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      用于提高5’-鳥苷一磷酸生產(chǎn)力的棒狀菌菌株和用其生產(chǎn)5’-鳥苷一磷酸的方法

      文檔序號:581504閱讀:473來源:國知局
      專利名稱:用于提高5’-鳥苷一磷酸生產(chǎn)力的棒狀菌菌株和用其生產(chǎn)5’-鳥苷一磷酸的方法
      用于提高5’-鳥苷一磷酸生產(chǎn)力的棒狀菌菌株和用其生產(chǎn) 5’ -鳥苷一磷酸的方法
      技術(shù)領(lǐng)域
      本發(fā)明涉及棒狀菌(Corynebacteria)菌株,其具有較內(nèi)源性蘋果酸脫氫酶更高的活性,因此能以高產(chǎn)率產(chǎn)生ATP。本發(fā)明還與使用該棒狀菌菌株結(jié)合具有胺化活性的酶或微生物生產(chǎn)5’ -鳥苷一磷酸的方法有關(guān)。
      背景技術(shù)
      5’ -鳥苷一磷酸(在下文中被稱作“GMP”)是廣泛使用的作為增味劑的食品添加齊U,如同肌苷一磷酸(在下文中被稱作“IMP”)。GMP引出鮮味(umami taste),其用途取決于也正被使用的谷氨酸一鈉(MSG)。它通常與IMP協(xié)同使用以增加MSG鮮味的強(qiáng)度。迄今已知的制備GMP的方法的實(shí)例包括(1)酵母RNA的酶促降解,(2)直接微生物發(fā)酵成GMP,C3)微生物發(fā)酵成鳥苷,然后化學(xué)磷酸化,(4)微生物發(fā)酵成鳥苷,然后酶促磷酸化,( 微生物發(fā)酵成黃苷5’ - 一磷酸(在下文中被稱作“XMP”),然后通過棒狀菌菌株轉(zhuǎn)化成GMPdP (6)微生物發(fā)酵成XMP,然后通過具有氨基酶活性的大腸桿菌(Escherichia coli)將XMP轉(zhuǎn)化成GMP。其中,方法(1)具有材料供應(yīng)的困難和在經(jīng)濟(jì)上不是有益的,方法 (2)由于GMP的膜通透性而遭受低產(chǎn)率的缺點(diǎn)。因此,其它方法在工業(yè)應(yīng)用中廣泛使用。對于生產(chǎn)XMP并將其轉(zhuǎn)化成GMP的方法(6),關(guān)鍵是提供ATP作為輔因子。XMP到 GMP的轉(zhuǎn)化中使用的大多數(shù)ATP由XMP的生產(chǎn)菌株提供。在該轉(zhuǎn)化方法中,二甲苯起到重要的作用,因?yàn)槠湓黾覣TP和XMP的膜通透性。培養(yǎng)基中的二甲苯允許ATP和XMP穿透進(jìn)入GMP的生產(chǎn)菌株,然后將XMP轉(zhuǎn)化成GMP。因此,GMP的生產(chǎn)方法采取增加ATP生產(chǎn)力的策略。從XMP到GMP的轉(zhuǎn)化通過以下反應(yīng)式表示
      XMP + ATP + NH3 --------------> GMP + AMP + PPi
      XMP氨基酶S卩,充當(dāng)輔因子的ATP的連續(xù)供應(yīng)對GMP的生產(chǎn)過程是必需的,在該過程中XMP主要由XMP的生產(chǎn)菌株產(chǎn)生,然后在具有XMP氨基酶活性的酶或微生物存在的情況下轉(zhuǎn)化成 GMP。因此,提高XMP的生產(chǎn)菌株的ATP生產(chǎn)力非常重要。在該轉(zhuǎn)化過程中產(chǎn)生的AMP被重新用作ATP生產(chǎn)的底物。實(shí)際上,基于腺嘌呤的核苷酸被循環(huán)用于ATP的產(chǎn)生。因此,提高XMP生產(chǎn)菌株的ATP生產(chǎn)力對高產(chǎn)率的GMP生產(chǎn)是必需的。蘋果酸脫氫酶的活性對ATP的產(chǎn)生具有重大影響。