專利名稱：細(xì)胞角蛋白19 mRNA的測(cè)定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及利用核酸擴(kuò)增法的細(xì)胞角蛋白19 mRNA的測(cè)定方法。更準(zhǔn)確地說(shuō)，本發(fā)明提供適合一定溫度(40至60°C，優(yōu)選43°C)下的mRNA的擴(kuò)增、檢測(cè)的寡核苷酸，通過(guò)本發(fā)明，能夠簡(jiǎn)便且快速地測(cè)定試樣中的細(xì)胞角蛋白19 mRNA。另外，本發(fā)明還提供用于細(xì)胞角蛋白19 mRNA測(cè)定的試劑，對(duì)于分子生物學(xué)、生化學(xué)、醫(yī)學(xué)領(lǐng)域等中的研究和診斷治療有用。
背景技術(shù)：
細(xì)胞角蛋白為形成細(xì)胞骨架的中間絲蛋白，且特征性地存在于上皮組織中。到目前為止，已鑒定出20種以上的細(xì)胞角蛋白，并且基于該蛋白的電荷而分類為酸性的I型和中性至堿性的II型。已知細(xì)胞角蛋白根據(jù)種類不同而表達(dá)位點(diǎn)不同，細(xì)胞角蛋白8、18、19 主要在上皮細(xì)胞中表達(dá)，細(xì)胞角蛋白5、14局限于基底細(xì)胞，細(xì)胞角蛋白2、6、10、11局限于基底上的組織。細(xì)胞角蛋白在醫(yī)療等領(lǐng)域中被廣泛認(rèn)識(shí)的一個(gè)原因在于，使用抗細(xì)胞角蛋白抗體的免疫染色經(jīng)常被使用。大多數(shù)情況下，癌癥的診斷通過(guò)病理學(xué)診斷進(jìn)行，通常使用將懷疑有癌癥的組織或細(xì)胞進(jìn)行蘇木精/曙紅染色(HE染色)后得到的樣本。但是，在HE染色中存在難以分清癌細(xì)胞和正常細(xì)胞的情況，有時(shí)癌細(xì)胞的發(fā)現(xiàn)會(huì)被忽略。因此，使用抗細(xì)胞角蛋白抗體的免疫組織染色經(jīng)常被使用。將上皮組織以外的被檢物使用抗細(xì)胞角蛋白抗體進(jìn)行免疫組織染色，結(jié)果呈陽(yáng)性反應(yīng)時(shí)，本來(lái)應(yīng)該僅在上皮組織中表達(dá)的細(xì)胞角蛋白在該組織中表達(dá)，在組織學(xué)上異常，即病理學(xué)上可判斷為癌癥。已知細(xì)胞角蛋白19 (以下記為“CK19”)不僅主要在上皮組織中表達(dá)，而且也在其他正常組織中少量表達(dá)，但各種癌癥中其的表達(dá)的亢進(jìn)是明顯的。在使用上述的抗細(xì)胞角蛋白抗體的免疫染色中，也大多使用將CK19識(shí)別為抗原的抗體。CK19的這種表達(dá)特性滿足作為腫瘤標(biāo)記物的條件，實(shí)際中作為腫瘤標(biāo)記物而被廣泛使用。CK19由于在各種癌癥中表達(dá)亢進(jìn)，因而適用的癌癥種類多，使用方法也遍及癌癥的早期診斷、轉(zhuǎn)移的診斷、治療效果的監(jiān)測(cè)等多方面，可以說(shuō)是非常有用的腫瘤標(biāo)記物。如上所述，雖然利用病理診斷的癌癥的診斷作為金標(biāo)準(zhǔn)(gold standard)而被廣泛使用，但需要病理醫(yī)生有較高的技術(shù)，且指出有時(shí)癌細(xì)胞的發(fā)現(xiàn)被忽略是由于所使用的被檢物造成的。近年來(lái)，為了減少這種忽略、并且能在各醫(yī)院等進(jìn)行均衡的診斷，提出了遺傳篩查(核酸擴(kuò)增法)的使用，或者已一部分實(shí)用化。核酸擴(kuò)增法的靈敏度高是已知的，能夠得到用于擴(kuò)增特定基因的高特異性，并且通過(guò)測(cè)定方法進(jìn)行試樣中的特定基因的定量也是可能的。即，還能夠提供關(guān)于特定基因的表達(dá)量的大小的信息。通常，在使用核酸擴(kuò)增法的腫瘤標(biāo)記物基因mRNA的檢測(cè)中，RT-PCR (Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction，逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng))法作為核酸擴(kuò)增法被廣泛使用，且有報(bào)道稱其對(duì)CK19 mRNA也適用(參見(jiàn)Anne-Marie，C. et al. ,Laboratory Investigation, 77, 213-220 (1997).(非專利文獻(xiàn) 1) ；Tao，L.et al. ,British Journal ofCancer, 94,1164-1169 (2006).(非專利文獻(xiàn) 2) ；Wang, H. Y. et al. , International Journal of Gynecological Cancer，16，643-648 (2006).(非專利文獻(xiàn) 3) ；ffeiggelt, B. et al.， British Journal of Cancer, 90,1531-1537 (2004).(非專利文獻(xiàn) 4) ；Kamiya, Μ. et al.， British Journal of Dermatology, 149,998-1005 (2003).(非專利文獻(xiàn) 5) ；Makino, H. et al. , Hepato-Gastroenterology, 50,1407-1410 (2003).