專利名稱：羊膜來源的貼壁細(xì)胞的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明提供了來自羊膜的新型血管生成細(xì)胞，及其細(xì)胞群，在此稱為“羊膜來源的貼壁細(xì)胞”(AMDAC)。羊膜來源的貼壁細(xì)胞不同于以前描述的胎盤干細(xì)胞，包括組織培養(yǎng)塑料貼壁胎盤干細(xì)胞。
2.
背景技術(shù)：
細(xì)胞組合物，例如，干細(xì)胞組合物，已成為針對(duì)多種生理缺陷的有吸引力的治療手段，例如，用于骨髓替代治療。存在對(duì)于其它細(xì)胞群的需求，例如，具有血管生成的潛能和/ 或性質(zhì)的干細(xì)胞或祖細(xì)胞。3.發(fā)明概述在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種分離的羊膜來源的貼壁細(xì)胞，在此也稱為AMDAC， 其中所述細(xì)胞附著于組織培養(yǎng)塑料，且其中所述細(xì)胞是0CT-4_(0CT-4陰性，0CT-4也稱為 P0U5F1或八聚體結(jié)合蛋白4)，或經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄酶聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)測定，例如，按照30 個(gè)循環(huán)的RT-PCR的測定，與合適的對(duì)照細(xì)胞系進(jìn)行對(duì)比，例如胚胎癌衍生的干細(xì)胞系(例如，NTERA-2，例如，來自美國模式培養(yǎng)物保藏所，ATCC編號(hào)CRL-1973)，所述細(xì)胞是0CT_4_。 在一個(gè)具體的實(shí)施方式中，細(xì)胞經(jīng)RT-PCR測定為0CT-4_，和經(jīng)免疫定位測定為VEGFR1 / Flt-l+(血管內(nèi)皮生長因子受體1)和/或VEGFR2/KDR+(血管內(nèi)皮生長因子受體2，也稱為激酶插入域受體)。在另一個(gè)具體的實(shí)施方式中，細(xì)胞經(jīng)RT-PCR測定為0CT-4_，和經(jīng)免疫定位測定為⑶49f+(整聯(lián)蛋白- α 6+)。在一個(gè)具體的實(shí)施方式中，所述細(xì)胞經(jīng)RT-PCR測定為 0CT-4_，和經(jīng)RT-PCR測定為HLA-G_。在另一個(gè)具體的實(shí)施方式中，所述細(xì)胞經(jīng)RT-PCR測定為0CT-4—，和經(jīng)免疫定位測定為⑶90+、⑶105+、或⑶117—。在一個(gè)更加具體的實(shí)施方式中， 所述0CT-4—細(xì)胞是⑶90+、⑶105+、和⑶117_。在另一個(gè)具體的實(shí)施方式中，細(xì)胞經(jīng)例如30 個(gè)循環(huán)的RT-PCR測定為0CT-4—，且不表達(dá)S0X2。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述0(^-4_細(xì)胞經(jīng)免疫定位測定為⑶四+、⑶73+、ABC-p+、* ⑶38_中的一種或多種。在另一個(gè)具體的實(shí)施方式中，所述0CT_4_細(xì)胞經(jīng)免疫定位測定還是⑶9+、⑶10+、 CD44\ CD54\ CD98+、Tie_2+(血管生成素受體)、TEM_7+(腫瘤內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物7)、CD31_、 ⑶;34—、⑶45—、⑶133—、⑶143_(血管緊張素I轉(zhuǎn)換酶，ACE)、⑶146_(黑色素瘤細(xì)胞粘附分子)、 CXCR4(趨化因子(C-X-C基序)受體4)中的一種或多種。在一個(gè)更加具體的實(shí)施方式中， 所述細(xì)胞經(jīng)免疫定位測定為⑶9+、⑶10+、⑶44+、⑶M+、⑶98+、Tie-2+、TEM-7+、⑶3Γ、⑶;
⑶45_、OT133_、⑶143_、⑶146_、和CXCR4_。在另一個(gè)更具體的實(shí)施方式中，在此提供的羊膜來源的貼壁細(xì)胞經(jīng)RT-PCR測定為0CT-4—；經(jīng)免疫定位測定為VEGFRl/Flt-Γ和/或VEGFR2/ KDR+ ；以及經(jīng)免疫定位測定為⑶3Γ、⑶;34-、⑶45-、⑶133-、和/或Tie_2-中的一種或多種或全部。在一個(gè)具體的實(shí)施方式中，羊膜來源的貼壁細(xì)胞或羊膜來源的貼壁細(xì)胞群在例如> 20個(gè)循環(huán)的PCR擴(kuò)增下，比具有等價(jià)細(xì)胞數(shù)量的NTERA-2細(xì)胞或NTERA-2細(xì)胞群少表達(dá)至少21og的0CT-4mRNA。在另一個(gè)具體的實(shí)施方式中，所述0CT_4_細(xì)胞經(jīng)免疫定位測定還是 VE-鈣粘蛋白_ (⑶144_)。在另一個(gè)具體的實(shí)施方式中，所述0(^-4_細(xì)胞還經(jīng)免疫定位測定 CD105+和CD200+呈陽性。在另一個(gè)具體的實(shí)施方式中，所述0CT-4—細(xì)胞在暴露于I-IOOng/ mL VEGF (血管內(nèi)皮生長因子)4-21天后經(jīng)免疫定位測定不表達(dá)⑶34。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種分離的羊膜來源的貼壁細(xì)胞，其中所述細(xì)胞附著于組織培養(yǎng)塑料，且其中所述細(xì)胞經(jīng)RT-PCR測定是0CT-4_和S0X-2_ ；以及經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)測定是⑶90+、⑶105+、和⑶117。在一個(gè)具體的實(shí)施方式中，OCT-4—，S0X-2—細(xì)胞經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)測定還是HLA-G_或⑶271_。在一個(gè)更加具體的實(shí)施方式中，所述細(xì)胞經(jīng)RT-PCR測定為OCT-f和S0X-2-；以及經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)測定為CD90+、CD105+、CDl CD27r和HLA-G^在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種分離的羊膜來源的貼壁細(xì)胞，其中所述細(xì)胞附著于組織培養(yǎng)塑料，且其中所述細(xì)胞對(duì)于⑶309 (也稱為VEGFR2/KDR+)呈陽性。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種分離的羊膜來源的貼壁細(xì)胞，其中所述細(xì)胞附著于組織培養(yǎng)塑料，且其中所述細(xì)胞經(jīng)RT-PCR測定是0CT-4_、和經(jīng)免疫定位測定為 VEGFR2/KDR+、CD9+、CM4+、CD105+、CD200+、或VE-鈣粘蛋白-中的一種或多種的。在一個(gè)具體的實(shí)施方式中，所述細(xì)胞經(jīng)例如> 20個(gè)循環(huán)的RT-PCR測定為0CT-4_，和經(jīng)免疫定位測定為VEGFR2/KDR+、CD9+、CM4+、CD105+、CD200+、和VE-鈣粘蛋白\在另一個(gè)具體的實(shí)施方式中，細(xì)胞在暴露于Ι-lOOng/mL的VEGF下4_21天后經(jīng)免疫定位測定不表達(dá)⑶34。在另一個(gè)實(shí)施方式中，羊膜來源的貼壁細(xì)胞是0CT-4—、⑶49f+、HLA-G—、⑶90+、 CD105+、和CD117_。在一個(gè)更加具體的實(shí)施方式中，所述細(xì)胞經(jīng)免疫定位或流式細(xì)胞術(shù)測定為 CD9+、CD10+、CD44+、CD54+、CD98+、Tie_2+、TEM-7+、CD31\ CD34\ CD45\ CD133\ CD143\ CD146_(黑色素瘤細(xì)胞粘附分子)、或CXCR4—中的一種或多種。在一個(gè)更加具體的實(shí)施方式中，所述細(xì)胞經(jīng)免疫定位測定為⑶9+、⑶10+、⑶44+、⑶M+、⑶98+、Tie-2+、TEM-7+、⑶3Γ、 ⑶;34-、⑶45-、⑶133-、CD143\⑶146-、和QCCR4-。在另一個(gè)具體的實(shí)施方式中，所述細(xì)胞經(jīng)免疫定位測定還為VEGFRl/Flt-Γ和/或VEGFR2/KDR+ ；以及經(jīng)免疫定位測定為CD3r、CD;34-、 ⑶45_、OT133_、和/或Tie-2_中的一種或多種。在另一個(gè)具體的實(shí)施方式中，所述細(xì)胞經(jīng)免疫定位測定還為 VEGFR1/Flt-1+、VEGFR2/KDR+、CD31\ CD34\ CD45\ CD133\和 Tie_2\在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了一種分離的羊膜來源的貼壁細(xì)胞，其中所述細(xì)胞經(jīng)例如 30 個(gè)循環(huán)的 RT-PCR 測定不表達(dá) FGF4、IFNG、CXCLlO, ANGPT4、ANGPTL3、FGA、 LEP、PRL、PROK1、TNMD、FLT3、XLKD1、CDH5、LECT1、PLG、TERT、S0X2、NANOG、MMP-13、DLX5、或 BGLAP的mRNA。在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了一種分離的羊膜來源的貼壁細(xì)胞，其中所述細(xì)胞經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)測定不能組成性地表達(dá)不變鏈、HLA-DR-DP-DQ、⑶6、⑶271中的一種或多種。本發(fā)明在此進(jìn)一步提供了一種分離的細(xì)胞群，其包含一種羊膜來源的貼壁細(xì)胞。 在一個(gè)具體的實(shí)施方式中，所述群體中至少約50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%或 99%的細(xì)胞是羊膜來源的貼壁細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述細(xì)胞經(jīng)RT-PCR測定為0CT-4_， 和經(jīng)免疫定位測定為VEGFRl/Flt-Γ和/或VEGFR2/KDR+，且其中所述分離的細(xì)胞群不是羊膜。在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了一種分離的細(xì)胞群，包含一種羊膜來源的貼壁細(xì)胞，其經(jīng)RT-PCR測定為0CT-4-和HLA-G-，和經(jīng)免疫定位測定為VEGFRl/Flt-?；騐EGFR2/ KDR+；且其中所述分離的細(xì)胞群不是羊膜。在一個(gè)具體的實(shí)施方式中，所述群體中至少約 50 %、60 %、70 %、80 %、90 %、95 %、98 %或99 %的細(xì)胞是所述羊膜來源的貼壁細(xì)胞。在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了一種分離的細(xì)胞群，包含一種羊膜來源的貼壁細(xì)胞，其中所述細(xì)胞附著于組織培養(yǎng)塑料，其中所述細(xì)胞經(jīng)RT-PCR測定是0CT-4_，經(jīng)免疫定位測定是VEGFRl/Flt-Γ和VEGFR2/KDR+，其中所述細(xì)胞經(jīng)免疫定位測定還是CD9+、CD10+、CD44+、 CD54+、CD98+、Tie_2+、TEM-7+、CD31\ CD34\ CD45\ CD133\ CD143\ CD146-、或 CXCR4-中的一種或多種，或經(jīng)例如>20個(gè)循環(huán)的RT-PCR測定是HLA-G_，且其中所述分離的細(xì)胞群不是羊膜。在一個(gè)具體的實(shí)施方式中，所述群體中至少約50%、60%、70%、80%、90%、95%、98% 或99%的細(xì)胞是所述羊膜來源的貼壁細(xì)胞。在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了一種分離的細(xì)胞群，包含一種羊膜來源的貼壁細(xì)胞，其中所述細(xì)胞附著于組織培養(yǎng)塑料，其中所述細(xì)胞經(jīng)RT-PCR測定是0CT-4—，經(jīng)免疫定位測定是VEGFRl/Flt-Γ和/或VEGFR2/KDR+，其中所述細(xì)胞在暴露于Ι-lOOng/mL的VEGF下4_21天后經(jīng)免疫定位測定不表達(dá)⑶34，且其中所述分離的細(xì)胞群不是羊膜。在一個(gè)具體的實(shí)施方式中，所述群體中至少約50^^60^^70%, 80 %、90 %、95 %、98 %或99 %的細(xì)胞是所述羊膜來源的貼壁細(xì)胞。在另一個(gè)實(shí)施方式中，當(dāng)上述任何含有羊膜來源的貼壁細(xì)胞的細(xì)胞群在諸如血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、上皮生長因子(EGF)、血小板衍生的生長因子(PDGF)或堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)等血管生成因子存在下培養(yǎng)于底物，例如MATRIGEL 上的時(shí)候，形成芽或管狀結(jié)構(gòu)。在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了一種細(xì)胞群，其中所述分離的細(xì)胞群中至少約50%、60%、70%、80%、90%、95%或98%的細(xì)胞是羊膜來源的貼壁細(xì)胞，其經(jīng)RT-PCR測定為0CT-4 且對(duì)于VEGFR2/KDR、CD9、CD54、CD105、或CD200呈陽性。在一個(gè)具體的實(shí)施方式中，所述分離的細(xì)胞群中至少約50%、60%、70%、80%、90%、95%或98%的細(xì)胞是羊膜來源的貼壁細(xì)胞，其經(jīng)RT-PCR測定為0CT-4—，和經(jīng)免疫定位測定為VEGFR2/KDR+、CD9+、 ⑶M+、⑶105+、和⑶200+。在一個(gè)更加具體的實(shí)施方式中，所述羊膜來源的貼壁細(xì)胞在暴露于Ι-lOOng/mL的VEGF下4_21天后經(jīng)免疫定位測定不表達(dá)⑶34。在一個(gè)具體的實(shí)施方式中，所述羊膜來源的貼壁細(xì)胞附著于組織培養(yǎng)塑料。在另一個(gè)具體的實(shí)施方式中，當(dāng)所述細(xì)胞群在諸如血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、上皮生長因子(EGF)、血小板衍生的生長因子(PDGF)或堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)等血管生成因子存在下培養(yǎng)于底物，例如 MATRIGEL 上的時(shí)候，形成芽或管狀結(jié)構(gòu)。在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了一種細(xì)胞群，例如，人細(xì)胞，其中所述分離的細(xì)胞群中至少約50 %、60%、70 %、80%、90 %、95%或98 %的細(xì)胞是羊膜來源的貼壁細(xì)胞， 其表達(dá) ACTA2、ADAMTSU ΑΜ0Τ, ANG、ANGPTU ANGPT2、ANGPTLU ANGPTL2、ANGPTL4、BAIU CD44、CD200、CEACAMU CHGA, C0L15A1、C0L18A1、C0L4A1、C0L4A2、C0L4A3、CSF3、CTGF, CXCLl2, CXCL2、DNMT3B、ECGFl、EDGl、EDIL3、ENPP2、EPHB2、FBLN5、F2、FGFl、FGF2、FIGF, FLT4、FN1、FST、F0XC2、GRN、HGF、HEY1、HSPG2、IFNB1、IL8、IL12A、ITGA4、ITGAV、ITGB3、MDK、 MMP2、MY0Z2、NRP1、NRP2、PDGFB, PDGFRA, PDGFRB, PECAMl、PF4、PGKl、PROXl、PTN、SEMA3F、 SERPINB5、SERPINC1、SERPINF1、TIMP2、TIMP3、TGFA、TGFBl、THBSl、THBS2、TIEl、TIE2/TEK、 TNF、TNNI1、TNFSF15、VASH1、VEGF、VEGFB、VEGFC、VEGFR1/FLT1、或VEGFR2/KDR 的 RNA 中的一種或多種或全部。
