專利名稱：人胚胎干細胞向胰腺內(nèi)分泌譜系的分化的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明提供了促進多能干細胞分化的方法。具體地講，本發(fā)明提供了一種增加與胰腺內(nèi)分泌譜系相關(guān)的標記物表達的方法。
背景技術(shù)：
用于I型糖尿病的細胞替代療法的進展以及可移植胰島的缺乏已使得注意力集中在開發(fā)適于移植物移入的胰島素生成細胞或β細胞的來源上。一種方法是從多能干細胞，例如胚胎干細胞產(chǎn)生功能性β細胞。在脊椎動物的胚胎發(fā)育中，多能干細胞可在稱為原腸胚形成的過程中產(chǎn)生包括三個胚層(外胚層、中胚層和內(nèi)胚層)的細胞群體。諸如甲狀腺、胸腺、胰腺、腸和肝臟之類的組織將從內(nèi)胚層，經(jīng)由中間階段發(fā)育而來。該過程中的中間階段是形成定形內(nèi)胚層。定形內(nèi)胚層細胞可表達多種標記物，例如HNF-3 β、GATA4、Mixll、CXCR4和Sox_17。定形內(nèi)胚層分化成胰腺內(nèi)胚層導致形成胰腺。胰腺內(nèi)胚層細胞表達胰-十二指腸同源盒基因Pdxl。在不存在Pdxl時，胰腺形成腹胰芽和背胰芽后不再發(fā)育。因而，Pdxl表達標志著胰腺器官發(fā)生中的一個關(guān)鍵步驟。除了其他細胞類型，成熟的胰腺還包括外分泌組織和內(nèi)分泌組織。外分泌和內(nèi)分泌組織來自胰腺內(nèi)胚層的分化。據(jù)報道，從小鼠的胚胎細胞衍生了帶有胰島細胞特征的細胞。例如，Lumelsky等人 (Science 292 =1389,2001)報道了小鼠胚胎干細胞向類似胰島的胰島素分泌結(jié)構(gòu)的分化。 Soria等人(Diabetes 49 =157,2000)報道，衍生自小鼠胚胎干細胞的胰島素分泌細胞使鏈脲佐菌素誘導的糖尿病小鼠中的血糖變正常。例如，Hori等人(PNAS 99 =16105,2002)揭示，用磷酸肌醇 3_ 激酶(LY294002)的抑制劑處理小鼠胚胎干細胞產(chǎn)生了類似β細胞的細胞。又如，Blyszczuk等人(PNAS 100 :998，2003)報道，從組成型表達1^x4的小鼠胚胎干細胞產(chǎn)生了胰島素生成細胞。Micallef等人報道說，視黃酸可調(diào)節(jié)胚胎干細胞定向形成Pdxl陽性胰腺內(nèi)胚層。 在對應(yīng)于胚胎的原腸胚形成末的期間，加入胚胎干細胞分化第4天的培養(yǎng)物中時視黃酸是誘導 Pdxl 最有效的(Diabetes 54:301,2005)。Miyazaki等人報道了過表達Pdxl的小鼠胚胎干細胞系。他們的結(jié)果顯示，外源Pdxl表達在所得的分化細胞中明顯增強了胰島素、生長抑素、葡萄糖激酶、神經(jīng)元素3、 P48、Pax6 和 HNF6 基因的表達(Diabetes 53:1030,2004)。Skoudy等人報道說，激活素A(TGF-β超家族的成員)能上調(diào)小鼠胚胎干細胞中的胰腺外分泌基因(Ρ48和淀粉酶)和內(nèi)分泌基因(Pdxl、胰島素和胰高血糖素)的表達。 使用InM激活素A時觀察到最大的效果。他們還觀察到，胰島素和Pdxl mRNA的表達水平不受視黃酸的影響；然而，3nM FGF7處理導致Pdxl的轉(zhuǎn)錄水平升高(Biochem. J. 379 :749，2004)。Shiraki等人研究了能特征性增強胚胎干細胞分化成Pdxl陽性細胞的生長因子的效果。他們觀察到，TGF-β 2可再現(xiàn)地產(chǎn)生更高比例的Pdxl陽性細胞(Genes Cells. 2005 年 6 月；10 (6) =503-16)。Gordon等人闡明了在不存在血清的情況下和在存在激活素連同fet信號轉(zhuǎn)導抑制劑的情況下從小鼠胚胎干細胞誘導brachyUry+/HNF-3 β +內(nèi)胚層細胞(US 2006/0003446A1)。Gordon 等人(PNAS，第 103 卷，第 16806 頁，2006 年)聲稱“Wnt 禾口 TGF-β /nodal/ 激活素信號轉(zhuǎn)導同時為前原條的產(chǎn)生所必需”。然而，胚胎干細胞發(fā)育的小鼠模型可能不會完全模擬高等哺乳動物(例如人)中的發(fā)育程序。Thomson等人從人胚泡分離了胚胎干細胞(Science 282 :114，1998)。同時， Gearhart和其同事從胎兒生殖腺組織衍生了人胚胎生殖(hEG)細胞系(Shamblott等人， Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:13726,1998)。與可簡單通過與白血病抑制因子(LIF) — 起培養(yǎng)來防止分化的小鼠胚胎干細胞不一樣，人胚胎干細胞必須維持在非常特殊的條件下 (美國專利 No. 6，2OO,洲6、WO 99/20741, WO ΟΙ/δΙΘΙ6)。D'Amour等人描述了在高濃度激活蛋白和低血清的存在下產(chǎn)生人胚胎干細胞衍生的定形內(nèi)胚層的富集培養(yǎng)物(Nature Biotechnology 2005)。將這些細胞移植到小鼠的腎囊下，導致分化成具有某些內(nèi)胚層器官的特性的更成熟細胞。在加入FGF-10之后，人胚胎干細胞衍生的定形內(nèi)胚層細胞可進一步分化成Pdxl陽性細胞(US 2005/0266554A1)。D，Amour 等人(Nature Biotechnology-24，1392-1401 (2006))聲稱“我們已開發(fā)出一種將人胚胎干(hEQ細胞轉(zhuǎn)化成能夠合成胰腺激素即胰島素、胰高血糖素、生長抑素、 胰多肽和生長素釋放肽(ghrelin)的內(nèi)分泌細胞的分化方法。該方法通過引導細胞經(jīng)過通向能表達內(nèi)分泌激素的細胞的類似定形內(nèi)胚層、腸管內(nèi)胚層、胰腺內(nèi)胚層和內(nèi)分泌前體的各階段，來模擬體內(nèi)胰腺器官發(fā)生。，，又如，F(xiàn)isk等人報道了用于從人胚胎干細胞產(chǎn)生胰島細胞的系統(tǒng) (US2006/0040387A1)。在該情形中，分化途徑分成三個階段。首先用丁酸鈉和激活素A的組合使人胚胎干細胞分化成內(nèi)胚層。然后將細胞與TGF-β拮抗劑(例如成頭蛋白(Noggin)) 結(jié)合EGF或β細胞素一起進行培養(yǎng)，以產(chǎn)生Pdxl陽性細胞。通過煙酰胺誘導終末分化。在一個例子中，Benvenistry等人聲稱“我們得出結(jié)論認為，Pdxl的過量表達增強了胰腺富集基因(pancreatic enriched genes)的表達，胰島素表達的誘導可能需要另外的僅存在于體內(nèi)的信號(Benvenistry 等人，Stem Cells 2006 ；24 :1923-1930)，，。因此，仍明顯需要開發(fā)用于建立能擴增以滿足目前臨床需要，同時又保持分化成胰腺內(nèi)分泌細胞、胰腺激素表達細胞或胰腺激素分泌細胞的潛力的多能干細胞系的條件。 我們采取了替代方法來改善使人胚胎干細胞向胰腺內(nèi)分泌細胞分化的效率。

發(fā)明內(nèi)容
在一個實施例中，本發(fā)明提供使多能干細胞分化的方法，該方法包括以下步驟a.培養(yǎng)多能干細胞，
b.使所述多能干細胞分化成表達定形內(nèi)胚層譜系特征性標記物的細胞，C.使所述表達定形內(nèi)胚層譜系特征性標記物的細胞分化成表達胰腺內(nèi)胚層譜系特征性標記物的細胞，以及d.使所述表達胰腺內(nèi)胚層譜系特征性標記物的細胞分化成表達胰腺內(nèi)分泌譜系特征性標記物的細胞。在一個實施例中，本發(fā)明提供了一種用于增加與胰腺內(nèi)分泌譜系相關(guān)的標記物的表達的方法，所述方法包括用包含量足以引起與胰腺內(nèi)分泌譜系相關(guān)的標記物表達增加的 TGF- β受體激動劑的培養(yǎng)基處理表達胰腺內(nèi)分泌譜系特征性標記物的細胞。


圖1示出本發(fā)明所采用的分化方案的略圖。圖2示出與本發(fā)明所采用的分化方案的各個階段相關(guān)的標記物的表達。分圖a) 示出在已分化至第1階段的人胚胎干細胞系Hl的細胞中通過FACS確定的CXCR4的表達。 分圖b)示出在已分化至第1階段的人胚胎干細胞系Hl的細胞中通過實時PCR確定的與第 1階段相關(guān)的標記物的表達。圖3示出分化至本發(fā)明所采用的分化方案的第6階段并隨后用激活素A處理(第 7階段)的人胚胎干細胞系Hl的細胞的雙硫腙染色。分圖a)示出在通過40 μ m細胞過濾網(wǎng)之前用雙硫腙染色的細胞的相差。分圖b)示出能夠通過40 μ m細胞過濾網(wǎng)的用雙硫腙染色的細胞的相差。分圖c示出未能通過40 μ m細胞過濾網(wǎng)的用雙硫腙染色的細胞的相差。圖4示出根據(jù)實例2所述的方法，在分化至本發(fā)明所采用分化方案的第6階段并在分化至第6階段之后用激活素A處理的人胚胎干細胞系Hl的細胞中，通過實時PCR確定的pdx-1 (分圖a)、nkx6-l (分圖b)、Pax4(分圖c)、nkx2· 2(分圖d)、胰島素(分圖e)和胰高血糖素(分圖f)的表達。
