專利名稱：采用拉曼光譜法分離、表征和/或鑒定微生物的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于檢測、分離和/或鑒定樣品中的微生物的方法和系統(tǒng)。具體而言， 本發(fā)明涉及利用拉曼光譜技術(shù)快速表征和/或鑒定微生物的直接方法。
背景技術(shù)：
檢測生物學(xué)流體中的病原微生物，應(yīng)該在盡可能最短的時(shí)間內(nèi)進(jìn)行，尤其是在敗血癥的情況下，對于該病癥盡管醫(yī)生可利用的抗生素的范圍廣泛，但是其死亡率仍然保持較高。生物學(xué)活性劑(諸如微生物)在患者體液尤其是血液中的存在，一般采用血培養(yǎng)瓶進(jìn)行檢測。血流感染與高的發(fā)病率和死亡率有關(guān)，然而當(dāng)前的診斷方法即培養(yǎng)之后進(jìn)行生物化學(xué)鑒定和抗生素敏感性測試，可能要耗費(fèi)幾天時(shí)間來進(jìn)行。通常，基于臨床癥狀開始經(jīng)驗(yàn)療法，而只有當(dāng)初始療法失效時(shí)測試結(jié)果才會影響臨床決策。在陽性血液培養(yǎng)結(jié)果之后的最初幾個(gè)小時(shí)內(nèi)、優(yōu)選1個(gè)小時(shí)內(nèi)表征血液感染的能力，將會顯著地加強(qiáng)所提供的診斷信息的臨床相關(guān)性。已經(jīng)提出了分子擴(kuò)增方法來填補(bǔ)這方面的需要，但是對于這種方法仍然存在嚴(yán)重的挑戰(zhàn)。陽性血液培養(yǎng)液自身代表具有用于各種快速、鑒定(ID)測試的潛能的天然擴(kuò)增的微生物種群。為了提供穩(wěn)健的結(jié)果，傳統(tǒng)的自動(dòng)表型ID測試(諸如Vitek *、Phoenix 和 Microscan 系統(tǒng))或手動(dòng)表型測試(諸如API)要求微生物處于適當(dāng)?shù)纳L階段并且無干涉培養(yǎng)基和血液產(chǎn)物。這些系統(tǒng)利用在平板培養(yǎng)基上從陽性培養(yǎng)液中生長16 M小時(shí)的菌落。然而，為了獲得更快的結(jié)果，一些實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)報(bào)道了采用這些系統(tǒng)及從陽性血培養(yǎng)瓶中分離的微生物。這些直接獲自培養(yǎng)瓶的試驗(yàn)并不是對于所有的微生物(例如，革蘭氏陽性球菌)都是適當(dāng)?shù)模唇?jīng)測試廠商驗(yàn)證，并且一般要花費(fèi)3 8小時(shí)才能提供結(jié)果。迫切需要更快且更廣泛的特異性試驗(yàn)，以便在陽性培養(yǎng)結(jié)果之后的最初幾個(gè)小時(shí)內(nèi)、優(yōu)選1個(gè)小時(shí)內(nèi)為醫(yī)師提供臨床上相關(guān)的結(jié)果。拉曼光譜法具有實(shí)現(xiàn)非常快速地鑒定微生物的潛能，但是可能會遇到在液體微生物培養(yǎng)基中和臨床樣品諸如血液或其組合中存在的許多高度熒光和吸收性化合物的干擾。 直接從陽性血液培養(yǎng)液中回收微生物的最常用的方法是兩步差速離心和在血清分離器管中的離心。已經(jīng)描述了用于分離、表征和/或鑒定微生物的其它方法，包括美國專利第4，847，198號公開了一種利用UV激發(fā)拉曼光譜法鑒定微生物的方法。 根據(jù)'198專利，通過紫外光譜范圍內(nèi)的單波長接觸細(xì)菌懸浮液。部分所用的光能被吸收而部分光能被發(fā)射。發(fā)射的光能，共振增強(qiáng)拉曼散射，作為反向散射能量進(jìn)行測定。對該能量進(jìn)行處理以產(chǎn)生細(xì)菌的特征性光譜。Vo-Dinh的美國專利第5，938，617號涉及一種系統(tǒng)，該系統(tǒng)通過用幾個(gè)波長的光激發(fā)樣品并同步采集發(fā)射強(qiáng)度來鑒定樣品中生物病原體。系統(tǒng)包括用于將樣品暴露于激發(fā)輻射并由此產(chǎn)生發(fā)射輻射的機(jī)制。生物病原體可能是病毒和細(xì)菌。美國專利第6，177，266號公開了一種采用通過基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MQ分析細(xì)胞蛋白提取物或整個(gè)細(xì)胞產(chǎn)生的屬、種和菌株的特異性生物標(biāo)記對細(xì)菌進(jìn)行化學(xué)分類學(xué)分類的方法。在美國專利第7，070, 739號中，顯示了一種通過二維超離心直接從體液或均質(zhì)化組織中提取、分離和純化微生物(包括病毒)的方法。在第一步離心步驟中，將沉降速度高于待鑒定的微生物的沉降速率的所有粒子除去。在第二步超離心步驟中，采用專用鋸齒離心管，于填充的流體中應(yīng)用等密度分帶以形成寬范圍的密度梯度。根據(jù)該專利，分離技術(shù)能夠用于通過利用核酸特異性染料的光散射或熒光檢測分帶的粒子，以及用于以非常小的體積回收分帶的粒子，從而通過質(zhì)譜分析病毒蛋白亞單位和完整的病毒粒子以及通過熒光流量細(xì)胞計(jì)數(shù)測定核酸的質(zhì)量和由限制酶產(chǎn)生的片段的質(zhì)量進(jìn)行表征。美國專利申請出版物第2007/0037135號公開了一種用于鑒定和定量懸浮于液體中的生物樣品的系統(tǒng)。該系統(tǒng)包括具有至少一個(gè)激發(fā)光源的熒光激發(fā)模塊；樣品界面模塊， 其可選地耦合到熒光激發(fā)模塊用于定位生物樣品以接受來自至少一個(gè)激發(fā)光源的激發(fā)光； 熒光發(fā)射模塊，其可選地耦合到樣品界面模塊并包含至少一個(gè)用于檢測生物樣品的熒光激發(fā)-發(fā)射矩陣的檢測儀；和計(jì)算機(jī)模塊，其經(jīng)過操作耦合到熒光發(fā)射模塊。計(jì)算機(jī)模塊對生物樣品的熒光激發(fā)-發(fā)射矩陣進(jìn)行多變量分析以鑒定和定量生物樣品。然而，‘135申請并未討論從復(fù)雜生物學(xué)樣品諸如血液中鑒定和定量微生物。美國專利申請出版物第2007/0175278號描述了采用液體培養(yǎng)基培養(yǎng)所關(guān)注的樣品，包括例如血液、尿液、糞便、脈管導(dǎo)管等，工業(yè)生產(chǎn)線，水系統(tǒng)，食物產(chǎn)品，化妝品，藥物制劑和法醫(yī)樣品。隨后，通過本領(lǐng)域內(nèi)已知的方法，例如通過離心可以從液體培養(yǎng)基中收集微生物。然后可以將濃縮的微生物轉(zhuǎn)移到載體物質(zhì)中，可選地在干燥之后，用于獲取振動(dòng)光譜。該專利中請討論了用于鑒定和分類微生物的各種方法，包括振動(dòng)光譜法，諸如拉曼光譜法。然而，這些方法在試圖從復(fù)雜樣品(諸如含血液的培養(yǎng)基)中分離和表征微生物時(shí)具有一些缺點(diǎn)。所得的微生物制劑經(jīng)常包含污染性的紅血細(xì)胞、血小板、脂質(zhì)微粒、血漿酶和細(xì)胞碎片，這些都可以導(dǎo)致結(jié)果變差。這些方法也是非常勞動(dòng)密集型的并且由于其步驟能夠使?jié)撛谖ｋU(xiǎn)的病原體在空氣中暴露于使用者從而是不安全的。仍需要從臨床樣品 (例如，血液培養(yǎng)液)和其它無這些干擾物質(zhì)并與快速鑒定技術(shù)相容的復(fù)雜樣品中分離微生物的簡單、安全且可靠的方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供用于分離、表征和/或鑒定樣品中微生物的方法。方法實(shí)現(xiàn)了比現(xiàn)有技術(shù)更快速地表征和/或鑒定微生物，從而更快地診斷(例如，在患有或疑似患有敗血癥的受試者中)并鑒定受污染物質(zhì)(例如，食品和藥物)。在本發(fā)明的方法中所包括的步驟，從獲得樣品到表征和/或鑒定微生物，都可以在非常短的時(shí)間框架內(nèi)實(shí)施以產(chǎn)生臨床相關(guān)的可采取行動(dòng)的信息，例如在不到約120分鐘內(nèi)。另外，可以使本發(fā)明的方法完全自動(dòng)化，由此降低處理傳染性物質(zhì)和/或污染樣品的風(fēng)險(xiǎn)。在一個(gè)方面中，本發(fā)明涉及表征和/或鑒定測試樣品中的微生物的方法，包括(a)獲得已知包含或可能包含微生物的測試樣品；(b)選擇性地溶解所述測試樣品中的非微生物細(xì)胞以產(chǎn)生溶胞樣品；(c)使微生物與所述溶胞樣品的其它組分分離以形成微生物的離析的樣品；(d)采用一種或多種拉曼光譜技術(shù)對所述離析的微生物進(jìn)行探詢以產(chǎn)生所述微生物的光譜測定結(jié)果；和(e)通過將所述光譜測定結(jié)果與對已知微生物測定的光譜測定結(jié)果，或預(yù)測的光譜性質(zhì)對比來表征和/或鑒定所述離析的樣品中的所述微生物。在另一個(gè)方面中，本發(fā)明涉及表征和/或鑒定血液培養(yǎng)物中的微生物的方法，包括(a)從已知包含或可能包含微生物的血液培養(yǎng)物中獲得樣品；(b)選擇性地溶解所述樣品中的非微生物細(xì)胞以產(chǎn)生溶胞樣品；(c)將所述溶胞樣品鋪層在密封容器中的密度緩沖墊層上；(d)將所述容器離心以使微生物與所述樣品的其它組分分離并形成微生物顆粒；(e)采用一種或多種拉曼光譜技術(shù)在原位對所述離析的微生物進(jìn)行光譜探詢以產(chǎn)生所述微生物的光譜測定結(jié)果；和(f)通過將所述光譜測定結(jié)果與對已知微生物測定的光譜測定結(jié)果或預(yù)測的光譜性質(zhì)對比來表征和/或鑒定所述離析樣品中的所述微生物。在又一個(gè)方面中，本發(fā)明涉及表征和/或鑒定微生物的方法，包括(a)獲得已知包含或可能包含微生物的測試樣品；(b)將所述測試樣品放置于密封容器中；(c)使微生物在原位與所述測試樣品的其它組分分離以在所述密封容器中形成離析的微生物樣品；(d)采用一種或多種拉曼光譜技術(shù)在原位對所述離析的微生物進(jìn)行光譜探詢以產(chǎn)生所述微生物的光譜測定結(jié)果；和(e)通過將所述光譜測定結(jié)果與對已知微生物測定的光譜測定結(jié)果或預(yù)測的光譜性質(zhì)對比來表征和/或鑒定所述離析的樣品中的所述微生物。在一個(gè)實(shí)施方式中，分離通過將測試樣品鋪層在容器中的密度緩沖墊層上方并將容器離心以?；⑸?，同時(shí)樣品培養(yǎng)基仍保持在密度緩沖墊層的頂部來實(shí)施。在另一個(gè)實(shí)施方式中，容器在底部和/或側(cè)面上具有光學(xué)窗口以便使微生物顆粒能夠進(jìn)行光譜學(xué)上的探詢?？梢酝ㄟ^將顆粒的光譜與已知微生物的一種光譜或多種光譜或預(yù)測的光學(xué)性質(zhì)進(jìn)行比較來鑒定微生物。這種無需進(jìn)一步處理而直接在顆粒中鑒定微生物的能力增強(qiáng)了微生物鑒定的安全性。在一個(gè)實(shí)施方式中，光譜探詢是基于包含微生物的組成分子的振動(dòng)結(jié)構(gòu)的探詢。 在其它實(shí)施方式中，光譜探詢部分地基于從在本發(fā)明方法期間加入且與特異性微生物或微生物組相互作用的其它物質(zhì)中獲得的信號。在另一個(gè)實(shí)施方式中，該方法進(jìn)一步包括回收微生物顆粒，再懸浮微生物并進(jìn)行進(jìn)一步的鑒定或表征試驗(yàn)(例如，耐藥性、毒力因子、抗藥型)的步驟。在本文的附圖中和下面闡述的描述中對本發(fā)明進(jìn)行更詳細(xì)的解釋。