(非專禾Ij 文獻(xiàn) 6) ；Bustin, S. A. et al. , British Journal of Cancer，79，1813-1820 (1999).(非專利文獻(xiàn) 7) ；Fujita, Y. et al. , Gastric Cancer, 9, 308-314 (2006).(非專利文獻(xiàn) 8)；日本特表 2003-527098 號(hào)公報(bào) (專利文獻(xiàn)2)；日本特表2005-522231號(hào)公報(bào)(專利文獻(xiàn)3)；日本特表2008-502330號(hào)公報(bào)(專利文獻(xiàn)4))。該擴(kuò)增法，例如，在從腫瘤組織提取RNA后，需要如下兩階段的步驟(根據(jù)情況有時(shí)還需要另外實(shí)施檢測(cè)步驟)(a)利用逆轉(zhuǎn)錄酶由提取的RNA合成cDNA的步驟；和(b)通過(guò)PCR擴(kuò)增該cDNA并進(jìn)行檢測(cè)的步驟，因此，暗示著操作的復(fù)雜性和二次污染的危險(xiǎn)性。另外，實(shí)施上述二階段的步驟通常需要2小時(shí)以上，因而在多個(gè)步驟的實(shí)施所導(dǎo)致的重現(xiàn)性不良、大量被檢物處理和檢查成本的降低方面存在問(wèn)題。為了縮短反應(yīng)時(shí)間，也開(kāi)發(fā)了同時(shí)進(jìn)行上述二階段的步驟的一步RT-PCR法，但被指出與分別進(jìn)行各步驟的RT-PCR法相比檢測(cè)靈敏度降低、容易產(chǎn)生非特異的擴(kuò)增產(chǎn)物等。而且，利用PCR法的擴(kuò)增由于擴(kuò)增的是雙鏈DNA，因而混入的染色體DNA 也有可能被擴(kuò)增，因此，為了嚴(yán)密地分析mRNA表達(dá)，需要進(jìn)行利用DNase等的消化而完全地除去染色體DNA。因此，導(dǎo)致操作更加復(fù)雜和重現(xiàn)性不良。另外，PCR法需要急劇地使反應(yīng)溫度升降，因此成為自動(dòng)化時(shí)反應(yīng)裝置的省力化和低成本化的障礙。另外，作為其它核酸擴(kuò)增法，還報(bào)道有使用RT-LAMP(Reverse Transcription-Loop mediated isothermal AMPlification，逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增)法的 CK19 mRNA 的擴(kuò)增、檢測(cè)(參見(jiàn) Tujimoto，M. et al.，Clinical Cancer Research, 13, 4807-4816(2007).(非專利文獻(xiàn) 9) ；Mike, V. et al. , International Journal of Cancer, 122，2562-2567 (2008).(非專利文獻(xiàn)10)；日本特開(kāi)2004-89180號(hào)公報(bào)(專利文獻(xiàn)5))。這是通過(guò)將2種內(nèi)引物、2種外引物、逆轉(zhuǎn)錄酶、鏈置換型DNA聚合酶、底物等混合并在一定溫度(65°C左右)下保溫而擴(kuò)增目的核酸的方法。但是，上述擴(kuò)增法的引物設(shè)計(jì)的數(shù)量多、并且各引物設(shè)計(jì)中存在很多限制，因此設(shè)計(jì)非常復(fù)雜。例如，需要對(duì)目的基因在3’末端、5’末端各選擇3個(gè)區(qū)域(此時(shí)各區(qū)域間的距離等很重要)，并在此基礎(chǔ)上將各區(qū)域的同源的或互補(bǔ)的序列組合而設(shè)計(jì)長(zhǎng)度不同的引物。當(dāng)然，由于此時(shí)各引物的Tm值和GC含量等與反應(yīng)性相關(guān)聯(lián)，因此能夠設(shè)計(jì)引物的區(qū)域相當(dāng)有限。另外，為了加快反應(yīng)速度，可以使用環(huán)引物 (Loop Primer)(使用環(huán)引物時(shí)檢測(cè)時(shí)間縮短至30分鐘左右)，但還需要設(shè)計(jì)2個(gè)引物。這樣設(shè)計(jì)多個(gè)引物除了困難之外，在制造成本方面也不利。而且在LAMP法中，不直接檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物而檢測(cè)反應(yīng)溶液的濁度，由此相對(duì)地推測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物的量。檢測(cè)濁度的方法由于不直接檢測(cè)擴(kuò)增核酸，因此在產(chǎn)生非特異的擴(kuò)增產(chǎn)物時(shí)不僅不能進(jìn)行定量的檢測(cè)，而且根據(jù)測(cè)定結(jié)果不能得知是否產(chǎn)生了非特異的擴(kuò)增產(chǎn)物。另外，在多個(gè)引物參與反應(yīng)的LAMP法中， 難以完全地控制非特異的擴(kuò)增產(chǎn)物的產(chǎn)生。因此，可以說(shuō)該方法不適合PCR法中的一部分已經(jīng)報(bào)道的如多重PCR那樣、對(duì)多個(gè)腫瘤標(biāo)記物同時(shí)進(jìn)行擴(kuò)增檢測(cè)的方法。這是因?yàn)闈岫葯z測(cè)法中不能判斷對(duì)哪種腫瘤標(biāo)記物進(jìn)行了擴(kuò)增檢測(cè)。