專利名稱：促進(jìn)植物生長的蛋白復(fù)合物的制作方法
促進(jìn)植物生長的蛋白復(fù)合物本發(fā)明涉及促進(jìn)植物生長的蛋白復(fù)合物。更具體地，本發(fā)明涉及來自分裂后期促進(jìn)復(fù)合物/細(xì)胞周期體(Anaphase Promoting Complex/Cyclosome)的特定蛋白質(zhì)在增加苗生長速率(shoot growth rate)和/或增強(qiáng)細(xì)胞分裂速率中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
遍在蛋白化介導(dǎo)的蛋白酶解是控制調(diào)節(jié)蛋白水平的主要機(jī)制。底物遍在蛋白化過程包括三種酶的級聯(lián)活性，即遍在蛋白激活酶(El)、遍在蛋白綴合酶(E》以及遍在蛋白連接酶(Ε； )。遍在蛋白化的底物特異性和調(diào)節(jié)由E3遍在蛋白蛋白連接酶賦予，其直接結(jié)合靶蛋白質(zhì)，并且是遍在蛋白化級聯(lián)中的限速步驟(參見Hershko and Ciechanover，1998和 Peters,2002)。兩種結(jié)構(gòu)相關(guān)的多蛋白E3連接酶，即分裂后期促進(jìn)復(fù)合物/細(xì)胞周期體(APC/C) 和Skpl/Cullin/F-box蛋白質(zhì)(SCF)復(fù)合物驅(qū)動真核細(xì)胞周期行進(jìn)。SCF連接酶的活性主要控制從G1/S和G2/M的轉(zhuǎn)換(transition)，而APC/C主要為有絲分裂的行進(jìn)和退出所需 (Morgan,1999)。APC是已知催化遍在蛋白化反應(yīng)的最復(fù)雜的分子機(jī)構(gòu)之一，因為其含有一打以上的亞基(Yoon et al. ,2002 ；Peters et al.，1996)。這種復(fù)雜性是不希望的，因為許多其它遍在蛋白連接酶僅由一或幾個亞基組成，意味著遍在蛋白連接酶活性非必然依賴于多個亞基。因此，仍費(fèi)解的是為什么APC由如此多的蛋白質(zhì)成分組成及其各個功能如何。APClO 是 APC/C 的亞基，其含有 Doc 1 (Destruction of Cyclin)結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域也見于遍在蛋白-蛋白酶體系統(tǒng)的一些其它蛋白質(zhì)中。已知酵母中APClO的突變體阻止底物與APC/CGdhl結(jié)合，提示這個亞基可能在底物識別起作用。I^assmore et al. (2003)已經(jīng)證實APC10有助于APC底物識別，不依賴于共激活物，及提示APC10起潛在的APC調(diào)節(jié)亞基的作用。芽殖酵母APC的生物化學(xué)分析示出APC10/D0C1通過增強(qiáng)APC-底物復(fù)合物的親和性而增加底物遍在蛋白化的進(jìn)程(Carrol et al.，2005)。重要地，APC與激活物⑶Hl和 ⑶C20之間的相互作用不受APC10/D0C1功能喪失的影響，提示APC10/D0C1直接或與其它核心APC亞基合作而促進(jìn)底物結(jié)合(Au et al.，2002)。擬南芥(Arabidopsis)中編碼APC亞基的整套基因的鑒別增進(jìn)了這樣的認(rèn)識，即植物中由遍在蛋白介導(dǎo)的蛋白酶解控制的基本過程與其它真核生物相似(Eloy et al., 2006)。然而，基因結(jié)構(gòu)和表達(dá)的結(jié)果闡明植物APC的獨(dú)特特性，及示出可能特別為生長應(yīng)答(適應(yīng)于變化的環(huán)境條件所需的)所需的柔性(flexible)復(fù)合物的前景(Eloy et al.， 2006)。

發(fā)明內(nèi)容
令人驚奇地，我們發(fā)現(xiàn)過表達(dá)APC10亞基以及APC10亞基的新相互作用物(Novel Interactor) (SAMBA)功能喪失的品系(line)示出增加的生長。
本發(fā)明第一方面是APClO或者其變體在增加植物生長和/或產(chǎn)量中的應(yīng)用。如本文所示，所述應(yīng)用是所述蛋白質(zhì)的應(yīng)用，和/或編碼該蛋白質(zhì)的核酸或者其互補(bǔ)序列的應(yīng)用。其包括但不限于基因組DNA、cDNA、信使RNA(包括5’和3’非翻譯區(qū))以及RNAi。如本文所用，變體包括但不限于SEQ ID N0:1(APC10蛋白)的同源物、直系同源物和旁系同源物。蛋白質(zhì)的“同源物”涵蓋相對于所述未修飾的蛋白質(zhì)具有氨基酸取代、缺失和/或插入并具有與衍生其的未修飾的蛋白質(zhì)相似的生物活性和功能活性的肽、寡肽、多肽、蛋白質(zhì)和酶。直系同源物和旁系同源物涵蓋用于描述基因祖先關(guān)系的進(jìn)化概念。旁系同源物是相同物種內(nèi)通過祖先基因復(fù)制而起源的基因；直系同源物是來自通過物種形成而起源的不同生物體的基因，并且也衍生自共同的祖先基因。優(yōu)選地，所述同源物、直系同源物或者旁系同源物在蛋白質(zhì)水平具有在BLASTp中測量(Altschul et al. ,1997 ；Altschul et al.