具體實施例方式將本發(fā)明的具體實施方式
部分分成以下幾個分部分，來描述或舉例說明本發(fā)明的某些特征、實施例或應(yīng)用，這是為了使公開內(nèi)容清楚起見，并非限制本發(fā)明。^X干細胞是由它們在單細胞水平上既自我更新又分化產(chǎn)生子代細胞的能力來定義的未分化細胞，包括自我更新祖細胞、非更新祖細胞和末端分化細胞。干細胞的特征還在于其具有在體外由多種胚層(內(nèi)胚層、中胚層和外胚層)分化成各種細胞譜系的功能細胞以及移植后產(chǎn)生多種胚層的組織和注入胚泡后基本上有助于大部分(如果不是所有的話) 組織形成的能力。干細胞根據(jù)其發(fā)育潛能分為(1)全能，指能夠產(chǎn)生所有的胚胎和胚胎外細胞類型；( 多能，指能夠產(chǎn)生所有的胚胎細胞類型；C3)專能，指能夠產(chǎn)生細胞譜系的亞群，但在特定組織、器官或生理系統(tǒng)內(nèi)能產(chǎn)生所有的細胞(例如造血干細胞(HSC)可產(chǎn)生的后代細胞包括HSC(自我更新型)、局限于血細胞的寡能祖細胞以及作為血液正常組分的所有細胞類型和成分(如血小板))；(4)寡能，指能夠產(chǎn)生比多能干細胞更有限的細胞譜系亞群；以及( 單能，指能夠產(chǎn)生單一細胞譜系(如生精干細胞)。
分化是未特化的(“未定向的”)或特化不足的細胞獲得特化細胞(如神經(jīng)細胞或肌肉細胞)的特征的過程。分化的細胞或誘導分化的細胞是已經(jīng)在細胞譜系中占據(jù)更特化的(“定向的”)位置的細胞。術(shù)語“定向的”當應(yīng)用到分化的過程時，指在分化途徑中已經(jīng)進行到這么一種程度的細胞在正常環(huán)境下，它會繼續(xù)分化成特定的細胞類型或細胞類型子集，且在正常環(huán)境下不能分化成另一細胞類型或回復到分化程度較低的細胞類型。去分化指細胞回復到細胞的譜系當中特化(或定向)程度較低的地位的過程。如本文所用，“細胞的譜系”限定細胞的遺傳關(guān)系，即它來自哪些細胞和它能產(chǎn)生什么細胞。細胞譜系將細胞定位于發(fā)育和分化的遺傳計劃內(nèi)。譜系特異性標記物是指與所關(guān)注譜系的細胞表型特異性相關(guān)并能夠用于評價非定向細胞向所關(guān)注譜系的分化的特征?！?β -細胞譜系”是指對于轉(zhuǎn)錄因子PDX-I和下列轉(zhuǎn)錄因子中的至少一種具有陽性基因表達的細胞NGN-3、Nkx2. 2、Nkx6. l、NeuroD、Isl-1、HNF_3 3、MAFA、Pax4 和 Pax6。表達β細胞譜系特征性標記物的細胞包括β細胞。如本文所用，“表達定形內(nèi)胚層譜系特征性標記物的細胞”或“第1階段細胞”或 “第1階段”是指表達至少一種下列標記物的細胞S0X-17、GATA-4、HNF-3 β、GSC、CerU Nodal、FGF8、Brachyury, Mix 樣同源盒蛋白、FGF4CD48、脫中胚蛋白(eomesodermin， E0MES)、DKK4、FGF17、GATA-6、CXCR4、C-Kit, CD99 或 0TX2。表達定形內(nèi)胚層譜系特征性標記物的細胞包括原條前體細胞、原條細胞、中內(nèi)胚層細胞和定形內(nèi)胚層細胞。如本文所用，“表達胰腺內(nèi)胚層譜系特征性標記物的細胞”是指表達至少一種下列標記物的細胞PDX-1、HNF-I β、PTF-I α、HNF-6或HB9。表達胰腺內(nèi)胚層譜系特征性標記物的細胞包括胰腺內(nèi)胚層細胞、原腸管細胞和后前腸細胞。如本文所用，“表達胰腺內(nèi)分泌譜系特征性標記物的細胞”或“第5階段細胞”或 “第5階段”是指表達至少一種下列標記物的細胞NGN-3、NeuroD、Islet-I、PDX-1、NKX6. 1、 PaX-4、Ngn-3或PTF-I α。表達胰腺內(nèi)分泌譜系特征性標記物的細胞包括胰腺內(nèi)分泌細胞、 胰腺激素表達細胞、胰腺激素分泌細胞和β細胞譜系的細胞。如本文所用，“定形內(nèi)胚層”指具有在原腸胚形成過程中從上胚層產(chǎn)生的細胞的特性并形成胃腸道及其衍生物的細胞。定形內(nèi)胚層細胞表達下列標記物HNF-3i3、GATA-4、 S0X-17, Cerberus、0TX2、goosecoid、C-Kit, CD99 和 Mixl 1。如本文所用，“胚外內(nèi)胚層”是指表達至少一種下列標記物的細胞群S0X-7、AFP和 SPARC。如本文所用，“標記物”是在所關(guān)注細胞中差異表達的核酸或多肽分子。關(guān)于這一點，差異表達意指陽性標記物的水平增加，而陰性標記物的水平降低。與其他細胞相比，所關(guān)注細胞中的核酸或多肽標記物的可檢測水平足夠高或足夠低，使得可以使用本領(lǐng)域已知的多種方法識別所關(guān)注細胞，并將所關(guān)注細胞與其他細胞區(qū)相區(qū)分。如本文所用，“中內(nèi)胚層細胞”是指表達至少一種下列標記物的細胞⑶48、脫中胚蛋白(EOMES)、S0X-17、DKK4、HNF-3 β、GSC、FGF17、GATA-6 如本文所用，“胰腺內(nèi)分泌細胞”或“胰腺激素表達細胞”是指能夠表達至少一種下列激素的細胞胰島素、胰高血糖素、生長抑素和胰多肽。如本文所用，“胰腺內(nèi)胚層細胞”或“第4階段細胞”或“第4階段”是指能夠表達至少一種下列標記物的細胞NGN-3、NeuroD、Islet-1、PDX-1、PAX-4、NKX2. 2。
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如本文所用，“胰腺激素生成細胞”指能夠生成至少一種下列激素的細胞胰島素、 胰高血糖素、生長抑素和胰多肽。如本文所用，“胰腺激素分泌細胞”或“第6階段細胞”或“第6階段”是指能夠分泌至少一種下列激素的細胞胰島素、胰高血糖素、生長抑素和胰多肽。如本文所用，“后前腸細胞”或“第3階段細胞”或“第3階段”是指能夠分泌至少一種下列標記物的細胞PDX-1、HNF-I、PTF-1A、HNF-6、HB-9、PR0X-1。如本文所用，“前原條細胞”指表達至少一種下列標記物的細胞=Nodal或FGF8。如本文所用，“原腸管細胞”或“第2階段細胞”或“第2階段”是指能夠分泌至少一種下列標記物的細胞HNF-1或HNF-4A。如本文所用，“原條細胞”指表達至少一種下列標記物的細胞=Brachyury、Mix樣同源盒蛋白或FGF4。多能干細胞的分離、擴增和培養(yǎng)多能干細胞的特件描述多能干細胞可表達階段特征性胚胎抗原(SSEA) 3和4以及可用稱為Tra-1_60和 Tra-1-81的抗體檢測的標記物中的一種或多種(Thomson等人，Science 282 =1145,1998) 多能干細胞體外分化導致喪失SSEA-4、Tra-1-60和Tra-l_81的表達(如果存在的話)， 并增加SSEA-I的表達。未分化的多能干細胞通常具有堿性磷酸酶活性，該酶可通過用4% 多聚甲醛固定細胞，然后用Vector Red作為底物顯影來檢測，如生產(chǎn)商所描述的(Vector Laboratories,Burlingame Calif)。未分化的多能干細胞通常還表達0ct_4和TERT，這可由RT-PCR檢測。增殖的多能干細胞的另一理想表型是分化成所有三個胚層即內(nèi)胚層、中胚層和外胚層組織的細胞的潛能。多能干細胞的多能性可例如通過這樣來證實將細胞注射進重癥聯(lián)合免疫缺陷(SCID)小鼠中，用4%多聚甲醛固定所形成的畸胎瘤，然后對它們進行組織學檢驗以確定是否存在來自三個胚層的細胞類型?；蛘?，可通過產(chǎn)生擬胚體并評估擬胚體的與三個胚層相關(guān)的標記物的存在來確定多能性?？梢允褂脴藴蔊帶技術(shù)并比較已公布的相應(yīng)靈長類物種的核型來分析增殖的多能干細胞系的核型。希望獲得具有“正常核型”的細胞，其意指細胞為整倍體，其中所有人染色體都存在并且沒有明顯的改變。多能干細胞的來源可以使用的多能干細胞類型包括，衍生自妊娠后形成的組織的已建立多能細胞系，妊娠后形成的組織包括取自妊娠期間任何時期(通常但不一定在妊娠約10-12周之前) 的胚前組織(例如，囊胚)、胚胎組織或胎兒組織。非限制性的例子是已建立的人胚胎干細胞系或人胚胎生殖細胞系，例如人胚胎干細胞系HI、H7和H9 (WiCell)。還可設(shè)想的是，在此類細胞的初始建立或穩(wěn)定期間使用本公開的組合物，在此情況下，源細胞將是直接取自源組織的原代多能細胞。另外合適的是取自已在不存在飼養(yǎng)細胞的情況下培養(yǎng)的多能干細胞群體的細胞。同樣合適的是突變型人胚胎干細胞系，例如BGOlv (BresaGen，Athens，GA)。在一個實施例中，人胚胎干細胞是如Thomson等人所述制備(美國專利 No. 5, 843, 780 ；Science 282 :1145,1998) ；Curr. Top. Dev. Biol. 38 133 ff. ,1998) ；Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. Α. 92 :7844,1995)。