圖1顯示了從血液培養(yǎng)物中處理和回收的各種微生物的拉曼光譜圖。圖2顯示了直接從血液培養(yǎng)液中回收的13種金黃色葡萄球菌(S. aureus)分離物的拉曼光譜圖。圖3顯示了在存在和不存在微生物的情況下，透過密封的分離裝置讀取的拉曼光譜圖。圖4顯示了透過密封的分離裝置讀取的血液培養(yǎng)來源的微生物顆粒的扣除背景的拉曼光譜圖。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明可以以不同的形式體現(xiàn)，并且不應(yīng)該解釋為僅限于本文中所闡述的實(shí)施方式。相反，提供這些實(shí)施方式以便使本公開是全面和完整的，并將向本領(lǐng)域的技術(shù)人員充分表達(dá)本發(fā)明的范圍。例如，可以將有關(guān)一個(gè)實(shí)施方式舉例說明的特征結(jié)合至其它實(shí)施方式中，以及可以將有關(guān)具體實(shí)施方式
舉例說明的特征從該實(shí)施方式中刪除。另外，依據(jù)本公開，在本文中提出的對實(shí)施方式的各種變通和添加對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言將會是顯而易見的，所述的各種變通和添加沒有偏離本發(fā)明。除非另外規(guī)定，本文所用的所有技術(shù)術(shù)語和科學(xué)術(shù)語都具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域中普通技術(shù)人員通常所理解的相同的含義。本文中在本發(fā)明的說明書中所用的術(shù)語僅僅是為了達(dá)到描述具體實(shí)施方式
的目的而不是用來限制本發(fā)明。定義如本文中所用的“一個(gè)(一種)”(“a”，“an”)或“該(the) ”可以意指一個(gè)(一種)或多于一個(gè)(一種)。例如，“一個(gè)”細(xì)胞可以意指單個(gè)細(xì)胞或多個(gè)細(xì)胞。而且，如本文中所用的“和/或”是指并包含一個(gè)或多個(gè)相關(guān)所列項(xiàng)的任何和所有的可能的組合，以及在另一種情況(“或”)下解釋為不組合。另外，如本文中所用的術(shù)語“約”，當(dāng)是指可測量的值諸如本發(fā)明的化合物或物質(zhì)的量、劑量、時(shí)間、溫度等時(shí)，意味著包含指定量的士20%、+10%、士5%、士 1%、士0. 5%，或甚至士 0. 的變化。如本文中所用的術(shù)語“微生物”意圖包括通常是單細(xì)胞的生物體，其能夠在實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行繁殖和處理，包括但不限于革蘭氏陽性細(xì)菌或革蘭氏陰性細(xì)菌、酵母菌、霉菌、 寄生蟲和柔膜細(xì)菌。本發(fā)明的革蘭氏陰性細(xì)菌的非限制性的實(shí)例包括以下屬的細(xì)菌 假單胞菌屬(Pseudomonas)、埃希式桿菌屬(Escherichia)、沙門氏菌屬(Salmonella)、 志賀氏桿菌屬(Shigella)、腸桿菌屬(Enterobacter)、克雷白氏桿菌屬(Klebsiella)、 沙雷氏菌屬(Serratia)、變形桿菌屬(Proteus)、彎曲菌屬(Campylobacter)、嗜血桿菌屬(Haemophilus)、摩根氏菌屬(Morganella)、弧菌屬(Vibrio)、耶爾森氏菌屬 (Yersinia)、不動(dòng)桿菌屬(Acinetobacter)、寡養(yǎng)單胞菌屬(Stenotrophomonas)、短波單胞菌屬(Brevundimonas)、青枯菌屬(Ralstonia)、無色桿菌屬(Achromobacter)、
8梭菌屬(Fusobacterium)、普氏菌屬(Prevotella)、布蘭漢氏球菌屬(Branhamella)、 奈瑟菌屬(Neisseria)、伯克氏菌屬(Burkholderia)、檸檬酸桿菌屬(Citrobacter)、 哈夫尼菌屬(Hafnia)、愛德華氏菌屬(Edwardsiella)、氣單胞菌屬(Aeromonas)、莫拉克斯氏菌屬(Moraxella)、布魯氏菌屬(Brucella)、巴斯德氏菌屬(Pasteurella)、 普羅維登斯菌屬O^rovidencia)、和軍團(tuán)菌屬(Legionella)。本發(fā)明的革蘭氏陽性細(xì)菌的非限制性的實(shí)例包括以下屬的細(xì)菌腸球菌屬(Enterococcus)、鏈球菌屬 (Streptococcus)、葡萄球菌屬(Staphylococcus)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、類芽孢桿菌屬(Paenikicillus)、乳桿菌屬(LactcAacillus)、李斯特菌屬(Listeria)、消化鏈球菌屬(Peptostreptococcus)、丙酸菌屬(Propionibacterium)、梭菌屬(Clostridium)、 擬桿菌屬(Bacteroides)、加德納菌屬(Gardnerella)、庫克菌屬(Kocuria)、乳球菌屬(Lactococcus)、明串珠菌屬(Leuconostoc)、微球菌屬(Micrococcus)、分枝桿菌屬(Mycobacteria)和棒狀桿菌屬(Corynebacteria)。本發(fā)明的酵母菌和霉菌的非限制性的實(shí)例包括以下屬的那些念珠菌屬(Candida)、隱球菌屬(Cryptococcus) 卡氏菌屬(Nocardia)、青霉菌屬(Penicillium)、鏈格孢屬(Alternaria)、紅酵母屬 (Rhodotorula)、曲霉屬(Aspergillus)、鍵刀菌屬(Fusarium)、酵母屬(Saccharomyces) 和毛孢子菌屬(Trichosporon)。本發(fā)明的寄生蟲的非限制性的實(shí)例包括以下屬的那些 錐體蟲屬CTrypanosoma)、巴貝西蟲屬(Babesia)、利什曼原蟲屬(Leishmania)、瘧原蟲屬(Plasmodium)、Wucheria、布魯格氏絲蟲屬(Brugia)、盤尾絲蟲屬(Onchocerca)和納氏蟲屬(Naegleria)。本發(fā)明的柔膜細(xì)菌的非限制性的實(shí)例包括以下屬的那些支原體屬 (Mycoplasma)禾口服原體屬(Ureaplasma)。在如本文中更詳細(xì)地描述的一個(gè)實(shí)施方式中，可以對來自樣品或生長培養(yǎng)基的微生物進(jìn)行分離和探詢以表征和/或鑒定樣品中存在的微生物。如本文中所用的術(shù)語“分離 (separate)”意圖包括已經(jīng)從其原始狀態(tài)或從生長培養(yǎng)基或培養(yǎng)基中除去、濃縮或另外分開的任何的微生物樣品。例如，根據(jù)本發(fā)明，可以使微生物與可能另外干擾表征和/或鑒定的非微生物或非微生物組分分離開(例如，作為分離的樣品(separated sample))。該術(shù)語可以包括夾在兩個(gè)其它層之間的微生物層(例如，離心后在高密度緩沖墊層頂部收集的微生物)，或在固體表面(例如，過濾膜)上收集的微生物層。該術(shù)語也可以包括已經(jīng)部分地通過層(例如，密度緩沖墊層)的微生物的收集。同樣，分離的微生物樣品可以包括微生物和/或其組分的任何收集或?qū)?，這比原始樣品更濃，或另外從原始樣品中分離出來，并且其可以是從微生物的緊密堆積的稠密塊到微生物的擴(kuò)散層。在分離形式或樣品中可以包含的微生物組分包括但不限于以任何組合形式存在的菌毛、鞭毛、傘毛和莢膜。與微生物分離開的非微生物組分可以包括非微生物細(xì)胞(例如，血液細(xì)胞和/或其它組織細(xì)胞)和/或其任何組分。在如本文中更詳細(xì)地描述的又一個(gè)實(shí)施方式中，可以對來自樣品或生長培養(yǎng)基的微生物進(jìn)行分離和探詢以表征和/或鑒定樣品中存在的微生物。如本文中所用的術(shù)語“離析的(isolated) ”意圖包括已經(jīng)從其原始狀態(tài)或從其生長培養(yǎng)基或培養(yǎng)基中至少部分地純化的任何微生物樣品，以及其中所含的任何非微生物或非微生物組分。例如，根據(jù)本發(fā)明， 微生物可以與可能另外干擾表征和/或鑒定的非微生物或非微生物組分離析分開(例如， 作為離析的樣品(isolated sample))。與微生物分離開的非微生物組分可以包括非微生物細(xì)胞(例如，血液細(xì)胞和/或其它組織細(xì)胞)和/或其任何組分。在如本文中更詳細(xì)地描述的又一個(gè)實(shí)施方案中，可以對來自樣品或生長培養(yǎng)基的微生物進(jìn)行?；吞皆円员碚骱丸b定樣品中存在的微生物。如本文中所用的術(shù)語“顆?！币鈭D包括已經(jīng)被壓縮或沉積成微生物團(tuán)塊的任何微生物樣品。例如，通過離心或本領(lǐng)域內(nèi)的其它已知方法可以將樣品中的微生物在試管底部壓縮或沉積成團(tuán)塊。該術(shù)語包括離心后在容器的底部和/或側(cè)面上的微生物(和/或其組分)的收集。在顆粒中可以包含的微生物組分包括但不限于以任何組合形式存在的菌毛、鞭毛、傘毛和莢膜。根據(jù)本發(fā)明，微生物可以與可能另外干擾表征和/或鑒定的非微生物或非微生物組分粒化分開(例如作為基本上純化的微生物顆粒)。與微生物分離開的非微生物組分可以包括非微生物細(xì)胞(例如，血液細(xì)胞和/或其它組織細(xì)胞)和/或其任何組分。如本文中所用的術(shù)語“密度緩沖墊層”是指整個(gè)具有均勻密度的溶液。本發(fā)明提供了用于分離、表征和/或鑒定樣品中微生物的方法。而且，該方法可以特別用于從復(fù)雜樣品諸如含血液的培養(yǎng)基中分離、表征和/或鑒定微生物?？焖俜椒ㄒ矊?shí)現(xiàn)了比現(xiàn)有技術(shù)更快地表征和/或鑒定微生物，從而更快速地診斷(例如，在患有或疑似患有敗血癥的受試者中)并表征/鑒定受污染物質(zhì)(例如，食品和藥物)。本發(fā)明的方法中所包含的步驟，從獲得樣品到表征和/或鑒定微生物，都可以在非常短的時(shí)間框架內(nèi)實(shí)施以得到臨床上相關(guān)的可采取行動(dòng)的信息。在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明的方法可以在不到約120 分鐘內(nèi)，例如在不到約 110、100、90、80、70、60、50、40、30、20、15、10、5、4、3、2 或 1 分鐘內(nèi)進(jìn)行實(shí)施。本發(fā)明的方法的極度快速性代表優(yōu)于現(xiàn)有方法的改進(jìn)?？梢允褂帽景l(fā)明方法來表征和/或鑒定本文中所述的任何微生物。在一個(gè)實(shí)施方式中，微生物是細(xì)菌。在另一個(gè)實(shí)施方式中，微生物是酵母菌。在另一個(gè)實(shí)施方式中，微生物是霉菌。在另外的實(shí)施方式中， 微生物是寄生蟲。在另一個(gè)實(shí)施方式中，微生物是柔膜細(xì)菌。