專利名稱：含羧酸酯制劑中過水解酶的穩(wěn)定的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及酶法過酸合成以及原位酶催化領(lǐng)域。針對以下用途，能以足夠有效的濃度制備至少一種過氧羧酸表面消毒或衛(wèi)生處理、醫(yī)療器械滅菌、食品加工設(shè)備滅菌，以及適用于紡織物和衣物洗滌護(hù)理應(yīng)用如漂白、脫色、除臭、消毒或衛(wèi)生處理。
背景技術(shù)：
過酸組合物已報(bào)道是有效的抗微生物劑。已經(jīng)描述了清潔、滅菌、和/或消毒硬質(zhì)表面、肉產(chǎn)品、活植物組織、和醫(yī)療設(shè)備以杜絕有害微生物生長的方法(例如美國專利 6，545，047、美國專利6，183，807、美國專利6，518，307、美國專利5，683，724和美國專利申請公布2003/0026846)。也已報(bào)道過酸在制備用于衣物洗滌劑應(yīng)用的漂白組合物中是有用的(美國專利3，974，082、美國專利5，296，161和美國專利5，364，554)。過酸可以通過羧酸和過氧化氫的化學(xué)反應(yīng)進(jìn)行制備(參見Organic Peroxides, Daniel Swern，編輯，第 1 卷，第 313-516 頁；Wiley Interscience, New York, 1971) 此反應(yīng)通常由強(qiáng)無機(jī)酸如濃硫酸催化。過氧化氫與羧酸的反應(yīng)是平衡反應(yīng)，并且過酸的產(chǎn)生通過使用過量濃度的過氧化物和/或羧酸，或通過去除水而得到促進(jìn)?！┻^酸類消毒劑或漂白劑由過酸、過氧化氫和相應(yīng)羧酸的平衡混合物構(gòu)成。這些商業(yè)過酸清潔系統(tǒng)的一個(gè)缺點(diǎn)是隨時(shí)間推移，過酸在溶液中往往不穩(wěn)定。解決穩(wěn)定性問題的一種方法是在使用前將多種反應(yīng)組分混合在一起以生成過酸，而這些組分單獨(dú)放置時(shí)可長期穩(wěn)定。優(yōu)選地，各種反應(yīng)組分容易貯存、操作相對安全，并在混合后能夠快速地產(chǎn)生有效濃度的過酸。最近報(bào)道CE-7糖酯酶家族具有過水解酶活性。已證實(shí)，這些“過氧水解”酶與過氧源組合時(shí)，對于從多種羧酸酯底物制備過酸尤其有效(參見授予DiCosimo等人的 W02007/070609和美國專利申請公布2008/0176299以及2008/176783，；所述專利各自以引用方式全文并入本文)。已證實(shí)，糖酯酶CE-7家族的一些成員具有足夠的過水解活性，一旦將反應(yīng)組分混合后，能在1分鐘內(nèi)由一元醇、二醇和甘油的乙酰酯生成4000至5000ppm的過乙酸，并在5分鐘至30分鐘內(nèi)生成高達(dá)9000ppm的過乙酸(DiCosimo等人，美國專利申請公布 2009/0005590)。在授予DiCosimo等人的U. S. 2009/0005590中描述的酶法過酸生成系統(tǒng)通?；诙鄠€(gè)反應(yīng)組分的使用，這些反應(yīng)組分保持分開直至需要過酸溶液。使用該方法解決了與很多過酸類消毒劑和漂白劑貯存相關(guān)的過酸不穩(wěn)定性問題。然而，當(dāng)使用包含CE-7糖酯酶的多組分制劑時(shí)，可提供過水解活性長期穩(wěn)定性的特定制劑仍有待解決。當(dāng)貯存在log P值 (例如，物質(zhì)在辛醇和水之間分配系數(shù)的對數(shù)，其中P等于[溶質(zhì)]^l/[溶質(zhì)]小于2的有機(jī)液體或溶劑中時(shí)，尤為關(guān)注具有過水解活性的CE-7酶的長期貯存穩(wěn)定性。DiCosimo 等人以前描述的若干種有機(jī)酯底物的log P值小于2。無論是將酶直接懸浮在有機(jī)液體或溶劑中，還是使用可混溶的有機(jī)/水單相液體或溶劑時(shí)，有機(jī)液體或溶劑都會降低酶的活性。