， 2005)的至少 50%、51%、52%、53%、54%或55%、56%、57%、58%、59%，優(yōu)選地 60%, 61 %,62%,63 %,64%,65 %,66%,67%,68 %,69 %,更優(yōu)選地 70 %,71 %,72 %,73 %, 74%、75%、76%、77%、78%、79%，還更優(yōu)選地 80 % ,81 % ,82 % ,83 % ,84 % ,85 % ,86 %, 87%、88%、89%，最優(yōu)選地 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更高的序列相同性。作為非限制性例子，SEQ ID N0:1的直系同源物是Pt796785(楊樹)、 Vv00024912001 (葡萄)、AC187383 (玉米)和0s05g50360 (稻)。植物生長和/或產(chǎn)量的增加通過將包含根據(jù)本發(fā)明使用的基因的測試植物與在相同條件下生長的作為對照的親本未轉(zhuǎn)化植物進(jìn)行對比而測量。優(yōu)選地，生長的增加以生物量產(chǎn)生的增加進(jìn)行測量?！爱a(chǎn)量” 是指這樣的情況，即其中僅植物的部分、優(yōu)選植物的經(jīng)濟(jì)學(xué)重要部分如葉、根或者種子的生物量增加。如本文所用，術(shù)語“增加”是指與本文所述對照植物相比，產(chǎn)量和/或生長增加至少5%、6%、7%、8%、9%或者10%，優(yōu)選至少15%或者20%，更優(yōu)選25%、30%、35%或者40%。如本文所用，植物生長的增加優(yōu)選以葉生物量、根生物量和種子生物量中任一或多項的增加進(jìn)行測量。本發(fā)明另一方面涉及APClO相互作用蛋白或者其變體、或者編碼該蛋白質(zhì)的核酸或者其互補(bǔ)序列在增加植物生長中的應(yīng)用。事實上，由于APClO是蛋白質(zhì)復(fù)合物的一部分， 其功能可以由該復(fù)合物中其他蛋白質(zhì)的過表達(dá)或者低表達(dá)補(bǔ)償。優(yōu)選地，所述APClO相互作用蛋白選自 AT2G39090、AT2G20000、AT5G05560、AT3G48150、AT1G06590、AT1G78770、 AT4G21530、AT2G04660、AT1G32310、AT2G42260、AT4GA19210、AT3G57860、AT3G16320、 AT4G25550、AT5G13840、AT3G48750、AT3G56150 和 AT2G06210 中的任一或多種蛋白，或者其變體。更優(yōu)選地，所述APClO相互作用蛋白是SAMBA(SEQ ID NO :2)，或者其變體。如本文所用，變體包括但不限于SEQ ID N0:2(SAMBA蛋白)的同源物、直系同源物或者旁系同源物。蛋白質(zhì)的“同源物”涵蓋相對于所述未修飾的蛋白質(zhì)具有氨基酸取代、缺失和/或插入并具有與衍生其的未修飾的蛋白質(zhì)相似的生物活性和功能活性的肽、寡肽、多肽、蛋白質(zhì)和酶。直系同源物和旁系同源物涵蓋用于描述基因祖先關(guān)系的進(jìn)化概念。旁系同源物是相同物種內(nèi)通過祖先基因復(fù)制而起源的基因；直系同源物是來自通過物種形成起源的不同生物體的基因，并且也衍生自共同的祖先基因。優(yōu)選地，所述同源物、直系同源物或者旁系同源物在蛋白質(zhì)水平具有如在BLASTp 中測量(Altschul et al. , 1997 ；Altschul et al. ,2005) 的至少 40%、41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%，優(yōu)選 50%、51%、52%、 53%、54%或55%、56%、57%、58%、59%，優(yōu)選 60 % ,61 % ,62 % ,63 % ,64 % ,65 % ,66 %,67%、68%、69%，更優(yōu)選 70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、以及還更優(yōu)選 80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%，最優(yōu)選 90% 91%,92%, 93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或者更高的序列相同性。優(yōu)選地，所述同源物、直系同源物或者旁系同源物包含一或多個如下保守基序K (D/E) EA和/或PRS (R/H/C) I，更優(yōu)選基序(R/幻 K (D/E) EA (M/L/V)和 / 或 F (E/Q/D/G/A) (G/A) PRS (R/H/C) I，最優(yōu)選基序 K (D/E) E AXXXLXXXXMXXLXXXVXXLXXXXWXFXXraSXI，其中X可以是任何氨基酸。保守基序在

