慮也見于沃特森(Watson)等人(1992)重組DNA(RecombinantDNA)第2版，科學(xué)美國(guó)人(ScientificAmericanBooks)，紐約(NY)中。另外，基本上任何核酸(和幾乎任何帶標(biāo)記的核酸，無論標(biāo)準(zhǔn)或非標(biāo)準(zhǔn))都可從多種商業(yè)來源中的任一者定制或標(biāo)準(zhǔn)定購，這些商業(yè)來源例如米德蘭標(biāo)準(zhǔn)試劑公司(MidlandCertifiedReagentCompany)(德克薩斯州米德蘭(Midland，TX)，mere,com)、美國(guó)基因公司(TheGreatAmericanGeneCompany)(加利福尼亞州雷蒙鈉(Ramona，CA)，可在萬維網(wǎng)genco.com上獲得)、艾普斯基因公司(ExpressGenInc.)(伊利諾伊州芝加哥(Chicago,IL)，可在萬維網(wǎng)expressgen.com上獲得)、歐普隆技術(shù)公司(OperonTechnologiesInc.)(加利福尼亞州阿拉米達(dá)(Alameda，CA))和許多其它來源。重組宿主細(xì)胞可按分批或連續(xù)模式培養(yǎng)，其中細(xì)胞采集(在相關(guān)多肽于細(xì)胞內(nèi)積聚的情況下)或培養(yǎng)物上清液的采集為分批或連續(xù)模式。對(duì)于在原核宿主細(xì)胞中制備，優(yōu)選分批培養(yǎng)和細(xì)胞采集。選擇密碼子本發(fā)明的選擇密碼子可擴(kuò)充蛋白質(zhì)生物合成機(jī)器的遺傳密碼子框架。舉例來說，選擇密碼子包括例如獨(dú)特的三堿基密碼子；無義密碼子，例如終止密碼子，包括(但不限于)琥珀密碼子(UAG)、赭石密碼子或蛋白石密碼子(UGA)；非天然密碼子；四個(gè)或四個(gè)以上堿基的密碼子；稀有密碼子等。可將多個(gè)(例如一個(gè)或一個(gè)以上、兩個(gè)或兩個(gè)以上、三個(gè)48或三個(gè)以上等)選擇密碼子引入所需基因或多聚核苷酸中。本發(fā)明的選擇密碼子可擴(kuò)充蛋白質(zhì)生物合成機(jī)器的遺傳密碼子框架。舉例來說，選擇密碼子包括(但不限于)獨(dú)特的三堿基密碼子；無義密碼子，例如終止密碼子，包括(但不限于)琥珀密碼子(UAG)、赭石密碼子或蛋白石密碼子(UGA)；非天然密碼子；四個(gè)或四個(gè)以上堿基的密碼子；稀有密碼子等。所屬領(lǐng)域技術(shù)人員易于了解，可引入所需基因或多聚核苷酸中的選擇密碼子的數(shù)目范圍很廣，包括(但不限于)在編碼抗原或全生物體(如使用本發(fā)明的遺傳修飾全生物體的非限制性實(shí)例MAP和大腸桿菌)的單一多聚核苷酸中存在一個(gè)或一個(gè)以上、兩個(gè)或兩個(gè)以上、三個(gè)或三個(gè)以上、4個(gè)、5個(gè)、6個(gè)、7個(gè)、8個(gè)、9個(gè)、10個(gè)或10個(gè)以上。在一個(gè)實(shí)施例中，所述方法涉及使用作為終止密碼子的選擇密碼子，用于在體內(nèi)并入所選氨基酸，例如非天然氨基酸。舉例來說，產(chǎn)生識(shí)別終止密碼子的Ο-tRNA，并通過O-RS利用所選氨基酸將其氨?；?。天然存在的宿主氨酰基-tRNA合成酶不識(shí)別這一Ο-tRNA。可使用常規(guī)定點(diǎn)誘變將終止密碼子引入相關(guān)多肽中的相關(guān)位點(diǎn)。例如參見賽爾斯J.R.(Sayers,J.R.)等人，(1988)，用于基于硫代磷酸酯的寡聚核苷酸定向誘變中的5'-3‘夕卜切核酸醇(5‘-3‘Exonucleaseinphosphorothioate-basedoligonucleotide-directedmutaRenesis.)