在兩篇已發(fā)表的文獻(xiàn)中綜述了有機(jī)溶劑對酶活性和結(jié)構(gòu)的影響，它們是(a) C. Laane等人，Biotechnol. Bioeng. 30 81-87 (1987) ； (b) Cowan, D. Α.禾口 Plant, A. ,"Biocatalysis in Organic Phase Systems.，，， "Biocatalysis at Extreme Temperatures，，第 7 章，Kelly, R. W. W.禾口 Adams, Μ·編輯， Amer. Chem. Soc. Symposium Series,Oxford University Press,New York,NY,第86-107頁 (199幻。上文Cowan和Plant指出(第87頁)行業(yè)內(nèi)一般認(rèn)為，在有機(jī)相體系中使用log PS 2的有機(jī)溶劑來穩(wěn)定胞內(nèi)酶幾乎沒有意義。log P介于2和4之間的有機(jī)溶劑可根據(jù)酶的穩(wěn)定性視情況使用，而那些log P > 4的有機(jī)溶劑一般可用于有機(jī)相體系。上文的Cowan和Plant還指出(第91頁)溶于單相有機(jī)-水溶劑中的酶的直接暴露影響取決于溶劑濃度、溶劑/酶表面基團(tuán)相互作用、以及溶劑/酶水化層相互作用。因?yàn)槿軇┑膌og P值必須足夠低，使得溶劑可完全與水相混溶以形成單相，因此，含有低log P值有機(jī)溶劑的單相有機(jī)-水溶劑通常會對酶的穩(wěn)定性產(chǎn)生負(fù)面影響(在低有機(jī)溶劑濃度應(yīng)用中除外)。據(jù)報(bào)道甘油三乙酸酯的log P值為0.25 (Y. Μ. Gunning等人，J. Agric. Food Chem. 48 :395-399 QOOO))，其類似于乙醇(log Ρ_0· 26)和異丙醇(log P 0. 15) (Cowan 和 Plant)；因此在甘油三乙酸酯中貯存酶粉預(yù)計(jì)會導(dǎo)致不可接受的酶活性喪失，使用log P <2的附加共溶劑也會一樣，這些共溶劑如環(huán)己酮，log P = 0.94 (Cowan和Plant) ； 1，2_丙二醇，log P =-1. 41 (Gunning 等人)；1，3_ 丙二醇，log P =-1. 3 (S_J. Kuo 等人，J. Am. Oil Chem. Soc. 73 :1427-1433(1996)) ；二乙二醇丁醚，log P = O. 56 (N. Funasaki 等人，J. Phys. Chem. 88 :5786-5790(1984))；三甘醇，log P = -1. 75 (L. Braeken 等人，ChemPhysChem 6 1606-1612(2005))。因此，待解決的問題是，使用過酸生成酶在用于過酸生產(chǎn)的有機(jī)酯底物中的混合物制成一種產(chǎn)品，其中所述酶即使貯存在含有羧酸酯底物的混合物中，仍保持顯著的過水解酶活性。發(fā)明概述所述問題已通過一種方法的發(fā)明解決，所述方法用于穩(wěn)定至少一種結(jié)構(gòu)上歸類為 CE-7酶并且當(dāng)在含羧酸酯的制劑中時(shí)具有過水解活性的酶的過水解活性。更具體地講，在包含羧酸酯和包含CE-7酶的酶粉的制劑中加入至少一種緩沖劑以及至少一種賦形劑可提高貯存在該制劑中的CE-7酶的過水解活性的穩(wěn)定性。在一個(gè)方面，提供了一種當(dāng)酶存在于包含所述酶和羧酸酯的制劑中時(shí)穩(wěn)定酶的過水解活性的方法，所述方法包括(a)提供一種含水制劑，所述含水制劑包含至少一種結(jié)構(gòu)上歸類為CE-7酶并具有過水解活性的酶、至少一種賦形劑，并任選地包含至少一種表面活性劑；(b)噴霧干燥(a)中的含水制劑以制備酶粉，所述酶粉包含所述至少一種酶、所述至少一種寡糖賦形劑，并任選地包含所述至少一種表面活性劑；并且(c)將(b)中的酶粉與至少一種緩沖劑和一種羧酸酯混合形成制劑，其中加入制劑的至少一種緩沖劑可提高所述至少一種酶在貯存在所述制劑中時(shí)的過水解活性穩(wěn)定性。