另外，LAMP法與RT-PCR法一樣，也以雙鏈DNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增，因此存在擴(kuò)增染色體DNA的可能性。另外，雖然利用LAMP法擴(kuò)增時(shí)的溫度為恒定的65°C，但在反應(yīng)前后通常需要高溫處理，這成為反應(yīng)裝置的省力化和低成本化的障礙。另一方面，作為在一定溫度下僅對(duì)RNA進(jìn)行擴(kuò)增的方法，報(bào)道有NASBA法(參照日本專利第2650159號(hào)公報(bào)(專利文獻(xiàn)6)；日本專利第3152927號(hào)公報(bào)(專利文獻(xiàn)7))、以及 TMA法(參照日本專利第3241717號(hào)公報(bào)(專利文獻(xiàn)8))等。上述RNA擴(kuò)增方法，利用含有針對(duì)目的RNA的啟動(dòng)子序列的引物、逆轉(zhuǎn)錄酶以及根據(jù)需要的核糖核酸酶H(RNaSe H)，合成含有啟動(dòng)子序列的雙鏈DNA，以該雙鏈DNA為模板，利用RNA聚合酶生成含有來(lái)源于目的 RNA的特定堿基序列的RNA，接著以該RNA為含有啟動(dòng)子序列的雙鏈DNA合成的模板，進(jìn)行連鎖反應(yīng)。并且，在RNA擴(kuò)增后，通過(guò)電泳或使用結(jié)合了可檢測(cè)的標(biāo)記的核酸探針的雜交法等檢測(cè)擴(kuò)增了的RNA。上述RNA擴(kuò)增法由于在一定溫度下、以一個(gè)階段僅對(duì)RNA進(jìn)行擴(kuò)增，因此適合簡(jiǎn)單的RNA測(cè)定，但利用雜交法等的檢測(cè)需要復(fù)雜的操作，因此不僅不適合大量被檢物處理和自動(dòng)化，而且存在容易導(dǎo)致結(jié)果重現(xiàn)性不良和擴(kuò)增核酸的二次污染的問(wèn)題。而且，通常 NASBA法、TMA法得到結(jié)果均需要90分鐘以上，不能快速地得到結(jié)果。另外，雖然擴(kuò)增步驟在一定溫度下進(jìn)行，但通常在擴(kuò)增步驟前需要預(yù)加熱(例如，65°C )，在反應(yīng)裝置的省力化和低成本化方面存在問(wèn)題。作為簡(jiǎn)便地對(duì)RNA進(jìn)行擴(kuò)增/測(cè)定的方法，可以列舉Ishiguro等的方法(參見(jiàn)日本特開(kāi) 2000-014400 號(hào)公報(bào)(專利文獻(xiàn) 9) ；Ishiguro, T. et al.，Analytical Biochemistry，314，1247-1252 (2003).(非專利文獻(xiàn)11))。上述方法在以嵌入性熒光色素標(biāo)記的、且被設(shè)計(jì)成當(dāng)其與目的核酸形成互補(bǔ)的雙鏈時(shí)由于嵌入性熒光色素部分嵌入上述雙鏈部分中而熒光特性發(fā)生變化的寡核苷酸探針的存在下，實(shí)施RNA擴(kuò)增方法，并測(cè)定熒光特性的變化，其可以同時(shí)且快速簡(jiǎn)便地在一定溫度、一個(gè)階段且密閉容器內(nèi)實(shí)施RNA擴(kuò)增和測(cè)定。在該方法中，由于使用對(duì)擴(kuò)增后的核酸特異的寡核苷酸探針，因此能夠直接檢測(cè)擴(kuò)增后的核酸，而且通過(guò)使用多種嵌入性熒光色素，能夠在對(duì)多個(gè)核酸進(jìn)行擴(kuò)增后檢測(cè)各擴(kuò)增產(chǎn)物。作為該方法更具體的方式，對(duì)于存在于任意的RNA中且能使該RNA區(qū)別于其他 RNA的特定堿基序列，(1)使用與該特定堿基序列的3’末端側(cè)互補(bǔ)的DNA引物和RNA依賴性DNA聚合酶 (逆轉(zhuǎn)錄酶)，以RNA為模板生成與特定序列互補(bǔ)的DNA ；(2)使具有核糖核酸酶H活性的酶作用于通過(guò)(1)的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)生成的RNA-DNA 雙鏈而分解RNA，從而生成單鏈DNA ；(3)使用與⑵中生成的單鏈DNA的3’末端互補(bǔ)的、并且其本身的5’末端具有 RNA聚合酶的啟動(dòng)子序列的DNA引物和DNA依賴性DNA聚合酶，合成含有上述啟動(dòng)子序列的雙鏈DNA ；(4)使RNA聚合酶作用于(3)中生成的雙鏈DNA而生成轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物(特定堿基序列的 RNA)。而且，(4)中生成的RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物是來(lái)源于特定堿基序列的RNA，因此成為上述(1) 的反應(yīng)中的模板，與上述⑴的反應(yīng)中使用的DNA引物結(jié)合，從而發(fā)生(1)至(4)的反應(yīng)， 由此，引起RNA擴(kuò)增的連鎖反應(yīng)。