圖15中示出。優(yōu)選地，所述同源物、直系同源物或者旁系同源物是植物蛋白質(zhì)，更優(yōu)選是具有所述相同性百分比和所述保守基序的植物蛋白質(zhì)。優(yōu)選地，所述同源物、直系同源物或者旁系同源物在體外或者在體內(nèi)是生物學(xué)活性的，如通過其與APClO的相互作用而測量。作為非限制性實例，SAMBA(SEQ ID NO 2)的直系同源物選自 SEQ ID NO :3_SEQ ID NO :21。在一個優(yōu)選的實施方案中，APClO是過表達(dá)的。在另一優(yōu)選的實施方案中，SAMBA 的表達(dá)被抑制或者完全消除。過表達(dá)或者抑制是指與未修飾的親本植物相比在相同條件下生長的修飾的植物中的表達(dá)。使基因過表達(dá)或者抑制基因表達(dá)的方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員已知。作為非限制實例，過表達(dá)可以通過將基因的編碼序列置于強(qiáng)啟動子例如但非限于CMV 35S啟動子的控制下而實現(xiàn)?；蛘?，過表達(dá)可以通過增加基因的拷貝數(shù)而實現(xiàn)。作為非限制性實例，基因表達(dá)的抑制可以通過基因沉默、反義RNA或者通過RNAi實現(xiàn)。RNAi的設(shè)計為本領(lǐng)域技術(shù)人員已知。作為非限制性實例,RNAi可以用Web micro RNA designer (Ossowki et al. ,2005-2009)設(shè)計。所述RNAi可以針對mRNA的5’非翻譯末端區(qū)域的一部分、針對編碼序列一部分，和/或針對3’末端區(qū)域。靶序列的一些非限制性實例在表1中列出。因此，本發(fā)明另一方面涉及如上述針對編碼SAMBA或者其變體的核酸的RNAi在增加植物生長中的應(yīng)用。所述RNAi僅靶向所述核酸的一部分，從而可以使所述靶序列位于編碼序列中，或者位于編碼SAMBA或者其變體的所述核酸的5’或3’非翻譯區(qū)。靶基因的過表達(dá)或者表達(dá)抑制可以通過將旨在用于所述過表達(dá)或者所述表達(dá)抑制的遺傳構(gòu)建體轉(zhuǎn)移進(jìn)植物中而獲得。將外源基因轉(zhuǎn)移進(jìn)植物基因組中被稱作轉(zhuǎn)化。植物物種的轉(zhuǎn)化是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)技術(shù)。有利地，幾種轉(zhuǎn)化方法中的任意方法均可用于將感興趣的基因?qū)牒线m的祖細(xì)胞中。描述的用于從植物組織或者植物細(xì)胞中轉(zhuǎn)化和再生植物的方法可用于瞬時或者穩(wěn)定轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化方法包括但不限于農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化、使用脂質(zhì)體、電穿孔、增加游離DNA攝取的化合物、將DNA直接注射進(jìn)植物中、基因槍轟擊、使用病毒或者花粉的轉(zhuǎn)化以及微粒轟擊(microprojection)。優(yōu)選地，用于本發(fā)明的植物選自擬南芥(Arabidopsis thaliana)、蕓苔屬(Brassicus sp.)、大豆(Glycine max)、漠藜苜猜(Medicago truncatula)、葡萄 (Vitis vinifera)、楊屬(Populus sp.)、爺屬(Solanum sp·)、舌甘菜(Beta vulgaris)、 陸地棉(Gossypium hirsutum)、燕麥(Avena sativa)、大麥(Hordeum vulgare)、普通小麥(Triticum aestivum)、禾 S (Oryza sativa)> 毛竹(Phyllostachys edulis)、芒屬(Miscanthus sp.)、小米(Panicum virgatum)、玉米(Zea mays)、甘蔴(Saccharum officinarum)、高梁(Sorghum bicolor)禾口蓖麻(Ricinus communis)。在優(yōu)選的實施方案中，所述植物是作物植物，優(yōu)選是單子葉植物或者谷物，更優(yōu)選是選自稻、玉米、大麥、小米、 黑麥、高粱和燕麥的谷物。本發(fā)明另一方面涉及轉(zhuǎn)基因植物，其包含針對編碼SAMBA (SEQ ID NO :2)或者其變體的核酸的RNAi。在此使用的轉(zhuǎn)基因植物是包含重組DNA構(gòu)建體的植物，所述重組DNA 構(gòu)建體可以通過轉(zhuǎn)化直接導(dǎo)入，或者通過近交間接導(dǎo)入。針對編碼SAMBA的核酸的RNAi是指能負(fù)調(diào)節(jié)SAMBA的野生型表達(dá)的RNAi。優(yōu)選地，所述轉(zhuǎn)基因植物選自擬南芥、蕓苔屬、大豆、蒺藜苜猜、葡萄、楊屬、茄屬、甜菜、陸地棉、燕麥、大麥、普通小麥、稻、毛竹、芒屬、小米、 玉米、甘蔗、高粱和蓖麻。更優(yōu)選地，所述轉(zhuǎn)基因植物是作物植物，優(yōu)選單子葉植物或者谷物，更優(yōu)選是選自稻、玉米、小麥、大麥、小米、黑麥、高粱和燕麥。附圖簡述圖1 :APC10表達(dá)。在三周齡植物的全部幼苗(seedling)中APClO表達(dá)的Q-PCR 分析。圖2 =APCIOoe品系的表型分析。兩周齡在體外(in vitro)生長的野生型(左側(cè)) 和APCIOoe植物(右側(cè))。圖3 野生型(Col-O)和APClO高產(chǎn)(overproducing)植物的第一對葉的葉生長動態(tài)分析。(A)葉片面積。(B)葉的遠(yuǎn)軸側(cè)表皮細(xì)胞數(shù)。(C)葉的遠(yuǎn)軸側(cè)表皮細(xì)胞大小。圖4 在土壤中生長的三周齡野生型哥倫比亞和APC10°E植物的葉測量。