在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了一種細(xì)胞群，例如，羊膜來源的貼壁細(xì)胞群； 或一種細(xì)胞群，其中所述分離的細(xì)胞群中至少約50 %、60 %、70 %、80 %、90 %、95 %或98 % 的細(xì)胞是羊膜來源的貼壁細(xì)胞，其表達(dá)⑶49d、連接蛋白-43、HLA-ABC、β2_微球蛋白、 CD349、⑶318、PDLU CD106、半乳凝素-1、ADAM 17前體(脫整聯(lián)蛋白及金屬蛋白酶域17) (TNF-α轉(zhuǎn)化酶)、血管緊張肽原前體、細(xì)絲蛋白Α( α-細(xì)絲蛋白)(細(xì)絲蛋白1)(內(nèi)皮肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白)(ABP480)(非肌肉細(xì)絲蛋白)、α-輔肌動(dòng)蛋白l(a-輔肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架亞型)(非肌肉α-輔肌動(dòng)蛋白1) (F-肌動(dòng)蛋白交聯(lián)蛋白)、低密度脂蛋白受體相關(guān)的蛋白 2前體(巨蛋白(Megalin))(糖蛋白330) (gp330)、1和II型巨噬細(xì)胞消除受體(巨噬細(xì)胞乙酰化的LDL受體I和II)、活化素受體II型B前體(ACTR-IIB)、Wnt_9蛋白、膠質(zhì)原纖維酸性蛋白、星形細(xì)胞(GFAP)、肌漿球蛋白-結(jié)合蛋白C、心-型(心MyBP-C) (C-蛋白、心肌亞型)、或肌球蛋白重鏈，非肌A型(細(xì)胞肌球蛋白重鏈、A型)(非肌肉肌球蛋白重鏈-A) (NMMHC-A)中的一種或更多或全部。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種細(xì)胞群，例如，羊膜來源的貼壁細(xì)胞群；或一種細(xì)胞群，其中所述分離的細(xì)胞群中至少約50%、60%、70%、80%、90%、95%或98%的細(xì)胞是羊膜來源的貼壁細(xì)胞，其在例如細(xì)胞生長的培養(yǎng)基中分泌VEGF、HGF、IL-8、MCP-3、FGF2、 卵泡抑素、G-CSF、EGF、ENA-78、GR0、IL_6、MCP-1、PDGF_BB、TIMP_2、uPAR、或半乳凝素-1 中的一種或多種或全部。在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了一種細(xì)胞群，例如，羊膜來源的貼壁細(xì)胞群； 或一種細(xì)胞群，其中所述分離的細(xì)胞群中至少約50 %、60 %、70 %、80 %、90 %、95 %或98 % 的細(xì)胞是羊膜來源的貼壁細(xì)胞，其表達(dá)血管生成的微RNA(miRNA)的水平高于骨髓來源的間質(zhì)干細(xì)胞，其中所述 miRNA 包括 miR-17-3p、miR-18a、miR_18b、miR_19b、miR-92、和 / 或 miR-296中的一種或更多或全部。在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了一種細(xì)胞群，例如，羊膜來源的貼壁細(xì)胞群；或一種細(xì)胞群，其中所述分離的細(xì)胞群中至少約50^^60^^70%, 80 %、90%、95%或98%的細(xì)胞是羊膜來源的貼壁細(xì)胞，其表達(dá)的血管生成微RNA(miRNA) 的水平低于骨髓來源的間質(zhì)干細(xì)胞，其中所述miRNA包括miR-20a、miR_20b、miR-221、 miR-222、miR-15b、和/或miR-16中的一種或更多或全部。在某些實(shí)施方式中，AMDAC, 或AMDAC群體，表達(dá)一種或更多或全部的血管生成miRNA :miR-17_3p、miR_18a、miR_18b、 miR-19b、miR-92、miR-20a、miR-20b、miR-296、miR-221、miR-222、miR-15b、和 / 或 miR-16。在另一個(gè)具體的實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了一種羊膜來源的血管生成細(xì)胞，或羊膜來源的血管生成細(xì)胞群，其在缺氧條件(例如，低于約5% O2)下以相對(duì)常氧條件(例如， 約20%或約21% O2)下增加的水平表達(dá)⑶202b、IL-8和/或VEGF。在另一個(gè)具體的實(shí)施方式中，分離的羊膜來源的貼壁細(xì)胞群另外包含第二種細(xì)胞類型。在具體的實(shí)施方式中，AMDAC包含所述群體中至少10%、15%、20%、25%、30%、 35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、80%、85%、90%、95%或至少 98% 的細(xì)胞。 在一個(gè)具體的實(shí)施方式中，第二種細(xì)胞類型包含于或分離自胎盤血、臍帶血、粗骨髓或其它組織。在一個(gè)更加具體的實(shí)施方式中、所述第二種細(xì)胞類型是胚胎干細(xì)胞、血細(xì)胞、分離自外周血的干細(xì)胞、分離自胎盤血的干細(xì)胞、分離自胎盤灌流液的干細(xì)胞、分離自胎盤組織的干細(xì)胞、分離自臍帶血的干細(xì)胞、臍帶干細(xì)胞、骨髓來源的間質(zhì)干細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞、造血干細(xì)胞、體干細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、內(nèi)皮祖細(xì)胞、周細(xì)胞、肌細(xì)胞、成心肌細(xì)胞、成肌細(xì)胞、成血管細(xì)胞、或心成肌細(xì)胞。在另一個(gè)具體的實(shí)施方式中，所述第二種細(xì)胞類型是造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞，例如，CD34+細(xì)胞。在另一個(gè)更具體的實(shí)施方式中，所述第二種細(xì)胞類型包含所述群體中至少10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、 55%、60%、65%、70%、80%、85%、90%、95%或至少 98%的細(xì)胞。在另一個(gè)具體的實(shí)施方式中，任何上述細(xì)胞正在被或已經(jīng)被培養(yǎng)增殖。在另一個(gè)具體的實(shí)施方式中，任何上述細(xì)胞都來自所述細(xì)胞培養(yǎng)物，其已被傳代至少1、2、3、4、5、6、 7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、或20次、或更多。在另一個(gè)具體的實(shí)施方式中， 任何上述細(xì)胞都來自培養(yǎng)物，其在培養(yǎng)物中倍增至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、 14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、 39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49 或至少 50 次，或更多。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種組合物，例如，藥物組合物，其包含在此提供的任何一種羊膜來源的貼壁細(xì)胞，或含有羊膜來源的貼壁細(xì)胞的細(xì)胞群。在一個(gè)具體的實(shí)施方式中，組合物是基質(zhì)或支架，例如，天然組織基質(zhì)或支架，例如，永久或可降解的去細(xì)胞化的組織基質(zhì)或支架；或合成的基質(zhì)或支架。在一個(gè)更加具體的實(shí)施方式中，所述基質(zhì)或支架的形狀為管狀或其它器官狀的三維形式。在另一個(gè)更具體的實(shí)施方式中，所述基質(zhì)為去細(xì)胞化的組織基質(zhì)。在另一個(gè)具體的實(shí)施方式中，組合物包含一種或多種在此提供的分離的羊膜來源的貼壁細(xì)胞，或含有羊膜來源的貼壁細(xì)胞的細(xì)胞群，其置于生理可接受的溶液中， 例如，鹽溶液、培養(yǎng)基等。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了治療患有循環(huán)系統(tǒng)疾病或紊亂的個(gè)體的方法，包括對(duì)所述個(gè)體以足以明顯改善所述疾病或紊亂的一種或更多癥狀的量和時(shí)間施用一種或多種在此描述的羊膜來源的貼壁細(xì)胞。在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了治療患有循環(huán)系統(tǒng)疾病或紊亂的個(gè)體的方法，包括對(duì)所述個(gè)體施用羊膜來源的貼壁細(xì)胞，其用藥量和時(shí)間與羊膜來源的貼壁細(xì)胞施用前的該個(gè)體相比足以明顯改善一種或更多心功能指標(biāo)，其中所述心功能指標(biāo)為胸腔心輸出量(CO)、心指數(shù)(Cl)、肺動(dòng)脈楔壓(PAWP)、心指數(shù)(Cl)、％縮短分?jǐn)?shù)(％ FS)、射血分?jǐn)?shù)(EF)、左心室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)、左心室舒張末內(nèi)徑(LVEDD)、左心室收縮末內(nèi)徑(LVESD)、收縮性(dP/dt)、心房或心室功能降低、泵效率增加、泵效率損失速率降低、血液動(dòng)力學(xué)功能損失降低、或與心肌病相關(guān)的并發(fā)癥減少。在一個(gè)具體的實(shí)施方式中，所述疾病或紊亂是心肌梗塞。在另一個(gè)具體的實(shí)施方式中，所述疾病或紊亂是心肌病。在其它具體的實(shí)施方式中，所述疾病或紊亂是動(dòng)脈瘤、心絞痛、主動(dòng)脈瓣狹窄、主動(dòng)脈炎、心率不齊、動(dòng)脈硬化、動(dòng)脈炎、非對(duì)稱性心室間隔肥厚(ASH)、動(dòng)脈粥樣硬化、心房纖顫和撲動(dòng)、細(xì)菌性心內(nèi)膜炎、Barlow綜合征(二尖瓣脫垂)、心動(dòng)過緩、脈管炎病(血栓閉塞性脈管炎)、心肌肥厚、心臟炎、頸動(dòng)脈疾病、主動(dòng)脈縮窄、先天性心臟缺損、充血性心力衰竭、冠狀動(dòng)脈疾病、Eisenmenger綜合征、栓塞、心內(nèi)膜炎、紅斑性肢痛病、肌纖維震顫、纖維肌肉發(fā)育不良、心傳導(dǎo)阻滯、心臟雜音、高血壓、低血壓、特發(fā)性嬰兒動(dòng)脈鈣化、川崎氏病(皮膚粘膜淋巴結(jié)綜合征、皮膚粘膜淋巴結(jié)病、小兒多動(dòng)脈炎)、代謝綜合征、微血管心絞痛、心肌炎、陣發(fā)性房性心動(dòng)過速(PAT)、結(jié)節(jié)性動(dòng)脈周圍炎(多動(dòng)脈炎、結(jié)節(jié)性多動(dòng)脈炎)、心包炎、周圍血管疾病、嚴(yán)重肢體缺血、靜脈炎、肺動(dòng)脈瓣狹窄(肺動(dòng)脈狹窄)、雷諾氏病、腎動(dòng)脈狹窄、腎性高血壓、風(fēng)濕性心臟病、糖尿病血管病變、間隔缺損、無癥狀心肌缺血、綜合征X、心動(dòng)過速、高安氏動(dòng)脈炎、i^allot四聯(lián)癥、大血管轉(zhuǎn)位、三尖瓣閉鎖、動(dòng)脈干、心臟瓣膜病、曲張潰瘍、靜脈曲張、脈管炎、室間隔缺損、 Wolff-Parkinson-White綜合征、心內(nèi)膜墊缺損、急性風(fēng)濕熱、急性風(fēng)濕性心包炎、急性風(fēng)濕性心內(nèi)膜炎、急性風(fēng)濕性心肌炎、慢性風(fēng)濕性心臟病、二尖瓣疾病、二尖瓣狹窄、風(fēng)濕性二尖瓣關(guān)閉不全、主動(dòng)脈瓣疾病、其他心內(nèi)膜結(jié)構(gòu)疾病、缺血性心臟病(急性、亞急性)、心絞痛、 急性肺心病、肺栓塞、慢性肺心病、脊柱后側(cè)凸性心臟病、心肌炎、心內(nèi)膜炎、心內(nèi)膜心肌纖維化、心內(nèi)膜纖維彈性組織增生癥、房室傳導(dǎo)阻滯、心律失常、心肌變性、腦血管疾病、動(dòng)脈、 小動(dòng)脈和毛細(xì)血管疾病、或靜脈和淋巴管疾病。在其它具體的實(shí)施方式中，所述疾病或紊亂是腦前動(dòng)脈閉塞和狹窄，或腦動(dòng)脈閉塞。在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了治療腦內(nèi)和腦部周邊血流破壞的個(gè)體的方法，例如，由于該個(gè)體的腦或中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNQ內(nèi)部或周邊血流破壞引發(fā)的癥狀或神經(jīng)功能障礙，其包括對(duì)該個(gè)體施用治療有效量的AMDAC。在某些實(shí)施方式中，血流破壞導(dǎo)致該個(gè)體的腦或CNS缺氧損傷或低氧損傷。在其它具體的實(shí)施方式中，所述疾病或紊亂是周圍動(dòng)脈閉塞和狹窄。在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了治療肢體內(nèi)部和周邊血流破壞的個(gè)體的方法，例如，由于該個(gè)體的周圍血管系統(tǒng)的內(nèi)部或周邊血流破壞引發(fā)的癥狀或血管缺陷，其包括對(duì)該個(gè)體施用治療有效量的 AMDAC0在某些實(shí)施方式中，血流破壞導(dǎo)致該個(gè)體的肢體和或手足缺氧損傷或低氧損傷。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了治療患有創(chuàng)傷或精神損傷的個(gè)體的方法，其包括對(duì)所述個(gè)體施用一種或多種在此描述的羊膜來源的貼壁細(xì)胞，其用藥量和時(shí)間足以明顯改善所述創(chuàng)傷或精神損傷。在另一個(gè)具體的治療方法實(shí)施方式中，所述細(xì)胞注射施用至所述個(gè)體。在一個(gè)更加具體的實(shí)施方式中，所述注射為注射入個(gè)體心臟的缺血性區(qū)域。在另一個(gè)特別的治療方法實(shí)施方式中，所述細(xì)胞靜脈輸液施用至所述個(gè)體。在另一個(gè)特別的治療方法實(shí)施方式中， 通過在所述個(gè)體中植入如上所述的含有羊膜來源的貼壁細(xì)胞的基質(zhì)或支架，將所述細(xì)胞、 或所述細(xì)胞的群體、或包含所述細(xì)胞的細(xì)胞群施用至所述個(gè)體。在此提供的分離的羊膜來源的貼壁細(xì)胞和細(xì)胞群不是諸如描述于美國專利號(hào) 7，255，879或美國專利申請(qǐng)公布號(hào)2007/0275362的分離的胎盤干細(xì)胞或細(xì)胞群。在此提供的分離的羊膜來源的貼壁細(xì)胞也不是內(nèi)皮祖細(xì)胞、羊膜上皮細(xì)胞、滋養(yǎng)層、滋養(yǎng)層細(xì)胞、胚胎生殖細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞、從胚胎內(nèi)細(xì)胞團(tuán)獲得的細(xì)胞、或從胚胎性腺嵴獲得的細(xì)胞。在此使用的術(shù)語“約”表示，例如，在所述數(shù)字或數(shù)值10%的范圍以內(nèi)。在此使用的關(guān)于在此描述的羊膜來源的貼壁細(xì)胞的術(shù)語“血管生成的 (angiogenic) ”，意為該細(xì)胞能夠形成血管或血管樣芽，或細(xì)胞能夠促進(jìn)在另一個(gè)細(xì)胞群中的血管生成(例如，形成血管或血管樣結(jié)構(gòu))，例如，內(nèi)皮細(xì)胞。在此使用的術(shù)語“血管生成(angiogenesis) ”表示血管形成的過程，其包括但不限于，內(nèi)皮細(xì)胞的激活、遷移、增殖，基質(zhì)重構(gòu)和細(xì)胞穩(wěn)定化。在此使用的術(shù)語“干細(xì)胞”定義了任何給定細(xì)胞群的功能屬性，其能夠廣泛增殖但不一定無限增殖，且有助于在胚胎發(fā)育或是出生后的組織替代和修復(fù)中形成多種組織。在此使用的術(shù)語“祖細(xì)胞”定義了任何給定細(xì)胞群的功能屬性，其能夠廣泛增殖但不一定無限增殖，且有助于在胚胎發(fā)育或是出生后的組織替代和修復(fù)中形成相對(duì)于干細(xì)胞數(shù)量有限的多種組織。
在此使用的術(shù)語“來源的(derived)”表示分離的或用其它方式純化的。例如，羊膜來源的貼壁細(xì)胞分離自羊膜。術(shù)語“來源的”涵蓋了培養(yǎng)于直接從諸如羊膜的組織中分離的細(xì)胞，以及培養(yǎng)或擴(kuò)增自初級(jí)分離物的細(xì)胞。在此使用的“免疫定位”表示在例如流式細(xì)胞術(shù)、熒光激活細(xì)胞分選、磁性細(xì)胞分選、原位雜交、免疫組織化學(xué)等中對(duì)諸如細(xì)胞標(biāo)記的化合物進(jìn)行檢測，其中使用免疫蛋白， 例如，抗體或其片段。在此使用的術(shù)語“分離的細(xì)胞”表示一種細(xì)胞，其基本上分離自例如細(xì)胞從中來源的羊膜或胎盤的其它細(xì)胞或組織。如果在例如收集和/或培養(yǎng)細(xì)胞的過程中，至少約20 %、 30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、或至少99 %的干細(xì)胞天然關(guān)聯(lián)的細(xì)胞被從該細(xì)胞中去除，則認(rèn)為該細(xì)胞是“分離的”。在此使用的術(shù)語“分離的細(xì)胞群”表示一種細(xì)胞群，其基本上分離自例如細(xì)胞群從中來源的羊膜或胎盤的其它細(xì)胞或組織。如果在例如收集和/或培養(yǎng)羊膜來源的貼壁細(xì)胞的過程中，至少約 20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、或至少 99% 的所述細(xì)胞群天然關(guān)聯(lián)的細(xì)胞或該細(xì)胞群從中來源的細(xì)胞被從該細(xì)胞群中去除，則認(rèn)為該細(xì)胞群是“分離的”。當(dāng)一種特殊標(biāo)記可以通過例如免疫定位或通過流式細(xì)胞術(shù)或通過RT-PCR被從背景中檢出的時(shí)候，認(rèn)為在此使用的細(xì)胞對(duì)于該特殊標(biāo)記是“陽性的”。例如，如果可在細(xì)胞上檢測出CD105明顯高于背景的量(相對(duì)于，例如，同型對(duì)照)，則細(xì)胞被描述為對(duì)于CD105是陽性的。在例如抗體-介導(dǎo)檢測的背景下，“陽性的”作為細(xì)胞的特定表面標(biāo)記存在的一種暗示，意為該標(biāo)記可用抗體檢測，例如，標(biāo)記特異性的熒光標(biāo)記抗體；“陽性的”還表示細(xì)胞攜帶該標(biāo)記，其含量可以在例如細(xì)胞計(jì)數(shù)器中產(chǎn)生信號(hào)，其能夠在背景中檢測到。例如，細(xì)胞是“⑶105+”，則其中細(xì)胞被可檢測地標(biāo)記了⑶105特異性抗體，且來自抗體的信號(hào)可檢測得出高于對(duì)照(例如，背景)。相反，在相同語境下，“陰性的”意為相對(duì)于背景而言細(xì)胞表面標(biāo)記使用其特異性抗體無法檢測。例如，細(xì)胞是“CD34—”，則其中細(xì)胞不能用CD34特異性抗體標(biāo)記檢測。除非在此另有說明，否則分化抗原(“CD”)標(biāo)記均使用抗體進(jìn)行檢測。例如，如果0CT-4的mRNA可使用例如30個(gè)循環(huán)的RT-PCR進(jìn)行檢測，則可以確定存在0CT-4， 且細(xì)胞是0CT-4+。4.附圖簡述