該核酸擴(kuò)增法的特征在于如下方面不需要如PCR法那樣升降反應(yīng)液的溫度，而且沒(méi)有分開(kāi)實(shí)施RNA的逆轉(zhuǎn)錄和其后的DNA擴(kuò)增反應(yīng)。另外，通過(guò)使可特異性地與擴(kuò)增后的 RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物結(jié)合的、嵌入性熒光色素標(biāo)記寡核苷酸探針共存于反應(yīng)液中，能夠在擴(kuò)增特定堿基序列或與該堿基序列互補(bǔ)的序列的同時(shí)直接檢測(cè)(監(jiān)測(cè))該擴(kuò)增的情況。因此，不需要像通常的RNA擴(kuò)增法那樣另行地進(jìn)行雜交檢測(cè)等，能大幅縮短得到結(jié)果為止的時(shí)間。但是，關(guān)于適合該核酸擴(kuò)增法的CK19 mRNA擴(kuò)增用引物序列及其組合、以及檢測(cè)用的寡核苷酸探針序列，還一無(wú)所知。這是因?yàn)?，其與需要通過(guò)在反應(yīng)開(kāi)始時(shí)使溫度暫時(shí)高于反應(yīng)溫度、從而使目的RNA的高級(jí)結(jié)構(gòu)(superstructure)變性的步驟的PCR法、LAMP法、 NASBA法、TMA法等核酸擴(kuò)增法不同，該核酸擴(kuò)增法通過(guò)擴(kuò)增反應(yīng)，在較低的一定溫度(40至 60 V，優(yōu)選43 V )條件下進(jìn)行目的mRNA的擴(kuò)增檢測(cè)。即，通常如mRNA那樣的單鏈RNA容易形成高級(jí)結(jié)構(gòu)是已知的，在該核酸擴(kuò)增法那樣的反應(yīng)條件下，目的mRNA形成高級(jí)結(jié)構(gòu)， 由于認(rèn)為其阻礙引物和探針的結(jié)合，因此最佳的引物和探針需要在無(wú)高級(jí)結(jié)構(gòu)的區(qū)域中設(shè)計(jì)。作為RNA高級(jí)結(jié)構(gòu)的指標(biāo)，可以利用二級(jí)結(jié)構(gòu)分析軟件由堿基序列計(jì)算和推導(dǎo)二級(jí)結(jié)構(gòu)，但由計(jì)算上的二級(jí)結(jié)構(gòu)推導(dǎo)實(shí)際的高級(jí)結(jié)構(gòu)極其困難。另外，在如該核酸擴(kuò)增法那樣在較低溫度下實(shí)施核酸擴(kuò)增時(shí)，與高溫下實(shí)施的PCR 法相比，容易產(chǎn)生引物二聚體這種非特異產(chǎn)物，為了降低非特異產(chǎn)物的生成，也需要嚴(yán)格選擇引物的組合。但是，通常使用的引物的設(shè)計(jì)法，由于以包括高溫下變性的步驟(例如PCR 法)為前提，因此在現(xiàn)有的引物設(shè)計(jì)技術(shù)中，設(shè)計(jì)適合該核酸擴(kuò)增法的引物是困難的。由此，為了利用上述的在一定溫度下的RNA擴(kuò)增/測(cè)定方法實(shí)現(xiàn)快速、簡(jiǎn)便、高靈敏度的CK19 mRNA測(cè)定，需要即使在一定溫度(40至60°C，優(yōu)選43°C)條件下結(jié)合效率也不降低、并且可擴(kuò)增、檢測(cè)CK19 mRNA的寡核苷酸及其組合。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于，提供對(duì)由人細(xì)胞、組織等得到的試樣，在一定溫度下、以一個(gè)階段的操作快速地測(cè)定細(xì)胞角蛋白19 mRNA的方法。本發(fā)明人為了解決上述問(wèn)題而反復(fù)進(jìn)行了深入研究，結(jié)果構(gòu)建了特異且快速地測(cè)定細(xì)胞角蛋白19 (以下記為CK19)mRNA的方法。第一發(fā)明為試樣中的CK19 mRNA的測(cè)定方法，其特征在于，上述測(cè)定方法使用了具有與CK19 mRNA內(nèi)的特定堿基序列的一部分同源的序列的第一引物、以及具有與特定堿基序列的一部分互補(bǔ)的序列的第二引物，其中第一或第二引物中任意一個(gè)的5’末端附加有RNA聚合酶的啟動(dòng)子序列，且所述測(cè)定方法包括下述的步驟(1)以RNA為模板利用具有RNA依賴性DNA聚合酶活性的酶合成與特定堿基序列互補(bǔ)的cDNA的步驟；(2)利用具有核糖核酸酶H(RNaSe H)活性的酶將上述(1)的反應(yīng)中得到的 RNA-DNA雙鏈的RNA分解的步驟(單鏈DNA的生成)；(3)以單鏈DNA為模板利用具有DNA依賴性DNA聚合酶活性的酶生成具有可轉(zhuǎn)錄上述特定堿基序列或與上述特定堿基序列互補(bǔ)的序列的RNA的啟動(dòng)子序列的雙鏈DNA的步驟；
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(4)利用具有RNA聚合酶活性的酶以上述雙鏈DNA為模板生成RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的步驟；(5)通過(guò)使該RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物成為上述(1)的反應(yīng)中的cDNA合成的模板而連鎖地生成RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的步驟；和(6)測(cè)定上述RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物量的步驟，并且，上述第一和第二引物為以下的任意一組(i)上述第一引物為由以序列號(hào)1表示的堿基序列中的至少15個(gè)連續(xù)的堿基形成的寡核苷酸，上述第二引物為由以序列號(hào)5表示的堿基序列中的至少15個(gè)連續(xù)的堿基形成的寡核苷酸；(ii)上述第一引物為由以序列號(hào)2表示的堿基序列中的至少15個(gè)連續(xù)的堿基形成的寡核苷酸，上述第二引物為由以序列號(hào)6表示的堿基序列中的至少15個(gè)連續(xù)的堿基形成的寡核苷酸；(iii)上述第一引物為由以序列號(hào)3表示的堿基序列中的至少15個(gè)連續(xù)的堿基形成的寡核苷酸，上述第二引物為由以序列號(hào)7表示的堿基序列中的至少15個(gè)連續(xù)的堿基形成的寡核苷酸；(iv)上述第一引物為由以序列號(hào)4表示的堿基序列中的至少15個(gè)連續(xù)的堿基形成的寡核苷酸，上述第二引物為由以序列號(hào)8表示的堿基序列中的至少15個(gè)連續(xù)的堿基形成的寡核苷酸。