A-品系 5. 3的葉面積和葉長度；B-品系2. 3的葉面積和葉長度。野生型植物的葉面積和葉長度以黃線示出。圖5 三周齡植物的鮮重和干重測量。A-22天齡APC10°E和野生型植物苗(shoot) 的鮮重。B-22天齡APC10°e和野生型植物苗的干重。圖6 最初葉的倍性水平分布:A-14天，B-18天。C-野生型、APC10OE5. 3和 APC10oe2. 3植物通過流式細(xì)胞計量術(shù)測量。圖7 =Samba敲除植物的分子分析。A-Samba的外顯子(方框)和內(nèi)含子(線)結(jié)構(gòu)示意圖。白色三角形表示T-DNA插入位點(diǎn)。B-SAMBA表達(dá)。對兩周齡植物的兩最初葉中的SAMBA表達(dá)進(jìn)行Q-PCR分析。圖8 =SAMBA敲除品系的表型分析。兩周齡在體外生長的SAMBA敲除植物(左側(cè)) 和野生型植物(右側(cè))。A-SAMBA敲除植物(SALK_018488)和野生型植物。B-SAMBA敲除植物(SALK_04883;3)和野生型植物。圖9 在體外(in vitro)和體內(nèi)(in vivo)生長的三周齡植物的葉測量。A-22天齡在體外生長的哥倫比亞(線)和SAMBA敲除植物(方塊)中的葉系列測量。B-得自測量 A的代表性圖片。C-22天齡在體內(nèi)生長的哥倫比亞(明線)和SAMBA敲除植物(暗線)中的葉系列測量。圖10 三周齡植物的鮮重和干重測量。A-Samki和野生型對照植物的苗鮮重。 B-Samba和野生型對照植物的苗干重。圖11 野生型和Samba敲除植物的12和15天齡植物葉1和2的測量，以及14天齡野生型和Samki敲除植物的最初葉的倍性水平分布。黑色長方形(野生型植物)，灰色長方形(Samba敲除植物)。(A)葉片面積(mm2)。
(B)葉遠(yuǎn)軸側(cè)表皮細(xì)胞數(shù)。(C)野生型和Samba敲除植物的倍性水平(％ )。圖12 兩周齡植物的根測量。A-野生型和Samba敲除植物的初生根測量。B-得自測量A的代表性圖片。C-根鮮重測量。D-根干重測量。圖13 野生型和Samba敲除植物的種子大小測量。圖14 甘露醇實驗。野生型和Samba敲除植物在25mM甘露醇條件下生長，對照實驗植物在無甘露醇條件下生長。圖15 =SAMBA變體的比對，示出保守基序。Arath 擬南芥(Arabidopsis thaliana) ；Brana 甘藍(lán)型油菜(Brassicus napus) ；Glyma 大豆(Glycine max)； Medtr — _ 胃 H (Medicago truncatula) ；Vitvi ^ ^ (Vitis vinifera) ；Poptr
沙Il 山楊(Populus tremula) ；Solly # ^jp (Solanum lycopersicon) ；Betvu:舌甘菜(Beta vulgaris) ；Avesa 燕麥(Avena sativa) ；Horvu 大麥(Hordeum vulgare) ；Triae 普通小麥(Triticum aestivum) ；Orysa M (Oryza sativa) ；Phyed 毛竹(Phyllostachys edulis) ；Panvi /J、(Panicum virgatum) ；Zeama ΞΕ (Zea mays) ；Sacof 1ξ["胃 (Saccharum officinarum) ；Sorbi :1 (Sorghum bicolor)。
實施例材料和方法克隆如述進(jìn)行在組成型花椰菜煙草花葉病毒35S啟動子控制下的編碼標(biāo)簽融合體的轉(zhuǎn)基因克隆、擬南芥細(xì)胞懸浮培養(yǎng)物的轉(zhuǎn)化、蛋白質(zhì)提取物制備、TAP純化、蛋白質(zhì)沉淀和分離(Van Leene et al. ，2007 & 2008)。使用BLAST程序在擬南芥(Arabidopsis thaliana)基因組版本(www, arabidopsis. org)搜索APClO基因同系物。在TA^數(shù)據(jù)庫中鑒別一個579bp及大約21KDa 的序列。APClO (AT2G18290)的編碼區(qū)用于設(shè)計特異性引物(AttblAPClO ggggacaagtttg tacaaaaaagcaggcttcacaatggcgacagagtcatcggaat 禾口 Attb2APC10 ggggaccactttgtacaag aaagctgggtatgttcttcaaacttctcctgctc),以分離各自的 cDNA,并從擬南芥(Arabidopsis thaliana)哥倫比亞生態(tài)型的組織中通過PCR直接擴(kuò)增。使用Pfx試劑盒(Invitrogen)，根據(jù)廠商指導(dǎo)進(jìn)行PCR反應(yīng)。使用Gateway系統(tǒng) (Invitrogen)通過attBfcittP重組位點(diǎn)將來自APClO基因的完整cDNA的PCR片段導(dǎo)入 PDONr 201中，隨后通過attL XattR位點(diǎn)重組重組進(jìn)pK7WG2載體中。所述序列通過測序證實。APC10_pK7WG2構(gòu)建體用于轉(zhuǎn)化擬南芥(Arabidopsis thaliana)，通過浸花 (flower-dip)方法(Clough and Bent, 1998)進(jìn)行。植物材料SAMBA 敲除植物(種子編碼SALK_048833 和 SALK_018488)得自 Salk 收藏(http://simal.salk. edu/)。每個品系的20株植物基因型通過PCR確定， 使用T-DNA插入元件的特異性引物和SAMBA的特異性引物進(jìn)行(salk 018488， LP_atgacgaaacaccgaaaacacand, RP_agttttatggtcggtcacacg ；Salk 048833, LP_ccattgggatcattactgctg, RP_aaaggaaacgtgacgattgtg ；T-DNA iJl^l^1), LBb 1_3