核酸石開究(NucleicAcidsRes)，16:791_802o當(dāng)例如在體內(nèi)組合0-RS、0-tRNA和編碼相關(guān)多肽的核酸時(shí)，對(duì)終止密碼子反應(yīng)而并入所選氨基酸，從而得到在特定位置含有所選氨基酸(例如非天然氨基酸)的多肽。在本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例中，用作選擇密碼子的終止密碼子是琥珀密碼子UAG和/或蛋白石密碼子UGA。舉例來說，有關(guān)識(shí)別琥珀密碼子的Ο-tRNA的實(shí)例，參見SEQIDNO.:6；且有關(guān)識(shí)別蛋白石密碼子的Ο-tRNA的實(shí)例，參見SEQIDN0.:7。將UAG和UGA都用作選擇密碼子的遺傳密碼可編碼22個(gè)氨基酸，同時(shí)保留赭石無義密碼子UAA，這是最豐富的終止信號(hào)。可在不顯著干擾宿主細(xì)胞的情況下在體內(nèi)并入所選氨基酸，例如非天然氨基酸。舉例來說，在非真核細(xì)胞(例如大腸桿菌)中，由于UAG密碼子的抑制效率取決于Ο-tRNA(例如，琥珀抑制性tRNA)與釋放因子I(RFl)(其與UAG密碼子結(jié)合并起始核糖體釋放生長(zhǎng)肽)之間的競(jìng)爭(zhēng)，故可例如通過增加0-tRNA(例如，抑制性tRNA)的表達(dá)水平，或使用RFl缺陷型細(xì)胞株來調(diào)節(jié)抑制效率。在真核細(xì)胞中，由于UAG密碼子的抑制效率取決于Ο-tRNA(例如，琥珀抑制性tRNA)與真核釋放因子(例如，eRF)(其與終止密碼子結(jié)合并起始核糖體釋放生長(zhǎng)肽)之間的競(jìng)爭(zhēng)，故可例如通過增加0-tRNA(例如，抑制性tRNA)的表達(dá)水平來調(diào)節(jié)抑制效率。也可用稀有密碼子編碼非天然氨基酸。舉例來說，當(dāng)降低體外蛋白質(zhì)合成反應(yīng)中的精氨酸濃度時(shí)，已證實(shí)，稀有精氨酸密碼子AGG可有效地利用經(jīng)丙氨酸?；暮铣蓆RNA插入Ala。例如參見馬(Ma)等人，生物化學(xué)(Biochemistry.)32:7939(1993)。在此情況下，合成tRNA將與作為大腸桿菌中的次要物質(zhì)存在的天然存在tRNAArg競(jìng)爭(zhēng)。一些生物體不使用所有三聯(lián)體密碼子。已經(jīng)利用藤黃微球菌(Micrococcusluteus)中的未指定密碼子AGA在體外轉(zhuǎn)錄/翻譯提取物中插入氨基酸。例如參見科瓦爾(Kowal)和奧利弗(Oliver)，核酸研究(Nucl.Acid.Res.)25:4685(1997)?？僧a(chǎn)生本發(fā)明的組分以在體內(nèi)使用這些稀有密碼子。選擇密碼子還包含延長(zhǎng)的密碼子，例如四個(gè)或四個(gè)以上堿基的密碼子，例如四個(gè)、五個(gè)、六個(gè)或六個(gè)以上堿基的密碼子。四堿基密碼子的實(shí)例包括(但不限于)AGGA、CUAG、UAGA、CCCU等。五堿基密碼子的實(shí)例包括(但不限于)AGGAC、CCCCU、CCCUC、CUAGA、CUACU、UAGGC等。一個(gè)特征可包括使用基于移碼抑制的延長(zhǎng)密碼子。四個(gè)或四個(gè)以上堿基的密碼子可將例如一個(gè)或多個(gè)所選氨基酸(包括(但不限于)非天然氨基酸)插入同一蛋白質(zhì)中。舉例來說，在突變?chǔ)?tRNA存在下，例如具有反密碼子環(huán)(例如，具有CU(X)nXXXAA序列，其中η=1)的特定移碼抑制性tRNA，四個(gè)或四個(gè)以上堿基的密碼子被讀成單一氨基酸。