另外，可以使本發(fā)明的方法完全自動(dòng)化，從而降低了處理傳染性物質(zhì)和/或污染樣品的風(fēng)險(xiǎn)。在一個(gè)方面，本發(fā)明涉及表征和/或鑒定測試樣品中的微生物的方法，包括(a)獲得已知包含或可能包含微生物的測試樣品；(b)選擇性地溶解所述測試樣品中的非微生物細(xì)胞以產(chǎn)生溶胞樣品；(c)使微生物與所述溶胞樣品的其它組分分離以形成微生物的離析的樣品；(d)采用一種或多種拉曼光譜技術(shù)對所述離析的微生物進(jìn)行探詢以產(chǎn)生所述微生物的光譜測定結(jié)果；和(e)通過將所述光譜測定結(jié)果與對已知微生物測定的光譜測定結(jié)果，或預(yù)測的光譜性質(zhì)對比來表征和/或鑒定所述離析的樣品中的所述微生物。在另一個(gè)方面中，本發(fā)明涉及表征和/或鑒定微生物的方法，包括(a)獲得已知包含或可能包含微生物的測試樣品；(b)將所述測試樣品放置于密封容器中；(c)使微生物在原位與所述測試樣品的其它組分分離以形成所述密封容器中微生物的離析的微生物樣品；(d)采用一種或多種拉曼光譜技術(shù)在原位對所述離析的微生物進(jìn)行光譜探詢以產(chǎn)生所述微生物的光譜測定結(jié)果；和(e)通過將所述光譜測定結(jié)果與對已知微生物測定的光譜測定結(jié)果或預(yù)測的光譜性質(zhì)對比來表征和/或鑒定所述離析的樣品中的所述微生物。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式中，方法包括在探詢微生物之前從分離容器中回收分離步驟期間形成的微生物顆?；蚱涞囊徊糠帧＠?，在形成顆粒之后，可以將流體從顆粒中吸出并將顆粒再懸浮于合適的培養(yǎng)基(例如，其中微生物能存活的培養(yǎng)基)中?？梢詫⒃賾腋〉奈⑸飶姆蛛x容器中移出。然后，可以例如在懸浮液中或在已將它們再?；髮ξ⑸锾皆儚亩M(jìn)行表征和/或鑒定。在其它實(shí)施方式中，可以在分離容器中對再懸浮的微生物進(jìn)行探詢，例如在懸浮液中或已將它們再粒化之后。在另外的實(shí)施方式中，從顆粒中回收的微生物可以直接用于進(jìn)一步的探詢(例如，拉曼光譜法)而無需再懸浮。樣品可以通過本發(fā)明的方法進(jìn)行測試的樣品(S卩，測試樣品)包括其中微生物存在和/ 或生長或可能疑似存在和/或生長的臨床和非臨床樣品，以及對微生物的存在進(jìn)行常規(guī)或不定期檢測的物質(zhì)的樣品。所利用的樣品的量由于方法的通用性和/或靈敏度可能大大不同。樣品制備可以通過本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員已知的任何技術(shù)來實(shí)施，盡管本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)在于可以利用系統(tǒng)對復(fù)雜的樣品類型(諸如例如血液、體液、和/或其它不透明的物質(zhì))直接進(jìn)行測試，而僅需極少的或無需大量的預(yù)處理。在一個(gè)實(shí)施方式中，樣品取自培養(yǎng)物。在另一個(gè)實(shí)施方式中，樣品取自微生物培養(yǎng)物(例如，血液培養(yǎng)物)。在另一個(gè)實(shí)施方式中，在樣品中疑似或已知包含微生物。可以檢測的臨床樣品包括通常在臨床或研究實(shí)驗(yàn)室中測試的任何類型的樣品，包括但不限于血液、血清、血漿、血液部分、關(guān)節(jié)液、尿液、精液、唾液、糞便、腦脊髓液、胃內(nèi)容物、陰道分泌物、組織勻漿、骨髓抽取液、骨勻漿、痰、抽吸物、拭子和拭子渣液(rinsates)、 其它體液等。在另一個(gè)實(shí)施方式中，可以對臨床樣品進(jìn)行培養(yǎng)并使用培養(yǎng)樣品。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)了在研究以及獸用和醫(yī)藥應(yīng)用中的用途?？梢垣@取臨床樣品的合適受試者一般是哺乳動(dòng)物受試者，但是可以是任何動(dòng)物。如本文中所用的術(shù)語“哺乳動(dòng)物”包括但不限于人、非人靈長類動(dòng)物、牛、綿羊、山羊、豬、馬、貓、狗、兔子、嚙齒類動(dòng)物(例如，大鼠或小鼠)等。人類受試者包括新生兒、嬰幼兒、青少年、成年人和老年受試者?？梢垣@取樣品的受試者包括但不限于哺乳動(dòng)物、鳥類、爬行動(dòng)物、兩棲動(dòng)物和魚類?？梢赃M(jìn)行測試的非臨床樣品包括物質(zhì)，所述物質(zhì)包含但不限于食品、飲料、藥物、 化妝品、水(例如，飲用水、非飲用水、和廢水)、海水壓載物、空氣、土壤、污水、植物材料(種子、葉子、莖、根、花、果實(shí))、血液制品(例如血小板、血清、血漿、白血細(xì)胞部分等)、捐贈器官或組織樣品、生物戰(zhàn)樣品等等。方法也尤其十分適合實(shí)時(shí)測試以監(jiān)控工業(yè)環(huán)境中的污染水平、過程控制、質(zhì)量控制等。在另一個(gè)實(shí)施方式中，可以對非臨床樣品進(jìn)行培養(yǎng)，并使用培養(yǎng)樣品。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，樣品獲自患有或疑似患有微生物感染的受試者(例如，患者)。在一個(gè)實(shí)施方式中，受試者患有或疑似患有敗血癥，例如，菌血癥或真菌血癥。 樣品可以是直接獲自受試者的血液樣品。樣品可以來自由患者的血液樣品生長的血液培養(yǎng)物，例如BacT/ALERT 血液培養(yǎng)物。血液培養(yǎng)樣品可以來自陽性血液培養(yǎng)物，例如，表明微生物存在的血液培養(yǎng)物。在某些實(shí)施方式中，樣品在其轉(zhuǎn)為陽性之后短時(shí)間內(nèi)，例如約6小時(shí)之內(nèi)，例如約5、4、3、或2小時(shí)內(nèi)，或在約60分鐘，例如約55、50、45、40、35、30、25、20、15、 10、5、4、3、2或1分鐘內(nèi)取自陽性血液培養(yǎng)物。在一個(gè)實(shí)施方式中，樣品取自其中微生物處于對數(shù)生長期的培養(yǎng)物。在另一個(gè)實(shí)施方式中，樣品取自其中微生物處于靜止期的培養(yǎng)物。本發(fā)明提供了用于檢測、表征和/或鑒定微生物的高靈敏度。這能夠使檢測、表征和/或鑒定無需首先必須經(jīng)過下列步驟通過使它們在固體或半固體培養(yǎng)基上生長來分離微生物，以及對生長的菌落采樣。因此，在本發(fā)明一個(gè)實(shí)施方式中，樣品不是來自在固體或半固體表面上生長的微生物(例如，細(xì)菌、酵母菌或霉菌)菌落。因此在本發(fā)明一個(gè)實(shí)施方式中，樣品不是來自在固體或半固體表面上生長的微生物(例如，細(xì)菌、酵母菌或霉菌)菌落。樣品的體積應(yīng)該足夠大以產(chǎn)生實(shí)施本發(fā)明方法的分離/離析步驟后可以進(jìn)行探詢的微生物的分離樣品或微生物顆粒。適當(dāng)?shù)捏w積將取決于樣品的來源和樣品中微生物的預(yù)期水平。例如，陽性血液培養(yǎng)物將含有比待檢測污染的飲用水樣品更高的每體積微生物水平，因此可能需要相對于飲用水樣品體積更小的血液培養(yǎng)基。一般而言，樣品大小可以是低于約50ml，例如，低于約40、30、20、15、10、5、4、3、或^11。在某些實(shí)施方式中，樣品大小可以是約1ml，例如約0. 75、0.5或0. 25ml。在某些實(shí)施方式中，其中分離以微量規(guī)模進(jìn)行，則樣品大小可以是低于約200 μ 1，例如，低于約150、100、50、25、20、15、10或5μ 1。在一些實(shí)施方式中(例如，當(dāng)期望樣品含有少量微生物時(shí))，樣品大小可以是約IOOml或更大，例如， 約 250、500、750 或 IOOOml 或更大?？蛇x的溶胞步驟在一些實(shí)施方式中，獲得樣品之后，本發(fā)明的方法中的下一個(gè)步驟是選擇性地溶解樣品中可能存在的不想要的細(xì)胞，例如血液細(xì)胞和/或組織細(xì)胞。細(xì)胞可以溶解以允許微生物與樣品的其它組分分離。微生物與其它組分的分離防止在探詢步驟期間產(chǎn)生干擾。 如果期望非微生物細(xì)胞在樣品中不存在或期望其不會干擾探詢步驟，則可以不需要實(shí)施溶胞步驟。在一個(gè)實(shí)施方式中，待溶解的細(xì)胞是樣品中存在的非微生物細(xì)胞且可能存在于樣品中的微生物細(xì)胞不發(fā)生溶解。然而，在一些實(shí)施方式中，特定種類的微生物的選擇性溶胞可能是所期望的并因此可以根據(jù)本文中描述的以及本領(lǐng)域內(nèi)眾所周知的方法進(jìn)行實(shí)施。例如，可以選擇性地溶解不想要的微生物種類，例如溶解酵母菌，而不溶解細(xì)菌或反之亦然。 在另一個(gè)實(shí)施方式中，溶解所需的微生物以便分離微生物的特定亞細(xì)胞組分，例如，細(xì)胞膜或細(xì)胞器。在一個(gè)實(shí)施方式中，溶解所有的非微生物細(xì)胞。在其它實(shí)施方式中，溶解一部分的非微生物細(xì)胞，例如，溶解防止干擾探詢步驟的足夠多的細(xì)胞。細(xì)胞的溶解可以通過本領(lǐng)域內(nèi)已知的有效地選擇性溶解細(xì)胞而溶解或不溶解微生物的任何方法進(jìn)行實(shí)施，包括但不限于加入溶胞溶液、超聲處理、滲透壓沖擊、化學(xué)處理和/或其組合。溶胞溶液是一種能夠溶解細(xì)胞例如非微生物細(xì)胞(例如，通過溶解真核細(xì)胞膜) 和/或微生物細(xì)胞的溶液。在一個(gè)實(shí)施方式中，溶胞溶液可以包含一種或多種清潔劑、一種或多種酶、或一種或多種清潔劑和一種或多種酶的組合，并且可以進(jìn)一步包含其它物質(zhì)。在一個(gè)實(shí)施方式中，清潔劑可以是非變性溶胞清潔劑，諸如Triton X-100、Triton X-100-R、 撲土切11 父-114、肥-40、66皿口01 (-100、66皿口01 父-100、18印&1 0六 630、Arlasolve 200、 Brij 96/97、CHAPS、辛基β _D_吡喃葡萄糖苷、皂苷和單十二烷基九乙二醇醚(C12E9，聚多卡醇(polidocenol))。可選地，可以包含變性溶胞清潔劑，諸如十二烷基硫酸鈉、N-月桂酰肌氨酸、脫氧膽酸鈉、膽汁鹽類、十六烷基三甲基溴化銨、SB3-10、SB3-12、氨基磺基甜菜堿-14(amidosulfobetaine-14)和C7Bz0?？蛇x地，還可以包含增溶劑，諸如Brij 98、Brij 58、Brij 35、Tween 80、Tween 20、Pluronic L64、Pluronic P84、非-清潔性磺基甜菜堿(NDSB 201)、兩親高分子(amphipols) (PMAL-C8)和甲基-β-環(huán)糊精。通常，非-變性清潔劑和增溶劑以超過其臨界膠束濃度(CMC)的濃度使用，而變性清潔劑可以以低于其 CMC的濃度加入。例如，非-變性溶胞清潔劑可以在約0. 010%至約10%，例如約0. 015% 至約1. 0 %，例如約0. 05 %至約0. 5 %，例如約0. 10 %至約0. 