圖1顯示了羊膜來源的貼壁細(xì)胞和NTERA-2細(xì)胞的干細(xì)胞相關(guān)基因表達(dá)。圖2顯示了羊膜來源的貼壁細(xì)胞(AMDAC)的細(xì)胞表面的TEM-7表達(dá)。圖3顯示了羊膜來源的貼壁細(xì)胞分泌選定的血管生成蛋白。圖4顯示了羊膜來源的貼壁細(xì)胞條件化培養(yǎng)基對(duì)人內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)管腔形成的血管生成效果。圖5顯示了羊膜來源的貼壁細(xì)胞條件化培養(yǎng)基對(duì)人內(nèi)皮細(xì)胞遷移的血管生成效^ ο圖6顯示了羊膜來源的貼壁細(xì)胞條件化培養(yǎng)基對(duì)人內(nèi)皮細(xì)胞增殖的效果。圖7顯示了 HUVEC和羊膜來源的貼壁細(xì)胞對(duì)乙酰化LDL的吸收。圖8顯示了 HUVEC和羊膜來源的貼壁細(xì)胞的管腔形成。圖9顯示了在低氧和常氧條件下羊膜來源的貼壁細(xì)胞VEGF和IL-8的分泌。
圖10顯示了在常氧(約21% O2)和低氧(低于約5% O2)條件下細(xì)胞標(biāo)記Tie2 的表達(dá)。Y軸經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)測定的Tie2陽性的細(xì)胞百分比。圖11顯示了羊膜來源的貼壁細(xì)胞的成心肌細(xì)胞分化潛能，其中AM表示羊膜來源的貼壁細(xì)胞(AMDAC)，HD表示未處理的懸滴，HD IND表示暴露于誘導(dǎo)條件的懸滴，以及HD IND+5-AZA表示在5-氮雜胞苷存在或缺失的情況下的誘導(dǎo)。CTRL表示未處理的懸滴對(duì)照。圖12顯示了在雞胚絨膜尿囊血管生成模型中AMDAC對(duì)血管生成的正向效果。Lot ULot 2,Lot 3 來自三種不同的細(xì)胞制備物的AMDAC。bFGF 堿性成纖維細(xì)胞生長因子(陽性對(duì)照)。MDAMB231 血管生成性乳腺癌細(xì)胞系(陽性對(duì)照)。Y軸血管形成度。圖13顯示了在雞胚絨膜尿囊血管生成模型中AMDAC-條件化培養(yǎng)基對(duì)血管生成的正向效果。Lot ULot 2, Lot 3:來自三種不同的細(xì)胞制備物的AMDAC。bFGF 堿性成纖維細(xì)胞生長因子(陽性對(duì)照)。MDAMB231 血管生成性乳腺癌細(xì)胞系(陽性對(duì)照)。Y軸血管形成度。圖14A、14B 存在于星形細(xì)胞培養(yǎng)物、星形細(xì)胞和骨髓來源的間質(zhì)干細(xì)胞 (BM-MSC)共培養(yǎng)物、或星形細(xì)胞和AMDAC共培養(yǎng)物的過氧化氫產(chǎn)生的活性氧。14A AMDAC，Lot 1 ； 14B =AMDAC, Lot 2。單獨(dú)的HA(人星形細(xì)胞)、星形細(xì)胞+H2O2、和星形細(xì)胞 +BM-MSC+H202的條件對(duì)于圖14A和14B而言是相同的。RFU ROS活性活性氧的相對(duì)熒光單位。5.發(fā)明詳述5. 1羊膜來源的貼壁細(xì)胞的特性本發(fā)明提供了獨(dú)特的貼壁血管生成細(xì)胞及該細(xì)胞的群體，其分離自羊膜，在此稱為“羊膜來源的貼壁細(xì)胞”或AMDAC。羊膜來源的貼壁細(xì)胞在表觀上與間質(zhì)細(xì)胞有些相似， 其具有大致為成纖維樣的形狀。該細(xì)胞附著于細(xì)胞培養(yǎng)物表面，例如，組織培養(yǎng)塑料。AMDAC能展示將其區(qū)別于其它羊膜來源或胎盤來源的細(xì)胞的細(xì)胞標(biāo)記。例如，在一個(gè)實(shí)施方式中，羊膜來源的貼壁細(xì)胞經(jīng)RT-PCR測定是0CT-4_(八聚體結(jié)合蛋白4)。在另一個(gè)具體的實(shí)施方式中，0CT-4_羊膜來源的貼壁細(xì)胞經(jīng)免疫定位測定是CD49f+。在另一個(gè)具體的實(shí)施方式中，所述0CT-4_細(xì)胞經(jīng)RT-PCR測定是HLA-G_。在另一個(gè)具體的實(shí)施方式中， 0CT-4—細(xì)胞經(jīng)免疫定位測定是VEGFRl/Flt-Γ (血管內(nèi)皮生長因子受體1)和/或VEGFR2/ KDR+(血管內(nèi)皮生長因子受體幻。在一個(gè)具體的實(shí)施方式中，0CT-4—羊膜來源的貼壁細(xì)胞或0CT-4_羊膜來源的貼壁細(xì)胞群，在例如> 20個(gè)循環(huán)的PCR-擴(kuò)增下，比具有等價(jià)細(xì)胞數(shù)量和RNA擴(kuò)增循環(huán)數(shù)的NTERA-2細(xì)胞或NTERA-2細(xì)胞群少表達(dá)至少2log的PCR擴(kuò)增的 0CT-4mRNA。在另一個(gè)具體的實(shí)施方式中，所述OCT-f細(xì)胞是⑶90+、⑶105+、或⑶在一個(gè)更加具體的實(shí)施方式中，所述0CT-4—細(xì)胞是⑶90+、⑶105+、和⑶117—。在一個(gè)更加具體的實(shí)施方式中，細(xì)胞是0CT-4-或HLA-G-，并且還是⑶49f+、⑶90+、⑶105+、和⑶在一個(gè)更加具體的實(shí)施方式中，細(xì)胞是0CT-4-，HLA-G-、⑶49f+、⑶90+、⑶105+、和⑶在另一個(gè)具體的實(shí)施方式中，0CT-4_細(xì)胞例如經(jīng)30個(gè)循環(huán)的RT-PCR測定不表達(dá)S0X2。在一個(gè)具體的實(shí)施方式中，細(xì)胞經(jīng)免疫定位或流式細(xì)胞術(shù)測定是0CT-4—、⑶49f+、⑶90+、⑶105+、和 CD117—，和經(jīng)例如30個(gè)循環(huán)的的RT-PCR測定是S0X2_。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述0CT_4_細(xì)胞經(jīng)免疫定位測定是⑶四+、⑶73+，ABC-p+、* ⑶38_中的一種或多種。
在另一個(gè)具體的實(shí)施方式中，例如，0CT_4_AMDAC經(jīng)免疫定位測定可以還是⑶9+、 CD10+、CD44+、CD54+、CD98+、TEM_7+(腫瘤內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物 7)、CD31\ CD34\ CD45\ CD133\ ⑶143_(血管緊張素I轉(zhuǎn)換酶，ACE)、⑶146_(黑色素瘤細(xì)胞粘附分子)、或CXCR4_(趨化因子(C-X-C基序)受體4)中的一種或多種，或經(jīng)RT-PCR測定是HLA-G_。在一個(gè)更加具體的實(shí)施方式中，所述細(xì)胞經(jīng)免疫定位測定為⑶9+、⑶10+、⑶44+、⑶M+、⑶98+、Tie-2+、TEM-7+、 CD3r、CD34\CD45\CD133\CD143\CD146\和 C)(CR4、和經(jīng) RT-PCR測定為 HLA-G-。在一個(gè)實(shí)施方式中，在此提供的羊膜來源的貼壁細(xì)胞為⑶31_、⑶34_、⑶45_、和/或⑶133_中的一種或多種。在一個(gè)具體的實(shí)施方式中，羊膜來源的貼壁細(xì)胞經(jīng)RT-PCR測定是0CT-4_ ；經(jīng)免疫定位測定是 VEGFRl/Flt-Γ 和 / 或 VEGFR2/KDR+ ；以及 CD3r、CD34\CD45\* / 或 CD133-中的一種或多種或全部。在另一個(gè)具體的實(shí)施方式中，所述細(xì)胞經(jīng)免疫定位測定還為VE-鈣粘蛋白_。在另一個(gè)具體的實(shí)施方式中，所述細(xì)胞經(jīng)免疫定位測定還另外對(duì)⑶105+和⑶200+呈陽性。在另一個(gè)具體的實(shí)施方式中，所述細(xì)胞在暴露于Ι-lOOng/mL的VEGF下4_21天后經(jīng)免疫定位測定不表達(dá)⑶34。在更加具體的實(shí)施方式中，所述細(xì)胞在暴露于25-75ng/mL的VEGF下4_21 天、或50ng/mL的VEGF下4_21天后經(jīng)免疫定位測定不表達(dá)⑶34。在更加具體的實(shí)施方式中，所述細(xì)胞在暴露于1、2. 5、5、10、25、50、75或100ng/mL VEGF下4_21天后經(jīng)免疫定位測定不表達(dá)⑶34。在更加具體的實(shí)施方式中，所述細(xì)胞在暴露于Ι-lOOng/mL的VEGF下7_14 天，例如，7天后，經(jīng)免疫定位測定不表達(dá)⑶34。在具體的實(shí)施方式中，羊膜來源的貼壁細(xì)胞經(jīng)RT-PCR測定是0CT_4_，和經(jīng)免疫定位測定是VE-鈣粘蛋白-、VEGFR2/KDR+、CD9+、CM4+、CD105+、和/或CD200+中的一種或多種。 在一個(gè)具體的實(shí)施方式中，羊膜來源的細(xì)胞經(jīng)RT-PCR測定是0CT-4_，和經(jīng)免疫定位測定是 VE-鈣粘蛋白\VEGFR2/KDR+、CD9+、CM4+、CD105+、和CD200+。在另一個(gè)具體的實(shí)施方式中， 所述細(xì)胞在例如暴露于Ι-lOOng/mL的VEGF下4_21天后經(jīng)免疫定位測定不表達(dá)⑶34。在另一個(gè)實(shí)施方式中，羊膜來源的貼壁細(xì)胞是0CT-4—、⑶49f+、HLA_G_、⑶90+、 ⑶105+、和⑶117_。在一個(gè)更加具體的實(shí)施方式中，所述細(xì)胞經(jīng)免疫定位測定為⑶9+、⑶10+、 CD44+、CD54+、CD98+、Tie-2+、TEM-7+、CD3Γ、CD34\CD45\CD133\CD143\CD146\或CXCR4-中的一種或多種。在一個(gè)更加具體的實(shí)施方式中，所述細(xì)胞經(jīng)免疫定位測定為CD9+、CD10+、 CD44+、CD54+、CD98+、Tie_2+、TEM-7+、CD31\ CD34\ CD45\ CD133\ CD143\ CD146-、和 CXCR4-。 在另一個(gè)具體的實(shí)施方式中，所述細(xì)胞經(jīng)免疫定位測定還為VEGFR1/Flt-1+和/或VEGFR2/ KDR+ ；以及經(jīng)免疫定位測定為⑶3Γ、⑶;34-、⑶45-、⑶133\和/或Tie_2-中的一種或多種。 在另一個(gè)具體的實(shí)施方式中，所述細(xì)胞經(jīng)免疫定位測定還為VEGFR1/Flt-1+、VEGFR2/KDR+、 CD31\ CD34\ CD45\ CD133-、和 Tie_2\在另一個(gè)實(shí)施方式中，0(^-4_羊膜來源的貼壁細(xì)胞經(jīng)免疫定位測定還是⑶9+、 CD10+、CD44+、CD49f+、CD54+、CD90+、CD98+、CD105+、CD200+、Tie_2+、TEM-7+、VEGFRl/Flt-Γ、 和/或VEGFR2/KDR+(⑶309+)中的一種或多種或全部；或經(jīng)免疫定位測定還是⑶3Γ、⑶34_、 CD38\ CD45\ CD117\ CD133\ CD143\ CD144\ CD146\ CD271\ CXCR4\ HLA-G-JP / 或 VE-鈣粘蛋白^中的一種或多種或全部，或經(jīng)RT-PCR測定為S0X2_。在某些實(shí)施方式中，附著于組織培養(yǎng)塑料的分離的羊膜來源的貼壁細(xì)胞是 ⑶49f+。在一個(gè)具體的實(shí)施方式中，所述⑶49f+細(xì)胞經(jīng)免疫定位測定還是⑶9+、⑶10+、CD44+、CD54\ CD90+、CD98+、CD105+、CD200+、Tie_2+、TEM-7+、VEGFRl/Flt-1+、和 / 或 VEGFR2/ KDR+(⑶309+)中的一種或多種或全部；或經(jīng)免疫定位測定還是⑶3Γ、⑶34_、⑶38_、⑶45_、 CD117\ CD133\ CD143\ CD144\ CD146\ CD271\ CXCR4\ HLA-G\ OCT-4"和 / 或 VE-鈣粘蛋白-中的一種或多種或全部，或經(jīng)RT-PCR測定為S0X2_。在某些其它的實(shí)施方式中，分離的組織培養(yǎng)塑料附著的羊膜來源的貼壁細(xì)胞是 HLA-G-、CD90+和CDl 在一個(gè)具體的實(shí)施方式中，所述HLA_G-、CD90+和CDl 17—細(xì)胞經(jīng)免疫定位測定還是 CD9+、CD10+、CD44+、CD49f+、CD54+、CD98+、CD105+、CD200+、Tie_2+、TEM_7+、 VEGFRl/Flt-1+、和/或VEGFR2/KDR+(CD309+)中的一種或多種或全部；或經(jīng)免疫定位測定還是 CD31\ CD34\ CD38\ CD45\ CD133\ CD143\ CD144\ CD146\ CD271\ CXCR4\ OCT-4"和 / 或VE-鈣粘蛋白—中的一種或多種或全部，或經(jīng)RT-PCR測定為S0X2_。在另一個(gè)實(shí)施方式中，標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)條件下經(jīng)例如30個(gè)循環(huán)的RT-PCR測定，分離的羊膜來源的貼壁細(xì)胞或羊膜來源的血管生成細(xì)胞群不能組成型地表達(dá)以下的mRNA 成纖維細(xì)胞生長因子4(FGF4)、干擾素γ (IFNG)、趨化因子(C-X-C基序)配體10 (CXCLlO)、血管生成素4(ANGPT4)、血管生成素樣3(ANGPTL3)、纖維蛋白原α鏈(FGA)、瘦素(LEP)JI 乳素(PRL)、前動(dòng)力蛋白1 (PROKl)、腱調(diào)蛋白(TNMD)、FMS樣酪氨酸激酶3(FLT3基因)、胞外連接域容納I(XLKDl)、鈣粘蛋白5、2型(CDH5)、白細(xì)胞衍生的趨化因子I(LECTl)、纖溶酶原(PLG)、端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(TERT)、(性別決定區(qū)Y)-盒2(S0X2)、NAN0G、基質(zhì)金屬蛋白酶 13(MMP-13)、無遠(yuǎn)端同源(distal-less homeobox) 5 (DLX5)、和 / 或骨 Y -羧基谷氨酸 (GLA)蛋白(BGLAP)。在其它實(shí)施方式中，分離的羊膜來源的貼壁細(xì)胞或羊膜來源的血管生成細(xì)胞群表達(dá)以下的mRNA (ARNT2)、神經(jīng)生長因子(NGF)、腦衍生的神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)、 神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞衍生的神經(jīng)營養(yǎng)因子(⑶NF)、神經(jīng)營養(yǎng)因子3(NT-3)、NT-5、缺氧誘導(dǎo)因子 1 α (HIFlA)、缺氧誘導(dǎo)蛋白2 (HK^)、血紅素氧化酶(脫環(huán))1 (HMOXl)、胞外超氧化物歧化酶[Cu-Zn] (S0D3)、過氧化氫酶(CAT)、轉(zhuǎn)化生長因子β 1 (TGFBl)、轉(zhuǎn)化生長因子β 1受體 (TGFBlR)、和肝細(xì)胞生長因子受體(HGFR/c-met)。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了含有在此描述的羊膜來源的貼壁細(xì)胞的分離的細(xì)胞群。細(xì)胞群可以是同類群體，例如，細(xì)胞群中至少約90^^95^^98%或99%為羊膜來源的貼壁細(xì)胞。細(xì)胞群可以是混合的，例如，細(xì)胞群中最多約10%、20%、30%、40%、50%、60%、 70%或80%的細(xì)胞是羊膜來源的貼壁細(xì)胞。然而，分離的細(xì)胞群不是組織，即，不是羊膜。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了一種含AMDAC的分離的細(xì)胞群，例如，基本上均勻的AMDAC細(xì)胞群，其中所述AMDAC附著于組織培養(yǎng)塑料，且其中所述AMDAC經(jīng)RT-PCR測定是0CT-4—。在一個(gè)具體的實(shí)施方式中，AMDAC例如經(jīng)免疫定位或RT-PCR測定是⑶49f+或 HLA-G+.在另一個(gè)具體的實(shí)施方式中，所述AMDAC群體經(jīng)免疫定位測定是VEGFRl/Flt-Γ和 /或VEGFR2/KDR+，其中所述分離的細(xì)胞群不是羊膜(amnion/amniotic membrane)。在一個(gè)更加具體的實(shí)施方式中，AMDAC經(jīng)RT-PCR測定是0CT_4_和/或HLA_G_，和經(jīng)免疫定位測定是VEGFRl/Flt-Γ和/或VEGFR2/KDR+。在一個(gè)具體的實(shí)施方式中，所述群體中至少約50 %、 60%、70%、80%、90%、95%、98%或99%的細(xì)胞是所述羊膜來源的貼壁細(xì)胞。