在另一方面，提供了一種在多組分過酸生成系統(tǒng)中用作第一組分的制劑，所述制劑包含以下物質(zhì)的混合物(a)至少一種羧酸酯，所述羧酸酯選自甘油一乙酸酯、甘油二乙酸酯、甘油三乙酸酯、甘油一丙酸酯、甘油二丙酸酯、甘油三丙酸酯、甘油一丁酸酯、甘油二丁酸酯、甘油三丁酸酯、以及它們的混合物；(b)酶粉，所述酶粉包含至少一種結(jié)構(gòu)上歸類為CE-7酶并具有過水解活性的酶、 至少一種賦形劑，并任選地包含至少一種表面活性劑組成的噴霧干燥制劑；以及(c)至少一種緩沖劑；其中所述至少一種緩沖劑提高了所述至少一種酶在存在于所述制劑中時(shí)的穩(wěn)定性。在又一個(gè)方面，提供了包含第一組分和第二組分的消毒系統(tǒng)，所述第一組分包含上述制劑而所述第二組分包含過氧源水溶液并任選地包含過氧化氫穩(wěn)定劑。在另一個(gè)方面，提供了酶促制備過氧羧酸的方法，所述方法包括(a)提供一組反應(yīng)組分，所述組分包含(1)上述制劑；和(2)過氧源水溶液；以及(b)混合所述反應(yīng)組分，從而制備過氧羧酸。在另一個(gè)方面，提供了使用酶促產(chǎn)生的過氧羧酸組合物對硬質(zhì)表面或無生命物體進(jìn)行消毒或衛(wèi)生處理的方法，所述方法包括(a)提供一組反應(yīng)組分，所述組分包含(1)上述制劑；和(2)過氧源水溶液；(b)混合所述反應(yīng)組分，從而制備過氧羧酸產(chǎn)物；(c)任選地稀釋所述過氧羧酸產(chǎn)物；以及(d)使所述硬質(zhì)表面或無生命物體與在步驟(b)或步驟(C)中產(chǎn)生的過氧羧酸接觸，從而將所述表面或所述無生命物體消毒。另一個(gè)方面是使用酶促產(chǎn)生的過氧羧酸組合物對衣物或紡織物進(jìn)行漂白、脫色、 除味、衛(wèi)生處理或消毒的方法，所述方法包括(a)提供一組反應(yīng)組分，所述組分包含(1)制劑，所述制劑包含⑴上述制劑；和(ii)羧酸酯；以及(2)過氧源；(b)在合適的含水反應(yīng)條件下混合所述反應(yīng)組分，從而形成過氧羧酸產(chǎn)物；(c)任選地稀釋所述過氧羧酸產(chǎn)物；以及(d)使所述衣物或紡織物與在步驟(b)或步驟(C)中產(chǎn)生的過氧羧酸接觸；其中所述衣物或紡織物經(jīng)過清洗、脫色、除臭、衛(wèi)生處理、消毒、或它們的組合。生物序列簡述下面的序列遵循37 C. F. R. § § 1. 821-1. 825( "Requirements for Patent Applications Containing Nucleotide Sequences and/or Amino Acid SequenceDisclosures-the Sequence Rules”)，并且符合世界知識產(chǎn)權(quán)組織(World Intellectual Property Organization, WIPO)標(biāo)準(zhǔn) ST. 25(1998)、歐洲專禾Ij 公約(European Patent Convention, EPC)序列表要求、專利合作條約(Patent Cooperation Treaty, PCT)細(xì)則 5· 2 和 49. 5(a-bis)、以及行政指令(Administrative Instructions)第 208 節(jié)和附錄 C。用于核苷酸和氨基酸序列數(shù)據(jù)的符號和格式遵循在37 C. F. R. § 1. 822中所列出的規(guī)定。SEQ ID NO :1 是枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)ATCC 31954 先鋒霉素 C 脫乙酰酶的推導(dǎo)氨基酸序列。