第二發(fā)明為第一發(fā)明所述的CK19 mRNA的測(cè)定方法，其特征在于，上述第一和第二引物為以下的任意一組(i)上述第一引物為由以序列號(hào)19至22中任意一個(gè)表示的堿基序列中的至少15 個(gè)連續(xù)的堿基形成的寡核苷酸，上述第二引物為由以序列號(hào)29至32中的任意一個(gè)表示的堿基序列中的至少15個(gè)連續(xù)的堿基形成的寡核苷酸；(ii)上述第一引物為由以序列號(hào)23或24表示的堿基序列中的至少15個(gè)連續(xù)的堿基形成的寡核苷酸，上述第二引物為由以序列號(hào)33或34表示的堿基序列中的至少15個(gè)連續(xù)的堿基形成的寡核苷酸；(iii)上述第一引物為由以序列號(hào)25或26表示的堿基序列中的至少15個(gè)連續(xù)的堿基形成的寡核苷酸，上述第二引物為由以序列號(hào)35或36表示的堿基序列中的至少15個(gè)連續(xù)的堿基形成的寡核苷酸；(iv)上述第一引物為由以序列號(hào)27或28表示的堿基序列中的至少15個(gè)連續(xù)的堿基形成的寡核苷酸，上述第二引物為由以序列號(hào)37或38表示的堿基序列中的至少15個(gè)連續(xù)的堿基形成的寡核苷酸。第三發(fā)明為第一或第二發(fā)明所述的CK19 mRNA的測(cè)定方法，其特征在于，上述(6) 的步驟(測(cè)定RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物量的步驟)，通過(guò)在熒光色素標(biāo)記寡核苷酸探針存在下測(cè)定上述熒光特性的變化而實(shí)現(xiàn)，所述熒光色素標(biāo)記寡核苷酸探針被涉及成當(dāng)其與目的RNA形成互補(bǔ)的雙鏈時(shí)熒光特性發(fā)生變化。第四發(fā)明為第三發(fā)明所述的測(cè)定方法，其特征在于，上述熒光色素標(biāo)記寡核苷酸探針為通過(guò)連接子結(jié)合了嵌入性熒光色素的嵌入性熒光色素標(biāo)記寡核苷酸探針。第五發(fā)明為第四發(fā)明所述的測(cè)定方法，其特征在于，上述嵌入性熒光色素標(biāo)記寡核苷酸探針含有由序列號(hào)39至46所示的任意一個(gè)堿基序列中或者其互補(bǔ)序列中的至少15 個(gè)連續(xù)的堿基形成的寡核苷酸。第六發(fā)明為第一至第五發(fā)明所述的CK19 mRNA的測(cè)定方法，其特征在于，在上述 (1)的步驟(以RNA為模板利用具有RNA依賴性DNA聚合酶活性的酶合成與特定堿基序列互補(bǔ)的cDNA的步驟)之前，進(jìn)行如下步驟以CK19 mRNA中的特定堿基序列為模板，使用(i)切斷用寡核苷酸，其具有與上述特定堿基序列中的第一引物的同源區(qū)域的5’ 末端位點(diǎn)重疊的區(qū)域、以及與上述特定堿基序列中的從該位點(diǎn)向5’方向的相鄰的區(qū)域互補(bǔ)的序列；和(ii)具有核糖核酸酶H(RNase H)活性的酶，在上述特定堿基序列的5’末端位點(diǎn)切斷上述RNA。第七發(fā)明為第六發(fā)明所述的測(cè)定方法，其特征在于，上述切斷用寡核苷酸為由以序列號(hào)9至18中的任意一個(gè)表示的堿基序列形成的寡核苷酸。第八發(fā)明為上述寡核苷酸，其特征在于，其為用于特異性地?cái)U(kuò)增或檢測(cè)CK19 mRNA 的寡核苷酸，該寡核苷酸含有由序列號(hào)1至8或序列號(hào)39至46所示的任意一個(gè)堿基序列中或者其互補(bǔ)序列中的至少15個(gè)連續(xù)的堿基形成的寡核苷酸。第九發(fā)明為一種CK19 mRNA的測(cè)定試劑，其特征在于，含有至少一種第八發(fā)明所述
的寡核苷酸。


圖1表示CK19 RNA的標(biāo)準(zhǔn)曲線。(a)表1的寡核苷酸組合[8] ； (b)組合[10]； (c)組合[30]?？v軸為熒光強(qiáng)度比超過(guò)1.2的時(shí)間(檢測(cè)時(shí)間，分鐘)，橫軸為以log表示的測(cè)定中使用的初期標(biāo)準(zhǔn)RNA量(拷貝數(shù))。另外，記載有由各點(diǎn)求出的線性一次曲線的方程式和R2的值。