多能干細胞的培養(yǎng)在一個實施例中，通常在飼養(yǎng)細胞層上培養(yǎng)多能干細胞，飼養(yǎng)細胞可以多種方式支持多能干細胞?；蛘?，在培養(yǎng)系統(tǒng)中培養(yǎng)多能干細胞，所述培養(yǎng)系統(tǒng)基本上不含飼養(yǎng)細胞，但同樣支持多能干細胞的增殖而不會進行顯著的分化。使用通過此前培養(yǎng)另一細胞類型而調(diào)理過的培養(yǎng)基來支持多能干細胞在無飼養(yǎng)細胞的培養(yǎng)物中生長而不分化。作為另一種選擇，用化學成分確定的培養(yǎng)基來支持多能干細胞在無飼養(yǎng)細胞的培養(yǎng)物中生長而不分化。例如，Reubinoff 等人(Nature Biotechnology 18:399—404(2000))禾口 Thompson 等人(Science，1998年11月6日第282卷，第5391期，第1145-1147頁)公開了用小鼠胚胎成纖維細胞飼養(yǎng)細胞層來培養(yǎng)來自人胚泡的多能干細胞系。Richards 等人(Stem Cells 21 :546-556,2003)對一組 11 種不同的成人、胎兒和新生兒飼養(yǎng)細胞層支持人多能干細胞培養(yǎng)的能力進行了評價。Richards等人聲稱“在成人皮膚成纖維細胞飼養(yǎng)層上培養(yǎng)的人胚胎干細胞系保持了人胚胎干細胞形態(tài)并保持了多能性”。US20020072117公開了可產(chǎn)生支持靈長類多能干細胞在無飼養(yǎng)細胞的培養(yǎng)物中生長的培養(yǎng)基的細胞系。所采用的細胞系是從胚胎組織獲得或從胚胎干細胞分化而來的間質(zhì)細胞系和成纖維細胞樣細胞系。US20020072117還公開了所述細胞系作為原代飼養(yǎng)細胞層的用途。又如，Wang等人(Stem Cells 23 1221-1227，2005)公開了用于人多能干細胞在衍生自人胚胎干細胞的飼養(yǎng)細胞層上長期生長的方法。又如，Stojkovic等人(Stem Cells 2005 23 :306-314,2005)公開了一種衍生自人胚胎干細胞的自發(fā)分化的飼養(yǎng)細胞系統(tǒng)。在另一例子中，Miyamoto等人(Stem Cells 22 =433-440,2004)公開了從人胎盤獲得的飼養(yǎng)細胞的來源。Amit等人(Biol. R印rod 68 :2150_2156，2003)公開了衍生自人包皮的飼養(yǎng)細胞層。又如，Inzunza等人(Stem Cells 23 =544-549,2005)公開了來自人出生后包皮成纖維細胞的飼養(yǎng)細胞層。US6642048公開了可支持靈長類多能干(pPQ細胞在無飼養(yǎng)細胞的培養(yǎng)物中生長的培養(yǎng)基以及可用于產(chǎn)生這種培養(yǎng)基的細胞系。US6642048聲稱“本發(fā)明包括從胚胎組織獲得或從胚胎干細胞分化而來的間質(zhì)細胞系和成纖維細胞樣細胞系。在本公開中描述并闡明了用于衍生這種細胞系、處理培養(yǎng)基以及用該調(diào)理培養(yǎng)基培育干細胞的方法”。又如，W02005014799公開了用于哺乳動物細胞維持、增殖和分化的條件培養(yǎng)基。 W02005014799聲稱“通過鼠細胞(特別是分化并永生化的轉(zhuǎn)基因肝細胞，稱為MMH (Met鼠肝細胞))的細胞分泌活性對根據(jù)本發(fā)明制備的培養(yǎng)基進行調(diào)理”。又如，Xu等人(Stem Cells 22 =972-980,2004)公開了一種從人胚胎干細胞衍生物獲得的調(diào)理培養(yǎng)基，所述干細胞衍生物已經(jīng)過遺傳修飾而過表達人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶。又如，US20070010011公開了一種用于維持多能干細胞的化學成分確定的培養(yǎng)基。—種可供選擇的培養(yǎng)系統(tǒng)采用補充有能促進胚胎干細胞增殖的生長因子的無血清培養(yǎng)基。例如，Cheon 等人(BioR印rod DOI :10. 1095/biolreprod. 105. 046870，2005 年 10月19日)公開了一種無飼養(yǎng)細胞的無血清培養(yǎng)系統(tǒng)，其中胚胎干細胞維持在補充有能引發(fā)胚胎干細胞自我更新的不同生長因子的未經(jīng)調(diào)理的血清替代(SR)培養(yǎng)基中。又如，Levenstein等人(Stem Cells 24 :568-574,2006)公開了使用補充有 bFGF 的培養(yǎng)基，在不存在成纖維細胞或調(diào)理培養(yǎng)基的情況下長期培養(yǎng)人胚胎干細胞的方法。又如，US20050148070公開了一種在無血清且無成纖維細胞飼養(yǎng)細胞的成分確定的培養(yǎng)基中培養(yǎng)人胚胎干細胞的方法，該方法包括在含有白蛋白、氨基酸、維生素、礦物質(zhì)、至少一種轉(zhuǎn)鐵蛋白或轉(zhuǎn)鐵蛋白替代品、至少一種胰島素或胰島素替代品的培養(yǎng)基中培養(yǎng)干細胞，該培養(yǎng)基基本上無哺乳動物胎血清且含有至少約lOOng/ml能激活成纖維細胞生長因子信號轉(zhuǎn)導受體的成纖維細胞生長因子，其中該生長因子的供給來源不是僅為成纖細胞飼養(yǎng)層，該培養(yǎng)基支持干細胞在無飼養(yǎng)細胞或調(diào)理培養(yǎng)基的情況下以未分化狀態(tài)增殖。又如，US20050233446公開了一種用于培養(yǎng)干細胞，包括未分化的靈長類原始干細胞的限定培養(yǎng)基。在溶液中，此培養(yǎng)基較于在培養(yǎng)的干細胞基本上是等滲的。在給定的培養(yǎng)物中，特定的培養(yǎng)基包含基礎(chǔ)培養(yǎng)基和各為一定量的bFGF、胰島素和抗壞血酸，所述bFGF、 胰島素和抗壞血酸為支持胚性干細胞進行基本上非分化性生長所必需。又如，US6800480描述“在一個實施例中，提供了用于以基本上未分化狀態(tài)培養(yǎng)靈長類來源的原始干細胞的細胞培養(yǎng)基，其包括低滲透壓、低內(nèi)毒素基礎(chǔ)培養(yǎng)基，此培養(yǎng)基可有效用于支持靈長類來源的原始干細胞的生長。基礎(chǔ)培養(yǎng)基混合了可有效支持靈長類來源的原始干細胞生長的營養(yǎng)血清和選自飼養(yǎng)細胞和衍生自飼養(yǎng)細胞的胞外基質(zhì)組分的基底。 該培養(yǎng)基還包括非必需氨基酸、抗氧化劑和選自核苷和丙酮酸鹽的第一生長因子”。又如，US20050244962描述“在一個方面，本發(fā)明提供了一種培養(yǎng)靈長類胚胎干細胞的方法。在基本上不含哺乳動物胎血清(優(yōu)選也基本上不含任何動物血清)的培養(yǎng)物中，并在存在由除僅成纖維細胞飼養(yǎng)層之外的來源提供的成纖維細胞生長因子情況下培養(yǎng)干細胞。在一種優(yōu)選的形式中，通過添加足夠的成纖維細胞生長因子，使得成纖維細胞飼養(yǎng)層(以前是維持干細胞培養(yǎng)物所需的)變成了非必需的”。在又一個例子中，W020050653M公開了一種基本上無飼養(yǎng)細胞和無血清的成分確定的等滲培養(yǎng)基，其包含a.基礎(chǔ)培養(yǎng)基；b. —定量的bFGF，該量足以支持基本上未分化的哺乳動物干細胞生長；c. 一定量的胰島素，該量足以支持基本上未分化的哺乳動物干細胞生長；和d. —定量的抗壞血酸，該量足以支持基本上未分化的哺乳動物干細胞生長。又如，W02005086845公開了一種維持未分化的干細胞的方法，所述方法包括使干細胞暴露于轉(zhuǎn)化生長因子-β (TGF-β)蛋白家族的成員、成纖維細胞生長因子(FGF)蛋白家族的成員或煙酰胺(NIC)，所述成員或煙酰胺的量足以維持細胞處于未分化狀態(tài)達足以實現(xiàn)所需結(jié)果的一段時間?？蓪⒍嗄芨杉毎臃N至合適的培養(yǎng)基質(zhì)上。在一個實施例中，合適的培養(yǎng)基質(zhì)是胞外基質(zhì)成分，例如衍自基底膜的成分，或者可形成黏著分子受體-配體偶聯(lián)物的一部分的成分。在一個實施例中，合適的培養(yǎng)基質(zhì)是MATRIGEL (Becton Dickenson)。MATRIGEL 是得自Engelbreth-Holm Swarm腫瘤細胞的可溶性制品，其在室溫下膠凝而形成重構(gòu)的基底膜。
