專利名稱：哺乳動物表達載體的制作方法
哺乳動物表達載體本發(fā)明描述用于整合進哺乳動物基因組的新的哺乳動物表達載體(含有或不含有目的基因，G0I)，所述載體包含新的調(diào)控元件組合。特別地，本發(fā)明描述了包含以下調(diào)控元件的表達載體猿猴病毒40增強子和早期啟動子區(qū)和Hbb內(nèi)含子II，或其片段、衍生物和修飾物，其中所述表達載體能夠接納至少一個目的基因并使其表達。優(yōu)選地，這樣的表達載體包含至少一個選擇標(biāo)記基因(例如，包括目的基因的PDGP，見

圖1 ；例如，不含目的基因的pDGP Δ G0I)。載體(不含目的基因)允許至少一個，優(yōu)選兩個或更多目的基因的摻入，其之后的表達和使用例如遺傳霉素(G418)和/或甲氨蝶呤(MTX)選擇轉(zhuǎn)染的細胞。作為根據(jù)本發(fā)明的哺乳動物表達載體的實例的pDGP AGOI載體顯示了 9555bp的序列，其一條鏈由 SEQ IDNO :2代表。作為根據(jù)本發(fā)明的哺乳動物表達載體的另一個示例，pDGP-AΔGOI載體顯示了 3830bp的序列，其一條鏈由SEQ ID NO 3代表。目前必須在大量細胞庫中進行多次連續(xù)選擇步驟以在細胞克隆以前生成和篩選高產(chǎn)細胞庫。因此培育細胞系是費時和費力的活動。有大量出版物論述了調(diào)控元件對表達水平的影響。早就知道位于GOI編碼序列中或緊接在GOI編碼序列之前的不同內(nèi)含子序列的正面作用并在許多出版物0，4，5，6)中描述。進行了致力于不同啟動子的轉(zhuǎn)錄效率的研究并將CMV啟動子鑒定為最有效的0，3，4，5，6)。因此，目前在大多數(shù)哺乳動物表達載體中的 GOI表達盒是由CMV啟動子驅(qū)動的并在GOI編碼序列緊接的上游具有內(nèi)含子序列。就特定表達載體中的GOI表達盒和選擇標(biāo)記基因的組合而言，已報導(dǎo)并在功能上檢驗了幾種組合(1)。對單克隆抗體(mAb)表達，描述了使用單獨表達輕鏈和重鏈的2種載體以及含有2種mAb鏈的表達盒和在同一質(zhì)粒上具有neo和dhfr表達盒的載體的解決方案⑴。在大多數(shù)情況下僅使用細胞內(nèi)報告蛋白例如熒光素酶(2，5，6)測定瞬時表達水平。通過此方法很難預(yù)測調(diào)控元件和/或載體在整合進染色體后將如何影響分泌蛋白質(zhì)的穩(wěn)定表達水平，其中最終表達水平是轉(zhuǎn)錄、翻譯、細胞內(nèi)運輸和分泌速度的復(fù)雜相互作用結(jié)果。盡管此問題對生物制藥工業(yè)是最重要的，其在文獻中很少涉及(3)。特別地，似乎從未討論過調(diào)控元件和選擇標(biāo)記的特定組合與開發(fā)細胞系所需的時間和細胞系的開發(fā)效率的相關(guān)性。因此，本發(fā)明的主要目的是尋找在上述參數(shù)時間和效率方面比本領(lǐng)域已知的調(diào)控元件和選擇標(biāo)記組合更好的組合。由此，本發(fā)明克服了上述不足并提供了用于整合進各個哺乳動物基因組中的哺乳動物表達載體(特別是分別顯示SEQ ID NO 2的序列的名為pDGPAGOI的和顯示SEQ ID NO 3的序列的名為pDGP-A Δ GOI的載體(如果缺乏目的基因)；和名為pDGP和pDGP_A的載體(如果包括目的基因)，見圖1和幻，其包含下列調(diào)控元件的新組合猿猴病毒40 (SV40) 增強子和早期啟動子區(qū)，Hbb內(nèi)含子II，或該內(nèi)含子的片段、衍生物和修飾物(其與文獻例如Xu等人( 中描述的嵌合內(nèi)含子不同，因此絕對不能與其混淆)，和任選地至少一種選擇標(biāo)記基因(例如neo，dhfr)。這些表達載體適于接納至少一個目的基因，并且如果接納了目的基因，能使其表達并之后能使用至少一種合適的選擇試劑(例如G418和/或MTX)選擇轉(zhuǎn)染的細胞。即使用G418的一步選擇可選擇以高量和以高度可重現(xiàn)方式表達由至少一種目的基因編碼的至少一種多肽的細胞，由此顯著減少開發(fā)細胞系的時間和工作量。作為邊注，應(yīng)當(dāng)考慮以下因素在現(xiàn)有技術(shù)中已知的在兩個或更多選擇步驟(其中之一通常為MTX選擇)后整合進基因組的表達載體通常產(chǎn)生含有幾個整合進其基因組的 GOI拷貝的細胞，因此以增加的速度表達G0I。完全相反地，本發(fā)明的表達載體不需要將其多個拷貝整合進基因組和/或兩輪或更多輪選擇步驟以使哺乳動物宿主細胞以增加的速度表達G0I。這是根據(jù)本發(fā)明的調(diào)控元件組合的直接結(jié)果并在于增加的表達速度而與整合進基因組的基因拷貝數(shù)無關(guān)。因此本發(fā)明的優(yōu)勢是無需進行分別使用G418和MTX的至少一步選擇步驟以獲得令人滿意的表達速度，但使用G418或MTX的僅一步選擇(例如示例性選擇系統(tǒng))就足夠。