30 % (用樣品稀釋后的最終濃度)的濃度使用。在另一個(gè)實(shí)施方式中，可以優(yōu)選使用聚氧乙烯清潔劑。聚氧乙烯清潔劑可以包含C12_18/E9_1(1結(jié)構(gòu)，其中C12_18表示12 18個(gè)碳原子的碳鏈長度和E9,表示9 10 個(gè)氧乙烯親水性頭基團(tuán)。例如，聚氧乙烯清潔劑可以選自Brij 97、Brij 96V、Genapol C-100、Genapol X-100、單十二烷基九乙二醇醚(聚多卡醇)，或其組合組成的組?？梢杂迷谌馨芤褐械拿赴ǖ幌抻?，消化核酸和其它膜污染物質(zhì)的酶(例如，蛋白酶XXIII、脫氧核糖核酸酶、神經(jīng)氨糖酸苷酶、多糖酶、Glucanex 和Pectinex )。 可以使用的其它添加劑包括但不限于還原劑諸如2-巰基乙醇Q-Me)或二硫蘇糖醇(DTT) 和穩(wěn)定劑諸如鎂、丙酮酸鹽和保濕劑。溶胞溶液可以在適合溶解所需細(xì)胞的任何PH下進(jìn)行緩沖，而這將取決于多種因素，包括但不限于，樣品的類型、待溶解的細(xì)胞和所用的清潔劑。 在一些實(shí)施方式中，PH可以處于約2至約13，例如約6至約13，例如約8至約13，例如約 10至約13的范圍中。合適的pH緩沖劑包括能夠保持pH處于所需范圍中的任何緩沖劑，例如，約0. 05M至約1. OM的CAPS。在一個(gè)實(shí)施方式中，將樣品和溶胞溶液混合然后孵育足以發(fā)生細(xì)胞膜的溶胞和溶解的一段時(shí)間，例如，約 1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、40、50 或 60 秒，或約 2、3、4、5、6、7、8、 9、10、15或20分鐘或更長的時(shí)間，例如，約1秒至約20分鐘，約1秒至約5分鐘，或約1秒至約2分鐘。孵育時(shí)間將取決于溶胞溶液的強(qiáng)度，例如清潔劑和/或酶的濃度。一般而言， 越弱的溶胞緩沖劑越需要更長的時(shí)間和更大的樣品稀釋度來完全溶解非微生物細(xì)胞。溶胞溶液的強(qiáng)度可以基于樣品中已知存在或疑似存在的微生物進(jìn)行選擇。對于更易于溶胞的微生物，可以使用弱溶胞溶液。溶胞可以在約2°C至約45°C，例如約15°C至約40°C，例如約 30°C至約40°C的溫度下發(fā)生。在一個(gè)實(shí)施方式中，可以將溶胞溶液載入到注射器中，然后可以將樣品吸入到注射器中從而使混合和孵育在注射器內(nèi)發(fā)生。在一個(gè)實(shí)施方式中，可以將溶胞溶液載入到注射器中，然后將樣品吸入到注射器中從而使混合和孵育在注射器內(nèi)發(fā)生。在一些實(shí)施方式中，溶胞條件(例如，溶液或孵育時(shí)間)，以及分離和/或探詢步驟，能夠足以殺死樣品中一些或所有的微生物。本發(fā)明的方法是高度通用的并且不要求所有微生物對于要發(fā)生的分離和鑒定都是活著的。在某些實(shí)施方式中，一些或所有的微生物可以是死亡的，死亡可以發(fā)生在本發(fā)明方法的步驟實(shí)施之前、期間和/或之后。在本發(fā)明的實(shí)踐中所考慮的溶胞緩沖劑的更多細(xì)節(jié)和描述公開在于2009年10月 30 日提交的標(biāo)題為“Methods for Isolation and Identification of Microorganisms”， 序列號為no. _的未決美國專利申請中，將其內(nèi)容結(jié)合于本文中作為參考。分離步驟本發(fā)明的方法中的下一步驟(例如，如果進(jìn)行溶胞步驟，則是在樣品已經(jīng)被溶胞之后的步驟)是分離步驟?？梢詫?shí)施分離步驟以使微生物與樣品的其它組分(例如，非微生物或其組分)分離，并將微生物濃縮成為實(shí)現(xiàn)鑒定和表征目的可以進(jìn)行探詢的顆粒。分
13離不必是完全的，即，不要求達(dá)到100%的分離。需要的是微生物與樣品的其它組分的分離足以允許對微生物進(jìn)行探詢且基本上不會受到其它組分干擾。例如，分離能夠產(chǎn)生至少約 10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%或 99%純度的或更高純度的微生物顆粒。在一個(gè)實(shí)施方式中，分離通過離心步驟實(shí)施，其中將樣品(例如，溶胞樣品)置于分離容器中的密度緩沖墊層的頂部并且將容器在允許微生物被分離的條件下離心(例如， 微生物可以在容器的底部和/或側(cè)面上形成顆粒)。根據(jù)該實(shí)施方式，樣品的其它組分(例如，在樣品培養(yǎng)基中可能存在的非微生物或其組分)保留在密度緩沖墊層的頂部或在密度緩沖墊層的頂層部分內(nèi)。一般而言，任何已知的容器都可以用于分離步驟。在一個(gè)實(shí)施方式中，分離容器是在于2009年10月30日提交的標(biāo)題為“S印aration Device for Use in the Separation, Characterization and/or Identification of Microorganisms" (^Ιψ 列號為—中的有關(guān)美國專利申請中公開的分離裝置。該分離步驟從樣品中的物質(zhì)諸如培養(yǎng)基、細(xì)胞碎片和/或其它可能干擾微生物的探詢(例如，通過內(nèi)熒光)的組分中分離出微生物。在一個(gè)實(shí)施方式中，密度緩沖墊層還用于分離活的微生物和死亡的微生物(其不通過密度緩沖墊層)。在另一個(gè)實(shí)施方式中，密度緩沖墊層不含有密度梯度，無論是在離心之前還是在離心之后。換句話說，對分離容器離心的時(shí)間和/或加速度的量不足以使組成密度緩沖墊層的物質(zhì)形成密度梯度。選擇緩沖墊層的密度以便使樣品中的微生物通過緩沖墊層而樣品的其它組分 (例如，血液培養(yǎng)液、細(xì)胞碎片)仍保留在緩沖墊層的頂部或沒有完全通過密度緩沖墊層。 也可以選擇密度緩沖墊層用來分離活的微生物(其通過緩沖墊層)和死亡的微生物(其不通過緩沖墊層)。合適的密度將取決于密度緩沖墊層中所用的物質(zhì)以及待分離的樣品。在一個(gè)實(shí)施方式中，緩沖墊層的密度在約1. 025至約1. 120g/ml，例如約1. 030至約1. 070g/ ml，約1. 040至約1. 060g/mL的范圍中或在約1. 025至約1. 120g/ml之間的任何范圍中。在另一個(gè)實(shí)施方式中，緩沖墊層的密度為約1. 025,1. 030,1. 035,1. 040,1. 045,1. 050,1. 055、 1. 060、1. 065、1. 070、1. 075、1. 080、1. 085、1. 090、1. 095、1. 100、1. 105、1. 110、1. 115 或 1.120g/ml。用于密度緩沖墊層的物質(zhì)可以是具有用于本發(fā)明方法的適當(dāng)?shù)拿芏确秶娜魏挝镔|(zhì)。在一個(gè)實(shí)施方式中，物質(zhì)是膠體二氧化硅。膠體二氧化硅可以是未涂覆的(例如， Ludox (W.R.Grace，CT))或者是例如用硅烷(例如，PureSperm (Nidacon Int' 1，瑞典) 或 Isolate (Irvine Scientific, Santa Ana, CA))或聚乙烯吡咯烷酮(例如，Percoll ， Percol 1 Plus (Sigma-Aldrich，St. Louis，MO))涂覆的。在一個(gè)實(shí)施方式中，選擇了對光譜探詢產(chǎn)生最小干擾作用的膠體二氧化硅，例如，具有最低內(nèi)熒光的物質(zhì)。膠體二氧化硅可以在任何合適的介質(zhì)中稀釋以形成合適的密度，例如，平衡鹽溶液、生理鹽水和/或 0. 25M的蔗糖。合適的密度可以采用濃度為約15%至約80% v/v，例如約20%至約65% ν/ν的膠體二氧化硅獲得。密度緩沖墊層的另一種合適的物質(zhì)是碘化造影劑，例如碘海醇 (Omnipaque NycoPi^p ，或 Nycodenz )和碘克沙醇(Visipaque 或 OptiPi^p )。對于血液培養(yǎng)樣品，合適的密度可以采用濃度為約10%至約25% w/v，例如約14%至約18% w/ ν的碘海醇或碘克沙醇獲得。對于血液培養(yǎng)樣品，蔗糖可以以約10%至約30% w/v例如約 15%至約20% w/v的濃度用作密度緩沖墊層?？梢杂糜谥苽涿芏染彌_墊層的其它合適的物質(zhì)包括低粘度高密度的油，諸如顯微鏡浸鏡油(例如，Type DF5Cargille Labs,New York)； 礦物油(例如，Drakeol 5, Draketex 50, Peneteck ；Penreco Co. , Pennsylvania)；娃油 (聚二甲基硅氧烷)；氟硅油；硅凝膠；甲泛影酸鹽-Ficoll (LymphoPri5pTM)，例如，對于血液培養(yǎng)樣品在約75%至約100%濃度下；泛影酸鹽-葡聚糖(PolymorphoPr印)，例如，對于血液培養(yǎng)樣品在約25%至約50%濃度下；羧甲基纖維素；羥丙基甲基纖維素；聚環(huán)氧乙烷 (高分子量)；Pluronic F 127 ；Pluronic F68 ；Pluronic 化合物的混合物；聚丙烯酸； 交聯(lián)的聚乙烯醇；交聯(lián)的聚乙烯吡咯烷；PEG甲醚甲基丙烯酸酯；果膠；瓊脂糖；黃原膠；膠凝糖；Phytagel ；山梨醇；Ficoll (例如，對于血液培養(yǎng)樣品濃度為約10%至約15%的 Ficoll 400)；甘油；葡聚糖(例如，對于血液培養(yǎng)樣品在約10%至約15%的濃度下)；糖原；氯化銫(例如，對于血液培養(yǎng)樣品在約15%至約25%的濃度下)；全氟碳流體(例如， 全氟正辛烷)；氫氟碳流體(例如，Vertrel XF)；和本領(lǐng)域內(nèi)眾所周知的類似物質(zhì)等等。在一個(gè)實(shí)施方式中，密度緩沖墊層選自以任意組合形式存在的一種或多種膠體二氧化硅、碘克沙醇、碘海醇、氯化銫、甲泛影酸鹽-FiC011 、泛影酸鹽-葡聚糖、蔗糖、FiC011 400、和/ 或葡聚糖。密度緩沖墊層也可以由物質(zhì)的組合構(gòu)成，例如膠體二氧化硅和油的組合。上述化合物的某些組合對于本發(fā)明的分離和讀數(shù)步驟是有益的。例如，具有不同UV-淬滅性質(zhì)的化合物的組合，如氯化銫和碘海醇。 密度緩沖墊層的體積/高度應(yīng)該足以實(shí)現(xiàn)微生物與其它樣品組分的分離。體積將取決于分離容器的大小和形狀。一般而言，可以使用約0. 1至約5ml的體積，例如約0. 2 至約1ml，例如約0. 2ml至約0. 5ml。如果以微量規(guī)模進(jìn)行分離，則密度緩沖墊層的體積可以是約1μ 1至約ΙΟΟμ 1，例如約5μ 1至約50 μ 1。在密度緩沖墊層的頂部放置或鋪層的樣品的體積應(yīng)該足以提供可產(chǎn)生適合探詢的顆粒的足夠的微生物。一般而言，可以使用適合裝入到容器中的任何體積。例如，可以使用約0. Iml至約5ml的體積，例如約0. 2ml至約1ml，例如約0. 2ml至約0. 5ml。如果以微量規(guī)模進(jìn)行分離，則樣品的體積可以是約1 μ 1 至約ΙΟΟμ 1，例如約5μ 1至約50 μ 1。對于樣品在容器中的可利用空間將取決于容器的尺寸和形狀。在一些實(shí)施方式中，在將樣品放置或鋪層在頂部之前可以將中間層(液體或固體)放置在密度緩沖墊層的頂部以防止密度緩沖墊層和樣品之間的任何混合。