然而,前述文件中任何地方都沒有提及經(jīng)設(shè)計(jì)提高蘋果酸脫氫酶活性以增加XMP產(chǎn)率的微生物和方法??紤]到,增加XMP生產(chǎn)菌株的ATP生產(chǎn)力以增加GMP產(chǎn)率并且優(yōu)于兩步轉(zhuǎn)化至關(guān)重要,本發(fā)明人進(jìn)行了集中研究并發(fā)現(xiàn)了引起該增加的基因。并且發(fā)現(xiàn)當(dāng)與XMP氨基酶結(jié)合使用時(shí),用串聯(lián)攜帶該基因的兩個(gè)拷貝的重組載體轉(zhuǎn)化的棒狀菌菌株能以高產(chǎn)率生產(chǎn) XMP和ATP,從而增加GMP的生產(chǎn)力。
      發(fā)明內(nèi)容技術(shù)問題因此本發(fā)明的目的是提供具有較內(nèi)源性蘋果酸脫氫酶更高活性的棒狀菌菌株,其因此能以高產(chǎn)率生產(chǎn)ATP。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供生產(chǎn)GMP的方法,包括培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的微生物;在培養(yǎng)物中產(chǎn)生XMP ;向培養(yǎng)物中加入具有XMP胺化活性的酶或微生物;和從培養(yǎng)物獲得GMP。技術(shù)方案根據(jù)其方面,本發(fā)明涉及較內(nèi)源性蘋果酸脫氫酶活性增強(qiáng)的棒狀菌菌株,從而以高產(chǎn)率生產(chǎn)ATP。將本發(fā)明的棒狀菌菌株進(jìn)行修飾,以具有較內(nèi)源活性更高的蘋果酸脫氫酶活性,造成ATP的生產(chǎn)力增加。如本文所用,術(shù)語“蘋果酸脫氫酶”,指通過脫氫作用催化蘋果酸鹽轉(zhuǎn)化成草酰乙酸鹽的酶。該酶伴隨乳酸脫氫酶在非常廣譜的活體生物中被發(fā)現(xiàn),并且需要DPN和NAD作為其活性的輔因子,這些輔因子通常伴隨乳酸脫氫酶。在根據(jù)本發(fā)明的棒狀菌菌株中,增加蘋果酸脫氫酶活性,從而以較高產(chǎn)率產(chǎn)生ATP,造成GMP的生產(chǎn)力增加。如本文所用,術(shù)語“內(nèi)源活性”意欲指野生型微生物中的目標(biāo)酶活性。術(shù)語“高于內(nèi)源活性”指與內(nèi)源品種的活性相比酶活性增加,不論起因于由酶自身引起的活性增加還是內(nèi)源基因或外源基因引起的活性增加。例如,酶活性增加可通過本領(lǐng)域公知的任何方法實(shí)現(xiàn),包括但不限于,增加或減少基因拷貝數(shù)、替換、修飾目標(biāo)啟動子或使目標(biāo)啟動子突變等。根據(jù)本發(fā)明所述的其活性將被增加的目標(biāo)酶蘋果酸脫氫酶由棒狀菌的mqo基因編碼。只要它與mqo基因在生物學(xué)上相同或相應(yīng),任何衍生物或類似物均可用于本發(fā)明。 即,如果其活性與mqo基因的活性基本上相同或相似,落入mqo基因范圍內(nèi)的任何基因均可用于本發(fā)明。有利地,在本發(fā)明中有用的基因與mqo基因序列共有至少70%,更優(yōu)選至少 80 %,甚至更優(yōu)選至少90 %,甚至遠(yuǎn)更優(yōu)選至少95 %和最優(yōu)選至少98 %同源性。更有利地, 蘋果酸脫氫酶由核苷酸序列SEQ ID NO. :7編碼?;蚩截惖脑黾涌赏ㄟ^外源基因的導(dǎo)入和/或內(nèi)源基因的擴(kuò)增而實(shí)現(xiàn)。基因拷貝數(shù)目可容易地被本領(lǐng)域的技術(shù)人員根據(jù)需要和目的確定。內(nèi)源基因的擴(kuò)增也可利用本領(lǐng)域已知的方法進(jìn)行,例如,通過在壓力下在合適的選擇性培養(yǎng)基中培養(yǎng)。