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其他的細胞外基質(zhì)組分和組分混合物適合作為替代物。取決于所擴增的細胞類型，這可包括單獨的層粘連蛋白、纖連蛋白、蛋白聚糖、巢蛋白、硫酸乙酰肝素等或者它們的各種組合?？稍诖嬖诳纱龠M細胞存活、增殖和保持理想特性的培養(yǎng)基存在的情況下，以合適的分布將多能干細胞接種于所述基質(zhì)上。所有這些特性可得益于對接種分布的認真考慮并可容易地由本領(lǐng)域技術(shù)人員確定。合適的培養(yǎng)基可用如下組分制備，例如達爾伯克氏改良伊格爾培養(yǎng)基(DMEM)， Gibco # 11965-092 ;Knockout達爾伯克氏改良伊格爾培養(yǎng)基(K0 DMEM)，Gibco # 10829-018 ；Ham' s F12/50% DMEM 基礎(chǔ)培養(yǎng)基；200mM L-谷氨酰胺，Gibco # 15039-027 ； 非必需氨基酸溶液，Gibco 11140-050 ； β-巰基乙醇，Sigma # M7522 ；人重組堿性成纖維細胞生長因子(bFGF), Gibco # 13256-029oM雜〒_ M成』夷_ i傾_在一個實施例中，本發(fā)明提供一種從多能干細胞產(chǎn)生胰腺激素生成細胞的方法， 該方法包括如下步驟a.培養(yǎng)所述多能干細胞，b.使所述多能干細胞分化成表達定形內(nèi)胚層譜系特征性標記物的細胞，c.使所述表達定形內(nèi)胚層譜系特征性標記物的細胞分化成表達胰腺內(nèi)胚層譜系特征性標記物的細胞，以及d.使所述表達胰腺內(nèi)胚層譜系特征性標記物的細胞分化成表達胰腺內(nèi)分泌譜系特征性標記物的細胞。在本發(fā)明的一個方面，胰腺內(nèi)分泌細胞是胰腺激素生成細胞。在一個替代方面， 胰腺內(nèi)分泌細胞是表達β細胞譜系特征性標記物的細胞。表達β細胞譜系特征性標記物的細胞能表達Pdxl和至少一種下列轉(zhuǎn)錄因子NGN-3、Nkx2. 2、Nkx6. 1、NeuroD, Isl-U HNF-3i3、MAFA、I^ax4和1^x6。在本發(fā)明的一個方面，表達β細胞譜系特征性標記物的細胞是β細胞。適用于本發(fā)明的多能干細胞包括例如人胚胎干細胞系Η9(ΝΙΗ編碼WA09)、人胚胎干細胞系Hl (NIH編碼WA01)、人胚胎干細胞系H7(NIH編碼WA07)和人胚胎干細胞系 SA002 (Cellartisj^W )。能表達至少一種以下多能細胞特有標記物的細胞也適用于本發(fā)明ABCG2、cripto、CD9、FoxD3、連接蛋白 43、連接蛋白 45、0ct4、Sox2、Nanog、hTERT、UTF_l、 ZFP42、SSEA-3、SSEA-4、Tra1-60、Tra1-81。定形內(nèi)胚層譜系特征性標記物選自S0X-17、GATA4、Hnf-3beta, GSC、CerU Nodal、 FGF8、Brachyury、Mix 樣同源盒蛋白、FGF4 CD48、脫中胚蛋白(EOMES)、DKK4、FGF17、GATA6、 CXCR4、C-Kit,⑶99和0TX2。適用于本發(fā)明的是表達至少一種定形內(nèi)胚層譜系特征性標記物的細胞。在本發(fā)明的一個方面，表達定形內(nèi)胚層譜系特征性標記物的細胞為原條前體細胞。在一個替代方面，表達定形內(nèi)胚層譜系特征性標記物的細胞為中內(nèi)胚層細胞。在一個替代方面，表達定形內(nèi)胚層譜系特征性標記物的細胞為定形內(nèi)胚層細胞。胰腺內(nèi)胚層譜特征性標記物選自Pdxl、HNF-I β，PTFla, HNF-6、ΗΒ9和PROXl。適用于本發(fā)明的是表達至少一種胰腺內(nèi)胚層譜系特征性標記物的細胞。在本發(fā)明的一個方面，表達胰腺內(nèi)胚層譜系特征性標記物的細胞為胰腺內(nèi)胚層細胞。
胰腺內(nèi)分泌譜系特征性標記物選自NGN-3、神經(jīng)源性分化蛋白(NeuroD)、 Islet-UPdx-UNKX6. l、Pax-4、Ngn_3以及PTF-1 α。在一個實施例中，胰腺內(nèi)分泌細胞能夠表達以下激素中的至少一種胰島素、胰高血糖素、生長抑素和胰多肽。適用于本發(fā)明的細胞為表達至少一種胰腺內(nèi)分泌譜系特征性標記物的細胞。在本發(fā)明的一個方面，表達胰腺內(nèi)分泌譜系特征性標記物的細胞為胰腺內(nèi)分泌細胞。胰腺內(nèi)分泌細胞可以是胰腺激素表達細胞?；蛘撸认賰?nèi)分泌細胞可以是胰腺激素分泌細胞。在本發(fā)明的一個方面，胰腺內(nèi)分泌細胞為表達β細胞譜系特征性標記物的細胞。表達β細胞譜系特征性標記物的細胞能表達Pdxl和至少一種以下轉(zhuǎn)錄因子NGN-3、 Nkx2.2、Nkx6. 1、NeuroD、Isl_l、HNF-3 β、MAFA、Pax4 和 Pax6。在本發(fā)明的一個方面，表達 β細胞譜系特征性標記物的細胞是β細胞。胃汰娜_尉普胃紐龍適_胞細成,可通過本領(lǐng)域的任何方法或通過本發(fā)明提出的任何方法，使多能干細胞分化成表達定形內(nèi)胚層譜系特征性標記物的細胞。例如，可根據(jù)D，Amour 等人，Nature Biotechnology 23，1534-1541 (2005)中公開的方法，使多能干細胞可分化成表達定形內(nèi)胚層譜系特征性標記物的細胞。例如，可根據(jù)Shinozaki 等人，Development 131,1651-1662(2004)中公開的方法，使多能干細胞可分化成表達定形內(nèi)胚層譜系特征性標記物的細胞。例如，可根據(jù)McLean等人，Stem Cells 25,29-38(2007)中公開的方法，使多能干細胞可分化成表達定形內(nèi)胚層譜系特征性標記物的細胞。例如，可根據(jù)D，Amour 等人，Nature Biotechnology 24，1392-1401 (2006)中公開的方法，使多能干細胞可分化成表達定形內(nèi)胚層譜系特征性標記物的細胞。例如，可通過將多能干細胞在含有激活素A的培養(yǎng)基中在血清不存在下進行培養(yǎng)，然后將所述細胞與激活素A和血清一起培養(yǎng)，再然后將所述細胞與激活素A和另一濃度的血清一起培養(yǎng)，使多能干細胞分化成表達定形內(nèi)胚層譜系特征性標記物的細胞。這個方法的一個例子在 Nature Biotechnology 23，1534-1541 (2005)中公開。例如，可通過將多能干細胞在含有激活素A的培養(yǎng)基中在血清不存在下進行培養(yǎng)，然后將所述細胞與激活素A和另一濃度的血清一起培養(yǎng)，使多能干細胞分化成表達定形內(nèi)胚層譜系特征性標記物的細胞。這個方法的一個例子在D’ Amour等人，Nature Biotechnology, 2005 中公開。例如，可通過將多能干細胞在含有激活素A和Wnt配體的培養(yǎng)基中在血清不存在下進行培養(yǎng)，然后移除Wnt配體并將所述細胞與激活素A和血清一起培養(yǎng)，使多能干細胞分化成表達定形內(nèi)胚層譜系特征性標記物的細胞。這個方法的一個例子在Nature Biotechnology 24，1392-1401 (2006)中公開。例如，可通過根據(jù)轉(zhuǎn)讓給Lif必can，Inc.的美國專利申請No. 11/736，908中所公開的方法處理多能干細胞，來使多能干細胞分化為表達定形內(nèi)胚層譜系特征性標記物的細胞。例如，可通過根據(jù)轉(zhuǎn)讓給Lif必can，Inc.的美國專利申請No. 11/779，311中所公開的方法處理多能干細胞，來使多能干細胞分化為表達定形內(nèi)胚層譜系特征性標記物的細胞。