SEQ ID NO 2是枯草芽孢桿菌(B. subtil is) ATCC 6633 先鋒霉素C脫乙酰酶的推導(dǎo)氨基酸序列。SEQ ID NO 3 是地衣芽孢桿菌(B. licheniformis) ATCC 14580 先鋒霉素 C 脫乙酰酶的推導(dǎo)氨基酸序列。SEQ ID NO :4是短小芽孢桿菌(B.pumilus)PS213乙酰木聚糖酯酶的推導(dǎo)氨基酸序列。SEQ ID NO :5 是熱纖梭菌(Clostridium thermocellum) ATCC 27405 乙酰木聚糖酯酶的推導(dǎo)氨基酸序列。SEQ ID NO :6是那不勒斯棲熱袍菌(Thermotoga neapolitana)乙酰木聚糖酯酶的推導(dǎo)氨基酸序列。SEQ ID NO :7是海棲熱袍菌(Thermotoga maritima)MSB8乙酰木聚糖酯酶的推導(dǎo)
氨基酸序列。SEQ ID NO :8 是熱厭氧桿菌屬(Thermoanaerobacterium sp.) Jff/SL YS485 乙酰木聚糖酯酶的推導(dǎo)氨基酸序列。SEQ ID NO 9是芽孢桿菌屬(Bacillus sp. )NRRL B-14911先鋒霉素C脫乙酰酶的推導(dǎo)氨基酸序列。應(yīng)當(dāng)指出的是，在GENBANK 登錄號ZP_01168674中報(bào)告的編碼芽孢桿菌屬NRRL B-14911先鋒霉素C脫乙酰酶的核酸序列似乎會編碼在N端增加的15個(gè)氨基酸，根據(jù)與其他先鋒霉素C脫乙酰酶的序列比對，以及根據(jù)報(bào)告長度(340個(gè)氨基酸)與其他CAH酶的觀測長度(通常為318至3 個(gè)氨基酸；參見代理人檔案號為CL4205 US NA、題目為 “ENZYMATIC PERACID PRODUCTION USING A C0S0LVENT” 的共同擁有、共同提交、共同未決的美國專利申請；其以引用方式并入本文)的比較，此核酸序列可能不正確。因此，本文報(bào)道的芽孢桿菌屬。NRRL B-14911先鋒霉素C脫乙酰酶的推導(dǎo)氨基酸序列與GENBANK 登錄號ZP_01168674下報(bào)道的不同，其不含N-端的15個(gè)氨基酸。SEQ ID NO 10是耐鹽嗜堿芽孢桿菌(Bacillus halodurans) C-125先鋒霉素C脫
乙酰酶的推導(dǎo)氨基酸序列。SEQ ID NO :11是克勞氏芽孢桿菌(Bacillus clausii)KSM-K16先鋒霉素C脫乙
酰酶的推導(dǎo)氨基酸序列。SEQ ID N0 12是枯草芽孢桿菌ATCC 四233 先鋒霉素C脫乙酰酶(CAH)的推導(dǎo)
氨基酸序列。SEQ ID NO 13 ^ Thermoanearobacterium saccharolyticum 5^11 C M^k 酶的推導(dǎo)氨基酸序列。SEQ ID NO 14是Thermotoga Iettingae乙酰木聚糖酯酶的推導(dǎo)氨基酸序列。
SEQ ID NO 15是Thermotoga petrophila乙酰木聚糖酯酶的推導(dǎo)氨基酸序列。SEQ ID NO 16是棲熱袍菌屬(Thermotoga sp. ) RQ2第一種乙酰木聚糖酯酶(本文稱為“RQ2 (a) ” )的推導(dǎo)氨基酸序列。SEQ ID NO 17是棲熱袍菌屬(Thermotoga sp. ) RQ2第二種乙酰木聚糖酯酶(本文稱為“RQ2 (b) ”)的推導(dǎo)氨基酸序列。SEQ ID NO 18是含SEQ ID NO :1的118至299位氨基酸殘基區(qū)域的氨基酸序列。