在優(yōu)選的實(shí)施例中,將攜帶為蘋果酸脫氫酶編碼的基因的載體導(dǎo)入棒狀菌菌株,以產(chǎn)生較內(nèi)源活性增強(qiáng)的轉(zhuǎn)化的微生物。只要其在本領(lǐng)域已知并且屬于棒狀菌屬,任何菌株可毫無限制地在本發(fā)明中使用。優(yōu)選地,本發(fā)明中有用的棒狀菌菌株的實(shí)例包括產(chǎn)氨棒桿菌、谷氨酸棒狀桿菌 (Corynebacterium glutamicum)、黃色短桿菌(Brevibacterium flavum)禾口乳酸發(fā)酵短桿菌(Brevibacterium lactofermentum),但不限于此。具體地,這些棒狀菌菌株之中是產(chǎn)氨棒桿菌 ATCC6872、熱產(chǎn)氨棒狀桿菌(Corynebacterium thermoaminogenes) FERM BP-1539、 谷氨酸棒狀桿菌ATCC 13032、谷氨酸棒狀桿菌R、黃色短桿菌ATCC 14067、乳酸發(fā)酵短桿菌 ATCC 13869及其衍生物。優(yōu)選的是從產(chǎn)氨棒桿菌KCCM-10530轉(zhuǎn)化的產(chǎn)氨棒桿菌KCJ-1304。攜帶mqo基因的重組載體可用于產(chǎn)生能以高產(chǎn)率生產(chǎn)ATP的微生物。如本文所用,術(shù)語“mqo基因”、簡稱“蘋果酸鹽醌氧化還原酶”基因,指為用作將蘋果酸鹽氧化成草酰乙酸鹽的蘋果酸鹽草酰乙酸鹽編碼的基因。
      只要攜帶mqo基因,任何常見的重組載體均能沒有限制地在本發(fā)明中被使用。優(yōu)選的是pDZ-mqo。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例中,利用含有SEQ ID NO. 7的mqo基因以構(gòu)建重組的pDZ-mqo載體(參見

      圖1)。術(shù)語“載體”,如本文所用,指用作載體以將外源遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)移到合適宿主細(xì)胞中的DNA分子,是含有使轉(zhuǎn)基因與宿主基因組重組的調(diào)節(jié)元件的DNA構(gòu)建物。優(yōu)選地,攜帶根據(jù)本發(fā)明的mqo載體的重組載體可具有圖1的切割圖顯示的結(jié)構(gòu)。圖1的切割圖表示的載體可被依次或同時(shí)導(dǎo)入棒狀菌。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式,將重組載體轉(zhuǎn)化到產(chǎn)氨棒桿菌KCCM-10530中,然后將該菌在選擇性培養(yǎng)基中培養(yǎng),以使mqo基因的兩個(gè)拷貝通過同源重組參入到宿主的基因組,導(dǎo)致產(chǎn)氨棒桿菌突變體產(chǎn)生,稱為產(chǎn)氨棒桿菌KCJ-1304。其以
      登錄號KCCM10972P保藏(韓國微生物保藏中心(韓國,首爾),保藏日期2008年12月3日)。根據(jù)其另一個(gè)方面,本發(fā)明涉及用攜帶mqo基因的重組載體轉(zhuǎn)化的棒狀菌菌株。 利用本領(lǐng)域已知的轉(zhuǎn)化方法可沒有限制地使用來自棒狀菌的mqo基因。優(yōu)選地,將mqo基因克隆到載體中,以用于轉(zhuǎn)化到細(xì)胞中。如果在本領(lǐng)域已知,任何方法可用于轉(zhuǎn)化。如本文所用,術(shù)語“轉(zhuǎn)化”是由外源 DNA的攝取、基因組參入和表達(dá)引起的細(xì)胞的遺傳改造。