具體實(shí)施例方式以下詳細(xì)地說(shuō)明本發(fā)明。本發(fā)明中的試樣是指含有RNA的核酸試樣。本發(fā)明使用以人細(xì)胞、人組織、體液、 血液、尿、大便、淋巴液、乳汁管液或者腹腔或胸腔洗液等作為材料、基于例如日本特開(kāi)平 7-59572號(hào)等中記載的方法制備的試樣，并對(duì)該試樣直接進(jìn)行測(cè)定，由此進(jìn)行作為該試樣來(lái)源的人細(xì)胞或組織等中所含的CK19 mRNA的測(cè)定。本發(fā)明中的特定堿基序列表示CK19 mRNA中的、與從第一引物的同源區(qū)域的5’末端到第二引物的互補(bǔ)區(qū)域的3’末端的堿基序列同源的RNA或DNA的堿基序列。S卩，在CK19 mRNA上，第一引物與自特定堿基序列的5’末端向3’方向的至少15個(gè)以上連續(xù)的堿基同源，第二引物與自特定堿基序列的3’末端向5’方向的至少15個(gè)以上連續(xù)的堿基互補(bǔ)。由此，在本發(fā)明中，來(lái)源于上述特定堿基序列的RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物被擴(kuò)增。本發(fā)明中的第一引物的同源區(qū)域的5’末端位點(diǎn)由特定堿基序列內(nèi)含有該同源區(qū)域的5’末端的部分序列形成，該位點(diǎn)是切斷用寡核苷酸的互補(bǔ)區(qū)域與第一引物的同源區(qū)域重疊的位點(diǎn)。本發(fā)明中的啟動(dòng)子是指RNA聚合酶結(jié)合并開(kāi)始轉(zhuǎn)錄的位點(diǎn)。已知有對(duì)各種RNA聚合酶特異的啟動(dòng)子序列，在本發(fā)明的使用中沒(méi)有特別限定啟動(dòng)子，但優(yōu)選分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)等中通常使用的T7啟動(dòng)子、SP6啟動(dòng)子、T3啟動(dòng)子。另外，上述序列中可以含有涉及轉(zhuǎn)錄效率的附加序列。本發(fā)明中的互補(bǔ)序列是指在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與作為對(duì)象的堿基序列雜交的序列。 作為高嚴(yán)謹(jǐn)條件的一例，可以列舉本發(fā)明的實(shí)施例中記載的核酸擴(kuò)增反應(yīng)液組成。另外，本發(fā)明中的同源序列是指在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與作為對(duì)象的堿基序列的完全互補(bǔ)序列雜交的序列。因此，本發(fā)明中所說(shuō)的互補(bǔ)或同源序列只要在對(duì)高嚴(yán)謹(jǐn)條件下的雜交的特異性和效率沒(méi)有影響的范圍內(nèi)就可以任意地設(shè)定長(zhǎng)度等，這一點(diǎn)是毋庸置疑的。另外，在對(duì)雜交的特異性和效率沒(méi)有影響的范圍內(nèi)，可以使用進(jìn)行了 1個(gè)至多個(gè)堿基的置換/缺失/插入的堿基序列。本發(fā)明中的核苷酸或核酸是指由天然存在的堿基、糖和糖間鍵形成的核苷酸或核苷(包含RNA和DNA兩者)，是包含其寡聚物(寡核苷酸，例如2至100個(gè)堿基左右)和聚合物(多核苷酸，例如100個(gè)堿基以上)的總稱。本發(fā)明中的核苷酸或核酸還包含發(fā)揮同樣功能的非天然存在的單體、用熒光分子以及放射性同位素標(biāo)記的單體、或者含有它們的寡聚物或聚合物等。本發(fā)明中的引物是指在核酸擴(kuò)增反應(yīng)中與模板雜交而開(kāi)始核酸擴(kuò)增反應(yīng)所需的核苷酸，并優(yōu)選基于核酸擴(kuò)增反應(yīng)中所希望擴(kuò)增的模板，將引物設(shè)計(jì)為本身含有對(duì)該模板特異的序列，以使其與該模板雜交，從而能夠通過(guò)PCR法、LAMP法、ICAN法、NASBA法、TMA 法、3SR法、TRC法(參見(jiàn)專利文獻(xiàn)9和非專利文獻(xiàn)11)之類的核酸擴(kuò)增反應(yīng)獲得鏈長(zhǎng)或序列方面有特異性的生成物。引物的長(zhǎng)度設(shè)計(jì)為具有通常15至100個(gè)堿基、優(yōu)選15至35個(gè)堿基的鏈長(zhǎng)，但并不限于該鏈長(zhǎng)。由此，本發(fā)明的第一和第二引物可以在本申請(qǐng)發(fā)明所記載的堿基序列的范圍內(nèi)、從至少15個(gè)以上連續(xù)的堿基的任意序列中選擇。即，本發(fā)明中的用于CK19 mRNA檢測(cè)的第一和第二引物如下(i)第一引物為由相對(duì)于與CK19 mRNA的一部分同源的、序列號(hào)1所記載的序列而言同源的序列中的至少15個(gè)連續(xù)的堿基形成的寡核苷酸，第二引物為由相對(duì)于與CK19 mRNA的一部分互補(bǔ)的、序列號(hào)5所記載的序列而言同源的序列中的至少15個(gè)連續(xù)的堿基形成的寡核苷酸；(ii)第一引物為由相對(duì)于與CK19 mRNA的一部分同源的、序列號(hào)2所記載的序列而言同源的序列中的至少15個(gè)連續(xù)的堿基形成的寡核苷酸，第二引物為由相對(duì)于與CK19 mRNA的一部分互補(bǔ)的、序列號(hào)6所記載的序列而言同源的序列中的至少15個(gè)連續(xù)的堿基形成的寡核苷酸；(iii)第一引物為由相對(duì)于與CK19 mRNA的一部分同源的、序列號(hào)3所記載的序列而言同源的序列中的至少15個(gè)連續(xù)的堿基形成的寡核苷酸，第二引物為由相對(duì)于與CK19 mRNA的一部分互補(bǔ)的、序列號(hào)7所記載的序列而言同源的序列中的至少15個(gè)連續(xù)的堿基形成的寡核苷酸；或者(iv)第一引物為由相對(duì)于與CK19 mRNA的一部分同源的、序列號(hào)4所記載的序列而言同源的序列中的至少15個(gè)連續(xù)的堿基形成的寡核苷酸，第二引物為由相對(duì)于與CK19 mRNA的一部分互補(bǔ)的、序列號(hào)8所記載的序列而言同源的序列中的至少15個(gè)連續(xù)的堿基形