如本文使用的術(shù)語“Hbb內(nèi)含子II”涉及顯示人β-珠蛋白(tibb)基因的第二個內(nèi)含子(Hbb內(nèi)含子2、序列的任意核酸分子，其包括在所述IAb基因的Hbb內(nèi)含子2上游緊接的IObp序列和在IAb基因的Hbb內(nèi)含子2下游緊接的IObp序列。根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語 "Hbb內(nèi)含子II的片段、衍生物和修飾物”包括能夠在嚴格雜交條件下與Hbb內(nèi)含子II雜交并(當(dāng)與SV40增強子和早期啟動子區(qū)組合時)具有與SV 40增強子/啟動子組合中的 Hbb內(nèi)含子II相同的表達增強活性的核酸分子。特別地，術(shù)語“Hbb內(nèi)含子II的片段、衍生物和修飾物”包括與顯示SEQ ID NO :1序列的核酸分子鏈，或與互補物，或其片段在嚴格雜交條件下雜交的核酸分子，并且在相同的SV40增強子/啟動子組合中其具有與顯示SEQ ID NO :1序列的核酸分子相同的表達增強活性。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實施方案，Hbb內(nèi)含子 II顯示SEQ ID NO 1所示的序列。如何進行核酸分子的雜交實驗是本領(lǐng)域熟知的，即本領(lǐng)域技術(shù)人員知道依照本發(fā)明她/他必須使用什么雜交條件。這些雜交條件在標(biāo)準(zhǔn)教科書例如Molecular Cloning A Laboratory Manual(Sambrook J. , Russell D. W. ) Cold Spring Harbor Laboratory(2001) N. Y. , Current Protocols inMolecular Biology (編Ausubel F. Μ. , Brent R., Kingston R. Ε. , MooreD. D. ,Seidman J. G,Smith J. A. ,Struhl K.)[Core publication in 1987-quarterly updated] Copyright O 2007by John Wiley and Sons, Inc.中提及?！皣栏耠s交條件”指例如在包含50%甲酰胺，5x SSC(750mM NaCl，75mM檸檬酸鈉)， 50mM磷酸鈉(pH 7. 6)，5x Denhardt' s溶液，10%硫酸葡聚糖和20mg/ml變性的已剪切的鮭精DNA的溶液中于40-60°C孵育過夜，接著在0. Ix SSC中于約65°C洗滌濾器。也考慮在較低的嚴格度雜交條件下與顯示SEQ ID NO :1的序列的核酸分子，或其互補物，或其部分雜交的核酸分子。雜交嚴格度和信號檢測的變化主要通過操縱甲酰胺濃度(較低百分比的甲酰胺導(dǎo)致較低的嚴格度)；鹽濃度或溫度實現(xiàn)。例如，較低的嚴格度條件包括在包含6X SSPE(20X SSPE = 3M NaCl ；0. 2M NaH2PO4 ；0. 02M EDTA, pH 7. 4) ,0. 5% SDS，30% 甲酰胺， 100mg/ml變性的已剪切的鮭精DNA的溶液中于37°C過夜孵育；接著在IX SSPE，0. 1% SDS 中洗滌。此外，為了獲得甚至更低的嚴格度，在嚴格雜交后進行的洗滌可在較高鹽濃度(例如5X SSC)下進行。值得一提的是可通過包括和/或替換用于在雜交實驗中抑制背景的替代封閉試劑實現(xiàn)上述條件中的變化。一般的封閉試劑包括Denhardt' s試劑，BLOTTOJf 素，變性的鮭精DNA和市售的專賣制劑。由于相容性的問題，加入特定封閉試劑可能需要上述雜交條件的修飾。
因此，本發(fā)明的第一個方面包括提供用于整合進哺乳動物基因組的表達載體，所述表達載體包含以下調(diào)控元件猿猴病毒40(SV40)增強子和早期啟動子區(qū)和Hbb內(nèi)含子 II，或其片段、衍生物和修飾物，優(yōu)選地所述內(nèi)含子顯示SEQ ID NO :1的序列，其中所述表達載體能夠接納至少一個目的基因并使其表達。本發(fā)明的該方面的優(yōu)選實施方案為(i)本發(fā)明的第一個方面的載體，其中所述載體包含至少一個編碼真核和/或原核選擇標(biāo)記的基因，特別是來自Tn5的新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因(neo)和/或二氫葉酸還原酶(dhfr)基因；(ii)本發(fā)明的第一個方面的載體，其中所述載體為環(huán)形；(iii)本發(fā)明的第一個方面的載體，其中所述載體包含在所述調(diào)控元件控制下的至少一個目的基因；(iv)本發(fā)明的第一個方面的載體，其中至少一個目的基因為編碼免疫球蛋白輕鏈的基因和/或編碼免疫球蛋白重鏈的基因；(ν)本發(fā)明的第一個方面的載體，其中調(diào)控元件，目的基因和編碼選擇標(biāo)記的基因的順序如下5' -SV40增強子/早期啟動子區(qū)，Hbb內(nèi)含子II，或其片段、衍生物和修飾物， 