SEQ ID NO 19是那不勒斯棲熱袍菌(Thermotoga neapolitana)乙酰木聚糖酯酶變體的推導(dǎo)氨基酸序列，其為共同擁有、共同提交、共同未決的美國專利申請代理人檔案號 CL4392 US NA (以引用方式全文并入本文)中所述序列的變體，其中在第277位的Xaa殘基SEQ ID NO 20是海棲熱袍菌(Thermotoga maritima)MSB8乙酰木聚糖酯酶變體的推導(dǎo)氨基酸序列，其為共同擁有、共同提交、共同未決的美國專利申請代理人檔案號CL4392 US NA中所述序列的變體，其中在第277位的Xaa殘基是Ala、Val、kr、或Thr。SEQ ID NO 21是Thermotoga Iettingae乙酰木聚糖酯酶變體的推導(dǎo)氨基酸序列， 其為共同擁有、共同提交、共同未決的美國專利申請代理人檔案號CL4392 US NA中所述序列的變體，其中在第277位的Xaa殘基是Ala、Val、kr、或Ilir。SEQ ID NO 22是Thermotoga petrophila乙酰木聚糖酯酶變體的推導(dǎo)氨基酸序列，其為共同擁有、共同提交、共同未決的美國專利申請代理人檔案號CL4392 US NA中所述序列的變體，其中在第277位的Xaa殘基是Ala、Val、kr、或Ilir。SEQ ID NO 是棲熱袍菌屬(Thermotoga sp. )RQ2乙酰木聚糖酯酶變體的推導(dǎo)氨基酸序列，其為衍生自共同擁有、共同提交、共同未決的美國專利申請代理人檔案號CL4392 US NA中"RQ2 (a)，，的變體，其中在第277位的Xaa殘基是Ala、Val、kr、或Thr。SEQ ID NO :24是棲熱袍菌屬(Thermotoga sp. )RQ2乙酰木聚糖酯酶變體的推導(dǎo)氨基酸序列，其為衍生自共同擁有、共同提交、共同未決的美國專利申請代理人檔案號CL4392 US NA中"RQ2 (b)，，的變體，其中在第278位的Xaa殘基是Ala、Val、kr、或Thr。SEQ ID NO :25 是熱厭氧桿菌屬(Thermoanaerobacterium sp. ) Jff/SL YS485 乙酰木聚糖酯酶的推導(dǎo)氨基酸序列。SEQ ID NO J6是卡那霉素鏈霉菌(Sti^ptomyces kanamyceticus)的卡那霉素抗性基因(kan)的編碼區(qū)。SEQ ID NO 27是含卡那霉素抗性基因的質(zhì)粒pKD13。SEQ ID NO :28是用于從質(zhì)粒pKD13克隆katG的正向引物。SEQ ID NO 29是用于從質(zhì)粒pKD13克隆katG的反向引物。SEQ ID NO 30 是使用 SEQ ID NO 28 和 SEQ ID NO 29 的引物從質(zhì)粒 pKD13 擴(kuò)增 katG得到的PCR產(chǎn)物。SEQ ID NO 31是過氧化氫酶-過氧化物酶基因(katG)的編碼區(qū)。SEQ ID NO 32是katG的推導(dǎo)氨基酸序列。SEQ ID NO 33是含有λ -Red重組酶基因的質(zhì)粒pKD46。SEQ ID NO :34是用于確認(rèn)katG中斷的正向引物。SEQ ID NO 35是用于確認(rèn)katG中斷的反向引物。
SEQ ID NO 36是含有FLP重組酶的溫敏質(zhì)粒pCP20。SEQ ID NO :37是用于從質(zhì)粒pKD13克隆katE的正向引物。SEQ ID NO 38是用于從質(zhì)粒pKD13克隆katE的反向引物。SEQ ID NO 39 是使用 SEQ ID NO 37 和 SEQ ID NO 38 的引物從質(zhì)粒 pKD13 擴(kuò)增 katE得到的PCR產(chǎn)物。SEQ ID NO :40是過氧化氫酶HPII基因(katE)的編碼區(qū)。SEQ ID NO 41是katE的推導(dǎo)氨基酸序列。SEQ ID NO 42是用于確認(rèn)katE中斷的正向引物。SEQ ID NO 43是用于確認(rèn)katE中斷的反向引物。SEQ ID NO :44是編碼那不勒斯棲熱袍菌乙酰木聚糖酯酶的基因的編碼區(qū)，如在 GENBANK (登錄號 AEOOO5I2)中報(bào)告。