在一個(gè)實(shí)施方式中，中間層可以是聚乙烯珠。在另一個(gè)實(shí)施方式中，可以在密度緩沖墊層和樣品之間放置小氣泡以防止混合。在另外的實(shí)施方式中，可以將密度緩沖墊層鋪層在高密度物質(zhì)(例如，全氟碳流體)的頂部從而使微生物在分離期間通過密度緩沖墊層并在密度緩沖墊層和高密度物質(zhì)之間的界面處收集。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，分離容器在甩平式轉(zhuǎn)頭中進(jìn)行離心從而使微生物直接在容器底部上形成顆粒。在足夠的加速度下將容器離心足夠長的時(shí)間從而使微生物與其它樣品組分分離(例如形成的顆粒)。離心加速度可以是約1，000 Xg至約20，OOOX g，例如約2，500 X g至約15，000 X g,例如約7，500 X g至約12，500 X g，等。離心時(shí)間可以是約 30秒至約30分鐘，例如約1分鐘至約15分鐘，例如，約1分鐘至約5分鐘。離心可以在約 2°C至約45°C，例如約15°C至約40°C，例如約20°C至約30°C的溫度下進(jìn)行實(shí)施。在一個(gè)實(shí)施方式中，分離容器包含封套，并在離心之前將封套應(yīng)用于容器以形成氣密式密封。封套的存在降低了處理具有或可能具有傳染性和/或危險(xiǎn)性的微生物的風(fēng)險(xiǎn)，以及污染樣品的風(fēng)險(xiǎn)。本發(fā)明方法的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是能夠采用密封容器(例如，氣密式密封容器)內(nèi)的微生物實(shí)施方法的任意一個(gè)或多個(gè)步驟(例如，溶胞、分離、探詢、和/或鑒定)。本發(fā)明方法，涉及自動(dòng)化系統(tǒng)的應(yīng)用，避免與處理高毒性微生物相關(guān)的健康和安全性風(fēng)險(xiǎn)，諸如從樣品中回收微生物用于直接測試發(fā)生的。在一個(gè)實(shí)施方式中，對容器離心的時(shí)間和/或力不足以在密度緩沖墊層內(nèi)形成密度梯度。本發(fā)明不涉及樣品的超離心，例如，在超過約100，OOOXg的力下離心。而且，本發(fā)明也不涉及等密度(平衡)沉降或分帶。分離容器可以是任何具有足以容納密度緩沖墊層和樣品的容積的容器。如本文中所指出的，在本發(fā)明的實(shí)踐中可以使用在于2009年10月30日提交的標(biāo)題為“S印aration Device for Use in the Separation， Characterization and/or Identification of
Microorganisms”序列號為__的有關(guān)美國專利申請中公開的分離裝置。在一個(gè)實(shí)施
方式中，容器剛好放入或能夠被剛好放入到離心機(jī)轉(zhuǎn)子中。容器的容積可以是約0. Iml至約25ml，例如約Iml至約10ml，例如約2ml至約8ml。如果分離以微量規(guī)模進(jìn)行，容器的容積可以是約2μ 1至約100μ 1，例如，約5μ 1至約50 μ 1。在一個(gè)實(shí)施方式中，容器在其上層部具有寬的內(nèi)徑以容納樣品和大部分的密度緩沖墊層，而在收集微生物顆粒的下層部分具有較窄的內(nèi)徑。窄部分具有的內(nèi)徑可以是約0.04至約0. 12英寸，例如約0.06至約0. 10 英寸，例如約0. 08英寸。寬部分具有的內(nèi)徑可以是約0. 32至約0. 40英寸，例如約0. 34至約0.38英寸，例如約0.36英寸。對于微量分離，內(nèi)徑可以甚至更小。例如，窄部分的內(nèi)徑可以是約0. 001至約0. 04英寸，例如，約0. 002至約0. 01英寸。錐形內(nèi)徑部分可以連接上下層部分。錐形部分具有的角度可以是約20至約70度，例如約30至約60度。在一個(gè)實(shí)施方式中，下層窄部分低于容器的總高度的一半，例如，低于容器的總高度的約40%、30%、 20%或10%。容器可以具有連接的封套裝置或可以通過螺紋接受封套裝置(例如，封蓋) 從而使容器在離心期間可以是密封式封閉的。在某些實(shí)施方式中，容器經(jīng)過設(shè)計(jì)以便使微生物樣品或顆?？梢栽诜蛛x之后很容易地回收、或另外獲得或從容器中移出，不論是以手動(dòng)還是自動(dòng)的方式(從而使技術(shù)人員不會暴露于容器的內(nèi)容物)。例如，容器可以包含含有顆粒并能夠與容器其余部分分開的可卸下部分或脫離部分。在另一個(gè)實(shí)施方式中，容器包含用于分離之后接近顆粒的工具，諸如一個(gè)或多個(gè)用于插入注射器或其它采樣裝置或用于吸出顆粒的孔道或可穿透的表面。在一個(gè)實(shí)施方式中，容器可以是管，例如離心管。在另一個(gè)實(shí)施方式中，容器可以是小片或卡片。在一個(gè)實(shí)施方式中，容器是獨(dú)立容器，即分離單個(gè)樣品的裝置。在其它實(shí)施方式中，容器是包含兩個(gè)或更多個(gè)分離容器從而能夠同時(shí)分離多個(gè)樣品的裝置的部分。在一個(gè)實(shí)施方式中，裝置包含2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20、25、 30、36、42、48、60、72、84、96或更多個(gè)分離容器。容器可以包含光學(xué)窗口，通過該光學(xué)窗口探詢能夠進(jìn)行。光學(xué)窗口可以是在容器的底部、頂部和/或側(cè)面。窗口能夠由具有可區(qū)別于微生物譜圖的振動(dòng)結(jié)構(gòu)的任何材料組成?？梢允褂闷渌鼌^(qū)分技術(shù)諸如共焦拉曼光譜法采集微生物的振動(dòng)光譜同時(shí)剔除窗口材料的光譜；這種技術(shù)為本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員眾所周知的。另外一種技術(shù)是空間偏轉(zhuǎn)拉曼光譜法， 其中激發(fā)光纖沿著窗口從發(fā)射(瑞利和拉曼光譜)置換。這種技術(shù)作為區(qū)分窗口材料和在窗口下方待測定的數(shù)量之間的方法對于本領(lǐng)域技術(shù)人員也是已知的。為了能夠采用其它光譜學(xué)技術(shù)進(jìn)行微生物顆粒的探詢，窗口也可以由任何對光(例如，至少部分近紅外光(NIR; 700nm-1400nm)，紫外光(UV ； 190nm_400nm)和 / 或可見光(VIS ；400nm-700nm)光譜)透明的材料組成。在一個(gè)實(shí)施方式中，光學(xué)窗口足夠薄而容許光譜探詢，這將取決于窗口的材料和探詢所用的方法。在另一個(gè)實(shí)施方式中，光學(xué)窗口盡可能薄而降低光譜探詢的干涉。例如窗口能夠具有低于約0. 20英寸，例如，低于約0. 15，0. 10，或0. 05英寸的厚度。在另一個(gè)實(shí)施方式中，通過過濾步驟實(shí)施分離，在所述的過濾步驟中，將樣品(例如溶胞樣品)放置于裝有具有阻留微生物的孔徑的選擇性過濾器或過濾裝置。所阻留的微生物可以通過使合適的緩沖液緩緩地通過過濾器來進(jìn)行洗滌。然后洗滌的微生物可以直接在過濾器上進(jìn)行探詢和/或通過直接在過濾器表面上采樣或通過用合適的水性緩沖溶液反沖洗過濾器回收進(jìn)行探詢。探詢步驟 一旦已將微生物分離、離析和/或?；?，可以對分離的樣品、離析的樣品或顆粒進(jìn)行探詢以鑒定和/或表征樣品或顆粒中的微生物。在一個(gè)實(shí)施方式中，探詢以非侵入方式進(jìn)行，即，對顆粒進(jìn)行探詢同時(shí)其保留在分離容器中。在另一個(gè)實(shí)施方式中，分離容器在整個(gè)探詢期間保持密封。以非侵入方式鑒定微生物的能力，可選地加上在整個(gè)分離和鑒定/ 表征過程期間保持容器密封并使一些或所有的步驟自動(dòng)化，從而避免不斷處理受污染的和 /或感染性的樣品并大大地提高了整個(gè)工藝的安全性。另外，通過直接探詢而不進(jìn)一步處理顆粒(例如，再懸浮、平板培養(yǎng)和菌落生長)進(jìn)行鑒定微生物的能力，大大地提高了能夠進(jìn)行鑒定/表征的速度。在一個(gè)實(shí)施方式中，在探詢之前將顆粒從分離容器中回收和/或再懸浮和可選地移出。在另一個(gè)實(shí)施方式中，在原位探詢之后將顆?；厥蘸?或再懸浮，然后實(shí)施進(jìn)一步的探詢。例如，能夠應(yīng)用于分離的微生物而不是微生物顆粒的技術(shù)諸如膠乳凝集測試或自動(dòng)表型鑒定測試能夠在回收的和/或再懸浮的微生物上實(shí)施。在一些實(shí)施方式中，可以對離析的樣品或顆粒進(jìn)行光譜探詢。光譜法能夠用于分析微生物的一種或多種固有性質(zhì)，例如，在不存在其它物質(zhì)，諸如染色劑、染料、結(jié)合劑等的情況下微生物內(nèi)存在的性質(zhì)。在其它實(shí)施方式中，光譜法可以用于分析微生物的一種或多種非固有性質(zhì)，例如，只有在其它物質(zhì)的輔助下才能檢測到的性質(zhì)。探詢可以采用例如紅外光譜法進(jìn)行實(shí)施。拉曼光譜法包括表面增強(qiáng)拉曼光譜法(SERS)、空間偏轉(zhuǎn)拉曼光譜法 (SORS)、透射拉曼光譜法和/或共振拉曼光譜法。為了增強(qiáng)拉曼(SERS)信號，微生物可以在離心之前用金和/或銀納米粒子涂層，和/或內(nèi)部光學(xué)表面可以用特定尺寸和形狀的金屬膠體預(yù)先涂層(對于 SERS,Efrima 等，J. Phys. Chem. B. (Letter) 102 :5947 (1998))。在另一個(gè)實(shí)施方式中，納米粒子在離心之前存在于密度緩沖墊層中并且當(dāng)微生物通過密度緩沖墊層時(shí)與微生物締合。在一個(gè)實(shí)施方式中，對離析的樣品或顆粒進(jìn)行探詢同時(shí)其仍保留在分離容器中?？梢酝ㄟ^容器上的光學(xué)窗口對容器進(jìn)行探詢。光學(xué)窗口可以在容器的底部和 /或任何一個(gè)側(cè)面或多個(gè)側(cè)面和/或頂部上。在一個(gè)實(shí)施方式中，分離容器在適合探詢的位置上放入或能夠被放入到光譜儀的支架中。光譜探詢可以通過本領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員已知的用于有效地檢測和/鑒定微生物的一種或多種固有或非固有性質(zhì)的任何技術(shù)進(jìn)行實(shí)施。在另一個(gè)實(shí)施方式中，如本文中所述的，可以將離析的樣品或顆粒移出用于探詢(例如，可以將離析的樣品或顆粒移出并制備用于通過質(zhì)譜進(jìn)行探詢，如本領(lǐng)域內(nèi)眾所周知的)。在又一個(gè)實(shí)施方式中，可以采用一種以上的方式對離析的樣品或顆粒進(jìn)行探詢。例如，可以采用熒光光譜法和拉曼光譜法對離析的樣品或顆粒進(jìn)行探詢。根據(jù)該實(shí)施方式，可以連續(xù)地或同時(shí)地實(shí)施這些探詢步驟。樣品激發(fā)源可以選自本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員已知的許多合適的光源?？