例如，可通過根據(jù)美國專利申請No. 60/990，529中所公開的方法處理多能干細胞，來使多能干細胞分化為表達定形內(nèi)胚層譜系特征性標記物的細胞。例如，可通過根據(jù)美國專利中請No. 61/076，889中所公開的方法處理多能干細胞，來使多能干細胞分化為表達定形內(nèi)胚層譜系特征性標記物的細胞。例如，可以通過根據(jù)美國專利申請No. 61/076，900中所公開的方法處理多能干細胞，來使多能干細胞分化為表達定形內(nèi)胚層譜系特征性標記物的細胞。例如，可通過根據(jù)美國專利申請No. 61/076，908中所公開的方法處理多能干細胞，來使多能干細胞分化為表達定形內(nèi)胚層譜系特征性標記物的細胞。例如，可以通過根據(jù)美國專利申請No. 61/076，915中所公開的方法處理多能干細胞，來使多能干細胞分化為表達定形內(nèi)胚層譜系特征性標記物的細胞。胃汰娜力陽普胃紐龍適_胞藤#表達定形內(nèi)胚層譜系特征性標記物的細胞的形成可通過在進行特定方案之前或之后檢測該標記物的存在來確定。多能干細胞通常不表達這類標記物。因而，當細胞開始表達它們時即檢測到多能細胞的分化?？赏ㄟ^將處理過的細胞群體暴露于可特異性識別由表達定形內(nèi)胚層譜系特征性標記物的細胞表達的蛋白質(zhì)標記物的試劑(例如抗體)來確定分化效率。用于評估蛋白質(zhì)標記物和核酸標記物在培養(yǎng)的或分離的細胞中的表達的方法是本領(lǐng)域的標準方法。這些方法包括定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)、Northern印跡原位雜交(參見例如"Current Protocols in Molecular Biology，，(Ausubel 等人(編輯)， 2001增刊))以及免疫測定法，例如分段材料的免疫組織化學分析，Western印跡、以及用于完整細胞中容易獲得的標記物的流式細胞分析(FACS)(參見例如Harlow和Lane的 "Using Antibodies :A Laboratory Manual，，, New York : Co Id Spring Harbor Laboratory Press (1998))ο多能干細胞的特征是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的，并且多能干細胞的其他特征不斷地被鑒別。多能干細胞標記物包括(例如)一種或多種如下物質(zhì)的表達ABCG2、cripto, FoxD3、Connexin43、Connexin45、0ct4、Sox2、Nanog、hTERT、UTF-1、ZFP42、SSEA-3、SSEA-4、 Tral-60、Tral-81o在用本發(fā)明方法處理多能干細胞后，可通過將處理過的細胞群體暴露于特異性識別由表達定形內(nèi)胚層譜系特征性標記物的細胞表達的蛋白質(zhì)標記物(例如CXCR4)來進行純化。^mm^mmnmr^mrnPAmmm^M^可通過本領(lǐng)域的任何方法或通過本發(fā)明提出的任何方法，使表達定形內(nèi)胚層譜系特征性標記物的細胞分化成表達胰腺內(nèi)胚層譜系特征性標記物的細胞。例如，可根據(jù)D，Amour 等人，Nature Biotechnology 24，1392-1401 (2006)中公開的方法，使表達定形內(nèi)胚層譜系特征性標記物的細胞分化成表達胰腺內(nèi)胚層譜系特征性標記物的細胞。可通過用成纖維細胞生長因子和hedgehog信號轉(zhuǎn)導途徑抑制劑KAAD-環(huán)巴胺處理表達定形內(nèi)胚層譜系特征性標記物的細胞，然后移除含有纖維細胞生長因子和KAAD-環(huán)巴胺的培養(yǎng)基，并隨后將所述細胞在含有視黃酸、成纖維細胞生長因子和KAAD-環(huán)巴胺的培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，來使表達定形內(nèi)胚層譜系特征性標記物的細胞進一步分化成表達胰腺內(nèi)胚層譜系特征性標記物的細胞。這個方法的一個例子在Nature Biotechnology 24， 1392-1401(2006)中公開。在本發(fā)明的一個方面，根據(jù)轉(zhuǎn)讓給Lif必can，Inc.的美國專利申請 No. 11/736,908中公開的方法，通過用視黃酸和至少一種成纖維細胞生長因子處理表達定形內(nèi)胚層譜系特征性標記物的細胞一段時間，來使表達定形內(nèi)胚層譜系特征性標記物的細胞進一步分化成表達胰腺內(nèi)胚層譜系特征性標記物的細胞。在本發(fā)明的一個方面，根據(jù)轉(zhuǎn)讓給Lif必can，Inc.的美國專利申請 No. 11/779,311中公開的方法，通過用視黃酸和至少一種成纖維細胞生長因子處理表達定形內(nèi)胚層譜系特征性標記物的細胞一段時間，來使表達定形內(nèi)胚層譜系特征性標記物的細胞進一步分化成表達胰腺內(nèi)胚層譜系特征性標記物的細胞。在本發(fā)明的一個方面，通過根據(jù)美國專利申請No. 60/990，529中所公開的方法處理表達定形內(nèi)胚層譜系特征性標記物的細胞，來使表達定形內(nèi)胚層譜系特征性標記物的細胞進一步分化成表達胰腺內(nèi)胚層譜系特征性標記物的細胞。表汰胰腺內(nèi)胚層譜系特征件標記物的細胞的檢測胰腺內(nèi)胚層譜系特征性標記物是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的，并且其他胰腺內(nèi)胚層譜系特征性標記物不斷被鑒別。這些標記物可用于確定根據(jù)本發(fā)明處理過的細胞是否已分化而獲得胰腺內(nèi)胚層譜系特征性特性。胰腺內(nèi)胚層譜系的特異性標記物包括一種或多種轉(zhuǎn)錄因子，例如 Hlxb9、PTF-la、PDX-1、HNF-6、HNF-1 β 的表達。可通過將處理過的細胞群體暴露于可特異性識別由表達胰腺內(nèi)胚層譜系特征性標記物的細胞表達的蛋白質(zhì)標記物的試劑(例如抗體)來確定分化效率。用于評估蛋白質(zhì)標記物和核酸標記物在培養(yǎng)的或分離的細胞中的表達的方法是本領(lǐng)域的標準方法。這些方法包括定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)、Northern印跡原位雜交(參見例如"Current Protocols in Molecular Biology，，(Ausubel 等人(編輯)， 2001增刊))以及免疫測定法，例如分段材料的免疫組織化學分析，Western印跡、以及用于完整細胞中容易獲得的標記物的流式細胞分析(FACS)(參見例如Harlow和Lane的 "Using Antibodies :A Laboratory Manual，，,New York :Cold Spring Harbor Laboratory Press (1998))ο表達胰腺內(nèi)分泌譜系特征性標記物的細胞的形成可通過本領(lǐng)域的任何方法或通過本發(fā)明公開的任何方法，使表達胰腺內(nèi)胚層譜系特征性標記物的細胞分化成表達胰腺內(nèi)分泌譜系特征性標記物的細胞。例如，可根據(jù)D，Amour 等人，Nature Biotechnology 24，1392-1401 (2006)中公開的方法，使表達胰腺內(nèi)胚層譜系特征性標記物的細胞分化成表達胰腺內(nèi)分泌譜系特征性標記物的細胞。例如，可通過將表達胰腺內(nèi)胚層譜系特征性標記物的細胞在含有DAPT和毒蜥外泌肽-4的培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，然后移除含有DAPT和毒蜥外泌肽-4的培養(yǎng)基，并隨后將所述細胞在含有毒蜥外泌肽1、IGF-I和HGF的培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，來使表達胰腺內(nèi)胚層譜系特征性標記物的細胞進一步分化成表達胰腺內(nèi)分泌譜系特征性標記物的細胞。這個方法的一個例子在 Nature Biotechnology 24，1392-1401 (2006)中公開。