SEQ ID NO 45是用于擴(kuò)增那不勒斯棲熱袍菌乙酰木聚糖酯酶基因的正向引物。SEQ ID NO 46是用于擴(kuò)增那不勒斯棲熱袍菌乙酰木聚糖酯酶基因的反向引物。SEQ ID NO 47是使用SEQ ID NO 45和SEQ ID NO 46的引物擴(kuò)增乙酰木聚糖酯酶得到的PCR產(chǎn)物。SEQ ID NO 48是編碼海棲熱袍菌MSB8乙酰木聚糖酯酶的基因，如在GENBANK (登錄號ΝΡ_227893· 1)中報(bào)告。SEQ ID NO :49是用于擴(kuò)增海棲熱袍菌乙酰木聚糖酯酶基因的正向引物。SEQ ID NO 50是用于擴(kuò)增海棲熱袍菌乙酰木聚糖酯酶基因的反向引物。SEQ ID NO 51是使用SEQ ID NO 49和SEQ ID NO 50的引物擴(kuò)增乙酰木聚糖酯酶得到的PCR產(chǎn)物。發(fā)明詳述本文公開了一種用于穩(wěn)定含羧酸酯制劑中CE-7酯酶的過水解酶活性的方法，該方法采用的方式是將基本上不溶的緩沖劑加入CE-7酯酶和羧酸酯的制劑中。此外，本發(fā)明還提供了包含通過本文所述方法產(chǎn)生的過酸的消毒制劑。在本公開中，使用了大量的術(shù)語和縮寫。除非另外特別說明，將采用下述定義。如本文所用，在本發(fā)明的元件或組分之前的詞語“一個(gè)”、“一種”旨在表明元件或組分的實(shí)例(即出現(xiàn)的事物)數(shù)量為非限制性的。因此，應(yīng)將“一個(gè)”和“一種”理解為包括一個(gè)(種)或至少一個(gè)(種)，并且元件或組分的詞語單數(shù)形式也包括復(fù)數(shù)指代，除非有
數(shù)字明顯表示單數(shù)。如本文所用，術(shù)語“包含”意指如權(quán)利要求中提及的所述特征、整數(shù)、步驟、或組分的存在，但它不預(yù)先排除一種或多種其他特征、整數(shù)、步驟、組分或其組的存在或添加。術(shù)語 “包含”旨在包括由術(shù)語“基本上由...組成”和“由...組成”涵蓋的實(shí)施方案。類似地， 術(shù)語“基本上由...組成”旨在包括由術(shù)語“由...組成”涵蓋的實(shí)施方案。如本文所用，修飾成分或反應(yīng)物的量使用的術(shù)語“約”是指可以通過例如以下方式而發(fā)生的用數(shù)字表示的量的變化在真實(shí)世界中用于制備濃縮物或使用溶液的一般測量和液體處理操作；這些操作中非故意的誤差；用于制備組合物或執(zhí)行方法的成分的制造、來源或純度中的差異；等等。術(shù)語“約”還包括因特定起始混合物所產(chǎn)生的組合物的不同平衡條件而不同的量。無論是否通過術(shù)語“約”來修飾，權(quán)利要求都包括量的等同量。
當(dāng)存在時(shí)，所有的范圍都包括端值以及其中的組合。例如，當(dāng)列出范圍“1至5”時(shí)， 所列范圍應(yīng)視為包括范圍“1至4”、“1至3”、“1至2”、“1至2&4至5”、“1至；3&5”等等。如本文所用，術(shù)語“底物”、“合適的底物”、以及“羧酸酯底物”可互換地專指(a)具有以下結(jié)構(gòu)的一種或多種酯[XJmR5其中X 為式 Ii6C(O)O 的酯基；R6為任選地由羥基或Cl至C4烷氧基取代的Cl至C7直鏈、支鏈或環(huán)狀烴基部分， 其中&任選地包含一個(gè)或多個(gè)醚鍵，其中&為C2至C7 ；R5為任選地由羥基取代的Cl至C6直鏈、支鏈、或環(huán)狀烴基部分，其中&中的每個(gè)碳原子各自包含不超過一個(gè)羥基或不超過一個(gè)酯基，并且其中&任選地包含一個(gè)或多個(gè)醚鍵；m為1至&中的碳原子數(shù)，在25°C下，所述一種或多種酯在水中具有至少5ppm的溶解度；或者(b)具有以下結(jié)構(gòu)的一種或多種甘油酯
權(quán)利要求