attttgccgatttcggaac)。在20株植物中，我們發(fā)現(xiàn)每個品系的2個單獨(dú)的純合子。T-DNA插入的存在及野生型基因的不存在通過對15天齡植物葉進(jìn)行基因組PCR證實。選擇這些植物產(chǎn)生更多的種子并用于隨后的分析。使用SAMBA的特異性引物(SAMBA_Fwd gctggtctagacgatttcca和 SAMBA_Rev-gcttcacttcacctcctttc)進(jìn)行 Q-PCR 以證實不存在 SAMBA 的 mRNA。擬南芥植物(生態(tài)型Col-O)用APC10_pK7WG2構(gòu)建體轉(zhuǎn)化，通過浸花(floral dip)方法(10)進(jìn)行。轉(zhuǎn)基因品系(APC10°e)通過在萌發(fā)培養(yǎng)基中50mg/l卡那霉素中選擇鑒別，隨后移至土壤中以優(yōu)化種子生產(chǎn)，及選擇T3純合植物。過表達(dá)品系通過Q-PCR證實，使用特異性弓 I物(APC10_Fwd tcatatccgccagatcaaagttt 和 APC10_Rev aaggttggtgcggaatagga)進(jìn)行， 以證實轉(zhuǎn)基因植物的mRNA水平。RNA提取和cDNA制備使用TRIzol試劑(Invitrogen)從冷凍材料中提取總RNA。為了消除制備物中存在的剩余基因組DNA，將RNA通過無RNAse的DNAse I根據(jù)廠商指導(dǎo)(Amersham Biosciences) 進(jìn)行處理，及使用來自Qiagen的RNeasy Mini試劑盒進(jìn)行純化。然后使用分光光度計對總 RNA進(jìn)行定量，并加樣于瓊脂糖凝膠上以檢測其完整性。使用“superscript III第一鏈合成系統(tǒng)”(Invitrogen)及oligo(dT)引物溶液在2ug RNA模板上根據(jù)廠商指導(dǎo)制備cDNA。蛋白酶解和肽分離在脫色后，將凝膠平板在H2O中洗滌1小時，在25mL的6. 66mM DTT(在50mM NH4HCO3中)中40分鐘使多肽二硫鍵還原，隨后在25mL的55mM IAM(在50mM NH4HCO3 中)中30分鐘使硫醇基團(tuán)烷化。在用水將該凝膠平板洗滌3次后，將蛋白質(zhì)凝膠的完整條帶切成薄片，收集于微滴定平板中，并基本如前所述略加改變進(jìn)行處理(Van Leene et al.，2007)。在每個微滴定平板孔中，使脫水的凝膠顆粒在20 μ L消化緩沖液中在4°C再水合30分鐘，所述消化緩沖液含有250ng胰蛋白酶(MS Gold ；Promega, Madison, WI)、 50mM NH4HCO3 禾Π 10 % CH3CN(ν/ν)。在加入 10 μ L 含有 50mM NH4HCO3 禾Π 10 % CH3CN(ν/ν) 的緩沖液之后，將蛋白質(zhì)在37°C消化3小時。濃縮所得肽，并用微型柱固相吸管尖(tip) (PerfectPureTM C18 tip, 200nL bed volume ；Eppendorf, Hamburg, Germany)脫鹽，并使用1.2yL的用α -氰基-4-羥基肉桂酸飽和的并摻加20fmole/y L Glul Fibrinop印tide B(Sigma Aldrich)、20fmole/μ L des-Pro2-Bradykinin(Sigma Aldrich)禾口 20fmole/ μ L Adrenocorticotropic Hormone Fragment 18-39 human(Sigma Aldrich)的 50 % CH3CN 0. 1 % CF3COOH 溶液直接洗脫在 MALDI 靶平板(0pti_T0FTM384 Well Insert ； Applied Biosystems, Foster City, CA)上。獲得質(zhì)譜使用MALDI 串聯(lián) MS 儀 0700 和 4800 Proteomics Analyzer ；Applied Biosystems)獲得所選擇的肽的肽質(zhì)量指紋及隨后的IkV CID片段化譜。肽質(zhì)譜和肽序列譜通過使用基本如前所述設(shè)置獲得(Van Leene et al.，2007)。根據(jù)廠商說明書校準(zhǔn)每個MALDI平板。所有肽質(zhì)量指紋(PMF)譜均使用三種內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行內(nèi)部校準(zhǔn)，即 m/z 963. 516(des-Pro2_Bradykinin)、m/z 1570. 677(Glul—Fibrinopeptide B)禾口 m/z