典型的轉(zhuǎn)化方法包括CaCl2沉淀、 Hanahan法——其中與DMSO (二甲基亞砜)結(jié)合,CaCl2沉淀的作用得到提高、電穿孔、磷酸鈣轉(zhuǎn)染、原生質(zhì)體融合、碳化硅纖維介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化、土壤桿菌(agrobacterium)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化、 PEG介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化、葡聚糖硫酸酯、陽離子脂質(zhì)體(lipofectamine)和干燥/抑制介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化 (desiccation/inhibition-mediated transformation)。tfl^H發(fā)明以 pDZ_mqo 進(jìn)白勺轉(zhuǎn)化不限于這些轉(zhuǎn)化的實(shí)例,而可沒有限制地利用本領(lǐng)域已知的任何方法完成。產(chǎn)氨棒桿菌KCCM10972P的基因組其中有mqo基因的兩個(gè)拷貝參入,該基因組是由具有圖1的切割圖顯示的結(jié)構(gòu)的PDZ-mqo向其中的導(dǎo)入和mqo基因的兩個(gè)拷貝與內(nèi)源基因的同源重組而產(chǎn)生的。根據(jù)其另外的方面,本發(fā)明涉及生產(chǎn)GMP的方法,包括(a)培養(yǎng)蘋果酸脫氫酶活性比內(nèi)源活性提高的棒狀菌菌株,從而以高產(chǎn)率生產(chǎn)ATP; (b)在培養(yǎng)物中產(chǎn)生XMP; (c)向培養(yǎng)物中加入具有XMP胺化活性的酶或微生物;和(d)從培養(yǎng)物獲得GMP。在本發(fā)明中,XMP 以較高的產(chǎn)率從轉(zhuǎn)化的微生物生成,然后在具有XMP胺化活性的XMP氨基酶或微生物存在的情況下轉(zhuǎn)化成GMP。優(yōu)選地,轉(zhuǎn)化的微生物是蘋果酸脫氫酶活性比內(nèi)源活性提高的棒狀菌菌株。本領(lǐng)域已知的任何培養(yǎng)基可沒有限制地用于培養(yǎng)能產(chǎn)生XMP或GMP的菌株。優(yōu)選地,培養(yǎng)基含有葡萄糖作為碳源和任選地各種其它碳源。對于在培養(yǎng)目標(biāo)微生物中的使用, 培養(yǎng)基必須滿足微生物生長的需求。棒狀菌菌株的培養(yǎng)基在本領(lǐng)域已知(例如Manual of Methods for General Bacteriology. American Society for Bacteriology. Washington D. C.,USA,1981)。對棒狀菌菌株有用的碳源實(shí)例包括糖和碳水化合物諸如葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麥芽糖、淀粉、纖維素等;油和脂類諸如大豆油、葵花子油、蓖麻油、椰子油等;脂肪酸諸如棕櫚酸、硬脂酸、亞麻酸等;醇類諸如甘油、乙醇等;和有機(jī)酸諸如乙酸。這些碳源可單獨(dú)或組合使用。有機(jī)物諸如胨、酵母提取物、牛肉膏、麥芽汁、玉米漿、大豆等;尿素;和無機(jī)化合物諸如氯化銨、磷酸銨、碳酸銨和硝酸銨可單獨(dú)或組合用作培養(yǎng)基中的氮源。磷酸二氫鉀或磷酸氫二鉀、或相應(yīng)的鈉鹽可用作磷源。此外,培養(yǎng)基可含有金屬鹽諸如硫酸鎂、 硫酸亞鐵(iron sulfate)等。另外,可需要氨基酸和/或維生素作為必需成分。培養(yǎng)基還可含有合適的前體??梢苑峙绞交蜻B續(xù)方式將這些物質(zhì)加入到培養(yǎng)基中??赏ㄟ^堿性化合物諸如氫氧化鈉、氫氧化鉀、氨等,或酸性化合物諸如磷酸或硫酸調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH。消泡劑諸如脂肪酸聚乙二醇酯可用于防止培養(yǎng)期間泡沫的產(chǎn)生??捎醚鯕饣蚝醒鯕獾臍怏w(例如空氣)對培養(yǎng)基充氣以保持有氧狀態(tài),或用氮?dú)狻錃饣蚨趸細(xì)怏w對培養(yǎng)基充氣以保持無氧狀態(tài)。培養(yǎng)溫度通常保持在20°C 45°C,優(yōu)選地在30°C 35°C。持續(xù)培養(yǎng)直到獲得XMP或GMP的最大量。從這一點(diǎn)上,需要10至160小時(shí)的時(shí)間段。在本發(fā)明中有用的具有XMP胺化活性的微生物可以是大腸桿菌??衫帽绢I(lǐng)域公知的任何方法培養(yǎng)具有XMP胺化活性的大腸桿菌。大腸桿菌的培養(yǎng)基可含有多種營養(yǎng)素, 包括無機(jī)氮源諸如銨、氯化銨、硫酸銨等,有機(jī)氮源諸如胨、NZ胺、牛肉膏、酵母提取物、麥芽汁、玉米漿、酪蛋白水解物、魚肉或魚粉、脫脂大豆餅或大豆粉,和無機(jī)化合物諸如磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、硫酸鎂、硫酸亞鐵、硫酸錳和碳酸鈣。需要時(shí),可使用維生素和營養(yǎng)缺陷型堿。對于培養(yǎng),可利用通氣的搖動培養(yǎng)或攪拌培養(yǎng)。培養(yǎng)溫度的范圍為30°C至45°C,優(yōu)選地為37°C至40°C。培養(yǎng)期間,優(yōu)選將pH調(diào)到相當(dāng)中性的水平。培養(yǎng)期是1到2天。由此, 具有XMP胺化活性的微生物積聚在培養(yǎng)基中。在本發(fā)明中,將含有XMP的培養(yǎng)基加入大腸桿菌的培養(yǎng)物中,該大腸桿菌具有將 XMP轉(zhuǎn)化成GMP的XMP胺化活性。在這一點(diǎn)上,XMP到GMP的轉(zhuǎn)化可用增加XMP膜通透性的化合物諸如二甲苯實(shí)現(xiàn)。二甲苯促進(jìn)XMP從培養(yǎng)基進(jìn)入GMP的生產(chǎn)菌株。對增加XMP的膜通透性有用的化合物在本領(lǐng)域公知。這樣的化合物的實(shí)例包括疏水性物質(zhì)(例如二甲苯、甲苯、苯、醋酸乙酯)、表面活性劑(陽離子表面活性劑,例如聚氧乙烯硬脂胺、十六烷基三甲基溴化銨、Cation FB和Cation F2-40E ;陰離子表面活性劑,例如油烯酰胺硫酸鈉(sodium oleyl amide sulfate) ,Newrex TAB和 Rapizole 80)、和金屬離子(例如鈣離子、鎂離子), 但不限于此。用于增加XMP的膜通透性的化合物量取決于其特性而發(fā)生變化,可由本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員適當(dāng)調(diào)節(jié)。由此產(chǎn)生的GMP可被分泌到培養(yǎng)基中或保持在細(xì)胞內(nèi)。根據(jù)本發(fā)明的生產(chǎn)GMP的方法包括從細(xì)胞或培養(yǎng)基中回收GMP。對于從細(xì)胞或培養(yǎng)基中回收GMP,可利用本領(lǐng)域公知的任何方法。這樣的方法的實(shí)例包括過濾、陽離子交換層析、結(jié)晶和HPLC,但不限于此。如本文所用,術(shù)語“鳥苷一磷酸”是在RNA中發(fā)現(xiàn)的由鳥苷和磷酸鹽組成的核苷酸。磷酸鹽部分可位于5’、3’或2’,分別稱為5’-、3’_或2’-型。在本發(fā)明中,GMP(5'-鳥苷一磷酸)以無色針狀晶體產(chǎn)生,并以游離形式存在于體內(nèi)。其具有分子式CltlH14N5O8P15鳥苷一磷酸其鹽形式,諸如鳥苷酸二鈉、鳥苷酸二鉀和鳥苷酸鈣(calcium guanylate)是食品添加劑,其被用作基于核酸的增味劑以提供蘑菇的味道。