1.當(dāng)酶存在于包含所述酶和羧酸酯的制劑中時(shí)穩(wěn)定所述酶的過水解活性的方法，所述方法包括(a)提供一種含水制劑，所述含水制劑包含至少一種結(jié)構(gòu)上歸類為CE-7酶并具有過水解活性的酶、至少一種賦形劑，并任選地包含至少一種表面活性劑；(b)噴霧干燥(a)中的含水制劑以制備酶粉，所述酶粉包含所述至少一種酶、所述至少一種賦形劑，并任選地包含所述至少一種表面活性劑；以及(c)將(b)中的所述酶粉與至少一種緩沖劑和一種羧酸酯混合以形成制劑，其中在所述制劑中加入所述至少一種緩沖劑提高了所述至少一種酶當(dāng)存在于所述制劑中時(shí)的過水解活性的穩(wěn)定性。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述至少一種賦形劑在所述酶粉的約95重量％至約25重量％范圍內(nèi)。
3.權(quán)利要求2的方法，其中所述至少一種賦形劑選自麥芽糖糊精、海藻糖、木聚糖、甘露聚糖、巖藻依聚糖、半乳甘露聚糖、脫乙酰殼多糖、棉子糖、水蘇糖、果膠、菊粉、果聚糖、支鏈型果聚糖、支鏈淀粉、以及它們的混合物。
4.權(quán)利要求3的方法，其中所述至少一種賦形劑為麥芽糖糊精。
5.權(quán)利要求3的方法，其中所述至少一種賦形劑為海藻糖。
6.權(quán)利要求1的方法，其中所述羧酸酯選自甘油一乙酸酯、甘油二乙酸酯、甘油三乙酸酯、甘油一丙酸酯、甘油二丙酸酯、甘油三丙酸酯、甘油一丁酸酯、甘油二丁酸酯、甘油三丁酸酯、以及它們的混合物。
7.權(quán)利要求6的方法，其中所述羧酸酯為甘油三乙酸酯。
8.權(quán)利要求1的方法，其中所述至少一種表面活性劑是存在的并且為聚山梨酸酯80。
9.權(quán)利要求2的方法，其中所述至少一種賦形劑為具有至少約1250的數(shù)均分子量和至少約9000的重均分子量的寡糖賦形劑。
10.權(quán)利要求9的方法，其中所述寡糖賦形劑具有至少約1700的數(shù)均分子量和至少約 15000的重均分子量。
11.權(quán)利要求1的方法，其中步驟(C)的所述制劑基本上不含水。
12.權(quán)利要求1至11中任一項(xiàng)的方法，其中所述至少一種緩沖劑為碳酸氫鈉、碳酸氫鉀、碳酸氫鈉和碳酸氫鉀的混合物、磷酸鈉、磷酸鉀、或磷酸鈉和磷酸鉀的混合物。
13.權(quán)利要求12的方法，其中所述至少一種緩沖劑在約5.5至約9. 5的pH范圍內(nèi)具有緩沖能力。
14.權(quán)利要求12的方法，其中(a)所述至少一種酶包含選自SEQ ID NO :6、SEQ ID NO :7、SEQ ID N0:19 禾口 SEQ ID NO :20的氨基酸序列，其中SEQ ID N0:19或SEQ ID NO :20氨基酸殘基277選自丙氨酸、纈氨酸、絲氨酸和蘇氨酸，并且(b)所述羧酸酯選自甘油二乙酸酯、甘油三乙酸酯、以及它們的混合物。
15.權(quán)利要求14的方法，其中所述至少一種賦形劑為麥芽糖糊精。
16.權(quán)利要求12的方法，其中(a)所述至少一種酶包含選自SEQID NO 6和SEQ ID NO 7的氨基酸序列；(b)所述至少一種賦形劑為麥芽糖糊精；(C)所述至少一種緩沖劑選自碳酸氫鈉、碳酸氫鉀、以及它們的混合物；并且 (d)所述羧酸酯為甘油三乙酸酯。
17.權(quán)利要求16的方法，其中所述至少一種緩沖劑為碳酸氫鈉。
18.在多組分過酸生成系統(tǒng)中用作第一組分的制劑，所述制劑包含以下物質(zhì)的混合物(a)至少一種羧酸酯，所述羧酸酯選自甘油一乙酸酯、甘油二乙酸酯、甘油三乙酸酯、甘油一丙酸酯、甘油二丙酸酯、甘油三丙酸酯、甘油一丁酸酯、甘油二丁酸酯、甘油三丁酸酯、 以及它們的混合物；(b)酶粉，所述酶粉包含至少一種結(jié)構(gòu)上歸類為CE-7酶并具有過水解活性的酶、至少一種賦形劑，并任選地包含至少一種表面活性劑；以及(c)至少一種緩沖劑；其中所述至少一種緩沖劑提高了所述至少一種酶當(dāng)存在于所述制劑中時(shí)的穩(wěn)定性。