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例如，可通過將表達胰腺內(nèi)胚層譜系特征性標記物的細胞在含有毒蜥外泌肽4 的培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，然后移除該含有毒蜥外泌肽4的培養(yǎng)基，并隨后將所述細胞在含有毒蜥外泌肽1、IGF-I和HGF的培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，來使表達胰腺內(nèi)胚層譜系特征性標記物的細胞進一步分化成表達胰腺內(nèi)分泌譜系特征性標記物的細胞。該方法的一個例子在 D' Amour 等人，NatureBiotechnology, 2006 中公開。例如，可通過將表達胰腺內(nèi)胚層譜系特征性標記物的細胞在含有DAPT和毒蜥外泌肽4的培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，來使表達胰腺內(nèi)胚層譜系特征性標記物的細胞進一步分化成表達胰腺內(nèi)分泌譜系特征性標記物的細胞。該方法的一個例子在D’ Amour等人， NatureBiotechnology, 2006 中公開。例如，可通過將表達胰腺內(nèi)胚層譜系特征性標記物的細胞在含有毒蜥外泌肽4 的培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，來使表達胰腺內(nèi)胚層譜系特征性標記物的細胞進一步分化成表達胰腺內(nèi)分泌譜系特征性標記物的細胞。該方法的一個例子在D’ Amour等人，Nature Biotechnology, 2006 中公開。在本發(fā)明的一個方面，根據(jù)轉(zhuǎn)讓給Lif必can，Inc.的美國專利申請 No. 11/736,908中所公開的方法，通過用抑制Notch信號轉(zhuǎn)導通路的因子處理表達胰腺內(nèi)胚層譜系特征性標記物的細胞，來使表達胰腺內(nèi)胚層譜系特征性標記物的細胞進一步分化為表達胰腺內(nèi)分泌譜系特征性標記物的細胞。在本發(fā)明的一個方面，根據(jù)轉(zhuǎn)讓給Lif必can，Inc.的美國專利申請 No. 11/779,311中所公開的方法，通過用抑制Notch信號轉(zhuǎn)導通路的因子處理表達胰腺內(nèi)胚層譜系特征性標記物的細胞，來使表達胰腺內(nèi)胚層譜系特征性標記物的細胞進一步分化為表達胰腺內(nèi)分泌譜系特征性標記物的細胞。在本發(fā)明的一個方面，根據(jù)轉(zhuǎn)讓給Lif必can，Inc.的美國專利申請 No. 60/953，178中所公開的方法，通過用抑制Notch信號轉(zhuǎn)導通路的因子處理表達胰腺內(nèi)胚層譜系特征性標記物的細胞，來使表達胰腺內(nèi)胚層譜系特征性標記物的細胞進一步分化為表達胰腺內(nèi)分泌譜系特征性標記物的細胞。在本發(fā)明的一個方面，根據(jù)美國專利申請No. 60/990，529中所公開的方法，通過處理表達胰腺內(nèi)胚層譜系特征性標記物的細胞，來使表達胰腺內(nèi)胚層譜系特征性標記物的細胞進一步分化成表達胰腺內(nèi)分泌譜系特征性標記物的細胞。在本發(fā)明的一個方面，本發(fā)明提供了一種用于增加與胰腺內(nèi)分泌譜系相關(guān)的標記物的表達的方法，所述方法包括用包含足量的TGF-β受體激動劑的培養(yǎng)基處理表達胰腺內(nèi)分泌譜系特征性標記物的細胞，以引起與胰腺內(nèi)分泌譜系相關(guān)的標記物表達的增加。所述TGF-β受體激動劑可以是任何能結(jié)合并激活TGF-β受體的任何試劑。在一個實施例中，所述TGF-β受體激動劑選自激活素Α、激活素B和激活素C。在一個替代實施例中，所述TGF-β受體激動劑可以是激活素A的肽變體。這類肽變體的實例公開于轉(zhuǎn)讓給Centocor R&D，Inc.的美國專利申請No. 61/076，889中。在一個實施例中，表達胰腺內(nèi)分泌譜系特征性標記物的細胞用其量足以引起與胰腺內(nèi)分泌譜系相關(guān)的標記物表達的增加的激活素A處理約一至約五天。作為另外一種選擇，表達胰腺內(nèi)分泌譜系特征性標記物的細胞用其量足以引起與胰腺內(nèi)分泌譜系相關(guān)的標記物表達的增加的激活素A處理約三至約五天。作為另外一種選擇，表達胰腺內(nèi)分泌譜系特征性標記物的細胞用其量足以引起與胰腺內(nèi)分泌譜系相關(guān)的標記物表達的增加的激活素A處理約五天。在一個替代實施例中，TGF-β受體激動劑選自⑶F-8、⑶F 11和⑶F-15。在一個實施例中，表達胰腺內(nèi)分泌譜系特征性標記物的細胞用選自⑶F-8、⑶F 11和⑶F-15的 TGF-β受體激動劑以及至少一種其他因子進行處理。在一個實施例中，所述至少一種其他因子是環(huán)苯胺-吡啶并三嗪化合物。這類環(huán)苯胺-吡啶并三嗪化合物的實例公開于轉(zhuǎn)讓給 Centocor R&D，Inc.的美國專利申請No. 61/076，900中。在一個替代實施例中，所述至少一種其他因子是苯胺-吡啶并三嗪化合物。這類苯胺-吡啶并三嗪化合物的實例公開于轉(zhuǎn)讓給Centocor R&D，Inc.的美國專利申請No. 61/076，908中。在一個替代實施例中，所述至少一種其他因子是公開于轉(zhuǎn)讓給Centocor R&D, Inc.的美國專利申請No. 61/076，915中的化合物。在本發(fā)明的一個方面，隨后將表達胰腺內(nèi)分泌譜系特征性標記物的細胞富集。富集步驟可以在用TGF-β受體激動劑處理表達胰腺內(nèi)分泌譜系特征性標記物的細胞之前進行。作為另外一種選擇，富集步驟可以在已用TGF-β受體激動劑處理表達胰腺內(nèi)分泌譜系特征性標記物的細胞之后進行。在一個實施例中，通過獲得表達胰腺內(nèi)分泌譜系特征性標記物的細胞的懸浮液并使細胞懸浮液通過40 μ m細胞過濾網(wǎng)來實現(xiàn)富集。表達胰腺內(nèi)分泌譜系特征性標記物的細胞的檢測胰腺內(nèi)分泌譜系特征性標記物是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的，并且其他胰腺內(nèi)分泌譜系特征性標記物不斷被鑒別。這些標記物可用于確定根據(jù)本發(fā)明處理過的細胞是否已分化而獲得胰腺內(nèi)分泌譜系特征性特性。胰腺內(nèi)分泌譜系的特異性標記物包括一種或多種轉(zhuǎn)錄因子，例如NGN-3、NeuroD、Islet-I的表達。β細胞譜系特征性標記物是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的，并且其他β細胞譜系特征性標記物不斷被鑒別。這些標記物可用于確認根據(jù)本發(fā)明處理的細胞已分化，以獲得
細胞譜系特征性的性質(zhì)。除了別的以外，β細胞譜系特異性特征包括一種或多種轉(zhuǎn)錄因子的表達，這些因子例如為Pdxl (胰腺和十二指腸同源盒基因-1)、Nkx2. 2、Nkx6. 1、 Isll、Pax6、Pax4、NeuroD、Hnflb、Hnf-6、Hnf-3 3 和 MafA 以及其他。這些轉(zhuǎn)錄因子在內(nèi)分泌細胞鑒別領(lǐng)域中已得到公認。參見例如Edlund(Nature Reviews Genetics 3 524-632(2002))ο可通過將處理過的細胞群體暴露于可特異性識別由表達胰腺內(nèi)分泌譜系特征性標記物的細胞表達的蛋白質(zhì)標記物的試劑(例如抗體)來確定分化效率。作為另一種選擇， 可通過將處理過的細胞群體暴露于可特異性識別由表達β細胞譜系特征性標記物的細胞表達的蛋白質(zhì)標記物的試劑(例如抗體)來確定分化效率。用于評估蛋白質(zhì)標記物和核酸標記物在培養(yǎng)的或分離的細胞中的表達的方法是本領(lǐng)域的標準方法。這些方法包括定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)、Northern印跡原位雜交(參見例如"Current Protocols in Molecular Biology，，(Ausubel 等人(編輯)， 2001增刊))以及免疫測定法，例如分段材料的免疫組織化學分析，Western印跡、以及用于完整細胞中容易獲得的標記物的流式細胞分析(FACS)(參見例如Harlow和Lane的 "Using Antibodies :A Laboratory Manual，，，New York :Cold Spring Harbor Laboratory