編碼免疫球蛋白輕鏈的基因，SV40多聚腺苷酸化信號序列；SV40增強子/早期啟動子區(qū)， Hbb內(nèi)含子II，或其片段、衍生物和修飾物，編碼免疫球蛋白重鏈的基因，SV40多聚腺苷酸化信號序列；SV40增強子/早期啟動子區(qū)，Τη5新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因，合成的多聚腺苷酸化信號序列，不含增強子序列的SV40早期啟動子，二氫葉酸還原酶基因，SV40多聚腺苷酸化信號序列-3'；(vi)本發(fā)明的第一個方面的載體，其中所述載體包含至少一個原核選擇標(biāo)記基因，例如抗生素抗性基因例如氨芐青霉素抗性基因，和/或本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的可有利地包含在哺乳動物表達載體中的另外的調(diào)控元件；和(vii)本發(fā)明的第一個方面的載體，其中所述載體為顯示9555bp序列的 pDGP Δ GOI載體，其一條鏈由SEQ ID NO 2的序列代表。本發(fā)明的第二個方面為產(chǎn)生本發(fā)明的第一個方面的表達載體的方法，其中所述方法包括將以下遺傳元件(a)和(b)排列在包含表達載體發(fā)揮功能和整合進哺乳動物宿主基因組通常所需的其他元件的載體中的步驟(a)猿猴病毒40增強子和早期啟動子區(qū)和(b) Hbb內(nèi)含子II，或其片段、衍生物和修飾物。本發(fā)明的該第二個方面的優(yōu)選實施方案為進一步包括排列(C)至少一個目的基因以使所述載體賦予其表達和/或(d)至少一個選擇標(biāo)記基因的步驟的方法。根據(jù)另一個優(yōu)選的實施方案，至少一個選擇標(biāo)記基因是來自Tn5的新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因和/或二氫葉酸還原酶基因。本發(fā)明的第三個方面是包含至少兩個如優(yōu)選的實施方案(i)，(ii)和(iii)中任一項定義的載體的載體系統(tǒng)，其中至少兩個載體各自包含至少一個目的基因。優(yōu)選這樣的載體系統(tǒng)，其中位于第一個載體中的第一個目的基因編碼免疫球蛋白輕鏈，位于第二個載體中的第二個目的基因編碼免疫球蛋白重鏈。本發(fā)明還考慮的另一個載體系統(tǒng)包含至少兩個載體，其中第一個載體根據(jù)本發(fā)明的第一個方面但沒有真核選擇標(biāo)記，其中第二個載體包含編碼賦予轉(zhuǎn)染細胞抗性的選擇標(biāo)記的至少一個基因。
本發(fā)明的第四個方面是包含本發(fā)明的第一個方面的優(yōu)選實施方案(i)，(ii)， (iii),(iv),(v),(vi)和(Vii)中任一項的表達載體或根據(jù)本發(fā)明的第三個方面的載體系統(tǒng)的哺乳動物細胞?；旧先我獠溉閯游锛毎膳c本發(fā)明共同使用，只要其允許多肽的重組表達。根據(jù)本發(fā)明的該第四個方面的優(yōu)選實施方案，此類細胞為COP細胞、L細胞、C127 細胞、Sp2/0細胞、NS-O細胞、NS-I細胞、NIH3T3細胞、PC12細胞、PC12h細胞、BHK細胞、 CHO細胞、COSl細胞、C0S3細胞、C0S7細胞、CVl細胞、Vero細胞、HeLa細胞、HEK-293細胞、 PERC6細胞，或來自二倍體成纖維細胞、骨髓瘤細胞和H印G2的細胞。本發(fā)明的第五個方面涉及產(chǎn)生本發(fā)明的第四個方面的細胞的方法，所述方法包括為哺乳動物細胞提供本發(fā)明的第一個方面的優(yōu)選實施方案⑴，(ii), (iii)，(iv), (ν), (Vi)和(Vii)中任一項的表達載體或根據(jù)本發(fā)明的第三個方面的載體系統(tǒng)，和優(yōu)選地用所述載體或載體系統(tǒng)轉(zhuǎn)染哺乳動物細胞的步驟。本發(fā)明的第六個方面是產(chǎn)生至少一種目的多肽的方法，其中所述方法包括在允許表達所述至少一種目的多肽的條件下在細胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)本發(fā)明的第四個方面的細胞的步驟。根據(jù)本發(fā)明的該第六個方面的優(yōu)選實施方案，通過培養(yǎng)根據(jù)本發(fā)明的第四個方面的CHO細胞產(chǎn)生至少一種目的多肽。根據(jù)本發(fā)明的載體特別適于在嚙齒類細胞例如CHO細胞中產(chǎn)生多肽。根據(jù)本發(fā)明的該第六個方面的另一個優(yōu)選實施方案，此類方法還包括從細胞培養(yǎng)基中分離所述至少一種目的多肽的步驟。