19.權(quán)利要求18的制劑，其中所述至少一種賦形劑為具有至少約1250的數(shù)均分子量和至少約9000的重均分子量的寡糖賦形劑。
20.消毒系統(tǒng)，所述消毒系統(tǒng)包含第一組分和第二組分，所述第一組分包含權(quán)利要求 18或19的制劑，并且所述第二組分包含過氧源水溶液并任選地包含過氧化氫穩(wěn)定劑。
21.衣物洗滌護(hù)理制劑，所述制劑包含第一組分和第二組分，所述第一組分包含權(quán)利要求18或19的制劑，并且所述第二組分包含過氧化氫水溶液并任選地包含過氧化氫穩(wěn)定劑。
22.酶促制備過氧羧酸的方法，所述方法包括(a)提供一組反應(yīng)組分，所述組分包含(1)權(quán)利要求18或19的制劑；和(2)過氧源水溶液；以及(b)混合所述反應(yīng)組分，從而制備過氧羧酸。
23.權(quán)利要求22的方法，其中(a)所述至少一種酶包含選自SEQ ID NO :6、SEQ ID NO :7、SEQ ID N0:19 禾口 SEQ ID NO :20的氨基酸序列，其中SEQ ID NO: 19或SEQ ID NO :20的氨基酸殘基277選自丙氨酸、 纈氨酸、絲氨酸和蘇氨酸；(b)所述至少一種賦形劑為麥芽糖糊精；(c)所述至少一種緩沖劑選自碳酸氫鈉、碳酸氫鉀、碳酸氫鈉和碳酸氫鉀的混合物、磷酸鈉、磷酸鉀、以及磷酸鈉和磷酸鉀的混合物；(d)所述至少一種羧酸酯為甘油三乙酸酯；并且(e)制備的過氧羧酸為過乙酸。
24.使用酶促產(chǎn)生的過氧羧酸組合物對硬質(zhì)表面或無生命物體進(jìn)行消毒的方法，所述方法包括(a)提供一組反應(yīng)組分，所述組分包含(1)權(quán)利要求18的制劑；和(2)過氧源水溶液；(b)混合所述反應(yīng)組分，從而制備過氧羧酸產(chǎn)物；(c)任選地稀釋所述過氧羧酸產(chǎn)物；以及(d)使所述硬質(zhì)表面或無生命物體與在步驟(b)或步驟(C)中制備的過氧羧酸接觸，從而對所述表面或所述無生命物體消毒。
25.使用酶促產(chǎn)生的過氧羧酸組合物對衣物或紡織物進(jìn)行漂白、脫色、除臭、衛(wèi)生處理或消毒的方法，所述方法包括(a)提供一組反應(yīng)組分，所述組分包含 (1) 一種混合物，所述混合物包含(1)權(quán)利要求18的制劑；和 ( )羧酸酯；以及(2)過氧源；(b)在合適的含水反應(yīng)條件下混合所述反應(yīng)組分，從而形成過氧羧酸產(chǎn)物；(c)任選地稀釋所述過氧羧酸產(chǎn)物；以及(d)使所述衣物或紡織物與在步驟(b)或步驟(c)中制備的過氧羧酸接觸； 其中所述衣物或紡織物經(jīng)過清洗、脫色、除臭、衛(wèi)生處理、消毒、或它們的組合。
26.權(quán)利要求M或25的方法，其中(a)所述至少一種酶包含選自SEQ ID NO :6、SEQ ID NO :7、SEQ ID NO :19 禾口 SEQ ID NO :20的氨基酸序列，其中SEQ ID NO: 19或SEQ ID NO :20的氨基酸殘基277選自丙氨酸、 纈氨酸、絲氨酸和蘇氨酸；(b)所述至少一種賦形劑為麥芽糖糊精；(c)所述至少一種緩沖劑選自碳酸氫鈉、碳酸氫鉀、碳酸氫鈉和碳酸氫鉀的混合物、磷酸鈉、磷酸鉀、以及磷酸鈉和磷酸鉀的混合物；(d)所述至少一種羧酸酯為甘油三乙酸酯；并且(e)制備的過氧羧酸為過乙酸。
全文摘要
本文公開了一種用于穩(wěn)定含羧酸酯制劑中CE-7酯酶的過水解活性的方法，該方法采用的方式是將基本上不溶的緩沖劑加入CE-7酯酶和羧酸酯的混合物中。此外，本發(fā)明還提供了包含通過本文所述方法產(chǎn)生的過酸的消毒制劑和衣物洗滌護(hù)理制劑。
文檔編號C12N9/18GK102239264SQ200980148509
公開日2011年11月9日 申請日期2009年10月1日 優(yōu)先權(quán)日2008年10月3日
發(fā)明者A·本-巴薩, M·S·佩恩, R·R·佐蘭茲, R·迪科西莫 申請人:納幕爾杜邦公司