梢允褂卯a(chǎn)生可用數(shù)據(jù)的電磁波譜的任何部分。能夠在紫外、可見和/或近紅外光譜中發(fā)射的光源，以及電磁波譜的其它部分，都可以利用并且對于本領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員都是已知的。因?yàn)槔庾V圖的產(chǎn)生一般是一個(gè)低效率過程(例如，對于每1百萬個(gè)入射光子產(chǎn)生1個(gè)拉曼光子)，拉曼需要具有大光子通量的光源。自從1960年發(fā)明激光(Maiman，《自然》(Nature))以來， 拉曼系統(tǒng)已經(jīng)使用激光光源來獲得拉曼光譜圖。使激光通過高選擇性(陷波)濾波器從而使得窄波長帶的激光發(fā)射傳導(dǎo)通過濾波器而同時(shí)阻斷由激光產(chǎn)生的其它贗像(artifacts) (例如，放大的自發(fā)發(fā)射、熒光、等離子體線等)。采用能夠通過采用中繼透鏡系統(tǒng)、光學(xué)纖維或二者的組合產(chǎn)生的各種光學(xué)系統(tǒng)將來自激光器的光引導(dǎo)至樣品。采用透鏡(諸如顯微鏡物鏡)將激光聚焦于樣品上從而獲得在樣品上的集中光能量的小斑點(diǎn)。 拉曼反向散射光和反向散射激發(fā)光都通過相同的顯微鏡物鏡進(jìn)行收集和校準(zhǔn)。散射光經(jīng)過濾光器將拉曼散射光與激發(fā)光分離。然后采用透鏡和/或光學(xué)纖維系統(tǒng)將拉曼散射光傳播至分散拉曼散射光的光譜儀上，從而使其碰撞到CCD檢測器陣列上。拉曼散射光的空間色散產(chǎn)生可以被儲存并與參考光譜圖比較用于表征的光譜 (例如，散射波長vs.強(qiáng)度)。樣品的發(fā)射可以通過任何合適的光譜區(qū)分裝置進(jìn)行測定，最優(yōu)選采用光譜儀。光譜儀可以是檢測特定發(fā)射波長的掃描單色器，由此從單色器產(chǎn)生的輸出通過光電倍增管進(jìn)行檢測，和/或分光光度計(jì)可以被設(shè)置為成像光譜儀，由此輸出通過成像檢測器陣列諸如電荷耦合器件(CCD)檢測器陣列檢測。在一個(gè)實(shí)施方式中，鑒別器允許通過光電檢測裝置(諸如，光電倍增管、雪崩光電二極管、CCD檢測器陣列和/或電子倍增電荷耦合器件 (EMCCD)檢測器陣列)觀察熒光和/或散射信號。根據(jù)本發(fā)明，對于已知微生物進(jìn)行了對照測量，由此實(shí)現(xiàn)采用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的各種數(shù)學(xué)方法使所測量的試驗(yàn)數(shù)據(jù)與所關(guān)注的微生物的表征相關(guān)。例如， 使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的軟件系統(tǒng)可以將樣品的數(shù)據(jù)與基線或?qū)φ諟y量結(jié)果進(jìn)行對比。更具體而言，這些數(shù)據(jù)可以通過許多多元分析方法，諸如例如一般判別分析法 (General Discriminant Analysis) (GDA)、偏最小二乘判另U 分析法(Partial Least Squares Discriminant Analysis) (PLSDA)、偏最小二乘回歸(Partial Least Squares regression)、主成分分析(Principal Component Analysis) (PCA)、平行因素分析 (Parallel Factor Analysis) (PARAFAC)、神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)分析(Neural Network Analysis) (NNA) 和/或支持向量機(jī)(Support Vector Machine) (SVM)進(jìn)行分析。這些方法可以用于將所關(guān)注的未知微生物基于已存在的命名分類到相關(guān)組，和/或基于在如以前所述的設(shè)計(jì)用于監(jiān)控、檢測和/或表征生物體的系統(tǒng)中的生物體的代謝、病原性和/或毒力分類到天然存在組。在又一個(gè)實(shí)施方式中，可以使用根據(jù)檢測系統(tǒng)的非-光譜測量結(jié)果諸如檢測時(shí)間和生長速率來輔助表征和/或鑒定離析的樣品或顆粒中的微生物。另外，取自分離裝置下部區(qū)域的照片圖像的測量結(jié)果可以提供關(guān)于鑒別分離物的有價(jià)值的信息，諸如顆粒大小、 形狀、顏色和密度。在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，離析的樣品或顆粒中的微生物的表征和/或鑒定不需要涉及精確物種的鑒定。表征涵蓋了生物微粒的廣泛分類或分級以及單一物種的實(shí)際鑒定。離析的樣品或顆粒中的微生物的分類可以包含對微生物的表型和/或形態(tài)學(xué)特征的測定。例如，生物微粒的表征可以基于可觀察的差異，諸如組成、形狀、大小、聚簇和/或代謝實(shí)現(xiàn)。在一些實(shí)施方式中，所關(guān)注的生物微粒的分類可能不需要給定的生物微粒的特征的先驗(yàn)知識而只需要與經(jīng)驗(yàn)測量結(jié)果一致的相關(guān)性，從而使這種方法比基于特異性結(jié)合事件或代謝反應(yīng)的方法更加通用和更易適應(yīng)。如本文中所用的“鑒定”意指確定以前未知的微生物所屬的科、屬、種和/或菌株。例如，將以前未知的微生物鑒定到科、屬、種和/或菌株水平。在一些情況下，表征包含提供足夠用于采取行動(dòng)的有用信息的分類模型。如本文中所用的優(yōu)選的分類模型包含分組到以下一組或多組(1)革蘭氏組；(2)臨床革蘭氏組； (3)治療組；和(4)功能組。

(1)革蘭氏組在革蘭氏組分類中，基于其革蘭氏染餼反應(yīng)和總尺寸，可以將微生物歸類成三大分類類別之一，所述組選自以下一組或多組(a)采用革蘭氏染色法染成深藍(lán)色的革蘭氏陽性微生物；(b)采用革蘭氏染色法染成紅色的革蘭氏陰性微生物；和(c)采用革蘭氏染色法染成藍(lán)黑色但是通過形態(tài)學(xué)特征和尺寸與細(xì)菌進(jìn)行區(qū)分的非常大的圓形細(xì)胞的酵母細(xì)胞。(2)臨床革蘭氏組可以將革蘭氏組進(jìn)一步分成幾組代表有區(qū)別的形態(tài)學(xué)特征的子類。這些子類包括由有經(jīng)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)室技師報(bào)道的所有相關(guān)臨床信息，并由此提供比陽性或陰性革蘭氏反應(yīng)更高水平的鑒定。這種具體的分類是非常有用的，因?yàn)槠渫ㄟ^采用自動(dòng)化系統(tǒng)提供相當(dāng)?shù)呐R床相關(guān)信息消除了關(guān)于依賴革蘭氏染色質(zhì)量和/或技師讀取涂片的技能水平的問題。更具體而言，基于這種分類模型的微生物子類可以選自以下一種或多種 (a)球菌，其是小而圓的細(xì)胞；(b)雙球菌，其是結(jié)合在一起的兩個(gè)小而圓的細(xì)胞；(c)棒狀菌，其是矩形形狀；和(d)桿菌，其具有桿狀形狀。這些能夠通過其它形態(tài)學(xué)信息確證的子類的實(shí)例包括(i)革蘭氏陽性球菌；(ii)鏈狀革蘭氏陽性球菌；(iii)簇狀革蘭氏陽性球菌(即，“葡萄樣”簇)；(iv)革蘭氏陽性雙球菌；(ν)革蘭氏陽性桿菌；(vi)具有內(nèi)芽孢的革蘭氏陽性桿菌；(vii)革蘭氏陰性桿菌；(viii)革蘭氏陰性球桿菌；(ix)革蘭氏陰性雙球菌；(x)酵母菌；和(xi)絲狀真菌。(3)治療組治療組包括多種微牛物物種，所沭的微牛物物種當(dāng)從具體試樣類型中分離出來時(shí)，用同類抗生素或抗生素的混合物進(jìn)行處理(例如，如在“Sanford Guide to Antimicrobial Therapy 2008”中所述的)。在許多情況下，對于能夠從初始的經(jīng)驗(yàn)療法改變至更靶向的療法的臨床醫(yī)師，不需要鑒定到種水平，因?yàn)橐粋€(gè)以上的物種可以采用相同的抗生素選擇處理。這種分類水平正確地將這些“相同處理”的微生物歸類到單個(gè)治療類另O。這種表征水平的實(shí)例包括區(qū)分高度耐藥的腸桿菌(Enterobacteriacae) (EB)種與敏感 EB種(腸桿菌屬某些種(Enterobacter spp.)與大腸桿菌(E. coli))、或耐氟康唑的念珠菌種(光滑念珠菌(C. glabrata)和克柔念珠菌(C.kruzei))與敏感念珠菌種(白色念珠菌(C. albicans)和近平滑念珠菌(C. parapsilosis))等等的能力。(4)功能組根據(jù)本發(fā)明，基于代謝、毒力和/或表型特性的混合，也可以將微生物歸類到幾個(gè)組中。非發(fā)酵性生物體可以明確地與發(fā)酵性生物體區(qū)分開。而且，產(chǎn)生溶血素的微生物物種可以與非溶血性物種分別進(jìn)行分組。在一些情況下，這些組表示比屬水平(例如，大腸桿菌類，革蘭氏陰性非發(fā)酵性桿菌)更寬泛的類別，一些在屬水平(例如，腸球菌屬(Enterococcus)，念珠菌屬(Candida))，和一些具有更近于種水平的區(qū)分(例如，凝固酶陰性葡萄球菌，α-溶血性鏈球菌，β-溶血性鏈球菌，凝固酶陽性葡萄球菌，即金黃色葡萄球菌(S. aureus))。 除了測量微生物的固有性質(zhì)用于鑒定目的外，本發(fā)明的方法可以進(jìn)一步包含使用其它鑒定劑來輔助分離和/或鑒定方法。與特異性微生物結(jié)合的作用劑，諸如親和配體， 可以用于分離微生物，鑒定微生物的分類或物種(例如，通過與獨(dú)特的表面蛋白或受體結(jié)合)和/或鑒別微生物的特征(例如，抗生素耐藥性)。所用的鑒定劑包括但不限于單克隆和多克隆抗體及其片段(例如，用于金黃色葡萄球菌鑒定的抗-Eap)、核酸探針、抗生素 (例如，青霉素、萬古霉素、多粘菌素B)、適體、肽模擬物、噬菌體衍生的結(jié)合蛋白、凝集素、 宿主先天免疫生物標(biāo)記物(急性期蛋白、LPS結(jié)合蛋白、CD14、甘露糖結(jié)合凝集素、Toll樣受體)，宿主防御肽(例如，防御素、cathelicidins, proteogrins、爪蟾抗菌肽)、細(xì)菌素 (bacterocins)(例如，羊毛硫抗生素(諸如乳酸鏈球菌肽、mersacidin、表皮素、雞葡萄球菌素(gallidermin)和plantaricin C)，和II類肽)、細(xì)菌噬菌體和選擇性用于核酸、月旨質(zhì)、碳水化合物、多糖、莢膜/黏液或蛋白質(zhì)的染料、或其任意組合。如果作用劑自身沒有給出可檢測的拉曼信號，則可以對該作用劑進(jìn)行標(biāo)記，諸如通過將該作用劑與拉曼活性示蹤劑(諸如，二甲基氨基偶氮苯(DAB)和4，4" -二吡啶基(DPY))結(jié)合以提供可檢測信號 (參見，例如，美國專利第5，376，556號和第7，518，721號)?？梢栽诒景l(fā)明方法的任何步驟中，例如當(dāng)獲得樣品時(shí)、溶胞期間、和/或分離期間將作用劑加入微生物中。在一些實(shí)施方式中，在顆粒的探詢期間可以測定該作用劑在顆粒中的存在。