舉例來說，有關(guān)識(shí)別四堿基密碼子的Ο-tRNA，參見PCT/US0V22061的SEQIDNOs.6、12。在其它實(shí)施例中，反密碼子環(huán)可解碼例如至少一個(gè)四堿基密碼子、至少一個(gè)五堿基密碼子或至少一個(gè)六堿基密碼子或更多堿基的密碼子。由于存在256個(gè)可能的四堿基密碼子，故可在同一細(xì)胞中使用四個(gè)或四個(gè)以上堿基的密碼子編碼多個(gè)非天然氨基酸。參見安德森(Anderson)等人，^)02)探究密碼子和反密碼子尺寸的極限(ExploringtheLimitsofCodonandAnticodonSize),化學(xué)與生奪勿學(xué)(ChemistryandBiology.)9:237-M4;麥格賴瑞(Magliery)，(2001)擴(kuò)充遺傳密碼大腸桿菌中四堿基密碼子的有效抑制劑的選擇和利用文庫方法鑒別“移碼”四堿基密碼子(ExpandingtheGeneticCodeSelectionofEfficientSuppressorsofFour-baseCodonsandIdentificationof"Shifty"Four-baseCodonswithaLibraryApproachinEscherichiacoli.)分子牛物學(xué)雜志(.LMol.Biol.)307:755_769。舉例來說，已使用四堿基密碼子，使用體外生物合成方法將非天然氨基酸并入蛋白質(zhì)中。例如參見馬(Ma)等人，(1993)牛物化學(xué)(Biochemistry),32:7939；和陽司(Hohsaka)等人，(1999)美國(guó)化學(xué)協(xié)會(huì)雜志(J.Am.Chem.Soc)，121:34。曾使用CGGG和AGGU，在體外利用兩個(gè)以化學(xué)方式?；囊拼a抑制性tRNA將2-萘基丙氨酸和賴氨酸的NBD衍生物同時(shí)并入抗生物素蛋白鏈菌素(streptavidin)中。例如參見陽司(Hohsaka)等人，(1999)美國(guó)化學(xué)協(xié)會(huì)雜志(J.Am.Chem.Soc)，121:12194。在體內(nèi)研究中，莫爾(Moore)等人檢查了具有NCUA反密碼子的tRNALeu衍生物抑制UAGN密碼子(N可為U、A、G或C)的能力，并且發(fā)現(xiàn)四聯(lián)體UAGA可以由具有UCUA反密碼子的tRNALeu以13%到沈%的效率解碼，其中在O或-1框內(nèi)極少解碼。參見莫爾(Moore)等人，(2000)分子生物學(xué)雜志(J.Mol.Biol.),298:195。在一個(gè)實(shí)施例中，可將基于稀有密碼子或無義密碼子的延長(zhǎng)密碼子用于本發(fā)明中，這樣可減少錯(cuò)義通讀(missensereadthrough)和其它不想要位點(diǎn)的移碼抑制。對(duì)于給定系統(tǒng)，選擇密碼子也可包括天然三堿基密碼子中的一種，其中內(nèi)源系統(tǒng)不使用(或很少使用)天然堿基密碼子。舉例來說，這包括缺乏識(shí)別天然三堿基密碼子的tRNA的系統(tǒng)和/或三堿基密碼子為稀有密碼子的系統(tǒng)。選擇密碼子任選包括非天然堿基對(duì)。這些非天然堿基對(duì)可進(jìn)一步擴(kuò)充現(xiàn)有的遺傳密碼。一個(gè)額外的堿基對(duì)使三聯(lián)體密碼子的數(shù)量從64增加到125。第三堿基對(duì)的特性包括穩(wěn)定且具選擇性的堿基配對(duì)、利用聚合酶以高保真度有效酶促并入DNA中，以及在合成新的非天然堿基對(duì)之后有效的持續(xù)引物延伸?？