10成的寡核苷酸。本發(fā)明中的用于CK19 mRNA檢測(cè)的第一和第二引物的更優(yōu)選的方式如下(i)第一引物為由相對(duì)于與CK19 mRNA的一部分同源的、序列號(hào)19至22所記載的任意一個(gè)序列而言同源的序列中的至少15個(gè)連續(xù)的堿基形成的寡核苷酸，第二引物為由相對(duì)于與CK19 mRNA的一部分互補(bǔ)的、序列號(hào)29至32所記載的任意一個(gè)序列而言同源的序列中的至少15個(gè)連續(xù)的堿基形成的寡核苷酸；(ii)第一引物為由相對(duì)于與CK19 mRNA的一部分同源的、序列號(hào)23或24所記載的序列而言同源的序列中的至少15個(gè)連續(xù)的堿基形成的寡核苷酸，第二引物為由相對(duì)于與CK19 mRNA的一部分互補(bǔ)的、序列號(hào)33或34所記載的序列而言同源的序列中的至少15 個(gè)連續(xù)的堿基形成的寡核苷酸；(iii)第一引物為由相對(duì)于與CK19 mRNA的一部分同源的、序列號(hào)25或26所記載的序列而言同源的序列中的至少15個(gè)連續(xù)的堿基形成的寡核苷酸，第二引物為由相對(duì)于與CK19 mRNA的一部分互補(bǔ)的、序列號(hào)35或36所記載的序列而言同源的序列中的至少15 個(gè)連續(xù)的堿基形成的寡核苷酸；或者(iv)第一引物為由相對(duì)于與CK19 mRNA的一部分同源的、序列號(hào)27或28所記載的序列而言同源的序列中的至少15個(gè)連續(xù)的堿基形成的寡核苷酸，第二引物為由相對(duì)于與CK19 mRNA的一部分互補(bǔ)的、序列號(hào)37或38所記載的序列而言同源的序列中的至少15 個(gè)連續(xù)的堿基形成的寡核苷酸。作為本發(fā)明中的用于CK19 mRNA檢測(cè)的第一和第二引物的優(yōu)選的一個(gè)方式，可以列舉(i)第一引物為選自序列號(hào)19至22所記載的序列中的一種寡核苷酸，第二引物為選自序列號(hào)29至32所記載的序列中的一種寡核苷酸；(ii)第一引物為選自序列號(hào)23或24所記載的序列中的一種寡核苷酸，第二引物為選自序列號(hào)33或34所記載的序列中的一種寡核苷酸；(iii)第一引物為選自序列號(hào)25或26所記載的序列中的一種寡核苷酸，第二引物為選自序列號(hào)35或36所記載的序列中的一種寡核苷酸；(iv)第一引物為選自序列號(hào)27或28所記載的序列中的一種寡核苷酸，第二引物為選自序列號(hào)37或38所記載的序列中的一種寡核苷酸。另外，作為本發(fā)明的一個(gè)方式，CK19 mRNA在成為cDNA合成的模板之前在該RNA內(nèi)的特定核酸序列的上述5’末端位點(diǎn)被切斷。通過(guò)在特定核酸序列的5’末端位點(diǎn)切斷，在 cDNA合成后，能夠通過(guò)延伸上述cDNA的3，末端而有效地合成與雜交于cDNA的第一引物的啟動(dòng)子序列互補(bǔ)的DNA鏈，結(jié)果形成功能性的雙鏈DNA啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)。作為這樣的切斷方法， 可以列舉如下方法通過(guò)添加具有與CK19 mRNA內(nèi)的特定堿基序列的5’末端位點(diǎn)(包含該特定堿基序列內(nèi)的5’末端位點(diǎn)的部分序列)重疊、并且與向5’方向的相鄰的區(qū)域互補(bǔ)的序列的寡核苷酸(以下記為切斷用寡核苷酸)，形成RNA-DNA雙鏈，利用具有核糖核酸酶 H(RNase H)活性的酶等切斷RNA-DNA雙鏈的RNA部分。該切斷用寡核苷酸的3’末端所具有的羥基，為了防止延伸反應(yīng)而被實(shí)施適當(dāng)?shù)男揎?，?yōu)選使用例如進(jìn)行了氨基化等的羥基。在本發(fā)明優(yōu)選的一個(gè)方式中，作為切斷用寡核苷酸，可以列舉由相對(duì)于與CK19 mRNA的一部分互補(bǔ)的、序列號(hào)9至18所記載的序列而言同源的序列形成的寡核苷酸。
本發(fā)明中的目的RNA表示RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物上的特定堿基序列中除上述弓丨物的同源或互補(bǔ)區(qū)域以外的序列，且具有可與嵌入性熒光色素標(biāo)記寡核苷酸探針互補(bǔ)地結(jié)合的序列。 由此，嵌入性熒光色素標(biāo)記寡核苷酸探針成為與本發(fā)明中的特定堿基序列的一部分互補(bǔ)或者同源的序列。本發(fā)明的一個(gè)方式中，作為嵌入性熒光色素標(biāo)記寡核苷酸探針可以列舉含有由相對(duì)于與CK19 mRNA的一部分互補(bǔ)的、序列號(hào)39至46所記載的序列而言同源或者互補(bǔ)的序列的至少15個(gè)連續(xù)的堿基形成的寡核苷酸的探針。