本發(fā)明的第七個方面涉及Hbb內(nèi)含子II，或其片段、衍生物和修飾物的用途，但優(yōu)選顯示SEQ ID NO 1的序列的Hbb內(nèi)含子II的用途，所述內(nèi)含子優(yōu)選地與SV40增強子和早期啟動子區(qū)在哺乳動物表達載體組合以增強哺乳動物表達系統(tǒng)中的異源基因的表達。根據(jù)本發(fā)明的第七個方面的優(yōu)選實施方案，此類用途由Hbb內(nèi)含子II、其片段、衍生物和修飾物在編碼異源基因的序列和驅(qū)動異源基因表達的SV40增強子和早期啟動子區(qū)之間的位置定義。本發(fā)明的第八個方面涉及根據(jù)本發(fā)明的載體在蛋白質(zhì)的高通量篩選方法中的用途。蛋白質(zhì)例如氨基酸序列不同的候選蛋白質(zhì)的不同變體的篩選(檢測)是開發(fā)新的治療蛋白質(zhì)(生物藥物)的傳統(tǒng)早期步驟。此篩選程序的目的是評估和之后最優(yōu)化待測目的蛋白質(zhì)的分子特征例如生物活性、免疫原性、聚集行為、表達潛力、翻譯后修飾等等。目前在大多數(shù)情況下，進行上述評估所需的蛋白質(zhì)的量通過在HEK(人胚胎腎)細胞例如ΗΕΚ293細胞中的瞬時蛋白質(zhì)表達得到。然而由于特別的調(diào)控原因，在生物藥物的情況下CHO細胞最常用作最終的生產(chǎn)細胞。盡管存在此不一致，工業(yè)和學(xué)術(shù)界的研究者仍使用目前的方法，因為與CHO細胞相比在HEK細胞中的瞬時蛋白質(zhì)表達幾乎從一開始就可得到相對高的蛋白質(zhì)滴度，由此避免了為得到穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的CHO細胞所需要的漫長選擇過程。 然而，此傳統(tǒng)方法的一個主要缺點是篩選(檢測)系統(tǒng)和最終生產(chǎn)系統(tǒng)使用不同來源(人對倉鼠細胞)的宿主細胞。當(dāng)在最終生產(chǎn)系統(tǒng)中表達目的蛋白質(zhì)時，此篩選和生產(chǎn)系統(tǒng)的不一致當(dāng)然需要使用不同培養(yǎng)基、過程條件等，導(dǎo)致少得多的(如果有的話)有關(guān)例如聚集行為、表達水平、翻譯后修飾的預(yù)測等的可比較(即相關(guān))數(shù)據(jù)。因此，需要組合快速和高滴度蛋白質(zhì)表達的優(yōu)勢(例如通過在HEK細胞中的瞬時蛋白質(zhì)表達得到的)和對已從大部分對應(yīng)最終生產(chǎn)系統(tǒng)的蛋白質(zhì)表達系統(tǒng)中得到的目的蛋白質(zhì)進行早期評估的優(yōu)勢的篩選/ 檢測系統(tǒng)。通過根據(jù)本發(fā)明的載體解決了上面的問題，因為其能夠在僅經(jīng)過短暫選擇期的 (例如，在含有G418的培養(yǎng)基中經(jīng)過2周的選擇)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細胞中表達大量的目的蛋白質(zhì)。因此，本發(fā)明的載體可有利地用于直接在生產(chǎn)系統(tǒng)(例如CHO細胞)中和最終將用于產(chǎn)生最終生物藥物的細胞培養(yǎng)(例如培養(yǎng)基和過程)條件下表達目的蛋白質(zhì)(例如不同蛋白質(zhì)變體)用于檢測/篩選目的。特別是在多種候選藥物蛋白質(zhì)(例如蛋白質(zhì)變體)的早期開發(fā)期，此方法消除了大量的時間損失，其否則將與所述候選蛋白質(zhì)的各個穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的生產(chǎn)細胞系的產(chǎn)生相關(guān)。同時，此新方法產(chǎn)生了在生產(chǎn)以及臨床前和臨床研究中與蛋白質(zhì)質(zhì)量和以后的行為的預(yù)測相關(guān)的更可比較的(即相關(guān))數(shù)據(jù)。本發(fā)明的特別優(yōu)選的實施方案包括以下方法和用途A.產(chǎn)生權(quán)利要求1或2的表達載體的方法，其中所述方法包括將調(diào)控元件(a)和 (b)排列至包含用于功能性表達載體通常所需的如下其他元件的載體的步驟(a)猿猴病毒40增強子和早期啟動子區(qū)和(b)Hbb內(nèi)含子II，或其片段、衍生物和修飾物。B. A的方法，其中所述方法還包括排列(c)至少一個目的基因以使所述載體能夠賦予其表達和/或(d)至少一個編碼選擇標(biāo)記的基因的步驟。C. B的方法，其中所述至少一個選擇標(biāo)記基因是來自Tn5的新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因和/或二氫葉酸還原酶基因。D.