山?jīng)修改而適用于諸方法和諸組合物的非天然堿基對(duì)的描述包括例如海奧(Hirao)等人，(2002)用于將氨基酸類似物并入蛋白中的非^^^(Anunnaturalbasepairforincorporatingaminoacidanaloguesintoprotein),自然生物技術(shù)(NatureBiotechnology)，20:177-182。也參見吳Y.(ffu,Y.)等人(2002)美國(guó)化學(xué)協(xié)會(huì)雜志(J.Am.Chem.Soc.)12414626-14630。其它相關(guān)出版物列于下文中。對(duì)于體內(nèi)使用，非天然核苷可透過膜，并且經(jīng)磷酸化形成相應(yīng)的三磷酸酯。此外，增加的遺傳信息也很穩(wěn)定，不會(huì)被細(xì)胞酶破壞。本納(Bermer)和其它人先前的嘗試?yán)昧瞬煌跇?biāo)準(zhǔn)沃特森-克里克(Watson-Crick)對(duì)的氫鍵模式，其中最值得關(guān)注的實(shí)例為iso-C:iso-G對(duì)。例如參見斯維澤(Switzer)等人，(1989)美國(guó)化學(xué)協(xié)會(huì)雜志(T.Am.Chem.Soc.),1118322；和皮克瑞利(Piccirilli)等人，(1990)自然(Nature),34333庫爾(Kool)，(2000)現(xiàn)代化學(xué)牛物學(xué)觀點(diǎn)(Curr.Opin.Chem.Biol.),4:602。一般說來，這些堿基在某種程度上與天然堿基錯(cuò)配，并且無法酶促復(fù)制。庫爾(Kool)和同事證實(shí)，堿基之間的疏水堆積相互作用可替代氫鍵來驅(qū)動(dòng)堿基對(duì)的形成。參見庫爾(Kool)，(2000)現(xiàn)代化學(xué)牛物學(xué)觀點(diǎn)(Curr.Opin.Chem.Biol),4:602；和庫克安(Guckian)及庫爾，(1998)德國(guó)應(yīng)用化學(xué)雜志(英文版)(Angew.Chem.Int.Ed.Engl.)，36,2825。在致力于開發(fā)滿足所有上述需求的非天然堿基對(duì)的過程中，查魯茲(Schultz)、羅姆斯伯格(Romesberg)和同事已經(jīng)系統(tǒng)地合成和研究了一系列非天然疏水性堿基。發(fā)現(xiàn)PICS:PICS自身對(duì)比天然堿基對(duì)穩(wěn)定，并且能夠利用大腸桿菌DNA聚合酶I的克列諾(Klenow)片段(KF)有效地并入DNA中。例如參見麥克米恩(McMirm)等人，(1999)美國(guó)化學(xué)協(xié)會(huì)雜志(T.Am.Chem.Soc.),12111585-6；以及小川(Ogawa)等人，(2000)美國(guó)化學(xué)協(xié)會(huì)雜志，122:3274。3麗:3麗自身對(duì)可通過KF以足以獲得生物功能的效率和選擇性合成。例如參見小川等人，(2000)美國(guó)化學(xué)協(xié)會(huì)雜志(.LAm.Chem.Soc.),122:8803。然而，這兩種堿基都充當(dāng)進(jìn)一步復(fù)制的鏈終止子。近來已開發(fā)出可用于復(fù)制PICS自身對(duì)的突變DNA聚合酶。此外，還可復(fù)制7AI自身對(duì)。例如參見泰厄CTae)等人，(2001)美國(guó)化學(xué)協(xié)會(huì)雜志(J.Am.Chem.Soc.)，123:7439。也已開發(fā)出新穎的金屬堿基對(duì)Dipic:Py，其在結(jié)合Cu(II)后形成穩(wěn)定對(duì)。