當(dāng)使用根據(jù)本發(fā)明轉(zhuǎn)化的微生物時(shí),能以高產(chǎn)率生產(chǎn)GMP,該產(chǎn)率被發(fā)現(xiàn)與常規(guī)的微生物相比提高了約8. 5%。發(fā)明的有益效果用根據(jù)本發(fā)明的重組載體轉(zhuǎn)化,棒狀菌菌株顯示提高的蘋果酸脫氫酶活性,因此以增加的產(chǎn)率產(chǎn)生ATP。當(dāng)用于從XMP向GMP的轉(zhuǎn)化時(shí),本發(fā)明的轉(zhuǎn)化菌株的GMP生產(chǎn)力較常規(guī)的微生物更高。
      附圖簡述圖1是顯示重組載體pDZ-mqo的結(jié)構(gòu)的示意圖,其中mqo基因的兩個(gè)拷貝被插入到pDZ載體中。發(fā)明的方式通過以下實(shí)施例可獲得對本發(fā)明的更好的理解,這些實(shí)施例被提出以進(jìn)行舉例說明,但不是被解釋為限制本發(fā)明。實(shí)施例1 來自XMP的生產(chǎn)菌株產(chǎn)氨棒桿菌KCCM-10530的mqo的克隆和用于基因組參入的重組載體(pDZ-mqo)的構(gòu)建mqo基因(NCBI ID_3345228)的核苷酸序列從來自NIH GenBank的數(shù)據(jù)獲得?;谠撔蛄?,合成兩對引物(SEQ ID N0S. 1至4)。當(dāng)棒狀菌KCCM-10530的基因組充當(dāng)模板時(shí),在高保真性DNA聚合酶 PfuUltra (Stratagene)存在的情況下使用SEQ ID N0S. 1至4的引物進(jìn)行PCR,在95°C變性30sec、在55°C退火30sec和在68°C延伸2min,進(jìn)行25個(gè)循環(huán)。由此獲得的PCR產(chǎn)物是 mqo基因的兩個(gè)拷貝,每個(gè)2. Ikb長(mq0-A、mq0-B),它們分別使用SEQ ID NOS :1和2以及 SEQ ID NOS 3和4兩組得到擴(kuò)增。SEQ ID NO 1 ;gctctagaATCGGTCATTCCATGAACCCSEQ ID NO 2 ;cgcggatccCATCGATATCGCCAACTCCASEQ ID NO 3 ;cgcggatccATCGGTCATTCCATGAACCCSEQ ID NO 4 ;gctctagaCATCGATATCGCCAACTCCA用合適的限制酶(mqo-A :XbaI+BamHI, mqo-B :BamHI+XbaI)處理之后,通過三重連接(three-piece junction)將PCR產(chǎn)物mqo-Α和mqo-Β插入先前已被XbaI和蝦堿性磷酸酶處理的PDZ載體中(參見韓國專利申請?zhí)?0-2007-9443 。最后,獲得重組pDZ-mqo 載體,其中mqo基因的兩個(gè)拷貝被串聯(lián)克隆。圖1是顯示用于參入到棒狀菌基因組中的重組pDZ-mqo載體的結(jié)構(gòu)示意圖。實(shí)施例2 插入mqo的菌株的產(chǎn)生將pDZ-mqo載體構(gòu)建物轉(zhuǎn)化到KCCM-10530菌株中,并與該基因組進(jìn)行同源重組以在基因組上與mqo基因相鄰的位置插入一個(gè)mqo基因拷貝。因此,獲得新的XMP生產(chǎn)菌株, 稱為產(chǎn)氨棒桿菌KCJ-1304,該菌株在其基因組上具有mqo基因的兩個(gè)拷貝。mqo基因的兩個(gè)拷貝的串聯(lián)插入是通過利用使用引物組(SEQ ID N0S. 5和6)的PCR鑒定的,該引物組靶向mqo基因的兩個(gè)拷貝的上游和下游核苷酸序列。SEQ ID N0. 5 CTTTTCGATGACGCCCAASEQ ID N0. 