在哺乳動物表達載體中與驅(qū)動異源基因表達的猿猴病毒40增強子和早期啟動子區(qū)組合的Hbb內(nèi)含子II，或其片段、衍生物和修飾物在增強哺乳動物表達系統(tǒng)中的異源基因表達中的用途。Ε. D的用途，其中Hbb內(nèi)含子II顯示SEQ ID NO 1的序列。F.D或E的用途，其中Hbb內(nèi)含子II，或其片段、衍生物和修飾物位于編碼異源基因和SV40增強子和早期啟動子區(qū)序列之間。顯示兩個或多個GOI表達盒的本發(fā)明的哺乳動物表達載體對表達多聚體，特別是異源多聚體蛋白質(zhì)(包括單克隆抗體)特別有用。只顯示1個GOI表達盒的本發(fā)明的載體可有利的用于表達單體蛋白質(zhì)例如細胞因子和激素，包括紅細胞生成因子例如達依泊汀 α。當(dāng)將表達多聚體蛋白質(zhì)，特別是單克隆抗體時，也考慮由本發(fā)明的至少兩個載體組成的載體系統(tǒng)，其中第一個載體包含第一個目的基因，第二個載體包含第二個目的基因。優(yōu)選地，在所述載體系統(tǒng)中，位于第一個載體上的所述第一個目的基因編碼免疫球蛋白輕鏈，位于第二個載體上的所述第二個目的基因編碼免疫球蛋白重鏈。根據(jù)本發(fā)明的哺乳動物載體適于單體和多聚體蛋白質(zhì)例如抗體的(重組)生產(chǎn)。 通常使用本發(fā)明的哺乳動物載體可生產(chǎn)的(重組)蛋白質(zhì)包括包含與以下蛋白質(zhì)之一的全部或部分相同或基本類似的氨基酸序列的蛋白質(zhì)Flt3配體，CD40配體，紅細胞生成刺激蛋白例如紅細胞生成素(EPO)，達依泊汀，包括達依泊汀α和血小板生成素，降鈣素，瘦蛋白，F(xiàn)as配體，NF-κ B受體激活劑的配體(RANKL)，腫瘤壞死因子(TNF)相關(guān)的凋亡誘導(dǎo)配體 (TRAIL)，胸腺間質(zhì)來源的淋巴細胞生成素，粒細胞集落刺激因子，粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)，生長因子包括肥大細胞生長因子，干細胞生長因子，表皮生長因子，角化細胞生長因子，巨核細胞生長和發(fā)育因子，RANTES,生長激素，胰島素，促胰島素，胰島素樣生長因子，甲狀旁腺激素，干擾素包括α-干擾素，β-干擾素和Y-干擾素，神經(jīng)生長因子，腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子，突觸結(jié)合蛋白樣蛋白(SLP1-5)，神經(jīng)營養(yǎng)因子-3"胰高血糖素， 白介素包括 IL-1, IL-la, IL-2, IL-3，IL-4，IL-5，IL-6，IL-7，IL-8，IL-9，IL-10，IL-11， IL-12，IL-13，IL-14，IL-15，IL-16，IL-17 和 IL-18，集落刺激因子，淋巴毒素-ρ，腫瘤壞死因子(TNF)，白血病抑制因子，制瘤素-M和細胞表面分子ELK和HeK的多種配體(例如 eph-相關(guān)激酶的配體或LERKS)。使用本發(fā)明的哺乳動物載體可生產(chǎn)的其他蛋白質(zhì)包括包含上述蛋白質(zhì)中任一種的受體、上述蛋白質(zhì)中任一種的這樣的受體的拮抗劑和與這些受體或拮抗劑基本類似的蛋白質(zhì)的氨基酸序列的全部或部分的蛋白質(zhì)。另外，使用本發(fā)明的哺乳動物載體可生產(chǎn)的蛋白質(zhì)包括包含分化抗原(被稱為CD 蛋白質(zhì))或其配體或與它們中的任一種基本類似的蛋白質(zhì)的氨基酸序列的全部或部分的蛋白質(zhì)。此類抗原的實例為包括⑶20，⑶22，⑶27，⑶30，⑶39，⑶40的分化抗原及其配體。使用本發(fā)明的哺乳動物載體也可生產(chǎn)酶活性蛋白質(zhì)或其配體。實例包括包含以下蛋白質(zhì)或其配體或與這些中的一種基本類似的蛋白質(zhì)的全部或部分的蛋白質(zhì)金屬蛋白酶-解聯(lián)蛋白家族成員、激素、葡糖腦苷脂酶、超氧化物歧化酶、組織纖溶酶原激活物、因子 VIII、因子IX、脫脂載脂蛋白E、脫脂載脂蛋白A-1、珠蛋白、IL-2拮抗劑、α-l抗胰蛋白酶、 TNF- α轉(zhuǎn)化酶，上述酶中任一種的配體和多種其他酶及其配體。本發(fā)明的哺乳動物載體也可用于生產(chǎn)體外選擇的嵌合蛋白以與特定靶蛋白結(jié)合并修飾其活性，和其抗體或部分和嵌合抗體，即具有與一個或多個鼠可變抗體免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域偶聯(lián)的人恒定抗體免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域的抗體，其片段或基本上類似的蛋白質(zhì)。本發(fā)明的哺乳動物載體也可用于生產(chǎn)包含抗體和細胞毒性或發(fā)光物質(zhì)的綴合物。