如本領(lǐng)域技術(shù)人員所易于理解的，具體微生物對影響其物理狀態(tài)或代謝的任何化合物諸如抗生素的敏感性，可以通過將化合物加入樣品、溶胞緩沖液、密度緩沖墊層或其任何混合物中進(jìn)行快速確定。在本發(fā)明的一個(gè)方面中，方法可以進(jìn)一步包含回收微生物顆粒和實(shí)施另外測試的步驟。在一個(gè)實(shí)施方式中，可以通過從樣品培養(yǎng)基和密度緩沖墊層中吸出來回收顆粒。在另一個(gè)實(shí)施方式中，可以通過將注射器插入容器并將顆粒吸出采回收顆粒，同時(shí)樣品培養(yǎng)基和密度緩沖墊層仍保持完整。然后可以將回收的顆粒再懸浮于合適介質(zhì)例如鹽水中。一旦再懸浮，可以對微生物進(jìn)行任何進(jìn)一步所需的測試，如本領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員公知的以及如以上所述的。具體而言，用再懸浮的微生物可以實(shí)施需要清潔微生物樣品的任何測試。在一些實(shí)施方式中，可以進(jìn)行另外的鑒定測試。鑒定測試的實(shí)例包括Vitek 2、擴(kuò)增和非擴(kuò)增核酸測試(NAT)、顯色和乳膠凝集分析、免疫分析(例如，采用標(biāo)記的抗體和/或其它配體)、 質(zhì)譜法(例如，MALDI-T0F質(zhì)譜法)和/或其它光學(xué)技術(shù)諸如紅外光譜法(FTIR)或拉曼光譜法。也可以進(jìn)行其它表征測試，諸如抗生素和/或其它藥物的耐藥性。其它表征可以是在本方法的初始分離和鑒定步驟期間開始的測試的一部分。例如，耐甲氧西林的金黃色葡萄球菌的檢測可以通過在分離微生物之前將拉曼示蹤物標(biāo)記的青霉素加入樣品中開始。一旦已將顆?；厥詹⑶以賾腋?，可以測定結(jié)合的青霉素水平。在本發(fā)明的一個(gè)方面中，可以使一些或所有的方法步驟自動(dòng)化。使本方法的步驟自動(dòng)化不僅允許更快地測試更多的樣品，而且這也降低了處理可能包含有害和/或傳染性的微生物的樣品中的人為誤差的風(fēng)險(xiǎn)。在本發(fā)明的某些實(shí)施方式中，方法還可以用于檢測測試樣品中微生物的存在。在這些實(shí)施方式中，所述方法包括以下步驟物
(a)獲得測試樣品；

(b)可選地溶解所述樣品中的細(xì)胞以產(chǎn)生溶胞樣品；和(c)使微生與所述溶胞樣品的其它組分分離以形成微生物顆粒；其中顆粒的存在表明在測試樣品中存在微生物。在一個(gè)實(shí)施方式中，采用裸眼檢測顆粒。在其它實(shí)施方式中，通過探詢，例如在光譜學(xué)上檢測顆粒。在一些實(shí)施方式中，檢測方法能夠用于監(jiān)控被微生物污染的樣品，例如食品、藥物、飲用水等。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述方法可以以重復(fù)模式實(shí)施用于定期監(jiān)控污染，例如， 每月一次，每周一次，每天一次，每小時(shí)一次或任何其它時(shí)間模式。在另一個(gè)實(shí)施方式中，可以根據(jù)需要對樣品進(jìn)行檢測，例如，當(dāng)懷疑受到污染時(shí)。在另外的實(shí)施方式中，檢測方法可以用于在臨床樣品例如血液培養(yǎng)物中尋找微生物的存在。例如，在某些時(shí)間點(diǎn)可以將樣品從血液培養(yǎng)基中移出并對樣品實(shí)施檢測方法以測定血液培養(yǎng)物是否是陽性的。在一個(gè)實(shí)施方式中，可以在培養(yǎng)物接種后的設(shè)定時(shí)間點(diǎn)取樣，例如，接種后24小時(shí)取樣，以測定血液培養(yǎng)基是否是陽性的。在另一個(gè)實(shí)施方式中，可以定期例如，每12、6、4或2小時(shí)或每60、50、 40、30、20、15、10或5分鐘從血液培養(yǎng)物中取樣，以在可檢測為陽性的短時(shí)間內(nèi)鑒定陽性血液培養(yǎng)物。在檢測方法的某些實(shí)施方式中，檢測步驟可以可選地在如本文中描述的鑒定方法之后進(jìn)行。在本發(fā)明的一個(gè)方面，可以使一些或所有的方法步驟自動(dòng)化。使方法步驟自動(dòng)化允許檢測更有效地檢測大量的樣品并降低了在處理可能包含有害和/或傳染性的微生物的樣品中的人為誤差的風(fēng)險(xiǎn)。然而，更重要的是，自動(dòng)化能夠在白天或夜晚的任何時(shí)間遞送關(guān)鍵性的結(jié)果而無延誤。一些研究已表明，對導(dǎo)致敗血癥的生物的更快速地鑒定與改善患者護(hù)理，縮短住院時(shí)間和降低整個(gè)成本相關(guān)。根據(jù)本發(fā)明，用于表征和/或鑒定微生物的方法的更多細(xì)節(jié)和描述公開在都于 2009 年 10 月 30 日提交的標(biāo)題分別為“Method for Separation, Characterization and/or Identification of Microorganisms using Spectroscopy" 禾口“Method for Separation,Characterization and/or Identification of Microorganisms using Mass Spectroscopy”序列號分別為—和—的未決美國專利申請中，將其內(nèi)容結(jié)合于本文中作為參考。在以下實(shí)施例中進(jìn)一步詳細(xì)說明本發(fā)明，所述實(shí)施例通過舉例說明的方式提供而不是預(yù)期以任何方式限制本發(fā)明。利用本領(lǐng)域內(nèi)眾所周知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)或下面具體描述的技術(shù)。實(shí)施例實(shí)施例1.用于通過拉曼光譜法鑒定來自血液培養(yǎng)物的微生物的溶胞-離心方法在低接種物水平下將微生物“接種”于含IOmL人血液的BacT/ALERT SA瓶子。在通過BacT/ALERT’ 3D微生物檢測系統(tǒng)標(biāo)記陽性的幾分鐘內(nèi)將血液培養(yǎng)液樣品從瓶子中移出。如下所示對培養(yǎng)液樣品進(jìn)行處理以從可能干擾后續(xù)分析的血液和培養(yǎng)基組分中將微生物分離出來將來自新鮮的陽性血液培養(yǎng)物的4. OmL培養(yǎng)液與2. OmL溶胞緩沖液(0. 45 % Brij 97在0. 3M CAPS, pH 11. 7中)合并，渦旋混合5秒并隨后在37°C的水浴中孵育90 秒。孵育后，在4個(gè)1. 5mL尖底離心管的每一個(gè)中將0. 95mL溶胞產(chǎn)物鋪層于0. 5mL密度緩沖墊層(14% w/v 碘海醇，O. 005% Pluronic F-108 在 IOmM Hepes,pH 7. 4 中)的頂部。然后將所有四個(gè)管以IOOOOg在25°C下離心2分鐘以通過密度緩沖墊層沉降(?；?微生物。 溶胞血液和培養(yǎng)基仍保留在緩沖墊層的上方。 當(dāng)完成離心周期時(shí)，除去上清液并將每一個(gè)管中的沉降的(?；?微生物用 10 μ L純水再懸浮。將所有四個(gè)管中的再懸浮微生物匯集到干凈的管中并輕輕地混合。然后調(diào)節(jié)每一個(gè)處理的試樣的體積以使最終懸浮液在660nm的光密度(A66tl)等于20/cm。將處理的試樣儲存在2 8°C下用于當(dāng)天測試，或者將處理的試樣等分并冷凍于_70°C下用于在以后日期中測試。實(shí)施例2.通過拉曼光譜法分析采用溶胞_離心法從陽性血液培養(yǎng)物中處理的微生物試樣根據(jù)實(shí)施例1中的程序處理的試樣在37°C下迅速解凍(如果先前實(shí)施了冷凍)， 輕輕地混合。使試樣的一部分保持未稀釋而將其余部分按照1 2稀釋于純水中。將每一種稀釋的和未稀釋的試樣各1微升施用于鍍金的顯微鏡載波片的第一表面上并在環(huán)境條件下靜置干燥。干燥后，采用RXm型號的拉曼顯微鏡(Kaiser Optical Systems Inc.， Michigan)在785nm的照明波長下對每一種干燥試樣按照5X5柵格圖案獲得25個(gè)譜圖。 顯微鏡配備40X物鏡，將激光功率設(shè)定為400mW，25個(gè)譜圖中的每一個(gè)都采用5秒累積時(shí)間來獲得。獲得之后，對譜圖進(jìn)行預(yù)處理以進(jìn)行噪聲消除(dark subtraction)、宇宙射線贗 象去除(cosmic ray artifact removal)、jti普·斷(spectral truncation)、■線扣除 (baseline subtraction)、歸一化和在準(zhǔn)備多變量統(tǒng)計(jì)分析時(shí)的離群值的消除。從陽性血液培養(yǎng)物中回收和處理的所選微生物的代表性拉曼光譜圖在圖1和圖2 中顯示。圖1顯示了四個(gè)微生物物種的光譜圖4種白色念珠菌分離物、6種銅綠假單胞菌分離物、13種大腸桿菌分離物和13種金黃色葡萄球菌分離物。為了清楚例證對每一個(gè)物種的光譜圖都進(jìn)行了平均化。不同物種的光譜圖之間的一致差異對于這些生物是顯而易見的。這表明已經(jīng)將潛在掩蔽性血液和培養(yǎng)基充分地除去從而獲得了處理后的微生物的特征光譜圖。圖2顯示了在圖1中示出為平均的金黃色葡萄球菌的13個(gè)獨(dú)立拉曼光譜圖。這 13個(gè)光譜圖表明在不同臨床分離物之間，甚至是當(dāng)在具有不同血液供體的不同血液培養(yǎng)基中生長時(shí)，該微生物的拉曼光譜圖的一致性。實(shí)施例3.通過拉曼光譜法非侵入性地分析由陽性血液培養(yǎng)物采用溶胞_離心法處理的微生物樣品在低接種物水平下將微生物“接種”于含IOmL人血液的BacT/ALERT‘ SA瓶子。在通過BacT/ALERT’ 3D微生物檢測系統(tǒng)標(biāo)記陽性的幾分鐘內(nèi)將血液培養(yǎng)液樣品從瓶子中移出。如下所示對樣品進(jìn)行處理1.將2. OmL陽性培養(yǎng)液樣品與1. OmL選擇性溶胞緩沖液(0. 45 % w/vBrij 97+0. 3M CAPS, pH 11. 7)混合，然后在37°C水浴上放置1分鐘。2.將1. OmL溶胞產(chǎn)物樣品覆蓋在容納于定制光學(xué)分離管中0. 5mL密度緩沖墊層 (24% w/v 氯化銫在 IOmM Hepes pH 7. 4 中 +0. 005% Pluronic F-108)上。在密度緩沖墊層的表面上存在聚丙烯球以有助于裝載而不會干擾兩個(gè)水相。3.光學(xué)分離管用螺旋蓋密封并以10，OOOrpm(配備A_8_ll甩開轉(zhuǎn)子的 Eppendorf 5417R微量離心機(jī)；參見圖4)離心2min。4.將密封管轉(zhuǎn)移至定制適配器中，所述定制適配器有助于通過Rxm型號的拉曼顯微鏡(Kaiser Optical Systems Inc.，Michigan)在785nm的照明波長下對在管子基部的微生物顆粒進(jìn)行探詢。還記錄了空分離管的光譜圖以建立這種塑料的基線拉曼光譜圖。圖3顯示了在有和無微生物顆粒的情況下透過塑料分離管采集的拉曼光譜圖。在這種模式中，光譜圖由來自塑料本身的拉曼譜帶支配；然而，微生物的獨(dú)特譜帶僅在微生物顆粒的光譜圖中接近1227/cm、1583/cm和1660/cm的波數(shù)處才可見。其它微生物譜帶也存在，但是在這個(gè)范圍中被更強(qiáng)的塑料譜帶掩蔽。圖4顯示了通過扣除空塑料分離管的光譜圖來消除背景之后3種微生物的拉曼光譜圖。盡管這種背景扣除并不是100%有效的，但是微生物的譜帶是清晰可見的。其它采集形式，諸如空間偏轉(zhuǎn)或透射采集，都可能進(jìn)一步改善背景補(bǔ)償(參見，例如，美國專利申請出版物第 2008/0129992 號和第 2009/0244533 號)。前述實(shí)施例舉例說明了本發(fā)明，而不能解釋為限制本發(fā)明。本發(fā)明通過以下權(quán)利要求以及包含在本文中的權(quán)利要求的等價(jià)體進(jìn)行限定。所有出版物、專利申請、專利、專利出版物以及本文中引證的任何其它文獻(xiàn)都以其全文結(jié)合于本文中用于與出現(xiàn)該文獻(xiàn)的句子和/或段落相關(guān)的教導(dǎo)。