82465, 198 (Adrenocorticotropic Hormone Fragment 18—39)，獲得在分析的 MALDI 革巴上的每個分析的肽點(diǎn)的平均質(zhì)量精確度為5ppm士 lOppm。使用單獨(dú)的PMF質(zhì)譜，對通過質(zhì)量排阻濾膜的信號-噪音比超過20的多達(dá)16個肽進(jìn)行片段化分析?；贛S的蛋白質(zhì)同源性鑒別處理每個樣品的PMF譜和肽序列譜，使用附帶的軟件套件(GPS Explorer 3. 6， Applied Biosystems)和基本如先前所述的參數(shù)設(shè)置(Van Leene et al.，2007)進(jìn)行處理。產(chǎn)生數(shù)據(jù)搜索文件，根據(jù)TA^ 8.0進(jìn)行蛋白質(zhì)同源鑒別，使用本地數(shù)據(jù)庫搜索引擎 (Mascot 2. LMatrix Science) 0保留相對分值超過95%可能性的最高命中的蛋白質(zhì)同源鑒別(第一級)。當(dāng)分值超過98%可能性閾值時，保持另外的陽性鑒別(第二級或更多級)。流式細(xì)胞計量術(shù)流式細(xì)胞計量術(shù)分析。將葉組織用剃須刀片在200-400 μ 1緩沖液(45mM MgCl2, 30mM檸檬酸鈉，20mM 3-[N-嗎啉代]-丙烷-磺酸pH 7和Triton X-100)中剁碎，經(jīng)過 30 μ m濾網(wǎng)過濾，加入1μ 1的lyg/mL的4'，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)。使用Cyflow ML流式細(xì)胞計(Partec)分析核DNA含量分布。葉測量和細(xì)胞數(shù)分析如先前所述(De Veylder et al. 2001)，在第12天和15天收獲的葉片1和2的遠(yuǎn)軸表皮上進(jìn)行Samba敲除植物和野生型植物的葉測量及隨后的細(xì)胞數(shù)分析。將植物播種在圓形12-cm培養(yǎng)皿的四分之一分區(qū)上，所述培養(yǎng)皿中填充了 IOOmL的0. 5XMurashige和 Skoog培養(yǎng)基(Duchefa，Haarlem，The Netherlands)以及0. 9%植物組織培養(yǎng)瓊脂。將所有健康植物置于乙醇中過夜以除去葉綠素，隨后澄清并貯存在乳酸中以進(jìn)行顯微鏡檢。如先前所述(De Veylder et al. ,2001)對從APC10°E和對照植物中從第4天至第25天每日收獲的葉片1和2的遠(yuǎn)軸表皮進(jìn)行完整動態(tài)分析。表型分析對于生物量測量，收獲20天齡植物的營養(yǎng)(vegetative)部分，通過對每個品系的大約20株植物進(jìn)行稱重測量鮮重，將同一植物置于皮氏平板上干燥1周并再次稱重而獲得干重。對于葉面積測量，從在體外生長22天的植物中制備葉片系列。葉從蓮座切下，在左側(cè)從兩子葉開始，接著從左至右為第一，第二，第三以及隨后的葉。對于根分析，在15天期間使植物在具有1. 2%瓊脂的MS培養(yǎng)基的平板上以垂直狀態(tài)生長。15天后，掃描該平板，使用圖像J 1.37程序分析圖片。對于鮮重測量，從25株植物的苗切下全部根，單獨(dú)稱重；對于干重測量，將同一植物置于皮氏平板上干燥1周，再次稱重。通過將種子置于透明塑料紙上進(jìn)行種子大小測量，每個品系單獨(dú)掃描。使用圖像 J 1.37程序分析全部種子面積的圖像。動態(tài)分析如先前所述(De Veylder et al.，2001)對從第4-25天每日收獲的葉片1和2的遠(yuǎn)軸表皮進(jìn)行動態(tài)分析。甘露醇實驗將Samba敲除和野生型的生態(tài)型哥倫比亞-O(Col-O)的幼苗在補(bǔ)加蔗糖的半強(qiáng)度Murashige和 Skoog培養(yǎng)基(Murashige and Skoog, 1962)中以 16 小時白天(110 μ molm-2s-l)和8小時黑夜的方案在體外生長。在高壓滅菌之前，在瓊脂培養(yǎng)基中加入25mM甘露醇(Sigma)。使處理的植物在25mM甘露醇平板上生長，對照植物在無甘露醇的相同培養(yǎng)基上生長。使植物生長20天并照相，使用Image J 1.37程序分析圖像。實施例1 :APC10對于植物生長的影響為了評定APClO在發(fā)育期間的功能，產(chǎn)生在花椰菜花葉病毒(CaMV) 35S組成型啟動子控制下表達(dá)更高水平的APClO mRNA的擬南芥植物。選擇11個獨(dú)立純合的單一基因座植物，其中APClO表達(dá)水平增加通過QPCR證實(圖1)。APClO過表達(dá)品系(APC10°e)與對照品系之間對比性表型分析示出具有較高水平 APClO的植物導(dǎo)致在發(fā)育期間和葉生長增加(圖2)。為了解哪些葉受影響，我們確定了來自APC10°E和野生型對照植物的2個獨(dú)立品系的所有葉的面積。在土壤中生長三周齡，與野生型對照植物相比轉(zhuǎn)基因植物中所有葉的面積均明顯增加(圖4)。為了研究觀測的表型的細(xì)胞基礎(chǔ)，我們對發(fā)育中的葉進(jìn)行動態(tài)分析。圖3示出當(dāng)與野生型植物對比時，物中葉面積和細(xì)胞數(shù)從發(fā)育開始時(第4天和第5天)即明顯增加。