在另一個(gè)具體的實(shí)施方式中，所述AMDAC是⑶90+、⑶105+、或⑶117_。在一個(gè)更加具體的實(shí)施方式中， 所述AMDAC是⑶90+、⑶105+、和⑶在一個(gè)更加具體的實(shí)施方式中，AMDAC是OCT-f、 ⑶49f+、⑶90+、⑶105+、和⑶117-。在另一個(gè)具體的實(shí)施方式中，AMDAC例如經(jīng)30個(gè)循環(huán)的RT-PCR測定不表達(dá)S0X2。在一個(gè)更加具體的實(shí)施方式中，該群體含有AMDAC，且其中所述 AMDAC經(jīng)免疫定位或流式細(xì)胞術(shù)測定是0CT-4-、HLA-G\ CD49f+、CD90+、CD105+和CDl 17、以及例如經(jīng)30個(gè)循環(huán)的RT-PCR測定是S0X2_。在另一個(gè)具體的實(shí)施方式中，在所述細(xì)胞群中的所述AMDAC經(jīng)免疫定位或流式細(xì)胞術(shù)測定是⑶90+、⑶105+、或⑶117_。在一個(gè)更加具體的實(shí)施方式中，AMDAC經(jīng)免疫定位或流式細(xì)胞術(shù)測定是⑶90+、⑶105+、和⑶117—。在一個(gè)更加具體的實(shí)施方式中，AMDAC例如經(jīng)RT-PCR測定是0CT-4—或HLA-G—，且經(jīng)免疫定位或流式細(xì)胞術(shù)測定還是⑶49f+、⑶90+、 ⑶105+、和⑶117_。在一個(gè)更加具體的實(shí)施方式中，在所述細(xì)胞群中的AMDAC是0CT-4—、 HLA-G\OT49f+、⑶90+、⑶105+、和⑶在另一個(gè)具體的實(shí)施方式中，AMDAC例如經(jīng)30個(gè)循環(huán)的RT-PCR測定不表達(dá)S0X2。在一個(gè)更加具體的實(shí)施方式中，細(xì)胞經(jīng)免疫定位或流式細(xì)胞術(shù)測定是0CT-4-、CD49f+、CD90+、CD105+、和CDl 17、和經(jīng)例如30個(gè)循環(huán)的RT-PCR測定是 S0X2-。在一個(gè)更加具體的實(shí)施方式中，AMDAC是OCT-f或HLA-G—，和另外是CD49f+、CD90+、 CD105+、和 CDl 在一個(gè)更加具體的實(shí)施方式中，AMDAC 是 0CT-4\HLA_G\CD49f+、CD90+、 CD105+、和 CD117\在另一個(gè)實(shí)施方式中，在所述細(xì)胞群中的羊膜來源的貼壁細(xì)胞附著于組織培養(yǎng)塑料，其經(jīng)RT-PCR測定為0CT-4-，和免疫定位測定經(jīng)VEGFRl/Flt-Γ和/或VEGFR2/KDR+，且經(jīng)免疫定位測定還為 CD9+、CD10+、CD44+、CD54+、CD98+、Tie_2+、TEM-7+、CD31\ CD34\ CD45\ ⑶133-、⑶143-、⑶146-、或CXCRf中的一種或多種，或經(jīng)RT-PCR測定為HLA-G—，且其中所述分離的細(xì)胞群不是羊膜。在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了一種分離的細(xì)胞群，包含一種羊膜來源的貼壁細(xì)胞，其中所述細(xì)胞附著于組織培養(yǎng)塑料，其中所述細(xì)胞經(jīng)RT-PCR測定是 0CT-4—，和經(jīng)免疫定位測定是VEGFRl/Flt-Γ和/或VEGFR2/KDR+，其中所述細(xì)胞在暴露于 1-lOOng/mL的VEGF下4_21天后經(jīng)免疫定位測定不表達(dá)⑶34，且其中所述分離的細(xì)胞群不是羊膜。在任一上述實(shí)施方式的具體的實(shí)施方式中，所述群體中至少約50^^60^^70%, 80%、90%、95%、98%或99%的細(xì)胞是所述羊膜來源的貼壁細(xì)胞。在另一個(gè)實(shí)施方式中，任何上述含有羊膜來源的貼壁細(xì)胞的細(xì)胞群在胞外基質(zhì)蛋白或血管生成因子存在的條件下培養(yǎng)時(shí)都形成芽或管狀結(jié)構(gòu)，胞外基質(zhì)蛋白為例如I和IV 型膠原蛋白，血管生成因子為例如血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、上皮生長因子(EGF)、血小板衍生的生長因子(PDGF)或堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)，細(xì)胞群在例如胎盤膠原蛋白或例如MATRIGEL 的基質(zhì)內(nèi)或基質(zhì)上培養(yǎng)至少4天到多至14天。羊膜來源的貼壁細(xì)胞和羊膜來源的貼壁細(xì)胞群顯示能夠表達(dá)涉及血管生成相關(guān)或心肌生成相關(guān)基因的蛋白的特性。在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了一種細(xì)胞或一種細(xì)胞群，其中所述分離的細(xì)胞群中至少約50 %、60 %、70 %、80 %、90 %、95 %或98 %的細(xì)胞是羊膜來源的貼壁細(xì)胞，其表達(dá)以下的RNA中的一種或更多或全部ACTA2(肌動(dòng)蛋白、α 2、平滑肌、主動(dòng)脈)、ADAMTS1 (具有凝血酶致敏蛋白1型基序的ADAM金屬肽酶)、AMOT (血管抑素結(jié)合蛋白)、ANG (血管生成素),ANGPTl (促血管新生蛋白因子1)、ANGPT2、ANGPTL1 (促血管新生蛋白因子樣1)、ANGPTL2、ANGPTL4、BAI1 (腦特異性血管生成抑制劑1)、⑶44、⑶200、 CEACAM1 (癌胚抗原相關(guān)的細(xì)胞粘附分子1)、CHGA (嗜鉻粒蛋白A)、C0L15A1 (膠原蛋白，XV 型，α 1)、C0L18A1 (膠原蛋白，XVIII 型，α 1)、C0L4A1 (膠原蛋白，IV 型，al)、C0L4A2(膠原蛋白，IV型，a2)、C0L4A3(膠原蛋白，IV型，a 3)、CSF3 (菌落刺激因子3 (粒細(xì)胞)、CTGF (結(jié)締組織生長因子)、CXCL12(趨化因子(C)CC基序)配體12 (基質(zhì)細(xì)胞衍生因子1))、 CXCL2.DNMT3B (DNA (胞嘧啶_5_)-甲基轉(zhuǎn)移酶3 β ) ,ECGFl (胸腺嘧啶磷酸化酶)、EDG1 (內(nèi)皮細(xì)胞分化基因1)、EDIL3 (EGF樣重復(fù)和盤菌素I樣域幻、ENPP2 (外核苷酸焦磷酸酶/磷酸二酯酶 2)、EPHB2 (EPH 受體 B2)、FBLN5 (FIBULIN 5)、F2 鍵(凝血因子 II (凝血酶))、 FGFl (酸性成纖維細(xì)胞生長因子)、FGF2(堿性成纖維細(xì)胞生長因子)、FIGF(C-fos誘導(dǎo)的生長因子(血管內(nèi)皮生長因子D))、FLT4(fms-相關(guān)的酪氨酸激酶4)、FN1(纖維連接蛋白1)、 FST (卵泡抑素)、F0XC2 (叉頭框C2 (MFH-1、間質(zhì)細(xì)胞叉頭1))、GRN (顆粒體蛋白)、HGF (肝細(xì)胞生長因子)、HEY1 (YRPff相關(guān)發(fā)狀/分裂增強(qiáng)子基序1)、HSPG2 (硫酸乙酰肝素蛋白多糖 2)、IFNBl (干擾素，β 1，成纖維細(xì)胞)、IL8(白細(xì)胞介素8)、IL12A、ITGA4 (整聯(lián)蛋白，α4 ； CD49d)、ITGAV (整聯(lián)蛋白，α V)、ITGB3 (整聯(lián)蛋白，β 3)、MDK (肝素結(jié)合細(xì)胞因子)、MMP2 (基質(zhì)金屬蛋白酶2)、MY0Z2 (myozenin 2)、NRPl (神經(jīng)氈蛋白1)、NRP2、PDGFB (血小板衍生的生長因子β ) >PDGFRA基因(血小板衍生的生長因子受體α )、PDGFRB、PECAMl (血小板/內(nèi)皮細(xì)胞粘附分子)、PF4 (血小板因子4)、PGKl (磷酸甘油酸激酶1)、PROXl (prospero同源異形盒1)、PTN (多效蛋白)、SEMA3F(semophorin 3F)、SERPINB5 (絲氨酸蛋白酶抑制蛋白肽酶抑制劑，分支乙(卵清蛋白)，成員5)、SERPINC1、SERPINF1、TIMP2(組織金屬蛋白酶2 組織抑制劑)、TIMP3、TGFA (轉(zhuǎn)化生長因子，α )、TGFBl、THBSl (凝血酶致敏蛋白1)、THBS2、 TIEl (免疫球蛋白樣酪氨酸激酶和EGF樣域1)、！1E2/TEK、TNF(腫瘤壞死因子)、TNNI1 (肌鈣蛋白1，1型)、TNFSF15(腫瘤壞死因子(配體)超家族，成員15)、VASHl (血管抑制蛋白 1)、VEGF (血管內(nèi)皮生長因子)、VEGFB、VEGFC、VEGFR1/FLT1 (血管內(nèi)皮生長因子受體1)、和 / 或 VEGFR2/KDR。當(dāng)使用人細(xì)胞時(shí)，全部的指定基因均表示人源序列，且如本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的， 代表性的序列可以在文獻(xiàn)或在GenBank中找到。這些序列的探針可以通過公共可獲得的序列進(jìn)行決定，或通過商業(yè)來源，例如，特異性TAQMAN 探針或TAQMAN 血管生成陣列(Applied Biosystems，商品號(hào) 4378710)。羊膜來源的貼壁細(xì)胞和羊膜來源的貼壁細(xì)胞群顯示能夠表達(dá)血管生成相關(guān)蛋白的特性。在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了一種細(xì)胞或一種細(xì)胞群，其中所述分離的細(xì)胞群中至少約50%、60%、70%、80%、90%、95%或98%的細(xì)胞是羊膜來源的貼壁細(xì)胞，其表達(dá) CD49d、連接蛋白-43、HLA-ABC, β 2-微球蛋白、CD349、CD318、PDLU CD106、半乳凝素-1、 ADAM 17前體(Α脫整聯(lián)蛋白及金屬蛋白酶域17) (TNF-α轉(zhuǎn)化酶)(TNF-α轉(zhuǎn)化酶)、血管緊張肽原前體、細(xì)絲蛋白Α( α -細(xì)絲蛋白)(細(xì)絲蛋白1)(內(nèi)皮肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白)(ΑΒΡ480) (非肌肉細(xì)絲蛋白)、α-輔肌動(dòng)蛋白1 (α-輔肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架亞型)(非肌肉α-輔肌動(dòng)蛋白1) (F-肌動(dòng)蛋白交聯(lián)蛋白)、低密度脂蛋白受體相關(guān)的蛋白2前體(巨蛋白)(糖蛋白330) (gp330)、1和II型巨噬細(xì)胞清道夫受體(巨噬細(xì)胞乙酰化的LDL受體I和II)、活化素受體IIB型前體(ACTR-IIB)、ffnt-9蛋白、膠質(zhì)原纖維酸性蛋白、星形細(xì)胞(GFAP)、肌凝蛋白結(jié)合的蛋白C、心-型(心MyBP-C) (C-蛋白、心肌亞型)、和/或肌球蛋白重鏈、非肌肉A型(細(xì)胞肌球蛋白重鏈，A型)(非肌肉肌球蛋白重鏈-A) (NMMHC-A)。在此提供的羊膜來源的貼壁細(xì)胞進(jìn)一步在例如內(nèi)皮細(xì)胞、內(nèi)皮祖細(xì)胞等細(xì)胞內(nèi)分泌促進(jìn)血管生成的蛋白。在某些實(shí)施方式中，羊膜來源的貼壁細(xì)胞、羊膜來源的貼壁細(xì)胞群、或含有羊膜來源的貼壁細(xì)胞的細(xì)胞群，例如，其中所述分離的細(xì)胞群中至少約50%、60%、70%、80%、90%、95%或98%的細(xì)胞是羊膜來源的貼壁細(xì)胞，向例如細(xì)胞或細(xì)胞群生長的培養(yǎng)基中分泌VEGF、HGF、11^-8、]\03-3、卩6卩2、卵泡抑素、6氣5卩』6卩3離-78、61 0、IL-6、 MCP-l、PDGF-BB、TIMP-2、uPAR、半乳凝素-1中的一種或多種或全部。在另一個(gè)實(shí)施方式中，任何上述含有羊膜來源的貼壁細(xì)胞的細(xì)胞群能夠?qū)е略谂c所述羊膜來源的貼壁細(xì)胞接觸的內(nèi)皮細(xì)胞群中形成芽或管樣結(jié)構(gòu)。在一個(gè)具體的實(shí)施方式中，例如在諸如I和IV型的膠原蛋白，和/或諸如血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、上皮生長因子 (EGF)、血小板衍生的生長因子(PDGF)或堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)胞外基質(zhì)蛋白等血管生成因子的存在下，例如，在例如胎盤膠原蛋白的基質(zhì)內(nèi)或基質(zhì)上或MATRIGEL 中培養(yǎng)至少4天和/或多至14天后，羊膜來源的血管生成細(xì)胞與人內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行共培養(yǎng)形成芽或管樣結(jié)構(gòu)或支撐內(nèi)皮細(xì)胞出芽。在另一個(gè)實(shí)施方式中，任何上述含有羊膜來源的貼壁細(xì)胞的細(xì)胞群在諸如膠原蛋白I和IV型的胞外基質(zhì)蛋白存在下，在例如胎盤膠原蛋白的基質(zhì)內(nèi)或基質(zhì)上或MATRIGEL 中培養(yǎng)時(shí)，分泌諸如血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、上皮生長因子(EGF)、血小板衍生的生長因子(PDGF)、堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)、或白細(xì)胞介素-8(IL-8)等血管生成因子，并從而能夠誘導(dǎo)人內(nèi)皮細(xì)胞形成芽或管樣結(jié)構(gòu)。在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了一種細(xì)胞群，例如，羊膜來源的貼壁細(xì)胞群； 或一種細(xì)胞群，其中所述分離的細(xì)胞群中至少約50 %、60 %、70 %、80 %、90 %、95 %或98 % 的細(xì)胞是羊膜來源的貼壁細(xì)胞，其表達(dá)血管生成的微RNA(miRNA)的水平高于骨髓來源的間質(zhì)干細(xì)胞，其中所述 miRNA 包括 miR-17-3p、miR_18a、miR_18b、miR_19b、miR-92、和 / 或miR496中的一種或更多或全部。在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了一種細(xì)胞群，例如，羊膜來源的貼壁細(xì)胞群；或一種細(xì)胞群，其中所述分離的細(xì)胞群中至少約50%、60%、 70^^80%,90^^95%或98%的細(xì)胞是羊膜來源的貼壁細(xì)胞，其表達(dá)一種或更多或全部血管生成微RNA(miRNA)的水平低于骨髓來源的間質(zhì)干細(xì)胞，其中所述miRNA包括miR-20a、 miR-20b、miR-221、miR-222、miR_15b、和/或miR-16中的一種或更多或全部。在某些實(shí)施方式中，AMDAC或AMDAC群體表達(dá)一種或多種或全部的血管生成miRNA :miR-17_3p、 miR-18a、miR_18b、miR_19b、miR-92、miR_20a、miR_20b、(血管生成 miRNA 簇 17-92 的成員)、miR-296、miR-221、miR-222、miR-15b、和 / 或 miR-16。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了一種分離的羊膜來源的貼壁細(xì)胞，其中所述細(xì)胞附著于組織培養(yǎng)塑料，且其中所述細(xì)胞經(jīng)RT-PCR測定是0CT-4_，和經(jīng)免疫定位測定是 ⑶49f+、HLA-G—、⑶90+、⑶105+、和⑶117—，且其中所述細(xì)胞(a)經(jīng)免疫定位測定表達(dá)⑶9、 CD10、CD44、CD54、CD98、CD200、Tie_2、TEM-7、VEGFRl/Flt-1、或 VEGFR2/KDR(CD309)中的一種或多種；(b)經(jīng)免疫定位測定不表達(dá)⑶31、⑶34、⑶38、⑶45、⑶133、⑶143、⑶144、 CD146, CD271、CXCR4、HLA-G、或VE-鈣粘蛋白，或經(jīng)RT-PCR測定不表達(dá)S0X2 ； (c)表達(dá)以下的 mRNA :ACTA2、ADAMTS1、AMOT、ANG、ANGPTl、ANGPT2、ANGPTL1、ANGPTL2、ANGPTL4、BAI1、 CD44、CD200、CEACAM1、CHGA, C0L15A1、C0L18A1、C0L4A1、C0L4A2、C0L4A3、CSF3、CTGF, CXCLl2, CXCL2、DNMT3B、ECGFl、EDGl、EDIL3、ENPP2、EPHB2、FBLN5、F2、FGFl、FGF2、FIGF, FLT4、FN1、FST、F0XC2、GRN、HGF、HEY1、HSPG2、IFNB1、IL8、IL12A、ITGA4、ITGAV、ITGB3、MDK、 MMP2、MY0Z2、NRP1、NRP2、PDGFB, PDGFRA, PDGFRB, PECAMl、PF4、PGKl、PROXl、PTN、SEMA3F、 SERPINB5、SERPINC1、SERPINF1、TIMP2、TIMP3、TGFA、TGFBl、THBSl、THBS2、TIEl、TIE2/TEK、TNF、TNNIU TNFSFl5, VASHU VEGF, VEGFB, VEGFC, VEGFR1/FLT1、或 VEGFR2/KDR ； (d)表達(dá)蛋白質(zhì) CD49d、連接蛋白-43、HLA-ABC, β 2-微球蛋白、CD!M9、CD318、PDLl、CD106、半乳凝素-1、ADAM 17、血管緊張肽原前體、細(xì)絲蛋白Α、α-輔肌動(dòng)蛋白1、巨蛋白、巨噬細(xì)胞乙酰化的LDL受體I和II、活化素受體IIB型前體、ffnt-9蛋白、膠質(zhì)原纖維酸性蛋白、星形細(xì)胞、 肌凝蛋白結(jié)合的蛋白C、或肌球蛋白重鏈，非肌肉A型中的一種或多種；(e)分泌VEGF、HGF、 IL-8、MCP-3、FGF2、卵泡抑素、G-CSF、EGF、ENA-78、GRO、IL-6、MCP-1、PDGF-BB、TIMP-2、uPAR、 或半乳凝素-1至細(xì)胞生長的培養(yǎng)基中；(f)表達(dá)微RNA :miR-17-3p、miR-18a、miR_18b、 miR-19b、miR-92、或miR496的水平高于數(shù)量相當(dāng)?shù)墓撬鑱碓吹拈g質(zhì)干細(xì)胞；(g)表達(dá)微 RNA :miR-20a、miR_20b、miR-221、miR-222、miR_15b、或 miR-16 的水平低于數(shù)量相當(dāng)?shù)墓撬鑱碓吹拈g質(zhì)干細(xì)胞；(h)表達(dá) miRNA :miR-17-3p、miR_18a、miR_18b、miR_19b、miR-92、 miR-20a、miR-20b、miRj96、miR-221、miR-222、miR-15b、或 miR-16 ；和 / 或(i)較之在 21% O2下表達(dá)CD202b、IL-8或VEGF而言，當(dāng)培養(yǎng)于低于約5 %仏時(shí)表達(dá)增加水平的CD202b、I L-8 或VEGF。