15Press (1998))ο在本發(fā)明的一個方面，通過在處理后測定給定細胞培養(yǎng)物中胰島素陽性細胞的百分比來確定分化的效率。在一個實施例中，本發(fā)明方法在給定培養(yǎng)物中產(chǎn)生約100%的胰島素陽性細胞。在一個替代實施例中，本發(fā)明方法在給定培養(yǎng)物中產(chǎn)生約90%的胰島素陽性細胞。在一個替代實施例中，本發(fā)明方法在給定培養(yǎng)物中產(chǎn)生約80%的胰島素陽性細胞。 在一個替代實施例中，本發(fā)明方法在給定培養(yǎng)物中產(chǎn)生約70%的胰島素陽性細胞。在一個替代實施例中，本發(fā)明方法在給定培養(yǎng)物中產(chǎn)生約60%的胰島素陽性細胞。在一個替代實施例中，本發(fā)明方法在給定培養(yǎng)物中產(chǎn)生約50%的胰島素陽性細胞。在一個替代實施例中， 本發(fā)明方法在給定培養(yǎng)物中產(chǎn)生約40%的胰島素陽性細胞。在一個替代實施例中，本發(fā)明方法在給定培養(yǎng)物中產(chǎn)生約30%的胰島素陽性細胞。在一個替代實施例中，本發(fā)明方法在給定培養(yǎng)物中產(chǎn)生約20%的胰島素陽性細胞。在一個替代實施例中，本發(fā)明方法在給定培養(yǎng)物中產(chǎn)生約10%的胰島素陽性細胞。在一個替代實施例中，本發(fā)明方法在給定培養(yǎng)物中產(chǎn)生約5%的胰島素陽性細胞。在本發(fā)明的一個方面，通過測定葡萄糖刺激的胰島素分泌來確定分化的效率，胰島素分泌可通過測量由細胞釋放的C-肽的量測定。在一個實施例中，由本發(fā)明方法產(chǎn)生的細胞可產(chǎn)生約IOOOng C-肽/pg DNA。在一個替代實施例中，由本發(fā)明方法產(chǎn)生的細胞可產(chǎn)生約900ng C肽/pg DNA。在一個替代實施例中，由本發(fā)明方法產(chǎn)生的細胞可產(chǎn)生約 800ng C肽/pg DNA。在一個替代實施例中，由本發(fā)明方法產(chǎn)生的細胞可產(chǎn)生約700ng C肽 /pg DNA。在一個替代實施例中，由本發(fā)明方法產(chǎn)生的細胞可產(chǎn)生約600ng C肽/pg DNA0 在一個替代實施例中，由本發(fā)明方法產(chǎn)生的細胞可產(chǎn)生約500ng C肽/pgDNA。在一個替代實施例中，由本發(fā)明方法產(chǎn)生的細胞可產(chǎn)生約400ng C肽/pg DNA。在一個替代實施例中， 由本發(fā)明方法產(chǎn)生的細胞可產(chǎn)生約500ng C肽/pg DNA。在一個替代實施例中，由本發(fā)明方法產(chǎn)生的細胞可產(chǎn)生約400ng C肽/pg DNA。在一個替代實施例中，由本發(fā)明方法產(chǎn)生的細胞可產(chǎn)生約300ng C肽/pg DNA。在一個替代實施例中，由本發(fā)明方法產(chǎn)生的細胞可產(chǎn)生約200ng C肽/pg DNA。在一個替代實施例中，由本發(fā)明方法產(chǎn)生的細胞可產(chǎn)生約IOOng C 肽/pg DNA。在一個替代實施例中，由本發(fā)明方法產(chǎn)生的細胞可產(chǎn)生約90ng C肽/pg DNA。 在一個替代實施例中，由本發(fā)明方法產(chǎn)生的細胞可產(chǎn)生約80ng C肽/pg DNA。在一個替代實施例中，由本發(fā)明方法產(chǎn)生的細胞可產(chǎn)生約70ng C肽/pg DNA。在一個替代實施例中， 由本發(fā)明方法產(chǎn)生的細胞可產(chǎn)生約60ng C肽/pg DNA。在一個替代實施例中，由本發(fā)明方法產(chǎn)生的細胞可產(chǎn)生約50ng C肽/pg DNA。在一個替代實施例中，由本發(fā)明方法產(chǎn)生的細胞可產(chǎn)生約40ng C肽/pg DNA。在一個替代實施例中，由本發(fā)明方法產(chǎn)生的細胞可產(chǎn)生約 30ng C肽/pg DNA。在一個替代實施例中，由本發(fā)明方法產(chǎn)生的細胞可產(chǎn)生約20ng C肽/ pg DNA。在一個替代實施例中，由本發(fā)明方法產(chǎn)生的細胞可產(chǎn)生約IOng C肽/pg DNA。ix^在一個方面，本發(fā)明提供了一種用于治療患有1型糖尿病，或有發(fā)展1型糖尿病風險的患者的方法。本方法涉及對多能干細胞進行培養(yǎng)，使該多能干細胞體外分化成細胞譜系，并將該β-細胞譜系的細胞移植進患者中。在另一個方面，本發(fā)明提供了一種用于治療患有2型糖尿病，或有發(fā)展2型糖尿病風險的患者的方法。該方法涉及將多能干細胞進行培養(yǎng)，使該培養(yǎng)的細胞體外分化成β -細胞譜系，并將該β -細胞譜系的細胞移植進該患者中。如果合適，可用有利于該植入細胞存活和功能的藥劑或生物活性劑對患者進行進一步處理。這些試劑可包括(例如)胰島素、TGF-β家族的成員(包括TGF-i3 1、2和 3)、骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP-2、-3、-4、-5、-6、-7、-11、-12和-13)、成纖維細胞生長因子_1 和-2、血小板衍生生長因子-AA和-BB、血小板富集血漿、胰島素生長因子(IGF-I、II)、 生長分化因子(⑶F-5、-6、-7、-8、-10、-15)、血管內(nèi)皮細胞衍生生長因子(VEGF)、多效蛋白(pleiotrophin)、內(nèi)皮素等等。其他藥物化合物可包括(例如)煙酰胺、胰高血糖素樣肽-I (GLP-I)和胰高血糖素樣肽-II、GLP-I和2模擬體、毒蜥外泌肽_4、視黃酸、甲狀旁腺激素、MAPK抑制劑例如美國已公布的專利申請2004/0209901和美國已公布的專利申請 2004/0132729中所公開的化合物。可使多能干細胞在移植進接受者前分化成胰島素生成細胞。在一個特定的實施例中，在移植進接受者之前，使多能干細胞完全分化成細胞。作為另一種選擇，可將多能干細胞以未分化狀態(tài)或部分分化的狀態(tài)移植進接受者中。可在該接受者中發(fā)生進一步分化?？蓪⒍ㄐ蝺?nèi)胚層細胞或，作為另一選擇，胰腺內(nèi)胚層細胞，或作為另一種選擇，β 細胞作為分散細胞進行移植，或可將這些細胞形成簇，可將這些細胞簇輸注進肝門靜脈內(nèi)。 作為另一種選擇，可將細胞設(shè)置在生物相容性的可降解聚合物型支持物中、多孔的非可降解性裝置中或可進行封裝以保護其免受宿主免疫應(yīng)答的破壞?？蓪⒓毎浦策M接受者中的合適位置內(nèi)。植入位點包括(例如)肝臟、原來的胰腺、腎包膜下空間、網(wǎng)膜、腹膜、漿膜下空間、腸、胃或皮下袋。為了增強植入細胞的進一步分化、存活率或活性，可在施用細胞之前、與其同時或之后施用額外的因子，例如生長因子、抗氧化劑或抗炎劑。在某些實施例中，生長因子用于體內(nèi)分化施用的細胞。這些因子可以由內(nèi)源細胞分泌并就地暴露于施用的細胞。可通過本領(lǐng)域已知的內(nèi)源生長因子或外源施用的生長因子的任意組合來誘導植入細胞進行分化。移植中所用的量取決于多種因素，包括患者的狀況和對該療法的響應(yīng)，并且可由本領(lǐng)域技術(shù)人員確定。在一個方面，本發(fā)明提供了一種用于治療患有糖尿病，或有發(fā)展糖尿病風險的患者的方法。該方法涉及培養(yǎng)多能干細胞、使該培養(yǎng)的細胞體外分化成細胞譜系，并將該細胞摻入三維的支持物中。在移植進患者前，可將該細胞在該支持物上體外維持。作為另一種選擇，可將包含該細胞的支持物直接移植進患者中而無需進行額外的體外培養(yǎng)?？扇芜x將至少一種有利于植入細胞的存活和功能的藥劑摻入該支持物中。適用于本發(fā)明目的的支持材料包括可用于組織修復的組織模板、導管、屏障物和貯器。具體地講，已經(jīng)在體外和體內(nèi)用于生物組織重建或再生，以及用于遞送趨化劑來誘導組織生長的泡沫、海綿、凝膠、水凝膠、紡織物和非織造結(jié)構(gòu)形式的合成材料和天然材料適用于實踐本發(fā)明的方法。參見，例如在美國專利5，770，417、美國專利6，022，743、美國專利5，567，612、美國專利5，759，830、美國專利6，626，950、美國專利6，534，084、美國專利 6，306，424、美國專利6，365，149、美國專利6，599，323、美國專利6，656，488、美國已公布的專利申請2004/0062753Α1、美國專利4，557，264和美國專利6，333，029中所公開的材料。為了形成含有藥劑的支承體，可在形成支承體前將藥劑與聚合物溶液混合。作為另一種選擇，可將藥劑涂覆于制好的支持物上，優(yōu)選在存在藥物載體的情況下進行。藥物可以液體、細分固體或任何其他合適的物理形式存在。作為另一種選擇，可將賦形劑加入支持物中以改變藥劑的釋放速率。在一個替代實施例中，將至少一種為抗炎化合物的藥物化合物摻入支持物中，例如在美國專利6，509，369中所公開的化合物?？蓪⒅辽僖环N為抗凋亡化合物的藥物化合物摻入支持物中，例如在美國專利 6，793，945中所公開的化合物。可將至少一種為纖維變性抑制劑的藥物化合物摻入支持物中，例如在美國專利 6，331，298中所公開的化合物。支持物還可摻有至少一種能夠增強血管生成的藥物化合物，例如美國已公布的專利申請2004/0220393和美國已公布的專利申請2004/0209901中所公開的化合物。支持物還可摻有至少一種為免疫抑制化合物的藥物化合物，例如美國已公布的專利申請2004/0171623中所公開的化合物。支持物還可摻有至少一種為生長因子的藥物化合物，例如TGF-β家族的成員(包括 TGF-β 1、2 和 3)、骨形態(tài)發(fā)生蛋白(ΒΜΡ-2、-3、-4、-5、-6、-7、-11、-12 和-13)、成纖維細胞生長因子-1和_2、血小板衍生生長因子-AA和-ΒΒ、血小板富集血漿、胰島素生長因子 (IGF-I、II)、生長分化因子(⑶F-5、-6、-8、-10、-15)、血管內(nèi)皮細胞衍生生長因子(VEGF)、 多效蛋白、內(nèi)皮素等等。