權(quán)利要求
1.一種表征和/或鑒定測試樣品中的微生物的方法，包括(a)獲得已知包含或可能包含微生物的測試樣品；(b)選擇性地溶解所述測試樣品中的非微生物細(xì)胞以產(chǎn)生溶胞樣品；(c)使微生物與所述溶胞樣品的其它組分分離以形成微生物的離析的樣品；(d)采用一種或多種拉曼光譜技術(shù)對所述離析的微生物進(jìn)行探詢以產(chǎn)生所述微生物的光譜測定結(jié)果；和(e)通過將所述光譜測定結(jié)果與對已知微生物測定的光譜測定結(jié)果或預(yù)測的光譜性質(zhì)對比來表征和/或鑒定所述離析的樣品中的所述微生物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中步驟(c)和步驟(d)在密封的容器中實(shí)施并且其中所述探詢步驟(d)是非侵入式的。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述拉曼光譜技術(shù)選自由拉曼光譜法、共焦拉曼光譜法、表面增強(qiáng)拉曼光譜法、空間偏轉(zhuǎn)拉曼光譜法、共振拉曼光譜法、透射拉曼光譜法、及其任意組合組成的組。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中基于一種或多種表型特征和/或形態(tài)學(xué)特征對所述微生物進(jìn)行表征。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中基于檢測時(shí)間、生長速率和微生物顆粒大小、形狀、顏色和/或密度中的一種或多種測定結(jié)果對所述微生物進(jìn)行表征。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中將所述微生物表征到一種或多種分類模型中，所述分類模型選自由革蘭氏組、臨床革蘭氏組、治療組和功能組組成的組。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中將所述微生物鑒定到屬水平、種水平或菌株水平。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述選擇性溶胞步驟(b)采用包含一種或多種清潔劑的溶胞溶液進(jìn)行實(shí)施。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中所述一種或多種清潔劑選自由Triton X-100、 Triton X-100-R, Triton X_114、NP-40、Genapol C_100、Genapol X-100, Ig印al CA 630、Arlasolve 200, Brij 96/97、CHAPS、辛基β -D-吡喃葡萄糖苷、皂苷、單十二烷基九乙二醇醚(C12E9，聚多卡醇)、十二烷基硫酸鈉、N-月桂酰肌氨酸、脫氧膽酸鈉、膽汁鹽類、 十六烷基三甲基溴化銨、SB3-10、SB3-12、氨基磺基甜菜堿-14、C7Bz0, Brij 98、Brij 58 ,Brij 35、Tween 80、Tween 20、Pluronic L64、Pluronic P84、非清潔性磺基甜菜堿 (NDSB 201)、兩親高分子(PMAL-C8)和甲基-β -環(huán)糊精組成的組。
10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中所述清潔劑是包含C12_18/E9_1(i結(jié)構(gòu)的聚氧乙烯清潔劑。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中所述聚氧乙烯清潔劑選自由Brij 97、Brij 96V、Genapol C-100、Genapol X-IOO 和聚多卡組成的組。
12.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中所述溶胞溶液還包含一種或多種酶，且其中所述一種或多種酶包含一種或多種蛋白酶和一種或多種核酸酶的混合物。
13.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中所述溶胞溶液包含一種或多種緩沖劑。
14.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中將所述溶胞樣品鋪層在所述容器中的密度緩沖墊層上，并且其中將所述容器離心以形成微生物顆粒。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其中所述密度緩沖墊層選自由膠體二氧化硅、碘化造影劑、蔗糖、顯微鏡浸鏡油、礦物油、硅油、氟硅油、硅凝膠、甲泛影酸鹽-Ficoll 、泛影酸鹽-葡聚糖、羧甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素、聚環(huán)氧乙烷(高分子量)、PluroniC F127、 Plur0niC F68、聚丙烯酸、交聯(lián)的聚乙烯醇、交聯(lián)的聚乙烯吡咯烷、PEG甲醚甲基丙烯酸酯、 果膠、瓊脂糖、黃原膠、膠凝糖、Wiytagel 、山梨醇、Ficoll 、甘油、葡聚糖、糖原、氯化銫、 全氟碳流體、氫氟碳流體、及其組合組成的組。
16.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述測試樣品是已知包含微生物的培養(yǎng)樣品。
17.—種表征和/或鑒定血液培養(yǎng)物中的微生物的方法，包括(a)從已知包含或可能包含微生物的血液培養(yǎng)物中獲得樣品；(b)選擇性地溶解所述樣品中的非微生物細(xì)胞以產(chǎn)生溶胞樣品；(c)將所述溶胞樣品鋪層在密封容器中的密度緩沖墊層上；(d)將容器離心以使微生物與所述樣品的其它組分分離并形成微生物顆粒；(e)采用一種或多種拉曼光譜技術(shù)在原位對所述離析的微生物進(jìn)行光譜探詢以產(chǎn)生所述微生物的光譜測定結(jié)果；和(f)通過將所述光譜測定結(jié)果與對已知微生物測定的光譜測定結(jié)果或預(yù)測的光譜性質(zhì)對比來表征和/或鑒定所述離析的樣品中的所述微生物。
18.一種表征和/或鑒定微生物的方法，包括(a)獲得已知包含或可能包含微生物的測試樣品；(b)將所述測試樣品放置于密封容器中；(c)使微生物在原位與所述測試樣品的其它組分分離以形成所述密封容器中微生物的離析的微生物樣品；(d)采用一種或多種拉曼光譜技術(shù)在原位對所述離析的微生物進(jìn)行光譜探詢以產(chǎn)生所述微生物的光譜測定結(jié)果；和(e)通過將所述光譜測定結(jié)果與對已知微生物測定的光譜測定結(jié)果或預(yù)測的光譜性質(zhì)對比來表征和/或鑒定所述離析的樣品中的所述微生物。
19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其中所述拉曼光譜技術(shù)選自由拉曼光譜法、共焦拉曼光譜法、表面增強(qiáng)拉曼光譜法、空間偏轉(zhuǎn)拉曼光譜法、共振拉曼光譜法、透射拉曼光譜法、 及其任意組合組成的組。
20.根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其中基于一種或多種表型特征和/或形態(tài)學(xué)特征對所述微生物進(jìn)行表征。
21.根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其中基于檢測時(shí)間、生長速率和微生物顆粒大小、形狀、顏色和/或密度中的一種或多種測定結(jié)果對所述微生物進(jìn)行表征。
22.根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其中將所述微生物表征到一種或多種分類模型中， 所述分類模型選自由革蘭氏組、臨床革蘭氏組、治療組和功能組組成的組。
23.根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其中將所述微生物鑒定到屬水平、種水平或菌株水平。
24.根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其中將所述樣品鋪層在所述容器中的密度緩沖墊層上，并且其中將所述容器離心以形成微生物顆粒。
25.根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其中所述密度緩沖墊層包含膠體二氧化硅、碘化造影劑、蔗糖、顯微鏡浸鏡油、礦物油、硅油、氟硅油、硅凝膠、甲泛影酸鹽-Ficoll 、泛影酸鹽-葡聚糖、羧甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素、聚環(huán)氧乙烷(高分子量)、PluroniC F127、 PluroniC F68、聚丙烯酸、交聯(lián)的聚乙烯醇、交聯(lián)的聚乙烯吡咯烷、PEG甲醚甲基丙烯酸酯、 果膠、瓊脂糖、黃原膠、膠凝糖、Wiytagel 、山梨醇、Ficoll 、甘油、葡聚糖、糖原、氯化銫、 全氟碳流體、和/或氫氟碳流體中的一種或多種。
26.根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其中所述測試樣品是已知包含微生物的培養(yǎng)樣品。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于分離、表征和/或鑒定測試樣品中的微生物的方法。本發(fā)明的方法包括用于溶解可能存在于測試樣品中的非微生物細(xì)胞的可選溶胞步驟，接著是一個(gè)后續(xù)的分離步驟。該方法可以用于從復(fù)雜樣品如含血液的培養(yǎng)基中分離、表征和/或鑒定微生物。本發(fā)明進(jìn)一步提供了對分離的微生物樣品進(jìn)行拉曼光譜探詢以產(chǎn)生微生物的測定結(jié)果并且采用所述拉曼光譜測定結(jié)果表征和/或鑒定樣品中的微生物。
文檔編號C12M1/12GK102272585SQ200980153296
公開日2011年12月7日 申請日期2009年10月30日 優(yōu)先權(quán)日2008年10月31日
發(fā)明者克里斯多夫·羅恩斯克, 布拉德福德·克萊, 瓊斯·海曼, 瑟曼·索普, 約翰·沃爾什 申請人:生物梅里埃公司