在一個(gè)具體的實(shí)施方式中，分離的羊膜來源的貼壁細(xì)胞經(jīng)RT-PCR測定是0CT_4_， 和經(jīng)免疫定位測定是⑶49f+、HLA-G_、⑶90+、⑶105+、和⑶117—，和(a)經(jīng)免疫定位測定表達(dá) CD9、CD10、CD44、CD54、CD90、CD98、CD200、Tie_2、TEM-7、VEGFRl/Flt-1、和 / 或 VEGFR2/ KDR(CD309) ； (b)經(jīng)免疫定位測定不表達(dá) CD31、CD34、CD38、CD45、CD133、CD143、CD144、 CD146、CD271、CXCR4、HLA-G, Ρ / 或 VE-鈣粘蛋白，或經(jīng) RT-PCR 測定不表達(dá) S0X2 ； (c)表達(dá)以下的 mRNA :ACTA2、ADAMTSU AMOT, ANG、ANGPT1、ANGPT2、ANGPTL1、ANGPTL2、ANGPTL4、 BAIU CD44、CD200、CEACAM1、CHGA、COL15A1、COL18A1、C0L4A1、C0L4A2、C0L4A3、CSF3、CTGF、 CXCLl2, CXCL2、DNMT3B、ECGFl、EDGl、EDIL3、ENPP2、EPHB2、FBLN5、F2、FGFl、FGF2、FIGF, FLT4、FN1、FST、F0XC2、GRN、HGF、HEY1、HSPG2、IFNB1、IL8、IL12A、ITGA4、ITGAV、ITGB3、MDK、 MMP2、MY0Z2、NRP1、NRP2、PDGFB, PDGFRA, PDGFRB, PECAMl、PF4、PGKl、PROXl、PTN、SEMA3F、 SERPINB5、SERPINC1、SERPINF1、TIMP2、TIMP3、TGFA、TGFBl、THBSl、THBS2、TIEl、TIE2/TEK、 TNF、TNNIl、TNFSF15、VASHl、VEGF、VEGFB、VEGFC、VEGFR1/FLT1、和 / 或 VEGFR2/KDR；(d)表達(dá) CD49d、連接蛋白-43、HLA-ABC、β 2-微球蛋白、0)349、0)318、卩01^1、0)106、半乳凝素-1、 ADAM 17、血管緊張肽原前體、細(xì)絲蛋白Α、α-輔肌動(dòng)蛋白1、巨蛋白、巨噬細(xì)胞乙酰化的LDL 受體I和II、活化素受體IIB型前體、ffnt-9蛋白、膠質(zhì)原纖維酸性蛋白、星形細(xì)胞、肌凝蛋白結(jié)合的蛋白C、和/或肌球蛋白重鏈，非肌肉A型中的一種或多種；(e)分泌VEGF、HGF、 I L-8、MCP-3、FGF2、卵泡抑素、G-CSF、EGF、ENA-78、GRO、I L-6、MCP-1、PDGF-BB、TIMP-2、uPAR、 和/或半乳凝素-1，例如至細(xì)胞生長的培養(yǎng)基中；(f)表達(dá)微RNA:miR-17-3p、miR-18a、 miR-18b、miR-19b、miR-92、和/或miR496的水平高于數(shù)量相當(dāng)?shù)墓撬鑱碓吹拈g質(zhì)干細(xì)胞；(g)表達(dá)微 RNA :miR-20a、miR-20b、miR-221、miR-222、miR-15b、和 / 或 miR-16 的水平低于數(shù)量相當(dāng)?shù)墓撬鑱碓吹拈g質(zhì)干細(xì)胞；(h)表達(dá)miRNA :miR-17-3p、miR-18a、miR_18b、 miR-19b、miR-92、miR-20a、miR-20b、miR-296、miR-221、miR-222、miR-15b、和 / 或 miR-16 ； 和/或(i)較之在21% O2下表達(dá)⑶202b、IL-8或VEGF而言，當(dāng)培養(yǎng)于低于約5% O2時(shí)表達(dá)增加水平的⑶202b、IL-8或VEGF。進(jìn)一步本發(fā)明提供了包含AMDAC的細(xì)胞群，例如AMDAC 群體，其具有一種或多種的上述特性。 在另一個(gè)實(shí)施方式中，任何上述含有羊膜來源的貼壁細(xì)胞的細(xì)胞群分泌血管生成因子。在具體的實(shí)施方式中，細(xì)胞群分泌血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、上皮生長因子(EGF)、血小板衍生的生長因子(PDGF)、堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)、和/或白細(xì)胞介素-8(IL-8)。在其它具體的實(shí)施方式中，含有羊膜來源的血管生成細(xì)胞的細(xì)胞群分泌一種或更多血管生成因子，從而誘導(dǎo)人內(nèi)皮細(xì)胞在體外創(chuàng)傷愈合分析中進(jìn)行遷移。在其它具體的實(shí)施方式中，含有羊膜來源的貼壁細(xì)胞的細(xì)胞群誘導(dǎo)人內(nèi)皮細(xì)胞、內(nèi)皮祖細(xì)胞、肌細(xì)胞或成肌細(xì)胞的成熟、分化或增殖。在另一個(gè)實(shí)施方式中，任何上述含有羊膜來源的貼壁細(xì)胞的細(xì)胞群在諸如膠原蛋白I和IV型的胞外基質(zhì)蛋白和/或一種或更多諸如VEGF、EGF、PDGF或bFGF等血管生成因子存在下，在例如胎盤膠原蛋白或MATRIGEL 的基質(zhì)上培養(yǎng)時(shí)，吸收乙?；兔苤鞍?(LDL)。在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了一種含有羊膜來源的貼壁細(xì)胞的細(xì)胞群，其中所述細(xì)胞附著于組織培養(yǎng)塑料，且其中所述細(xì)胞經(jīng)RT-PCR測定是0CT-4_，和經(jīng)免疫定位測定是VEGFR2/KDR+、CD9+、CM4+、CD105+、CD200+、或VE-鈣粘蛋白\在具體的實(shí)施方式中，在所述細(xì)胞群中至少 10%,20%,30%,40%,50%,60%,70%,80%,90%,95%,98%^； 99%的細(xì)胞是羊膜來源的細(xì)胞，其經(jīng)RT-PCR測定為0CT-4—，和經(jīng)免疫定位測定為VEGFR2/ KDR+、⑶9+、⑶M+、⑶105+、⑶200+、或VE-鈣粘蛋白_。在另一個(gè)具體的實(shí)施方式中，所述群體中的細(xì)胞中至少 10%,20%,30%,40%,50%,60%,70%,80%,90%,95%,98%^； 99% 是羊膜來源的細(xì)胞，其經(jīng)RT-PCR測定為0CT-4—，和經(jīng)免疫定位測定為VEGFR2/KDR+、CD9+、 ⑶M+、⑶105+、⑶200+、和VE-鈣粘蛋白-。在另一個(gè)具體的實(shí)施方式中，所述經(jīng)RT-PCR測定是OCT-f和經(jīng)免疫定位測定是VEGFR2/KDR+、CD9+、CM4+、CD105+、CD200+、或VE-鈣粘蛋白^的細(xì)胞，在暴露于Ι-lOOng/mL的VEGF下4_21天后經(jīng)免疫定位測定不表達(dá)⑶34。在另一個(gè)具體的實(shí)施方式中，所述細(xì)胞還為VE-鈣粘蛋白_。在此提供的細(xì)胞群，包含羊膜來源的貼壁細(xì)胞，能夠形成芽或管樣結(jié)構(gòu)，類似于血管或脈管。在一個(gè)實(shí)施方式中，在諸如VEGF，EGF，PDGF或bFGF的血管生成部分(moiety)存在下培養(yǎng)時(shí)，含有羊膜來源的貼壁細(xì)胞的細(xì)胞群形成芽或管樣結(jié)構(gòu)。在一個(gè)更加具體的實(shí)施方式中，所述經(jīng)RT-PCR測定0CT-4-和經(jīng)免疫定位測定VEGFR2/KDR+、CD9+、CM4+、CD105+、 CD200+、或VE-鈣粘蛋白_的羊膜來源的細(xì)胞，當(dāng)所述細(xì)胞群在血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)存在下培養(yǎng)時(shí)形成芽或管樣結(jié)構(gòu)。在此描述的羊膜來源的貼壁細(xì)胞在原代培養(yǎng)或在適合干細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基中增殖的過程中表現(xiàn)出上述特性，例如，細(xì)胞表面標(biāo)記和/或基因表達(dá)譜，和/或血管生成能力和功能的組合。所述培養(yǎng)基包括，例如，含有1-100% DMEM-LG(Gibco)、1-100% MCDB-201 (Sigma)、1-10% 胎牛血清(FCS) (Hyclone Laboratories) ,0. 1-5 X 胰島素-轉(zhuǎn)鐵因子-硒補(bǔ)充劑(ITS，Sigma)、0. 1-5X亞油酸-牛血清白蛋白(LA-BSA，Sigma)、KT5-Kr15M 地塞米松(Sigma)、KT2-KTkiM抗壞血酸2-磷酸鹽(Sigma)、l-50ng/mL表皮生長因子(EGF) (R&D SYSTEMS)、l-50ng/mL 血小板衍生的生長因子(PDGF-BB) (R&D SYSTEMS)、和 100U 青霉素/1000U鏈霉素的培養(yǎng)基。在一個(gè)具體的實(shí)施方式中，培養(yǎng)基含有60% DMEM-LG(Gibco)、 40% MCDB-201(Sigma)、2%胎牛血清(FCS) (Hyclone Laboratories) U X 胰島素-轉(zhuǎn)鐵因子-硒補(bǔ)充劑(ITS)UX亞油酸牛血清白蛋白(LA-BSA)UO-i3M地塞米松(Sigma)、抗壞血酸2-磷酸鹽(Sigma)、表皮生長因子(EGF) lOng/ml (R&D SYSTEMS)、血小板衍生的生長因子(PDGF-BB) 10ng/ml (R&D SYSTEMS)、和100U青霉素/1000U鏈霉素。其它合適的培養(yǎng)基
20如下詳述。在此提供的分離的羊膜來源的貼壁細(xì)胞群可以例如在一個(gè)容器中包含約、至少約、或不多于約 1X105、5X105、1X106、5X106、1X107、5X107、1X108、5X108、1X109、 δΧΚΛ ΧΙΟ δΧΙΟ ΧΙΟ11或更多羊膜來源的貼壁細(xì)胞。在不同的實(shí)施方式中，在此提供的分離的細(xì)胞群中至少 10%,20%,30%,40%,50%,60%,70%,80%,90%,95%, ^ 99%的細(xì)胞為羊膜來源的貼壁細(xì)胞。即，分離的羊膜來源的貼壁細(xì)胞群可以包括，例如，多達(dá) 1%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90% 的非干細(xì)胞。在此提供的羊膜來源的貼壁細(xì)胞可在基質(zhì)上培養(yǎng)。在不同的實(shí)施方式中，該基質(zhì)可以是任何表面，其上可以進(jìn)行羊膜來源的貼壁細(xì)胞的培養(yǎng)和/或篩選。一般，該基質(zhì)是塑料，例如，組織培養(yǎng)皿或多孔板塑料?？墒褂蒙锓肿踊蚝铣赡M試劑對(duì)組織培養(yǎng)塑料進(jìn)行處理、包被或印跡，例如，CELLTART 、MESENCULT ACF-底物、鳥氨酸、或聚賴氨酸，或胞外基質(zhì)蛋白，例如，膠原蛋白、層粘連蛋白、纖維粘連蛋白、玻璃體粘連蛋白等。羊膜來源的細(xì)胞，例如，在此提供的羊膜來源的貼壁細(xì)胞及該細(xì)胞群，可以分離自一種或更多的胎盤。例如，在此提供的分離的羊膜來源的細(xì)胞群可以是胎盤細(xì)胞群，包含那些來自于或包含于破碎的羊膜組織的細(xì)胞，例如，組織消化物(即，通過酶促消化羊膜收集細(xì)胞)，其中所述細(xì)胞群富集了羊膜來源的細(xì)胞，且其中組織來自于單一胎盤或來自兩個(gè)或更多胎盤。分離的羊膜來源的細(xì)胞可被培養(yǎng)和擴(kuò)增以產(chǎn)生所述細(xì)胞群。含有羊膜來源的貼壁細(xì)胞的胎盤細(xì)胞群也可被培養(yǎng)和擴(kuò)增以產(chǎn)生羊膜來源的貼壁細(xì)胞群。在某些實(shí)施方式中，展示任何上述標(biāo)記和/或基因表達(dá)特性的AMDAC已被傳代至少 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20次，或更多。在某些其它的實(shí)施方式中，展示任何上述標(biāo)記和/或基因表達(dá)特性的AMDAC已在培養(yǎng)物中傳代至少1、2、 3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、 31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49 或至少 50 次，或更多。5. 2含有其它細(xì)胞類型的羊膜來源的貼壁細(xì)胞群含有在此描述的羊膜來源的貼壁細(xì)胞的分離的細(xì)胞群可以包含第二種細(xì)胞類型， 例如，不是羊膜來源的貼壁細(xì)胞的胎盤細(xì)胞，或者，例如，不是胎盤細(xì)胞的細(xì)胞。例如，分離的羊膜來源的貼壁細(xì)胞群可以包含，例如，可以與第二種細(xì)胞類型的群體組合，其中所述第二種細(xì)胞類型為，例如，胚胎干細(xì)胞；血細(xì)胞(例如，胎盤血、胎盤血細(xì)胞、臍帶血、臍帶血細(xì)胞、周邊血、周邊血細(xì)胞，來自胎盤血、臍帶血、或周邊血的有核細(xì)胞、等等)；分離自血液的干細(xì)胞(例如，分離自胎盤血、臍帶血或周邊血的干細(xì)胞)；胎盤干細(xì)胞(例如，描述于美國專利號(hào)7，468，276和美國專利申請(qǐng)公布號(hào)2007/0275362的胎盤干細(xì)胞，其公開內(nèi)容全文引入作為參考)；來自胎盤灌流液的有核細(xì)胞，例如，來自胎盤灌流液的總有核細(xì)胞；臍帶血干細(xì)胞；血液來源的有核細(xì)胞群；骨髓來源的間質(zhì)細(xì)胞；骨髓來源的間質(zhì)干細(xì)胞；骨髓來源的造血干細(xì)胞；粗骨髓；成體(體)干細(xì)胞；組織中包含的干細(xì)胞群；培養(yǎng)的細(xì)胞，例如，培養(yǎng)的干細(xì)胞；全分化細(xì)胞群(例如，軟骨細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、羊膜細(xì)胞、格根包爾氏細(xì)胞、肌細(xì)胞、心肌細(xì)胞，等)；周邊細(xì)胞，等等。在一個(gè)具體的實(shí)施方式中，含有羊膜來源的貼壁細(xì)胞的細(xì)胞群包含胎盤干細(xì)胞或來自臍帶血的干細(xì)胞。在某些實(shí)施方式中，第二種細(xì)胞類型是血液或血細(xì)胞，其中紅細(xì)胞已經(jīng)從細(xì)胞群中移除。在一個(gè)具體的實(shí)施方式中，第二種細(xì)胞類型是造血干細(xì)胞。該造血干細(xì)胞可以是存在于，例如，未加工的胎盤、臍帶血或周邊血中；來自胎盤血、臍帶血或周邊血的總有核細(xì)胞中；分離自胎盤血、臍帶血或周邊血的CD34+細(xì)胞群中；未加工的骨髓中；來自骨髓的總有核細(xì)胞中；分離自骨髓CD34+細(xì)胞群中，等。在另一個(gè)實(shí)施方式中，分離的羊膜來源的貼壁細(xì)胞群與來自血管系統(tǒng)的多個(gè)成體細(xì)胞或祖細(xì)胞組合。在不同的實(shí)施方式中，所述細(xì)胞為內(nèi)皮細(xì)胞、內(nèi)皮祖細(xì)胞、肌細(xì)胞、成心肌細(xì)胞、周邊細(xì)胞、成血管細(xì)胞、成肌細(xì)胞或心成肌細(xì)胞。在另一個(gè)實(shí)施方式中，第二種細(xì)胞類型為培養(yǎng)中經(jīng)處理的非胚胎細(xì)胞類型，以表達(dá)與胚胎干細(xì)胞相關(guān)的多能性和功能標(biāo)記。在上述分離的羊膜來源的貼壁細(xì)胞群的具體的實(shí)施方式中，羊膜來源的貼壁細(xì)胞和第二種類型的細(xì)胞的其一或全部對(duì)于細(xì)胞的預(yù)定接受者而言為自體同源的或?yàn)楫愒吹?。在此進(jìn)一步提供了一種組合物，其包含羊膜來源的貼壁細(xì)胞和除羊膜來源的貼壁細(xì)胞外的多種干細(xì)胞。在一個(gè)具體的實(shí)施方式中，所述組合物包含一種干細(xì)胞，其來自胎盤，即，胎盤干細(xì)胞，例如，描述于美國專利號(hào)7, 045, 148,7, 255，879、和7，311，905 ；和美國專利申請(qǐng)公布號(hào)2007/0275362的胎盤干細(xì)胞，任何上述文獻(xiàn)公開的內(nèi)容在此全文引入作為參考。