6 CCACTTTATCGGGTGAGACCA實(shí)施例3 :mqo插入的菌株的蘋果酸脫氫酶活性如下測定實(shí)施例2中制備的產(chǎn)生XMP的產(chǎn)氨棒桿菌KCJ-1304的蘋果酸脫氫酶活性。將菌株接種到含有10g/l細(xì)菌用蛋白胨、5g/l細(xì)菌用牛肉膏、5g/l細(xì)菌用酵母抽提物、 2. 5g/l NaCl、50mg/l腺嘌呤和50mg/l鳥嘌呤的培養(yǎng)基中,并在30°C培養(yǎng)12小時(shí)直到獲得 OD 10?;厥誌OmL細(xì)胞培養(yǎng)物,將其在含有50mM HEPES、IOmM乙酸鉀、IOmM CaCl2和IOmM MgCl2中洗滌兩次,并懸浮在ImL同樣的緩沖液中。使用聲波儀打斷之后,將細(xì)胞裂解物離心。將上清液再次離心以產(chǎn)生沉淀物,然后將該沉淀物懸浮在IOOyL緩沖液中。將IOyL該懸浮液用作酶溶液。反應(yīng)緩沖液通過混合50mM HEPES, IOmM乙酸鉀和50 μ M 2,6- 二氯靛酚(dichloro indolphenol) (ClJnd)制備。反應(yīng)之前將Cl2Ind解凍和混合。向980 μ L 反應(yīng)混合物中加入IOyL IOOmM蘋果酸鹽作為底物和10 μ L酶溶液,然后在30°C搖動溫育15min。酶活性通過測量減少的Cl2Ind的濃度而測定。Cl2Ind在600nm具有吸收系數(shù) 22cm_1mM_10表1
      權(quán)利要求
      1.一種棒狀菌(Corynebacteria)菌株,其具有較野生型更高的蘋果酸脫氫酶活性,因此顯示提高的ATP生產(chǎn)力。
      2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的棒狀菌菌株,其中所述蘋果酸脫氫酶活性因mqo表達(dá)增加而提尚。
      3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的棒狀菌菌株,在其中參入具有圖1的切割圖顯示的結(jié)構(gòu)的載體。
      4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的棒狀菌菌株,所述菌株是產(chǎn)氨棒桿菌KCCM10972P。
      5.產(chǎn)生GMP的方法,其包括(a)培養(yǎng)權(quán)利要求1所述的棒狀菌菌株;(b)在所述培養(yǎng)物中產(chǎn)生XMP;(c)向所述培養(yǎng)物中加入具有XMP胺化活性的酶或微生物;和(d)從所述培養(yǎng)物獲得GMP。
      全文摘要
      公開利用新的微生物生產(chǎn)5′-鳥苷一磷酸的方法,該微生物具有較野生型更高的蘋果酸脫氫酶活性,因此顯示提高的ATP生產(chǎn)力。還公開新的微生物。該方法包括培養(yǎng)蘋果酸脫氫酶活性較內(nèi)源性活性提高的棒狀菌(Corynebacteria)菌株;因此以高產(chǎn)率產(chǎn)生ATP;在培養(yǎng)物中產(chǎn)生XMP;向培養(yǎng)物中加入具有XMP胺化活性的酶或微生物;和從培養(yǎng)物獲得GMP。
      文檔編號C12N1/20GK102300982SQ200980154010
      公開日2011年12月28日 申請日期2009年12月17日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月17日
      發(fā)明者吳潤錫, 樸長熙, 趙鎮(zhèn)滿, 金蕙園 申請人:Cj第一制糖株式會社
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