使用本發(fā)明的哺乳動物載體可生產(chǎn)的抗體、體外選擇的嵌合蛋白或抗體/細胞毒素或抗體/發(fā)光團綴合物的實例包括這樣的抗體，其識別包括但不限于上述蛋白質(zhì)和/或以下抗原的蛋白質(zhì)中的任意一種或組合:CD2, CD3, CD4, CD8, CDlla，CD14, CD18, CD20, CD22, CD23, CD25, CD33, CD40, CD44, CD52, CD80 (B7. 1)，CD86 (B7. 2)，CD147, IL-la, IL-1，IL-2，IL-3，IL-7，IL-4， IL-5, IL-8, IL-10, IL-2 受體，IL-4 受體，IL-6 受體，IL-13 受體，IL-18 受體亞基，PDGF-β， 和其類似物，VEGF, TGF, TGF-β 2，TGF-pl，EGF受體、VEGF受體，肝細胞生長因子，護骨蛋白配體，干擾素Y，B淋巴細胞刺激物，C5補體，IgE，腫瘤抗原CA125，腫瘤抗原MUCl, PEM抗原，ErbB2/HER-2，在患者血清中以提高的水平存在的腫瘤相關(guān)表位，癌相關(guān)表位或乳腺、結(jié)腸、鱗狀上皮細胞、前列腺、胰腺、肺和/或腎癌細胞和/或黑色素瘤、神經(jīng)膠質(zhì)瘤或神經(jīng)母細胞瘤細胞、腫瘤的壞死核心細胞上表達的蛋白質(zhì)，整聯(lián)蛋白0 40 7，整聯(lián)蛋白￥1^-4，B2 整聯(lián)蛋白，TRAIL受體1，2，3和4，RANK, RANK配體，TNF- α，粘附分子VAP-I，上皮細胞粘附分子(EpCAM)，細胞內(nèi)粘附分子-3 (ICAM-3)，Ieukointegrin粘附素，血小板糖蛋白gp IIb/ Illa，心肌球蛋白重鏈，甲狀旁腺激素，MHC I，癌胚抗原(CEA)，甲胎蛋白(AFP)，腫瘤壞死因子(TNF)，F(xiàn)c-y-Ι 受體，HLA-DR 10 β，HLA-DR 抗原，L-選擇蛋白，和 IFN- γ。本發(fā)明的哺乳動物載體也可用于生產(chǎn)包含上述蛋白質(zhì)或基本上類似的蛋白質(zhì)中的任一種的重組融合蛋白。例如，使用本發(fā)明的哺乳動物載體可生產(chǎn)包含上述蛋白質(zhì)之一外加多聚化結(jié)構(gòu)域例如亮氨酸拉鏈、卷曲螺旋、抗體的Fc部分或基本上類似的蛋白質(zhì)的重組融合蛋白。在這些重組融合蛋白中特別包括這樣的蛋白質(zhì)，其中TNFR或RANK的至少一部分與抗體的Fc部分融合?？梢岳斫?，本領(lǐng)域技術(shù)人員完全能夠確定與本發(fā)明有關(guān)的考慮使用的多種其他蛋白質(zhì)。在根據(jù)本發(fā)明的載體(特別是在pDGPAGOI/pDGP)中包含的遺傳元件(見圖1使用的縮寫)為· SV40enh/prom 猿猴病毒40增強子和早期啟動子區(qū)；· Hbb內(nèi)含子II，或其片段、衍生物和修飾物，如上面定義的。在根據(jù)本發(fā)明的載體(特別是在pDGPAGOI/pDGP)中可包含的遺傳元件(見圖1 使用的縮寫)為-neo 氨基糖苷_3’ -磷酸轉(zhuǎn)移酶(ΑΡΗ 3’ II)基因，又名新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因， 來自Τη5 ；APH 3，II使抗生素遺傳霉素(G418)失活；· dhfr 二氫葉酸還原酶基因；· SV40polyA 來自SV40的多聚腺苷酸化信號序列；· synth polyA 基于兔β -珠蛋白基因的多聚腺苷酸化信號的合成的多聚腺苷酸
化信號圖1圖示了作為本發(fā)明的示例實施方案(具有至少一個目的基因的載體)WpDGP 載體。其包含兩個分別顯示了基本上相同的結(jié)構(gòu)和調(diào)控元件的GOI表達盒，只是待表達的基因不同分別是單克隆抗體(抗-CD20-抗體)的輕鏈和重鏈，因此所述表達盒能夠在哺乳動物細胞中表達兩個不同的目的基因。圖3圖示了作為本發(fā)明的另一個示例實施方案(具有一個目的基因的載體)的 pDGP-Α載體。其包含顯示在上述調(diào)控元件的新和創(chuàng)造性組合控制下的達依泊汀α (其是一種激素或紅細胞生成因子)基因的1個GOI表達盒。目的基因通常是cDNA序列，但也可為(基因組)DNA序列。如上所述，根據(jù)本發(fā)明的載體(特別是pDGPAGOI/pDGP和pDGP_A Δ G0I/pDGP_A) 也可包含編碼選擇標(biāo)記的基因/表達盒。優(yōu)選的選擇標(biāo)記是由neo基因/表達盒編碼的新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶和由dhfr基因/表達盒編碼的二氫葉酸還原酶。編碼可選擇標(biāo)記的基因 /表達盒允許用例如遺傳霉素(G418)和甲氨蝶呤(MTX)選擇轉(zhuǎn)染的細胞。