在具體的實(shí)施方式中，所述胎盤干細(xì)胞是⑶200+和HLA-G+；⑶73+、⑶105+和⑶200+； ⑶200+和0CT-4+ ；⑶73+、⑶105+和HLA-G+ ；⑶73+和⑶105+，并且，當(dāng)所述群體在允許形成擬胚體的條件下培養(yǎng)時(shí)有利于在含有所述干細(xì)胞的胎盤細(xì)胞群中形成一種或更多擬胚體；或 0CT-4+，并且，當(dāng)所述群體在允許形成擬胚體的條件下培養(yǎng)時(shí)有利于在含有所述干細(xì)胞的胎盤細(xì)胞群中形成一種或更多擬胚體；或其任意組合。在一個(gè)更加具體的實(shí)施方式中，所述 CD200+、HLA-G+干細(xì)胞是CD;34\CD38\CD45\CD73+和CD 105+。在另一個(gè)更具體的實(shí)施方式中，所述⑶73+、⑶105+和⑶200+干細(xì)胞是⑶;⑶38\⑶和HLA-G+。在另一個(gè)更具體的實(shí)施方式中，所述 CD200+、0CT-4+ 干細(xì)胞是 CD34\ CD38\ CD45\ CD73+、CD105+ 和 HLA-G+。 在另一個(gè)更具體的實(shí)施方式中，所述⑶73+、⑶105+和HLA-G+干細(xì)胞是⑶34\⑶45\ 0CT-4+ 和⑶200+。在另一個(gè)更具體的實(shí)施方式中，所述⑶73+和⑶105+干細(xì)胞是0CT-4+、⑶34_、 CD38-和CD45-。在另一個(gè)更具體的實(shí)施方式中，所述0CT-4+干細(xì)胞是CD73+、CD105+、CD200+、 ⑶34_、⑶38_、和⑶45_。在另一個(gè)更具體的實(shí)施方式中，胎盤干細(xì)胞是來源于母親的(即，具有母親的基因型)。在另一個(gè)更具體的實(shí)施方式中，胎盤干細(xì)胞是來源于父親的(即，具有父親的基因型)。在另一個(gè)具體的實(shí)施方式中，所述組合物包含羊膜來源的貼壁細(xì)胞和胚胎干細(xì)胞。在另一個(gè)具體的實(shí)施方式中，組合物包含羊膜來源的貼壁細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞或干細(xì)胞，例如，骨髓來源的間質(zhì)細(xì)胞或干細(xì)胞。在另一個(gè)具體的實(shí)施方式中，組合物包含骨髓來源的造血干細(xì)胞。在另一個(gè)具體的實(shí)施方式中，組合物包含羊膜來源的貼壁細(xì)胞和造血祖細(xì)胞，例如，來自骨髓、胎血、臍帶血、胎盤血、和/或周邊血的造血祖細(xì)胞。在另一個(gè)具體的實(shí)施方式中，組合物包含羊膜來源的貼壁細(xì)胞和體干細(xì)胞。在一個(gè)更加具體的實(shí)施方式中，所述體干細(xì)胞是神經(jīng)干細(xì)胞、肝干細(xì)胞、胰干細(xì)胞、內(nèi)皮干細(xì)胞、心干細(xì)胞、或肌肉干細(xì)胞。在其它具體的實(shí)施方式中，所述第二種細(xì)胞類型包括約、至少、或不多于10%、 15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、或50%的所述群體中的細(xì)胞。在其它具體的實(shí)施方式中，在所述組合物中的AMDAC包括至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85% 或90%的在所述組合物中的細(xì)胞。在其它具體的實(shí)施方式中，羊膜來源的貼壁細(xì)胞包括約、至少、或不多于10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、或45%的所述群體中的細(xì)胞。分離的羊膜來源的貼壁細(xì)胞群中的細(xì)胞可以與另一種類型的多個(gè)細(xì)胞進(jìn)行組合， 例如，與干細(xì)胞群組合，其與每個(gè)群體中的總有核細(xì)胞數(shù)量的比例為約100，000，000 1、 50, 000, 000 1,20, 000, 000 1,10,000,000 1,5, 000,000 1,2,000,000 1、 1，000，000 1,500,000 1,200,000 1,100,000 1,50,000 1,20,000 1、 10,000 1,5,000 1,2,000 1,1,000 1,500 1,200 UlOO 1、50 1、20 1、 10 1、5 1、2 1、1 1、1 2、1 5、1 10、1 100,1 200,1 500,1 1,000, 1 2, OOOU 5, OOOU 10，000、1 20，000、1 50，000、1 100，000、1 500，000、 1 1,000，000、1 2，000，000、1 5，000，000、1 10，000，000、1 20，000，000、 1 50，000，000、或約1 100，000，000。分離的羊膜來源的貼壁細(xì)胞群中的細(xì)胞也可以與多種類型的多個(gè)細(xì)胞進(jìn)行組合。5. 3生長培養(yǎng)對(duì)于任何哺乳動(dòng)物細(xì)胞而言，在此描述的羊膜來源的貼壁細(xì)胞的生長取決于選定用于生長的特殊培養(yǎng)基。在最優(yōu)選條件下，羊膜來源的貼壁細(xì)胞一般約M小時(shí)后數(shù)量倍增。在培養(yǎng)過程中，在此描述的羊膜來源的貼壁細(xì)胞附著于培養(yǎng)基質(zhì)，例如組織培養(yǎng)容器的表面(例如，組織培養(yǎng)皿塑料，纖維粘連蛋白-包被的塑料，等等)并形成單層。一般，細(xì)胞在羊膜消化后2-7天內(nèi)在培養(yǎng)中穩(wěn)定建立。其以每天約0. 4-1. 2個(gè)群體倍增的速度進(jìn)行增殖，并可以經(jīng)歷至少30-50次群體倍增。細(xì)胞在半滿(subconfluence)和擴(kuò)增狀態(tài)中表現(xiàn)為間質(zhì)/成纖維細(xì)胞樣表型，并在全滿(confluence)狀態(tài)表現(xiàn)為立方形/鵝卵石樣外觀， 且培養(yǎng)增殖是強(qiáng)接觸抑制的。在培養(yǎng)擴(kuò)增中羊膜來源的血管生成細(xì)胞群可以形成胚狀體。5. 4獲得羊膜來源的血管生成細(xì)胞的方法羊膜來源的貼壁細(xì)胞和含有羊膜來源的貼壁細(xì)胞的細(xì)胞群可通過以下方式制備， 例如，分離自其它細(xì)胞或細(xì)胞群，例如，通過特殊的方法消化羊膜組織，并且可選地對(duì)得到的細(xì)胞或細(xì)胞群進(jìn)行檢測判斷其是否存在標(biāo)記或標(biāo)記組合，羊膜來源的貼壁細(xì)胞的特性， 或通過獲得羊膜細(xì)胞并基于標(biāo)記選擇羊膜來源的貼壁細(xì)胞的特性。在此提供的羊膜來源的貼壁細(xì)胞和分離的含有羊膜來源的貼壁細(xì)胞的細(xì)胞群，可以通過例如消化羊膜組織并進(jìn)而選擇貼壁細(xì)胞來制備。在一個(gè)實(shí)施方式中，例如，分離的羊膜來源的貼壁細(xì)胞或分離的含有羊膜來源的貼壁細(xì)胞的細(xì)胞群，可通過以下步驟制備(1) 用第一種酶消化羊膜組織，從羊膜間質(zhì)層細(xì)胞上的羊膜表皮層解離細(xì)胞；( 然后用第二種酶消化羊膜間質(zhì)層形成單細(xì)胞懸液；C3)在例如組織培養(yǎng)塑料的組織培養(yǎng)表面上的所述單細(xì)胞懸液中培養(yǎng)細(xì)胞；以及(4)篩選在更換培養(yǎng)基后附著于所述表面的細(xì)胞，從而制備分離的含有羊膜來源的貼壁細(xì)胞的細(xì)胞群。在一個(gè)具體的實(shí)施方式中，所述第一種酶是胰蛋白酶。在一個(gè)更加具體的實(shí)施方式中，所述胰蛋白酶使用濃度為0. 25%胰蛋白酶(w/v)， 用于5-20毫升，例如，10毫升溶液每克要消化的羊膜組織中。在另一個(gè)更具體的實(shí)施方式中，所述胰蛋白酶消化在37°C下進(jìn)行約15分鐘并重復(fù)多達(dá)3次。在另一個(gè)具體的實(shí)施方式中，所述第二種酶為膠原蛋白酶。在一個(gè)更加具體的實(shí)施方式中，所述膠原蛋白酶的使用濃度為50-500U/L，用于5mL每克要消化的羊膜組織。在另一個(gè)更具體的實(shí)施方式中，所述用膠原蛋白酶消化在37°C下進(jìn)行約45-60分鐘。在另一個(gè)具體的實(shí)施方式中，膠原蛋白酶消化后形成的單細(xì)胞懸液在步驟⑵和步驟⑶之間使用例如75 μ Μ-150 μ M濾器進(jìn)行過濾。在另一個(gè)具體的實(shí)施方式中，所述第一種酶是胰蛋白酶，且所述第二種酶是膠原蛋白酶。在另一個(gè)實(shí)施方式中，分離的含有羊膜來源的貼壁細(xì)胞的細(xì)胞群能夠通過從羊膜選擇細(xì)胞獲得，例如，通過本文其它部分描述的消化羊膜組織獲得細(xì)胞，其表現(xiàn)出一種或更多的羊膜來源的貼壁細(xì)胞特性。在一個(gè)實(shí)施方式中，例如，細(xì)胞群通過以下方法制備，包括選擇下述羊膜細(xì)胞(a)經(jīng)RT-PCR測定0CT-4呈陰性，和(b)經(jīng)免疫定位測定為VEGFR2/ KDR、⑶9、⑶54、⑶105、⑶200中的一種或多種呈陽性；以及從其它細(xì)胞中分離所述細(xì)胞形成細(xì)胞群。在一個(gè)具體的實(shí)施方式中，所述羊膜細(xì)胞還是VE-鈣粘蛋白_。在一個(gè)具體的實(shí)施方式中，細(xì)胞群通過選擇以下胎盤細(xì)胞制備(a)經(jīng)RT-PCR測定0CT-4呈陰性和經(jīng)免疫定位測定VE-鈣粘蛋白呈陰性，和(b)經(jīng)免疫定位測定VEGFR2/KDR、CD9、CM4、CD105、CD200 中的一種或多種呈陽性；以及從其它細(xì)胞中分離所述細(xì)胞形成細(xì)胞群。在某些實(shí)施方式中， 在通過RT-PCR進(jìn)行選擇之前通過免疫定位進(jìn)行選擇。在另一個(gè)具體的實(shí)施方式中，所述選擇包括選擇在1-lOOng/mL VEGF存在下培養(yǎng)4_21天后不表達(dá)細(xì)胞標(biāo)記⑶34的細(xì)胞。在另一個(gè)實(shí)施方式中，例如，細(xì)胞群通過以下方法制備，包括選擇附著于組織培養(yǎng)塑料并經(jīng)RT-PCR測定為0CT-4-、和經(jīng)免疫定位測定為VEGFRl/Flt-Γ和VEGFR2/KDR+的羊膜細(xì)胞，以及從其它細(xì)胞中分離所述細(xì)胞形成的細(xì)胞群。在一個(gè)具體的實(shí)施方式中，細(xì)胞群通過以下方法制備，其包括選擇經(jīng)RT-PCR測定為0CT-4—，和經(jīng)免疫定位測定為VEGFRl/ Flt-1+、VEGFR2/KDR+和HLA-G—的羊膜細(xì)胞。在另一個(gè)具體的實(shí)施方式中，所述細(xì)胞群通過以下方法制備，其中選擇經(jīng)免疫定位測定還為⑶9+、⑶10+、⑶44+、⑶M+、⑶98+、Tie-2+、 TEM-7+、CD3r、CD34\CD45\CD133\CD143\CD146-jP / 或 C)(CR4l 趨化因子(C-X-C 基序) 受體4)中的一種或多種或全部的羊膜細(xì)胞，并從沒有表現(xiàn)出一種或多種的這些特性的細(xì)胞中分離所述細(xì)胞。在另一個(gè)具體的實(shí)施方式中，所述細(xì)胞群通過選擇經(jīng)免疫定位測定還是VE-鈣粘蛋白的羊膜細(xì)胞，并從VE-鈣粘蛋白+的細(xì)胞中分離所述細(xì)胞進(jìn)行制備。在另一個(gè)具體的實(shí)施方式中，所述細(xì)胞群通過選擇經(jīng)免疫定位測定還是CD105+和CD200+的羊膜細(xì)胞，并從CD105—或CD200—的細(xì)胞中分離所述細(xì)胞。在另一個(gè)具體的實(shí)施方式中，所述細(xì)胞暴露于Ι-lOOng/mL的VEGF下4_21天后經(jīng)免疫定位測定不表達(dá)CD34。在細(xì)胞選擇中，沒有必要檢測整個(gè)細(xì)胞群的羊膜來源的貼壁細(xì)胞特性。相反，可以檢測細(xì)胞群的一種或更多的部分細(xì)胞(例如，約0. 5% -2% )的這些特性，并將結(jié)果用于計(jì)算群體中剩下的細(xì)胞。選擇的細(xì)胞可以通過下述方式被確認(rèn)為在此提供的羊膜來源的貼壁細(xì)胞在 VEGF(例如，約50ng/mL)存在下，在基質(zhì)例如MATRIGEL 上將細(xì)胞樣品(例如，約IO4至約 IO5細(xì)胞)培養(yǎng)4-14天，例如，7天，并肉眼觀察細(xì)胞出芽和/或細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)的出現(xiàn)。羊膜來源的貼壁細(xì)胞可使用細(xì)胞篩選領(lǐng)域已知的任何方法通過上述標(biāo)記進(jìn)行選擇。例如，貼壁細(xì)胞可以在例如流式細(xì)胞術(shù)或FACS免疫定位中使用針對(duì)一種或更多細(xì)胞表面標(biāo)記的抗體或多種抗體進(jìn)行篩選?？梢酝ㄟ^使用結(jié)合磁珠的抗體來進(jìn)行選擇。特異性針對(duì)某種標(biāo)記的抗體是本領(lǐng)域已知的并可通過商購獲得，例如，抗CD9 (Abeam)、CM4 (Abeam)、 CD105 (Abeam ；BioDesign International, Saco, ME,等)、CD200 (Abeam) _ Ifi _ 胃白 (SigmaAldrich)抗體?？蛊渌鼧?biāo)記的抗體也是可通過商購獲得的，例如，⑶34、⑶38和⑶45 可購自，例如，StemCell Technologies 或BioDesign International。適于 RT-PCR 的 0CT-4 序列的引物可購自，例如，Millipore或hvitrogen，或可以容易地衍生自GenBank登錄號(hào)DQ486513的人序列。獲得胎盤和羊膜組織的方法以及為獲得羊膜來源的貼壁細(xì)胞而對(duì)該組織進(jìn)行處理的詳細(xì)方法提供如下。5.4. 1細(xì)胞收集組合物一般地，可以從哺乳動(dòng)物胎盤的羊膜中獲得細(xì)胞，例如，人胎盤，其中使用生理可接受的溶液，例如，細(xì)胞收集組合物。優(yōu)選的，細(xì)胞收集組合物預(yù)防或抑制凋亡，預(yù)防或抑制細(xì)胞死亡、裂解、分解等等。細(xì)胞收集組合物詳細(xì)描述于相關(guān)的美國專利申請(qǐng)公布號(hào) 2007/0190042，標(biāo)題為 “Improved Medium for Collecting Placental Stem Cells and Preserving Organs, ”其公開內(nèi)容在此全文引入作為參考。細(xì)胞收集組合物可以包括任何適于收集和/或培養(yǎng)羊膜來源的貼壁細(xì)胞的生理可接受的溶液，例如，鹽溶液(例如，磷酸鹽緩沖鹽水、Kreb溶液、修飾的Kreb溶液、Eagle 溶液、0. 9% NaCl等)、培養(yǎng)基(例如，DMEM、H. DMEM等)，等等，其中添加或不添加緩沖成分， 例如，4-羥乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)。細(xì)胞收集組合物可以包含一種或更多保護(hù)細(xì)胞(例如，羊膜來源的貼壁細(xì)胞)的組分，即，從收集開始到培養(yǎng)的時(shí)間內(nèi)防止細(xì)胞死亡，或延遲細(xì)胞死亡，減少死亡的細(xì)胞群中的細(xì)胞數(shù)量，等。該組分可以是，例如，凋亡抑制劑(例如，半胱天冬酶抑制劑或JNK抑制劑)；血管擴(kuò)張劑(例如，硫酸鎂、抗高血壓藥、心房利鈉肽(ANP)、促腎上腺皮質(zhì)激素、促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素、硝普鈉、胼苯噠嗪、三磷酸腺苷、腺苷、吲哚美辛或硫酸鎂、磷酸二酯酶抑制劑等)；壞死抑制劑(例如，2-(1Η-吲哚-3-基)-3-戊胺-馬來酰亞胺、二硫代氨基甲酸吡咯烷或氯硝西泮)；TNF-α抑制劑；和/或攜氧全氟化碳(例如，全氟溴辛烷、全氟溴癸烷等)。細(xì)胞收集組合物可以包含一種或更多組織降解酶，例如，金屬蛋白酶、絲氨酸蛋白酶、中性蛋白酶、RNA酶、或DNA酶等。這些酶包括但不限于膠原蛋白酶(例如，膠原蛋白酶 I、II、III或IV，來自溶組織梭菌(Clostridium histolyticum)的膠原蛋白酶等) ’分散酶，嗜熱菌蛋白酶，彈性蛋白酶，胰蛋白酶，LIBERASE ，透明質(zhì)酸酶，等等。含有組織消化酶的細(xì)胞收集組合物的用途如下詳述。細(xì)胞收集組合物可以包含殺菌或抑菌有效量的抗生素。在一些非限制性的實(shí)施方式中，抗生素為大環(huán)內(nèi)酯類(例如，妥布霉素)、頭孢菌素(例如，頭孢氨芐、頭孢拉定、頭孢呋辛、頭孢丙烯、頭孢克洛、頭孢克肟或頭孢羥氨芐)、克拉霉素、紅霉素、青霉素(例如， 青霉素V)或喹諾酮(例如，氧氟沙星、環(huán)丙沙星或諾氟沙星)、四環(huán)素、鏈霉素等。在一個(gè)特殊的實(shí)施方式中，抗生素活性針對(duì)Gram(+)和/或Gram(-)細(xì)菌，例如，綠膿假單胞菌 (Pseudomonas aerugmosa) ^^^^111 ! (Staphylococcus aureus)，··。細(xì)胞收集組合物還可以包含一種或多種的下述化合物腺苷(約ImM至約50mM)； D-葡萄糖(約20mM至約IOOmM)；鎂離子(約ImM至約50mM)；分子量大于20，000道爾頓的大分子，在一個(gè)實(shí)施方式中，其含量足以維持內(nèi)皮完整性和細(xì)胞生存(例如，合成的或天然產(chǎn)生的膠體、多糖例如葡聚糖或聚乙二醇，含量約25g/l至約100g/l，或約40g/l至約60g/ 1)；抗氧化劑(例如，丁基羥基苯甲醚、丁基羥基甲苯、谷胱甘肽、維生素C或維生素E，含量為約25M至約100M)；還原劑(例如，N-乙酰半胱氨酸，含量為約0. ImM至約5mM)；防止鈣進(jìn)入細(xì)胞的試劑(例如，異搏定，含量為約2M至約25M)；硝化甘油(例如，約0. 