其他藥物化合物可包括(例如)煙酰胺、缺氧誘導因子l-α、胰高血糖素樣肽-1的1^-1)、61^-1和61^-2模擬體、毒蜥外泌肽-4、110叔1、成頭蛋白、呢 、視黃酸、 甲狀旁腺激素、腱生蛋白-C、彈性蛋白原、凝血酶衍生的肽、凱薩林菌素(cathelicidin)、 防御素(defensin)、層粘連蛋白、含有粘附性細胞外基質(zhì)蛋白例如纖粘蛋白和玻璃粘連蛋白的細胞結(jié)合結(jié)構(gòu)域和肝素結(jié)合結(jié)構(gòu)域的生物肽、MAPK抑制劑(例如在美國已公布的專利申請2004/0209901和美國已公布的專利申請2004/01327 中所公開的化合物)?？赏ㄟ^將細胞簡單地沉積在該支架上來實現(xiàn)將本發(fā)明細胞摻入支架中。細胞可通過簡單擴散進入支架中(J. Pediatr. Surg. 23(1 Pt 2) :3-9(1988)).已經(jīng)發(fā)展了若干其他方法來增強細胞接種的效率。例如，已經(jīng)將轉(zhuǎn)瓶用于將軟骨細胞接種于聚乙醇酸支架上 (Biotechnol. Prog. 14 (2) 193-202 (1998))。用于細胞接種另一種方法是利用離心，這種離心產(chǎn)生最小的應(yīng)力給接種的細胞并增強接種效率。例如，Yang等人發(fā)展了一種細胞接種方法(J. Biomed. Mater. Res. 55(3) :379-86 Q001))，稱為離心細胞固定(Centrifugational Cell Immobilization, CCI)。本發(fā)明通過(但不限于)以下實例進一步說明。SM實例1在不存在胎牛血清的情況下細胞系Hl的人胚胎干細胞向胰腺內(nèi)分泌細胞的分化將第52代的人胚胎干細胞系Hl細胞在涂覆有MATRIGEL (1 30稀釋物)的培養(yǎng)皿上培養(yǎng)并暴露于補充有2% BSA(目錄號15M01，MP Biomedical, Ohio)和100ng/ml激活素 A (R&D Systems, MN) +20ng/ml WNT-3a (目錄號 1324-WN-002，R&D Systems, MN) +8ng/ ml的bFGF(目錄號100-18B，P印roTech，NJ)的RPMI培養(yǎng)基一天，然后用補充有2% BSA和 100ng/ml激活素A加8ng/ml bFGF的RPMI培養(yǎng)基再處理兩天。接著，將培養(yǎng)物用DMEM/ F12+2% BSA+50ng/ml FGF7+0. 25 μ M環(huán)巴胺-KAAD (#239804，Calbiochem，CA)處理兩天，然后在 DMEM/F12+1 % B27 (Invitrogen, CA) +50ng/ml FGF7+0. 25 μ M 環(huán)巴胺-KAAD+2 μ M 視黃酸(RA) (Sigma，M0)+100ng/ml 成頭蛋白(R&D Systems, MN)中溫育四天。通過將細胞在DMEM/F12+1 % B27 (Invitrogen，CA)+100ng/ml 成頭蛋白+1 μ M DAPT(y-分泌酶抑制劑)(目錄號565784,Calbiochem,CA) +1 μ M ALK5抑制劑II (目錄號 616452, Calbiochem, Ca) +100ng/ml 導蛋白-4 (R&D Systems,MN)中溫育三天，然后在 DMEM/ F12+l% B27 (Invitrogen, CA) +1 μ M ALK5 抑制劑 II (Calbiochem，Ca)中再溫育七天，來使細胞分化為胰腺內(nèi)分泌細胞。增加了最后一個階段以進一步使內(nèi)分泌培養(yǎng)物成熟，該階段由在DMEM/F12+1% B27 (Invitrogen，CA)中處理七天構(gòu)成。除了該最后階段之外，所有其他階段均包括每日更換培養(yǎng)基。圖1概略地描述了該方法。在每個階段，用血球計計算細胞數(shù)目并收集RNA用于PCR分析。所有樣品均一式三份進行收集。圖2的分圖a和分圖b示出對應(yīng)于第1階段的三天(3D)這一時間點上的通過FACS 測得的細胞中的CXCR4表達和實時PCR的數(shù)據(jù)。表達的改變倍數(shù)相對于未分化的Hl胚胎干細胞示出。實例2向第6階段培養(yǎng)物添加激活素A顯著提高胰腺內(nèi)分泌標記物的表汰將第43代的人胚胎干細胞系Hl的細胞在涂覆有MATRIGEL (1 30稀釋物)的培養(yǎng)皿上培養(yǎng)，并根據(jù)實例1所述的方法分化為胰腺內(nèi)分泌細胞。在第6階段，將一些培養(yǎng)物用lOng/ml的激活素A(R&D Systems,MN)處理七天。在第7天，將細胞在室溫下用IX Accutase (Sigma,M0)處理5分鐘，然后移除Accutase并添加DMEM/12+1% B27。將貼壁細胞用細胞刮移除并輕輕地再懸浮，并使其通過40 μ m細胞過濾網(wǎng)。液流通過，移出留在過濾網(wǎng)上的細胞，收集樣品以用于PCR和雙硫腙染色。雙硫腙(DTZ)是選擇性結(jié)合鋅的染料，已經(jīng)證明胰島內(nèi)存在鋅。圖3(分圖a-c)示出了在使用40 μ m細胞過濾網(wǎng)分離之前和之后的 DTZ染色的培養(yǎng)物。大部分(大約80%)大于40 μ m的細胞簇DTZ染色呈陽性。這提供了一種快速且簡單的內(nèi)分泌富集細胞簇的富集方法。圖4(分圖a-f)示出了在第6階段用 +/-10ng/ml的激活素A處理并隨后使用40 μ m過濾器富集的細胞的基因表達譜。激活素A 添加到第6階段顯著提高了所有關(guān)鍵胰腺內(nèi)分泌標記物的表達。藉此將整篇文檔中引用的出版物全文以引用方式并入本文。盡管上文已結(jié)合實例和優(yōu)選實施例描述了本發(fā)明的各個方面，但應(yīng)當理解本發(fā)明的范圍不受上述具體實施方式
的限定，而受以下在專利法原則下正確解釋的權(quán)利要求書的限定。
19
權(quán)利要求
1.一種增加與胰腺內(nèi)分泌譜系相關(guān)的標記物的表達的方法，所述方法包括用包含量足以引起與胰腺內(nèi)分泌譜系相關(guān)的標記物表達增加的TGF-β受體激動劑的培養(yǎng)基處理表達與胰腺內(nèi)分泌譜系相關(guān)的標記物的細胞。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述TGF-β受體激動劑選自激活素Α、激活素B、 激活素C、激活素A的肽變體、⑶F-8、⑶F-Il和⑶F-15。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中將所述表達與胰腺內(nèi)分泌譜系相關(guān)的標記物的細胞進行富集。
4.一種使多能干細胞分化的方法，所述方法包括如下步驟a.培養(yǎng)所述多能干細胞，b.使所述多能干細胞分化成表達定形內(nèi)胚層譜系特征性標記物的細胞，c.使所述表達定形內(nèi)胚層譜系特征性標記物的細胞分化成表達胰腺內(nèi)胚層譜系特征性標記物的細胞，以及d.使所述表達胰腺內(nèi)胚層譜系特征性標記物的細胞分化成表達胰腺內(nèi)分泌譜系特征性標記物的細胞。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中通過用包含量足以引起與胰腺內(nèi)分泌譜系相關(guān)的標記物表達增加的TGF-β受體激動劑的培養(yǎng)基處理所述表達胰腺內(nèi)分泌譜系特征性標記物的細胞，來增加胰腺內(nèi)分泌譜系特征性標記物的表達。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中所述TGF-β受體激動劑選自激活素Α、激活素B、 激活素C、激活素A的肽變體、⑶F-8、⑶F-Il和⑶F-15。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中將所述表達與胰腺內(nèi)分泌譜系相關(guān)的標記物的細胞進行富集。
全文摘要
本發(fā)明提供了促進多能干細胞分化的方法。具體地講，本發(fā)明提供了一種使用TEF-β受體激動劑例如激活素A、激活素B、激活素C、GDF-8、GDF-11或GDF15來增加與胰腺內(nèi)分泌譜系相關(guān)的標記物的表達的方法。
文檔編號C12N5/071GK102333862SQ200980153742
公開日2012年1月25日 申請日期2009年10月22日 優(yōu)先權(quán)日2008年10月31日
發(fā)明者A·雷扎尼亞 申請人:森托科爾奧索生物科技公司