參見麥格斯(Meggers)等人，(2000)美國(guó)化學(xué)協(xié)會(huì)雜志(J.Am.Chem.Soc)，12210714。由于延長(zhǎng)密碼子和非天然密碼子固有地與天然密碼子正交，故本發(fā)明方法可利用這一特性產(chǎn)生其正交tRNA。翻譯旁路系統(tǒng)(translationalbypassingsystem)也可用于在所需多肽中并入所選氨基酸，例如非天然氨基酸。在翻譯旁路系統(tǒng)中，將大序列插入基因中，但并不翻譯成蛋白質(zhì)。所述序列含有的結(jié)構(gòu)可充當(dāng)誘導(dǎo)核糖體越過所述序列并繼續(xù)在插入序列下游翻譯的提示(cue)。所選和非天然氨基酸本文中使用的所選氨基酸是指任何所需的天然存在氨基酸或非天然氨基酸。天然存在氨基酸包括20種遺傳編碼的α-氨基酸中的任一種丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、組氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、色氨酸、酪氨酸、纈氨酸。在一個(gè)實(shí)施例中，將所選氨基酸以高保真度，例如以對(duì)指定選擇密碼子大于約70%的效率、對(duì)指定選擇密碼子大于75%的效率、對(duì)指定選擇密碼子大于約80%的效率、對(duì)指定選擇密碼子大于約85%的效率、對(duì)指定選擇密碼子大于約90%的效率、對(duì)指定選擇密碼子大于約95%的效率或?qū)χ付ㄟx擇密碼子大于約99%或更高的效率，并入正在生長(zhǎng)的多肽鏈中。本文中使用的非天然氨基酸是指不為硒代半胱氨酸和/或吡咯賴氨酸以及以下20種遺傳編碼的α-氨基酸的任何氨基酸、經(jīng)修飾氨基酸或氨基酸類似物丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、組氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、色氨酸、酪氨酸、纈氨酸。由式I說明α-氨基酸的一般結(jié)構(gòu)權(quán)利要求1.一禾中鳥分枝桿菌亞禾中畐丨J結(jié)核分枝桿菌(mycobacteriumaviumsubspeciesparatuberculosis,MAP)細(xì)胞，其特征在于，非天然氨基酸已經(jīng)并入必需基因產(chǎn)物的氨基酸序列中。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的MAP，其特征在于，所述非天然氨基酸是并入復(fù)制所需的MAP基因產(chǎn)物中。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的MAP，其特征在于，一個(gè)以上非天然氨基酸被并入一種以上必需基因產(chǎn)物中。4.一種大腸桿菌(E.coli)細(xì)胞，其特征在于，非天然氨基酸已經(jīng)并入必需基因產(chǎn)物中。5.一種細(xì)菌細(xì)胞，其特征在于，非天然氨基酸已經(jīng)并入必需基因產(chǎn)物中。6.一種細(xì)胞，其特征在于，非天然氨基酸已經(jīng)并入必需基因產(chǎn)物中。全文摘要本發(fā)明提供通過使用非天然或非天然編碼氨基酸制造疫苗的組合物和方法，包括提供全生物體疫苗的方法，所述全生物體疫苗具有有限的復(fù)制能力，由此增加疫苗的安全性和功效。文檔編號(hào)C12P21/00GK102224238SQ200980147222公開日2011年10月19日申請(qǐng)日期2009年9月28日優(yōu)先權(quán)日2008年9月26日發(fā)明者布萊德·黑利,田鋒申請(qǐng)人:Ambrx公司