05g/L至約0. 2g/L)；抗凝血?jiǎng)?，在一個(gè)實(shí)施方式中，其含量足以幫助防止殘血凝塊(例如，肝磷脂或水蛭素，含量為濃度約1000單位/1至約100，000單位/1)；或含氨氯吡脒化合物(例如，氨氯吡脒、乙基異丙基氨氯吡脒、六甲撐氨氯吡脒、二甲基氨氯吡脒或異丁基氨氯吡脈，含量為約1. OM至約5M)。在此描述的羊膜來源的貼壁細(xì)胞也可以在例如下述消化過程中以及消化后被收集到簡單的生理可接受緩沖液中，例如，磷酸鹽緩沖鹽水、0.9% NaCl溶液、細(xì)胞培養(yǎng)基，寸。5.4. 2收集和處理胎盤一般地，人胎盤在其出生后排出體內(nèi)的短時(shí)間內(nèi)或在例如剖腹產(chǎn)之后進(jìn)行收集。 在優(yōu)選的實(shí)施方式中，在對(duì)患者進(jìn)行知會(huì)同意并獲得該患者的完整病歷且與胎盤關(guān)聯(lián)后回收胎盤。優(yōu)選的，在分娩后繼續(xù)跟蹤病歷。該病歷可用于調(diào)整從中獲得的胎盤或細(xì)胞的后續(xù)應(yīng)用。例如，人胎盤細(xì)胞，例如，羊膜來源的貼壁細(xì)胞，可以按照病歷被用于嬰兒、或與胎盤有關(guān)的近親屬、或父母、兄弟姐妹或嬰兒的其它親屬的個(gè)體化用藥。在回收羊膜來源的貼壁細(xì)胞前移除臍帶血和胎盤血。在某些實(shí)施方式中，分娩后回收胎盤中的臍帶血。胎盤可被用于臍帶血常規(guī)回收過程。一般使用針或套管，在重力作用下給胎盤抽血(參見，例如，Anderson，美國專利號(hào)5，372，581 ；Hessel等人，美國專利號(hào)5，415，665)。針或套管通常置于臍帶靜脈，胎盤可以被輕柔的擠壓以幫助排空胎盤中的臍帶血。該臍帶血回收可以商業(yè)化地進(jìn)行，例如，Life Bank USA, Cedar Knolls, N.J.， ViaCord, Cord Blood Registry and Cryocell。優(yōu)選的，用重力排空胎盤而不進(jìn)行進(jìn)一步操作，從而使得臍帶血回收中的組織破壞得以最小化。一般地，將胎盤從分娩室或產(chǎn)房轉(zhuǎn)移到另一位置，例如，實(shí)驗(yàn)室中，用于通過例如灌注或組織解離來回收臍帶血并收集細(xì)胞。優(yōu)選的將胎盤轉(zhuǎn)移到無菌的、隔熱的轉(zhuǎn)移設(shè)備 (保持胎盤溫度20-28°C )中，例如，將胎盤與近端夾緊的臍帶血置于無菌拉鏈塑料袋中，后者接著被置于隔熱容器中。在另一個(gè)實(shí)施方式中，胎盤使用基本上按照描述于美國專利號(hào) 7，147，6 的臍帶血收集試劑盒進(jìn)行轉(zhuǎn)移。優(yōu)選的，胎盤在分娩后4-M小時(shí)轉(zhuǎn)移到實(shí)驗(yàn)室。 在某些實(shí)施方式中，優(yōu)選的在臍帶血回收前，在)臍帶插入胎盤的4-5cm厘米處夾緊近端臍帶。在其它實(shí)施方式中，在臍帶血回收后和進(jìn)一步處理胎盤之前，夾緊近端臍帶。在細(xì)胞收集之前可以將胎盤儲(chǔ)藏在無菌條件以及例如4-25°C (攝氏度)的溫度下，例如，室溫下。在灌注胎盤除去任何殘留的臍帶血之前，可以儲(chǔ)藏胎盤例如O-M小時(shí)、 高達(dá)48小時(shí)、或多于48小時(shí)。在一個(gè)實(shí)施方式中，在排出后約0小時(shí)至約2小時(shí)收獲胎盤。 胎盤可以在例如4-25°C (攝氏度)的溫度下儲(chǔ)藏于抗凝血?jiǎng)┤芤褐?。合適的抗凝血?jiǎng)┤芤菏潜绢I(lǐng)域熟知的。例如，可以使用檸檬酸鈉、肝磷脂或華法令鈉溶液。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，抗凝血?jiǎng)┤芤喊ǜ瘟字芤?例如，在1 1000溶液中l(wèi)%w/w)。優(yōu)選的抽血胎盤在收集細(xì)胞前儲(chǔ)藏不多于36小時(shí)。5. 4. 3羊膜組織的物理破碎和酶促消化在一個(gè)實(shí)施方式中，羊膜分離自剩余的胎盤，例如，通過鈍器解剖，例如，使用手指。在酶促消化和貼壁細(xì)胞回收之前可以將羊膜切成例如小塊或組織片段。羊膜來源的貼壁細(xì)胞可以獲得自完整羊膜，或來自羊膜的小塊部分，例如，面積為約1、2、3、4、5、6、7、8、9、 10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900 或約 1000 平方毫米的羊膜的部分。羊膜來源的貼壁細(xì)胞一般可以收集自胎盤羊膜或其部分，其可以在排出后約前3 天內(nèi)的任何時(shí)間進(jìn)行，但優(yōu)選排出后約0小時(shí)至48小時(shí)，或排出后約8小時(shí)至約18小時(shí)進(jìn)行。在一個(gè)實(shí)施方式中，通過使用一種或更多組織消化酶進(jìn)行酶促消化將羊膜來源的貼壁細(xì)胞自羊膜組織分離。羊膜或其部分可以使用例如一種或更多酶進(jìn)行消化，所述酶溶解或混合入如上所述的細(xì)胞收集組合物中。在某些實(shí)施方式中，細(xì)胞收集組合物包含一種或更多組織破壞性酶。酶促消化優(yōu)選使用酶的組合，例如，基質(zhì)金屬蛋白酶和中性蛋白酶的組合，例如，分散酶和膠原蛋白酶的組合，例如，相繼使用。當(dāng)使用多于一種蛋白酶時(shí)，所述蛋白酶可以同時(shí)使用或連續(xù)使用以消化羊膜組織。在一個(gè)實(shí)施方式中，例如，羊膜組織用胰蛋白酶消化3次，然后用膠原蛋白酶消化一次。在一個(gè)實(shí)施方式中，羊膜組織使用一種或多種的基質(zhì)金屬蛋白酶、中性蛋白酶和粘液分解酶進(jìn)行酶促消化。在一個(gè)具體的實(shí)施方式中，羊膜組織使用膠原蛋白酶、 分散酶和透明質(zhì)酸酶的組合進(jìn)行消化。在另一個(gè)具體的實(shí)施方式中，羊膜組織使用 LIBERASE (Boehringer MannheimCorp. , Indianapolis, Ind.)和透明質(zhì)酸酶的組合進(jìn)行消化。其它可用于破壞羊膜組織的酶包括木瓜蛋白酶，脫氧核糖核酸酶，絲氨酸蛋白酶，例如胰蛋白酶、糜蛋白酶或彈性蛋白酶。絲氨酸蛋白酶在血清中能夠被α2微球蛋白抑制，從而用于消化的培養(yǎng)基在某些實(shí)施方式中可以是無血清的。在某些其它的實(shí)施方式中，EDTA和 DNA酶被用于消化羊膜組織，例如，為了增加細(xì)胞回收效率。在某些其它的實(shí)施方式中，對(duì)消化物進(jìn)行稀釋從而避免細(xì)胞陷入粘性消化物中。一般組織消化酶的濃度包括，例如，50_200U/mL的膠原蛋白酶I和膠原蛋白酶IV、 1-lOU/mL的分散酶、和10-100U/mL的彈性蛋白酶。蛋白酶可以組合使用，即，在相同消化反應(yīng)中使用兩種或更多蛋白酶，或可以相繼使用以分離羊膜來源的貼壁細(xì)胞。例如，在一個(gè)實(shí)施方式中，羊膜組織或其部分首先使用合適量的胰蛋白酶在濃度約0. 25%、37°C下消化例如15分鐘，然后使用約1至約2mg/ml的膠原蛋白酶I消化例如45分鐘。在一個(gè)實(shí)施方式中，羊膜來源的貼壁細(xì)胞可以按照如下方式獲得。將羊膜切成 0. 1” XO. 1”至約5” X5”，例如2” X2”大小的碎片。通過三次如下胰蛋白酶消化將上皮單層從羊膜的胚胎側(cè)去除。將羊膜碎片置于裝有溫?zé)岬?例如，約20°C至約37°C)胰蛋白酶-EDTA溶液(0. 25% )的容器中。胰蛋白酶的體積可以是從約5mL每克羊膜至約5OmL每克羊膜。將容器振蕩約5分鐘至約30分鐘，例如，15分鐘，并保持溫度恒定。然后將羊膜碎片從胰蛋白酶溶液中分離，其中可以采用任何合適的方法，例如手工去除羊膜碎片，或通過過濾去除羊膜碎片。胰蛋白酶消化步驟可以重復(fù)至少一次以上。在胰蛋白酶消化最終結(jié)束后，將羊膜碎片放回裝有諸如磷酸鹽緩沖鹽水 (PBS)/10% FBS、PBS/5% FBS或PBS/3% FBS的溫?zé)岬囊鹊鞍酌钢泻腿芤旱娜萜髦?。將容器振蕩約5秒至約30分鐘，例如，5分鐘。然后將羊膜碎片從如上所述的胰蛋白酶中和溶液中進(jìn)行分離，并將羊膜碎片置于裝有溫?zé)岬腜H 7.2PBS的容器中。將容器振蕩約5秒至約 30分鐘，將羊膜碎片從如上所述PBS中進(jìn)行分離。然后將羊膜碎片置于裝有溫?zé)岬?例如，約20°C至約37°C )消化溶液的容器中。消化溶液的體積可以是從約5mL每克羊膜至約50mL每克羊膜。消化溶液包含在諸如DMEM 的合適培養(yǎng)基中的消化酶。典型的消化溶液包括I型膠原蛋白酶(約50U/mL至約500U/ mL) ； I型膠原蛋白酶(約50U/mL至約500U/mL)加分散酶(約5U/mL至約100U/mL)；以及 I型膠原蛋白酶(約50U/mL至約500U/mL)、分散酶(約2U/mL至約50U/mL)和透明質(zhì)酸酶(約3U/mL至約10U/mL)。將容器在37°C下振蕩，直至羊膜消化基本上完成(大約10分鐘至約90分鐘)。然后在容器中加入溫?zé)岬腜BS/5% FBS,比例為約ImL每克羊膜組織至約50mL每克羊膜組織。將容器振蕩約2分鐘至約5分鐘。然后用40 μ m-100 μ m濾器過濾細(xì)胞懸液去除任何未消化的組織。將細(xì)胞懸浮于溫?zé)岬腜BS (約ImL至約500mL)，然后在 200Xg至約400Xg下離心約5分鐘至約30分鐘，例如20°C下300Xg離心約15分鐘。離心后，去除上清液并將細(xì)胞重懸于合適的培養(yǎng)基。細(xì)胞懸液可以過濾(40μπι-70μπι濾器) 去除任何剩余的未消化組織，產(chǎn)生單一細(xì)胞懸液。在本實(shí)施方式中，將收集懸液中的細(xì)胞并按照本文其它部分所描述的方式培養(yǎng)， 以產(chǎn)生分離的羊膜來源的貼壁細(xì)胞及其細(xì)胞群。在本實(shí)施方式中，可以丟棄剩余的未消化羊膜?？梢酝ㄟ^例如離心進(jìn)行收集從羊膜組織釋放的細(xì)胞，并培養(yǎng)于標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞培養(yǎng)基中。在本文任一消化流程中，可以將消化獲得的細(xì)胞懸液進(jìn)行過濾，例如，通過含有從約50 μ m至約150 μ m,例如，從約75 μ m至約125 μ m的孔的濾器進(jìn)行過濾。在一個(gè)更加具體的實(shí)施方式中，細(xì)胞懸液可以通過兩個(gè)或更多濾器進(jìn)行過濾，例如，一個(gè)125 μ m濾器和一個(gè)75 μ m濾器。與在此描述的任何方法一起，可以在消化過程中通過選擇能夠表達(dá)一種或更多 AMDAC特性的細(xì)胞從釋放的細(xì)胞中分離AMDAC，如上述5. 1部分的描述。AMDAC也可以使用例如特別的兩步分離法進(jìn)行分離，其包括胰蛋白酶消化然后膠原蛋白酶消化。從而，在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種分離羊膜來源的貼壁細(xì)胞的方法，包括胰蛋白酶消化羊膜或其部分，從而從所述羊膜中釋放上皮細(xì)胞；從所述上皮細(xì)胞去除羊膜或其部分；進(jìn)一步用膠原蛋白酶消化羊膜或其部分，從而從所述羊膜或其部分中釋放羊膜來源的貼壁細(xì)胞；以及從所述羊膜中分離所述羊膜來源的貼壁細(xì)胞。在一個(gè)具體的實(shí)施方式中，羊膜或其部分的消化重復(fù)至少一次。在另一個(gè)具體的實(shí)施方式中，羊膜或其部分的膠原蛋白酶消化重復(fù)至少一次。在另一個(gè)具體的實(shí)施方式中，胰蛋白酶為約 0. 1%-1.0% (終濃度)。在一個(gè)更加具體的實(shí)施方式中，胰蛋白酶為約0. 25% (終濃度)。 在另一個(gè)具體的實(shí)施方式中，膠原蛋白酶為約50U/mL至約1000U/mL(終濃度)。在一個(gè)更加具體的實(shí)施方式中，膠原蛋白酶為約125U/mL(終濃度)。在另一個(gè)具體的實(shí)施方式中，分離方法還包括在細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述羊膜來源的貼壁細(xì)胞，并將所述培養(yǎng)物中的非貼壁細(xì)胞與所述羊膜來源的貼壁細(xì)胞進(jìn)行分離以產(chǎn)生富集羊膜來源的貼壁細(xì)胞的群體。在更加具體的實(shí)施方式中，所述富集羊膜來源的貼壁細(xì)胞群中至少50^^55^^60^^65^^70%, 75%、80%、85%、90%、95%、98%或99%的細(xì)胞為所述羊膜來源的貼壁細(xì)胞。在上述方法的一個(gè)更加具體的實(shí)施方式中，羊膜來源的貼壁細(xì)胞經(jīng)RT-PCR測定 0CT-4呈陰性和經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)測定為HLA-G+、⑶90+、⑶105+和⑶117—中的一種或多種。5. 4. 4羊膜來源的貼壁細(xì)胞的分離、分類和表征可以將細(xì)胞沉淀重懸于如上所述的新鮮細(xì)胞收集組合物中，或適于維持細(xì)胞的培養(yǎng)基中，例如，Dulbecco的改良Eagle培養(yǎng)基(DMEM) ；Iscove的改良Dulbecco培養(yǎng)基(IMDM)，例如含有2U/mL肝磷脂和2mMEDTA (GibcoBRL，NY)的IMDM無血清培養(yǎng)基；緩沖液 (例如PBS, HBSS)與FBS(例如2% ν/ν)混合物；等。在例如組織培養(yǎng)塑料表面培養(yǎng)的羊膜來源的貼壁細(xì)胞，無論其是否有額外的胞外基質(zhì)包被，例如纖維粘連蛋白，都可以通過差速貼壁法傳代或分離。例如，獲得按照上述 5. 4. 3節(jié)的描述用膠原蛋白酶消化的羊膜組織的細(xì)胞懸液，可以在組織培養(yǎng)塑料上的培養(yǎng)基中培養(yǎng)例如3-7天。培養(yǎng)過程中，懸液中的多個(gè)細(xì)胞附著于培養(yǎng)表面，且在連續(xù)培養(yǎng)后， 形成了羊膜來源的貼壁細(xì)胞。不形成羊膜來源貼壁細(xì)胞的非貼壁細(xì)胞在更換培養(yǎng)基時(shí)被去除。可以進(jìn)行監(jiān)控從羊膜中收集的細(xì)胞數(shù)量和類型，例如，通過使用諸如免疫定位的標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞檢測技術(shù)檢測細(xì)胞形態(tài)和表面標(biāo)記的變化來進(jìn)行監(jiān)控，其中檢測技術(shù)例如流式細(xì)胞術(shù)、細(xì)胞分選、免疫細(xì)胞化學(xué)(例如、組織特異性或細(xì)胞標(biāo)記特異性抗體染色)熒光激活細(xì)胞分選(FACS)、磁性激活細(xì)胞分選(MACS)、通過使用光學(xué)或共聚焦顯微鏡檢查細(xì)胞形態(tài)、和/或通過使用諸如PCR和基因表達(dá)譜等本領(lǐng)域熟知的技術(shù)檢測基因表達(dá)變化。這些技術(shù)也可以用于鑒定對(duì)于一種或更多特殊標(biāo)記呈陽性的細(xì)胞。例如，使用一種或更多⑶34抗體，人們可以使用上述技術(shù)以確定一種細(xì)胞是否包含可檢測量的CD34;如果是這樣的話， 那么細(xì)胞是⑶；34+。羊膜來源的細(xì)胞，例如，通過Ficoll分離、差速貼壁法或二者的組合分離的細(xì)胞可以使用熒光激活細(xì)胞分選儀(FACQ進(jìn)行分選。熒光激活細(xì)胞分選(FACQ是一種公知的分離顆粒的方法，包括分離細(xì)胞，其基于顆粒的熒光特性(參見，例如，Kamarch, 1987, Methods Enzymol,151 :150-165)。每個(gè)顆粒熒光部分的激光激發(fā)會(huì)導(dǎo)致微小的電荷，使得可以從混合物中進(jìn)行電磁分離陽性和陰性的顆粒。在一個(gè)實(shí)施方式中，細(xì)胞表面標(biāo)記特異性抗體或配體被標(biāo)記了不同的熒光標(biāo)簽。通過細(xì)胞分選儀處理細(xì)胞，從而允許基于細(xì)胞結(jié)合所用抗體的能力對(duì)細(xì)胞進(jìn)行分離。FACS分選的顆?？梢灾苯觾?chǔ)存至96-孔或384-孔板的各個(gè)孔內(nèi)，方便分離和克隆。在一個(gè)分選方案中，來自胎盤的細(xì)胞，例如，羊膜來源的貼壁細(xì)胞，可以基于標(biāo)記 CD49f、VEGFR2/KDR和/或Flt-1/VEGFRl的表達(dá)進(jìn)行分選。優(yōu)選的細(xì)胞鑒定為0CT-4—，例如， 通過RT-PCR檢測0CT-4在細(xì)胞樣品中的表達(dá)進(jìn)行鑒定，其中如果樣品中的細(xì)胞在30個(gè)循環(huán)后不能表現(xiàn)出可檢測的0CT-4的mRNA合成，則細(xì)胞是0CT_4_。例如，來自羊膜的VEGFR2/ KDR+ 和 VEGFRl/Flt-Γ 細(xì)胞可以從具有 VEGFR2/KDIT 和 VEGFR1/Flt-1+、CD9+、CD54+、CD105+、 CD200+和/或VE-鈣粘蛋白_中的一種或多種的細(xì)胞中進(jìn)行分選。在一個(gè)具體的實(shí)施方式中，將羊膜來源的具有 CD49f+、VEGFR2/KDR+、CD9+、CD54\ CD105+、CD200+ 和 / 或 VE-鈣粘蛋白-中的一種或多種的組織培養(yǎng)塑料貼壁細(xì)胞，或?qū)EGFR2/KDR+、⑶9+、⑶M+、⑶105+、 CD200+和VE-鈣粘蛋白_細(xì)胞，從不表達(dá)一種或多種這些標(biāo)記的細(xì)胞中進(jìn)行分選并選擇。在另一個(gè)具體的實(shí)施方式中，將另外為CD31+、CD34\ CD45\ CD 133"和/或Tie_2+的CD49f\ VEGFR2/KDR+、VEGFRl/Flt-Γ中的一種或多種或全部的細(xì)胞，從未表現(xiàn)出一種或更多或任何這些性質(zhì)的細(xì)胞中進(jìn)行分選。在另一個(gè)具體的實(shí)施方式中，將另外為⑶9+、⑶10+、⑶44+、 CD54+、CD98+、Tie_2+、TEM-7+、CD31\ CD34\ CD45\ CD133\ CD143\ CD146"和 / 或 CXCR4-的一種或多種或全部的VEGFR2/KDR+、VEGFRl/Flt-Γ細(xì)胞，從未表現(xiàn)出一種或更多或任何這些性質(zhì)的細(xì)胞中進(jìn)行分選。