主要結(jié)論是當(dāng)與野生型對照植物相比時，物在早期葉發(fā)育期間細(xì)胞分裂速率較高。盡管葉細(xì)胞組織結(jié)構(gòu)(organization)和細(xì)胞大小與對照植物相似，但是在 APCIOoe植物的成熟葉中細(xì)胞數(shù)明顯增加。為了證實與野生型植物相比轉(zhuǎn)基因植物的生物量是否存在顯著差異，在APC10°E 和野生型植物中測量苗的鮮重和干重。觀測到當(dāng)與野生型對照植物相比時轉(zhuǎn)基因植物中生物量增加(圖5A和B)，這些植物的鮮重和干重比野生型植物大約高15%。我們分析了 APC10°e植物的葉細(xì)胞在不同發(fā)育階段的DNA含量增殖(d8、dlO和 dl2)，擴(kuò)展(dl4、dl6和dl8)以及成熟組織(d20 ；d22 ；d24)。觀測到與野生型植物相比較高比例的細(xì)胞具有2C和4C DNA含量，及相反較低比例的細(xì)胞具有8C和16C DNA含量，示出在植物中核內(nèi)復(fù)制降低(圖6)。實施例2 =APClO相互作用蛋白的TAP分離及MS鑒別為了鑒別APClO在體內(nèi)的相互作用配偶體，對在35kaMV啟動子控制下表達(dá)的轉(zhuǎn)基因擬南芥細(xì)胞懸浮培養(yǎng)物進(jìn)行串聯(lián)親和性(TAP)純化，APClO在其N末端融合針對酵母開發(fā)的傳統(tǒng) TAP 標(biāo)簽(Rigaut et al.，1999)及 GS 標(biāo)簽(Burckstummer et al.，2006)。對具有Van Leene et al. O007)所述傳統(tǒng)標(biāo)簽的培養(yǎng)物進(jìn)行四次獨(dú)立的TAP純化，及對具有 Van Leene et al. (2008)所述GS標(biāo)簽的培養(yǎng)物進(jìn)行兩次純化。在新鮮培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng) 2天后，收獲蛋白質(zhì)提取物。將親和性純化的蛋白質(zhì)在4-12% NuPAGE凝膠上分離，用考馬斯亮藍(lán)染色。切取蛋白質(zhì)條帶，在凝膠中用胰蛋白酶消化并進(jìn)行MALDI-T0F/T0F質(zhì)譜分析以進(jìn)行蛋白質(zhì)鑒別。在減去通過對照純化(Van Leene et al. ,2007 & 2008)鑒別的背景蛋白質(zhì)之后，我們鑒別了 18種APClO相互作用蛋白(表2)。這些蛋白質(zhì)可以分為兩組14 種蛋白質(zhì)被實驗證實，4種蛋白質(zhì)僅在6個TAP實驗中的一個實驗中鑒別，其可代表很微弱或者瞬時的相互作用。實施例3 通過新的APC相互作用(SAMBA)蛋白敲除刺激植物生長在相互作用蛋白中，鑒別一種新的100個氨基酸的蛋白質(zhì)(AT1G32310)。選擇這種蛋白質(zhì)進(jìn)行更詳細(xì)的分析，因為其示出極其特異性結(jié)合APClO亞基。表達(dá)的蛋白質(zhì)是與來自O(shè)ryza sativa(GB :AAL67597. 1)的未知蛋白質(zhì)相似的一種未知蛋白質(zhì)。為了更好地理解這個基因的功能，從SALK收藏中選擇敲除植物并加以分析。在 Samki基因第一個外顯子上T-DNA插入的代表性圖解在圖7A中示出。通過Q-PCR分析在 samba突變植物中未檢測出SAMBA轉(zhuǎn)錄物(圖7B)，證實所述基因功能的喪失。與APCIOqe 植物表型相似，SAMBA敲除的突變體植物(純合SALK品系)當(dāng)和野生型對照(圖8)相比時，示出蓮座和葉生長增加。對在體外生長的samki突變體的全部葉面積的測量與野生型植物相比也示出葉面積顯著增加(圖9)。對苗的鮮重和干重(圖10)、葉面積(圖11)、根長度和重量(圖12)以及種子大小(圖1 的測量均示出SAMBA敲除植物的顯著增加，證實SAMBA是新的控制植物生長的基因。Samba敲除植物的表型通過測量在體外生長的22天齡植物的全部葉面積進(jìn)行詳細(xì)分析。結(jié)果示出與野生型植物相比，葉面積明顯增加(圖9A)。使用在土壤中生長的22 天齡植物進(jìn)行相同分析，可觀測到與在體外生長的植物相同的表型，與野生型植物相比在 samki敲除植物中顯著增加的葉面積(圖9C)。為了證實與野生型植物相比samki敲除植物的生物量是否存在明顯差異，我們測量了 20天齡植物的營養(yǎng)部分的鮮重和干重。鮮重(圖 10A)和干重(圖10B)的測量結(jié)果示出SAMBA敲除植物的生物量明顯增加，證實了控制植物生長的新的候選基因的假說。為了研究觀測的表型的細(xì)胞基礎(chǔ)，我們測量和分析了第12天和15天的第一對葉的面積和細(xì)胞數(shù)。圖IlA和B示出與野生型植物相比在Samba敲除植物中顯著增加的葉面積和細(xì)胞數(shù)，表示在samki敲除植物中細(xì)胞分裂較高。進(jìn)行流式細(xì)胞計量術(shù)以分析降低的Samki基因表達(dá)對于植物DNA含量的影響。 Samba敲除植物與野生型植物相比示出略微增加的8C DNA含量水平(圖11C)。也評估了 Samba敲除對于根和種子產(chǎn)量的影響。測量在萌發(fā)15天后初生根的長度。數(shù)據(jù)示出Samki敲除植物的根的長度與野生型植物相比顯著增加(圖12A)。samki敲除植物的較長的根的代表性圖片在圖12B中示出。