pDGP的neo表達盒包含由SV40增強子和早期啟動子區(qū)驅(qū)動的新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因并由合成的多聚腺苷酸化信號序列進一步轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)(如圖1中所見)。新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因來源于細菌，如果處于上述調(diào)控元件的控制下則在哺乳細胞中表達。完全相反地，pDGP的dhfr表達盒包含由SV40早期啟動子區(qū)(不含增強子序列)驅(qū)動的dhfr基因并由以3'-至5'-方向的SV40多聚腺苷酸化信號進一步轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)。二氫葉酸還原酶(DHFR)是二氫葉酸向四氫葉酸的轉(zhuǎn)化中所需的，后者進一步是細胞中的核酸合成所需的。通過甲氨蝶呤對二氫葉酸還原酶的不可逆抑制實現(xiàn)有效的細胞選擇。因此，用PDGP載體成功轉(zhuǎn)染的哺乳動物細胞(因此過表達DHFR蛋白質(zhì))能夠在補充甲氨蝶呤的培養(yǎng)基中生長。圖1圖示了依照本發(fā)明的優(yōu)選實施方案的載體(載體pDGP)，其包含兩個目的基因，即mAb HC和mAb LC(mAb 單克隆抗體；HC 重鏈；LC 輕鏈)。圖2圖示了對照載體。
圖3圖示了依照本發(fā)明的優(yōu)選實施方案的載體(載體pDGP-A)，其包含1個目的基因，即達依泊汀α (縮寫=Darbe alfa)。圖4圖示了另一個對照載體，即對照載體1，其中GOI(達依泊汀α)的表達處于 CMV增強子/啟動子(CMV enh/prom)和Hbb內(nèi)含子II的調(diào)控下。圖5圖示了另一個對照載體，即對照載體2，其中GOI(達依泊汀α)的表達僅處于 SV40增強子/啟動子(SV40enh/prom)調(diào)控下(不含任何內(nèi)含子序列)。為了檢測根據(jù)本發(fā)明的pDGP表達載體的性能，發(fā)明人比較了 pDGP(圖1所示)和對照載體(圖2所示)。pDGP和對照載體都包含相同的兩個目的基因(抗-CD20抗體的) mAb HC和mAb LC。將兩個載體轉(zhuǎn)染進相同的宿主細胞系(例如CHO K1PD，COSl，CVl，Vero， HeLa, HEK-293, PER C6)。然后在G418和MTX存在下對細胞進行連續(xù)的選擇步驟。在每個選擇步驟之后測定和比較在標(biāo)準(zhǔn)搖瓶批次中的mAb滴度。實驗的細節(jié)在下面給出。為了進一步檢測根據(jù)本發(fā)明的pDGP-A表達載體的性能，發(fā)明人比較了 pDGP-A(圖 3所示)和對照載體1和2 (分別在圖4和5中所示)。pDGP-A和對照載體1和2都包含相同的目的基因達依泊汀α，一種激素(紅細胞生成因子)。將載體轉(zhuǎn)染進相同的宿主細胞系(例如 CHO K1PD, COSl，CVl，Vero, HeLa, ΗΕΚ-293，PER C6)。與上述 pDGP 載體相反，表達載體pDGP-A、對照載體1和對照載體2分別包含單個GOI表達盒且不包含任何真核選擇標(biāo)記基因。因此，共轉(zhuǎn)染了包含新霉素抗性基因的Neo載體以在含有遺傳霉素(G418)的培養(yǎng)基中進行一步選擇。實驗的細節(jié)在下面給出。實驗根據(jù)本發(fā)明的哺乳動物載體可用于生產(chǎn)多種不同的(重組)蛋白質(zhì)。以下實施例分別說明了多聚體和單體蛋白質(zhì)的重組表達的一般實驗設(shè)定。特別地，通過使用針對⑶20 的單克隆抗體和達依泊汀α，一種激素(紅細胞生成因子)作為可使用根據(jù)本發(fā)明的哺乳動物載體表達的示例性蛋白質(zhì)收集了下文顯示的數(shù)據(jù)。實施例1 多聚體蛋白質(zhì)(單克隆抗-⑶20抗體)的表達表達載體設(shè)計和構(gòu)建使用載體NTI 9. 0評估軟件通過電腦設(shè)計了在此研究中使用的載體。構(gòu)建載體例如pDGP載體和對照載體(圖2)所需的片段在Geneart AG，Regensburg，Germany制備。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解根據(jù)本發(fā)明教導(dǎo)的一些載體組裝是可行的。由于根據(jù)本發(fā)明的載體的各個元件是本領(lǐng)域已知的，可通過例如測序或擴增和適當(dāng)?shù)乜寺』A(chǔ)遺傳元件和表達盒組裝合適的載體。因此，應(yīng)當(dāng)理解得到各個載體的一些其他實施方案和方法是合適的和容易得到的。在各個表達載體中驅(qū)動4個表達盒的表達的調(diào)控性遺傳元件列于表1。表1 :pDGP/對照載體中包含的調(diào)控性遺傳元件列表
權(quán)利要求