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羊膜來源的貼壁細(xì)胞的篩選可以針對(duì)消化產(chǎn)生的細(xì)胞懸液或從消化物收集的分離細(xì)胞來進(jìn)行，例如，通過離心或使用流式細(xì)胞儀分離。通過表達(dá)標(biāo)記的篩選可以單獨(dú)完成，或者，例如，與基于細(xì)胞培養(yǎng)中的貼壁性質(zhì)的細(xì)胞篩選流程聯(lián)用。例如，可以在基于標(biāo)記表達(dá)的分選之前或之后進(jìn)行貼壁篩選。對(duì)于抗體-介導(dǎo)的胎盤細(xì)胞檢測和分選，可以使用任何特殊標(biāo)記特異性的抗體， 其結(jié)合任何熒光基團(tuán)或適于細(xì)胞檢測和分選(例如，熒光激活細(xì)胞分選)的其它標(biāo)簽。結(jié)合特異性標(biāo)記的抗體/熒光基團(tuán)包括但不限于，異硫氰酸熒光素(FITC)偶聯(lián)的抗CD105單克隆抗體(可購自R&DSYSTEMSInc.，Minneapolis, Minnesota)；藻紅蛋白(PE)偶聯(lián)的抗 CD200 單克隆抗體(BD Biosciences Pharmingen) ；VEGFR2/KDR-生物素(CD309，Abeam)， 等等。針對(duì)在此公開的任何標(biāo)記的抗體都可以使用任何用于抗體的標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)簽進(jìn)行標(biāo)記，后者有利于檢測抗體，包括，例如，辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶、β -半乳糖苷酶、乙酰膽堿酯酶鏈霉親和素/生物素、抗生物素蛋白/生物素、傘形酮、熒光素、異硫氰酸熒光素(FITC)、 羅丹明、二氯三吖胺熒光素、丹磺酰氯或藻紅蛋白(PE)、魯米諾、熒光素酶、熒光素和水母蛋白，和合適的放射性材料的例子，包括125I、131I、MS或3Η。羊膜來源的貼壁細(xì)胞可以標(biāo)記有單一標(biāo)記的抗體，并基于該單一標(biāo)記進(jìn)行檢測和分選；或者可以同時(shí)標(biāo)記有多個(gè)不同標(biāo)記的多個(gè)抗體，并基于多種標(biāo)記進(jìn)行分選。在另一個(gè)實(shí)施方式中，可以使用磁珠分離細(xì)胞，例如，從其它羊膜細(xì)胞中分離在此描述的羊膜來源的貼壁細(xì)胞。細(xì)胞可以使用磁性激活細(xì)胞分選(MACQ技術(shù)進(jìn)行分選，其為一種基于顆粒結(jié)合磁珠(0. 5-100μπι直徑)的能力來分離顆粒的方法?？梢詫?duì)磁性微球進(jìn)行多種有用的修飾，包括共價(jià)添加特異性識(shí)別特殊細(xì)胞表面分子或半抗原的抗體。然后將磁珠與細(xì)胞混合進(jìn)行結(jié)合。然后將細(xì)胞通過磁場，分離具有特異性細(xì)胞表面標(biāo)記的細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方式中，隨后可以將這些細(xì)胞進(jìn)行分離并重新混合偶聯(lián)有抗其它細(xì)胞表面標(biāo)記的抗體的磁珠。再次將細(xì)胞通過磁場，分離結(jié)合有該兩種抗體的細(xì)胞。然后可以將該細(xì)胞在諸如微滴盤的不同盤內(nèi)進(jìn)行稀釋，用于克隆分離。可以使用本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)評(píng)價(jià)羊膜來源的貼壁細(xì)胞的活力、增殖潛力和壽命，例如臺(tái)盼藍(lán)拒染實(shí)驗(yàn)、熒光素二乙酸酯吸收分析、碘化丙錠吸收分析(評(píng)價(jià)活力)；以及胸腺嘧啶吸收分析或MTT細(xì)胞增殖分析(評(píng)價(jià)增殖)。細(xì)胞壽命可以通過本領(lǐng)域熟知的方法進(jìn)行測定，例如通過檢測延伸培養(yǎng)中的最大群體倍增數(shù)測定。羊膜來源的貼壁細(xì)胞還可以使用其它本領(lǐng)域已知的技術(shù)從胎盤細(xì)胞中進(jìn)行分離， 例如，所需細(xì)胞的選擇性生長(陽性篩選)，選擇性破壞不需要的細(xì)胞(陰性篩選)；基于分化細(xì)胞在混合例如大豆凝集素的群體中的凝集作用進(jìn)行分離；凍融過程；過濾；常規(guī)和區(qū)帶離心；離心淘析(逆流離心)；單位重力分離；逆流分配；電泳；等等。5. 5羊膜來源的貼壁細(xì)胞的培養(yǎng)5. 5.1 培養(yǎng)基分離的羊膜來源的貼壁細(xì)胞或該細(xì)胞的群體，可用于啟動(dòng)細(xì)胞培養(yǎng)或接種細(xì)胞培養(yǎng)物。一般將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到無菌組織培養(yǎng)容器中，后者或者不包被、或者包被胞外基質(zhì)或生物分子，例如層粘連蛋白、膠原蛋白(例如，天然或變性的)、明膠、纖維粘連蛋白、鳥氨酸、玻璃體粘連蛋白、和胞外膜蛋白(例如，MATRIGEL (BD Discovery Labware, Bedford, Mass. )) ο
AMDAC可以，例如，在適合干細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基中進(jìn)行培植。培植培養(yǎng)基可以， 例如，含有 EGM-2 培養(yǎng)基(Lonza)、DMEM+10 % FBS,或含有 60 % DMEM-LG(Gibco)、40 % MCDB-201(Sigma)、2%胎牛血清(FCS) (Hyclone Laboratories)、1 X 胰島素-轉(zhuǎn)鐵因子-硒補(bǔ)充劑(ITS)UX亞油酸-牛血清白蛋白(LA-BSA)UO-i3M地塞米松(Sigma)、抗壞血酸2-磷酸鹽(Sigma)、表皮生長因子(EGF) lOng/ml (R&D SYSTEMS)、血小板衍生的生長因子 (PDGF-BB) 10ng/ml (R&D SYSTEMS)、和IOOU青霉素/1000U鏈霉素的培養(yǎng)基(在此稱為“標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基”)。羊膜來源的貼壁細(xì)胞可被培養(yǎng)于本領(lǐng)域認(rèn)可的可用于例如貼壁胎盤干細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)的任何培養(yǎng)基，以及任何條件下。優(yōu)選的，培養(yǎng)基含有血清。在不同的實(shí)施方式中， AMDAC 的培養(yǎng)或傳代培養(yǎng)的培養(yǎng)基包括STEMPRO (Invitrogen) ,MSCM-sf (ScienCell, Carlsbad, CA)、MESENCULT -ACF 培養(yǎng)基(StemCell Technologies, Vancouver, Canada)、標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基、缺少EGF的標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基、缺少PDGF的標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基、DMEM+10 % FBS、EGM-2 (Lonza)、EGM-2MV(Lonza)、2 %、10 % 和 20 % 的 ES 培養(yǎng)基、ES-SSR 培養(yǎng)基或 α -ΜΕΜ-20 % FBS0可用于培養(yǎng)羊膜來源的貼壁細(xì)胞的培養(yǎng)基包括，例如，DMEM、IMDM、 DMEM(高或低葡萄糖)、Eagle基本培養(yǎng)基、Ham的FlO培養(yǎng)基(FlO)、Ham的F-12培養(yǎng)基(F12)、Iscove的改良Dulbecco培養(yǎng)基、間質(zhì)干細(xì)胞生長的培養(yǎng)基(MSCGM Lonza)、 ADVANCESTEM 培養(yǎng)基(Hyclone)、KN0CK0UT DMEM(Invitrogen)、Leibovitz 的 L-15 培養(yǎng)基、MCDB、DMEM/F12、RPMI 1640、改良 DMEM(Gibco)、DMEM/MCDB201 (Sigma)禾Π CELL-GRO FREE等等。在不同的實(shí)施方式中，例如，DMEM-LG(Dulbecco的改良必需培養(yǎng)基，低葡萄糖)/MCDB 201 (雞成纖維細(xì)胞基本培養(yǎng)基)含有ITS (胰島素-轉(zhuǎn)鐵因子-硒補(bǔ)充劑)、 LA+BSA(亞油酸-牛血清白蛋白)、葡萄糖、L-抗壞血酸106 丄6 、16 -1、和青霉素/鏈霉素；DMEM-HG(高葡萄糖)包含約2至約20%胎牛血清，例如，約10%的胎牛血清(FBS ；例如確定的胎牛血清，Hyclone，Logan Utah) ；DMEM-HG包含約2至約20% FBS，例如，約15%的 FBS ；IMDM(Iscove的改良Dulbecco培養(yǎng)基)包含約2至約20% FBS，例如，約10%的FBS, 約2至約20%馬血清，例如，約10%的馬血清，和氫化可的松；M199包含約2至約20%，例如，約10%的FBS、EGF和肝磷脂；α -MEM(最小必需培養(yǎng)基)包含約2至約20%，例如，約 10% 的 FBS、GLUTAMAX 和慶大霉素；DMEM 包含 10% FBS、GLUTAMAX 和慶大霉素；DMEM-LG 包含約2至約20%，例如，約15% (ν/ν)的胎牛血清(例如，確定的胎牛血清，Hyclone, LoganUtah)、抗生素/抗真菌藥(例如，青霉素約100單位/微升、鏈霉素100微克/微升、和 / 或兩性霉素 B 0.25 微克 / 微升(Invitrogen, Carlsbad, Calif))，和 0. 001 % (ν/ ν) β-巰基乙醇(Sigma, St. Louis Mo.)；補(bǔ)充 2-20 % FBS、非必需氨基酸(Invitrogen), β -巰基乙醇的KNOCKOUT DMEM基本培養(yǎng)基，補(bǔ)充KNOCKOUT 的血清替代品、含有2-20% FBS的α -MEM的KNOCKOUT 基本培養(yǎng)基，補(bǔ)充EGF、VEGF, bFGF、R3-IGF-1、氫化可的松、肝磷脂、抗壞血酸、FBS、慶大霉素的EBM2 基本培養(yǎng)基，等等。培養(yǎng)基可以補(bǔ)充一種或更多組分，包括，例如，血清(例如，F(xiàn)CS或FBS，例如，約 2-20% (ν/ν)；馬血清(ES)；人血清(HS)) ； β-巰基乙醇(BME)，優(yōu)選的約0.001% (ν/ν)； 一種或更多生長因子，例如，血小板衍生的生長因子(PDGF)、表皮生長因子(EGF)、堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)、胰島素樣生長因子-I(IGF-I)、白血病抑制因子(LIF)、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)和促紅細(xì)胞生成素(EPO)；氨基酸，包括L-纈氨酸；以及一種或更多抗生素和/或抗真菌劑以控制微生物污染，例如，青霉素G、硫酸鏈霉素、兩性霉素B、慶大霉素和制霉菌素，其可單獨(dú)或組合使用。羊膜來源的貼壁細(xì)胞(AMDAC)可被培養(yǎng)于標(biāo)準(zhǔn)組織培養(yǎng)條件，例如，培養(yǎng)于組織培養(yǎng)皿或多孔板。細(xì)胞還可以使用懸滴方法進(jìn)行培養(yǎng)。在該方法中，細(xì)胞在約5mL的培養(yǎng)基中懸浮于約1 X IO4細(xì)胞每mL，且一滴或更多培養(yǎng)基置于組織培養(yǎng)容器的蓋內(nèi)，例如，在 IOOmL Petri培養(yǎng)皿中。這些液滴可以是，例如，單一液滴，或來自例如多通道移液管的多個(gè)液滴。小心地將蓋翻轉(zhuǎn)并置于培養(yǎng)皿底部的頂上，其中含有一定體積的液體，例如，足夠維持培養(yǎng)皿中潮濕環(huán)境的無菌PBS，并進(jìn)而培養(yǎng)細(xì)胞。AMDAC也可以在標(biāo)準(zhǔn)或大體積或高產(chǎn)量培養(yǎng)系統(tǒng)中進(jìn)行培養(yǎng)，例如 T-搖瓶、Corning HYPERFLASK 、Cell Factories(Nunc)、 1-，2-，4_，10 或 40-Tray Cell stack，等等。在一個(gè)實(shí)施方式中，羊膜來源的貼壁細(xì)胞在能夠維持細(xì)胞未分化表型的化合物的存在下進(jìn)行培養(yǎng)。在一個(gè)具體的實(shí)施方式中，該化合物是取代的3，4-二氫吡啶酚[4，5-d] 嘧啶。在一個(gè)更加具體的實(shí)施方式中，該化合物是具有下述化學(xué)結(jié)構(gòu)的化合物該化合物可以與一種羊膜來源的貼壁細(xì)胞或該細(xì)胞群進(jìn)行接觸，其濃度為，例如， 約1 μ M至約10 μ Mo5. 5. 2羊膜來源的貼壁細(xì)胞的擴(kuò)增和增殖一旦分離了羊膜來源的貼壁細(xì)胞或分離了該細(xì)胞群(例如，分離自至少50%的羊膜細(xì)胞的羊膜來源的貼壁細(xì)胞或該細(xì)胞群，該細(xì)胞或細(xì)胞群通常與其在體內(nèi)相關(guān)聯(lián))，即可以在體外增殖和擴(kuò)增細(xì)胞。例如，貼壁細(xì)胞或羊膜來源的貼壁細(xì)胞群可以在組織培養(yǎng)容器中進(jìn)行培養(yǎng)，例如，培養(yǎng)皿、搖瓶、多孔板等，培養(yǎng)持續(xù)足夠時(shí)間使得細(xì)胞增殖至40-70%匯合度(confluence)，即，直到細(xì)胞及其后代占據(jù)40-70%的組織培養(yǎng)容器的培養(yǎng)表面積?？梢栽谂囵B(yǎng)容器中接種羊膜來源的貼壁細(xì)胞，接種密度允許細(xì)胞生長。例如，可以在低密度(例如，約400至約6，000細(xì)胞/cm2)至高密度(例如，約20，000或更多細(xì)胞/ cm2)下接種細(xì)胞。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，細(xì)胞培養(yǎng)于CO2為約0%至約5%的空氣中。在一些優(yōu)選的實(shí)施方式中，細(xì)胞培養(yǎng)于約0. 至約25% O2的空氣中，優(yōu)選的約5%至約20% O2的空氣中。細(xì)胞優(yōu)選的培養(yǎng)于約25°C至約40°C，優(yōu)選的約37°C。細(xì)胞優(yōu)選的培養(yǎng)于保溫箱中。培養(yǎng)過程中，培養(yǎng)基可以是靜止或進(jìn)行攪拌的，例如，培養(yǎng)過程中使用生物反應(yīng)器。羊膜來源的貼壁細(xì)胞優(yōu)選的生長于低氧化壓力下(例如， 添加谷胱甘肽、抗壞血酸、過氧化氫酶、生育酚、N-乙酰半胱氨酸等)。雖然羊膜來源的血管生成細(xì)胞可以生長至全滿，但是細(xì)胞優(yōu)選的不生長至全滿。 例如，一旦達(dá)到40% -70%的匯合度，即可以傳代細(xì)胞。例如，細(xì)胞可以使用本領(lǐng)域熟知的技術(shù)進(jìn)行酶處理，例如，胰蛋白酶化，將其從組織培養(yǎng)表面進(jìn)行分離。吸走細(xì)胞并對(duì)其進(jìn)行計(jì)數(shù)后，可以將約20，000-100，000細(xì)胞、優(yōu)選的約50，000細(xì)胞、或約400至約6，000細(xì)胞/cm2傳代至含有新鮮培養(yǎng)基的新培養(yǎng)容器。一般地，新培養(yǎng)基與去除細(xì)胞的培養(yǎng)基為相同類型。羊膜來源的貼壁細(xì)胞可以傳代至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、 18,19或20次，或更多。AMDAC可以在培養(yǎng)物中翻倍至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、 13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、 38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49 或至少 50 倍或更多。5. 6羊膜來源的貼壁細(xì)胞的保存在例如收集過程或使用諸如在此描述的方法來生產(chǎn)在此描述的組合物之前，可以將羊膜來源的貼壁細(xì)胞保存于，即，置于允許長期存儲(chǔ)的條件下，或抑制諸如凋亡或壞死的細(xì)胞死亡的條件下。羊膜來源的貼壁細(xì)胞可以使用例如包含凋亡抑制劑、壞死抑制劑和/或攜氧全氟化碳的組合物進(jìn)行保存，如描述于美國申請(qǐng)
發(fā)明者亞歷山大·卡普魯諾維斯基, 亞歷山大·弗蘭茨基, 克利斯登·拉巴左, 埃里克·勞, 尼拉弗·D·帕德里亞, 弗拉基米爾·揚(yáng)科維奇, 斯圖爾特·阿博特, 王佳倫, 詹妮弗·帕雷德斯, 詹姆士·W·愛丁格 申請(qǐng)人:人類起源公司