測量根的鮮重和干重(圖12C和D)，可以證實在Samba敲除植物中根生物量顯著增加。種子分析還示出增加的種子大小。測量野生型植物和Samba突變植物的全部種子面積。我們可以觀測到Samba突變植物的種子明顯大于野生型植物的種子(圖13)。實施例4 SAMBA敲除在應(yīng)激條件下的作用使野生型和Samba敲除植物在補(bǔ)加25mM甘露醇的瓊脂平板上生長，評估Samba突變植物在脅迫條件下生長的能力。如圖14所示，samki突變植物在脅迫條件下保持其增加的生物量的表型。表1 進(jìn)行RNAi的靶序列的非限制性實例Arabidopsis thalianaTAAACAAAGCGTATATGACCATCATTTTCGAGTAATAGGCTCHordeum vuIgareTAAGTTATGACTTATGAGCATTTTAGATGAATGCAACTCCAT
Oryzae sativaTAGAATTCTACCAGGCGTCTTTTGAGTAATCCTTACATGCGABrassica napusTATAAAGTTCGTGATGGACATTACTAGATATCACCAAACCTASaccharum officinarumTTCTACACCCTAGAAGTTCTTTACTAGGCTTCTTACAAGCACGlycine maxTATCAAGCTTTAAGTGTGCTCTTAACATGACACGAACTTCGCVinis viniferaTCTTGTGGAGAACTCCCCCAGTCTTGTGGAGAACTCCAGCAGSolanaceum lycopersicumTATCTATACTCGTTATCGCACTATCTATACTCGTAATCGCTCTATCTCATATGGAATTCGCGCTricitum aestivumTTAACAGGTGAGTCGAATCAGTTAACAGGTGAGTCGAATCATZea maysTCAACTCTGAGAGTTTCGCATTTACCATGACATTAACGTCGC表2.經(jīng)MS鑒別的APClO-共純化蛋白質(zhì)的列表。第3列提到在6個獨(dú)立實驗中多少相互作用物被鑒別
權(quán)利要求
1.APClO或者其變體和/或APClO相互作用蛋白在增加植物生長和/或產(chǎn)量中的應(yīng)用。
2.權(quán)利要求1的應(yīng)用，其中所述相互作用蛋白選自AT2G39090、AT2G20000、AT5G05560、 AT3G48150、AT1G06590、AT1G78770、AT4G21530、AT2G04660、AT1G32310、AT2G42260、 AT4GA19210、AT3G57860、AT3G16320、AT4G25550、AT5G13840、AT3G48750、AT3G56150 以及 AT2G06210。
3.權(quán)利要求1或2的應(yīng)用，其中所述相互作用蛋白包含SAMBA(SEQID NO⑵或者其變體。
4.權(quán)利要求3的應(yīng)用，其中所述變體包含保守基序K(D/E) EA和/或PRS (R/H/C) I。
5.權(quán)利要求3或4的應(yīng)用，其中所述變體包含保守基序K(D/E) EAXXXLXXXXMXXLXXXVXX LXXXXWXFXXPRSXI。
6.權(quán)利要求1的應(yīng)用，其中APClO或者其變體是過表達(dá)的。
7.權(quán)利要求3-5任一項的應(yīng)用，其中SAMBA(SEQ ID NO 2)或者其變體的表達(dá)被抑制。
8.針對編碼SAMBA(SEQ ID NO 2)或者其變體的核酸的RNAi在增加植物生長和/或產(chǎn)量中的應(yīng)用。
9.前述任一項權(quán)利要求的應(yīng)用，其中所述植物是作物植物。
10.權(quán)利要求9的應(yīng)用，其中所述作物是谷物。
11.權(quán)利要求10的應(yīng)用，其中所述谷物選自稻、玉米、小麥、大麥、小米、黑麥、高粱和燕麥。
12.權(quán)利要求1-11任一項的應(yīng)用，其中所述植物生長的增加是葉生物量增加、根生物量增加以及種子生物量增加中的任一或多項增加。
13.轉(zhuǎn)基因植物，其包含針對編碼SAMBA(SEQ ID NO 2)或者其變體的核酸的RNAi。
14.權(quán)利要求13的轉(zhuǎn)基因植物，其中所述轉(zhuǎn)基因植物是谷物。
15.權(quán)利要求14的轉(zhuǎn)基因植物，其中所述谷物選自稻、玉米、小麥、大麥、小米、黑麥、高粱和燕麥。
全文摘要
本發(fā)明涉及促進(jìn)植物生長的蛋白復(fù)合物。更特別地，本發(fā)明涉及來自分裂后期促進(jìn)復(fù)合物/細(xì)胞周期體的特定蛋白質(zhì)在增加苗生長速率和/或增強(qiáng)細(xì)胞分裂速率中的應(yīng)用。
文檔編號C12N15/82GK102439030SQ200980153936
公開日2012年5月2日 申請日期2009年12月4日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月5日
發(fā)明者A·埃默里, D·G·因澤, G·德耶格爾, G·比姆斯特, J·范萊內(nèi), N·B·埃洛伊, P·C·G·費(fèi)雷拉 申請人:弗拉芒區(qū)生物技術(shù)研究所, 根特大學(xué), 里約熱內(nèi)盧聯(lián)邦大學(xué)