1.一種包含以下調(diào)控元件的哺乳動物表達載體(a)猿猴病毒40增強子和早期啟動子區(qū)和(b)Hbb內(nèi)含子II，或其片段、衍生物和修飾物，其中所述表達載體能夠接納至少一個目的基因并使其表達。
2.權(quán)利要求1的載體，其中所述Hbb內(nèi)含子II顯示SEQID NO 1的序列。
3.權(quán)利要求1或2的載體，其中所述載體還包含至少一個編碼真核和/或原核選擇標(biāo)記的基因，特別是其中至少一個真核選擇標(biāo)記基因是來自Tn5的新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因和 /或二氫葉酸還原酶基因。
4.前面權(quán)利要求中任一項的載體，其中所述載體為環(huán)形和/或包含處于權(quán)利要求1(a) 和(b)中定義的調(diào)控元件控制下的至少一個目的基因。
5.權(quán)利要求4的載體，其中所述載體包含至少一個目的基因并且其中所述至少一個基因編碼免疫球蛋白輕鏈和/或免疫球蛋白重鏈。
6.權(quán)利要求1至5中任一項的載體，其中所述調(diào)控元件，目的基因和編碼選擇標(biāo)記的基因的順序如下5' -SV40增強子/早期啟動子區(qū)，Hbb內(nèi)含子II，或其片段、衍生物和修飾物，編碼免疫球蛋白輕鏈的基因，SV40多聚腺苷酸化信號序列；SV40增強子/早期啟動子區(qū)，Hbb內(nèi)含子II，或其片段、衍生物和修飾物，編碼免疫球蛋白重鏈的基因，SV40多聚腺苷酸化信號序列；SV40增強子/早期啟動子區(qū)，Tn5新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因，合成的多聚腺苷酸化信號序列；SV40早期啟動子，二氫葉酸還原酶基因，SV40多聚腺苷酸化信號序列-3'。
7.權(quán)利要求1至6中任一項的載體，其中所述載體為顯示9555bp的序列的pDGPΔ GOI 載體，其一條鏈由SEQ ID NO 2代表。
8.一種載體系統(tǒng)，其包含至少兩個如在權(quán)利要求3或4中定義的載體，其中所述至少兩個載體各自包含至少一個目的基因。
9.權(quán)利要求8的載體系統(tǒng)，其中位于第一個載體上的第一個目的基因編碼免疫球蛋白輕鏈，位于第二個載體上的第二個目的基因編碼免疫球蛋白重鏈。
10.一種載體系統(tǒng)，其包含至少兩個載體，其中第一個載體如權(quán)利要求1或2中定義并且其中第二個載體包含編碼賦予轉(zhuǎn)染細胞抗性的選擇標(biāo)記的至少一種基因。
11.權(quán)利要求10的載體系統(tǒng)，其中所述第一個載體為顯示3830bp序列的pDGP-AAGOI 載體，其一條鏈由SEQ ID NO 3代表。
12.哺乳動物細胞，其包含權(quán)利要求3至7中任一項的表達載體或包含權(quán)利要求8至 11中任一項的載體系統(tǒng)。
13.權(quán)利要求12的細胞，其中所述細胞為COP細胞、L細胞、C127細胞、Sp2/0細胞、 NS-O細胞、NS-I細胞、NIH3T3細胞、PC12細胞、PCUh細胞、BHK細胞、CHO細胞、COSl細胞、 C0S3細胞、C0S7細胞、CVl細胞、Vero細胞、HeLa細胞、HEK-293細胞、PER C6細胞，或來自二倍體成纖維細胞、骨髓瘤細胞和HepG2的細胞。
14.一種產(chǎn)生權(quán)利要求12的細胞的離體方法，所述方法包括對哺乳動物細胞提供權(quán)利要求3至7中任一項的表達載體或權(quán)利要求8至11中任一項的載體系統(tǒng)的步驟。
15.一種生產(chǎn)至少一種目的多肽的方法，其中所述方法包括在允許表達所述至少一種目的多肽的條件下在細胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)權(quán)利要求12的細胞的步驟。
16.權(quán)利要求15的方法，其中所述至少一種目的多肽被分泌至細胞培養(yǎng)基并且所述方法還包括從細胞培養(yǎng)基中分離所述至少一種目的多肽的步驟。
全文摘要
本發(fā)明描述了包含調(diào)控元件和一種或多種選擇標(biāo)記基因的新組合的新的哺乳動物表達載體。所述載體允許至少一個，優(yōu)選兩個或更多目的基因的摻入，其之后的表達和使用例如G418和/或MTX選擇轉(zhuǎn)染的細胞。作為根據(jù)本發(fā)明的哺乳動物表達載體的實例的pDGPΔGOI載體顯示了9555bp的序列，其一條鏈由SEQ ID NO2代表。
文檔編號C12N15/90GK102264908SQ200980151764
公開日2011年11月30日 申請日期2009年12月18日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月22日
發(fā)明者A·弗蘭基, D·戈賽爾 申請人:力奇制藥公司