作為本發(fā)明中的用于CK19 mRNA檢測(cè)的寡核苷酸的組合的一個(gè)方式，可以列舉(i)切斷用寡核苷酸為由與序列號(hào)9至12所記載的任意一個(gè)序列同源的序列形成的寡核苷酸，第一引物為由與序列號(hào)1所記載的序列同源的序列中的至少15個(gè)連續(xù)的堿基形成的寡核苷酸(需要說(shuō)明的是，第一引物的5’末端具有啟動(dòng)子序列，并且特定核酸序列中的該引物的同源區(qū)域的5’末端位點(diǎn)與序列號(hào)9至12所記載的序列的互補(bǔ)區(qū)域重疊)，第二引物為由與序列號(hào)5所記載的序列同源的序列中的至少15個(gè)連續(xù)的堿基形成的寡核苷酸，嵌入性熒光色素標(biāo)記寡核苷酸探針為含有由與序列號(hào)39至41所記載的任意一個(gè)序列同源的序列中的至少15個(gè)連續(xù)的堿基形成的寡核苷酸的探針；(ii)切斷用寡核苷酸為由與序列號(hào)13或14所記載的序列同源的序列形成的寡核苷酸，第一引物為由與序列號(hào)2所記載的序列同源的序列中的至少15個(gè)連續(xù)的堿基形成的寡核苷酸(需要說(shuō)明的是，第一引物的5’末端具有啟動(dòng)子序列，并且特定核酸序列中的該引物的同源區(qū)域的5’末端位點(diǎn)與序列號(hào)13或14所記載的序列的互補(bǔ)區(qū)域重疊)，第二引物為由與序列號(hào)6所記載的序列同源的序列中的至少15個(gè)連續(xù)的堿基形成的寡核苷酸，嵌入性熒光色素標(biāo)記寡核苷酸探針為含有由與序列號(hào)42或43所記載的序列同源的序列中的至少15個(gè)連續(xù)的堿基形成的寡核苷酸的探針；(iii)切斷用寡核苷酸為由與序列號(hào)15或16所記載的序列同源的序列形成的寡核苷酸，第一引物為由與序列號(hào)3所記載的序列同源的序列中的至少15個(gè)連續(xù)的堿基形成的寡核苷酸(需要說(shuō)明的是，第一引物的5’末端具有啟動(dòng)子序列，并且特定核酸序列中的該引物的同源區(qū)域的5’末端位點(diǎn)與序列號(hào)15或16的序列的互補(bǔ)區(qū)域重疊)，第二引物為由與序列號(hào)7所記載的序列同源的序列中的至少15個(gè)連續(xù)的堿基形成的寡核苷酸，嵌入性熒光色素標(biāo)記寡核苷酸探針為含有由與序列號(hào)44或45所記載的序列同源的序列中的至少 15個(gè)連續(xù)的堿基形成的寡核苷酸的探針；(iv)切斷用寡核苷酸為由與序列號(hào)17或18所記載的序列同源的序列形成的寡核苷酸，第一引物為由與序列號(hào)4所記載的序列同源的序列中的至少15個(gè)連續(xù)的堿基形成的寡核苷酸(需要說(shuō)明的是，第一引物的5’末端具有啟動(dòng)子序列，并且特定核酸序列中的該引物的同源區(qū)域的5’末端位點(diǎn)與序列號(hào)17或18的序列的互補(bǔ)區(qū)域重疊)，第二引物為由與序列號(hào)8所記載的序列同源的序列中的至少15個(gè)連續(xù)的堿基形成的寡核苷酸，嵌入性熒光色素標(biāo)記寡核苷酸探針為含有由與序列號(hào)46所記載的序列同源的序列中的至少15個(gè)連續(xù)的堿基形成的寡核苷酸的探針。需要說(shuō)明的是，在(i)中，需要設(shè)計(jì)為嵌入性熒光色素標(biāo)記寡核苷酸探針的互補(bǔ)序列與第一引物的同源序列以及第二引物的互補(bǔ)序列不重疊。作為本發(fā)明中的用于CK19 mRNA檢測(cè)的寡核苷酸的組合的更優(yōu)選的方式，可以列舉(i)切斷用寡核苷酸為由序列號(hào)9所記載的序列形成的寡核苷酸，第一引物為由序列號(hào)19所記載的序列形成的寡核苷酸(需要說(shuō)明的是，第一引物的5’末端具有啟動(dòng)子序列)，第二引物為選自序列號(hào)29或30所記載的序列中的一種寡核苷酸，嵌入性熒光色素標(biāo)記寡核苷酸探針為選自序列號(hào)39或40所記載的序列中的一種寡核苷酸；(ii)切斷用寡核苷酸為由序列號(hào)9所記載的序列形成的寡核苷酸，第一引物為由序列號(hào)19所記載的序列形成的寡核苷酸(需要說(shuō)明的是，第一引物的5’末端具有啟動(dòng)子序列)，第二引物為選自序列號(hào)31或32所記載的序列的一種寡核苷酸，嵌入性熒光色素標(biāo)記寡核苷酸探針為選自序列號(hào)39至41所記載的序列中的一種寡核苷酸；(iii)切斷用寡核苷酸為由序列號(hào)10所記載的序列形成的寡核苷酸，第一引物為由序列號(hào)20所記載的序列形成的寡核苷酸(需要說(shuō)明的是，第一引物的5’末端具有啟動(dòng)子序列)，第二引物為選自序列號(hào)29或30所記載的序列中的一種寡核苷酸，嵌入性熒光色素標(biāo)記寡核苷酸探針為選自序列號(hào)39或40所記載的序列中的一種寡核苷酸；(iv)切斷用寡核苷酸為由序列號(hào)10所記載的序列形成的寡核苷酸，第一引物為由序列號(hào)20所記載的序列形成的寡核苷酸(需要說(shuō)明的是，第一引物的5’末端具有啟動(dòng)子序列)，第二引物為選自序列號(hào)31或32所記載的序列中的一種寡核苷酸，嵌入性熒光色素標(biāo)記寡核苷酸探針為選自序列號(hào)39至41所記載的序列中的一種寡核苷酸；(ν)切斷用寡核苷酸為由序列號(hào)11所記載的序列形成的寡核苷酸，第一引物為由序列號(hào)21所記載的序列形成的寡核苷酸(需要說(shuō)明的是，第一引物的5’末端具有啟動(dòng)子序列)，第二引物為選自序列號(hào)29或30所記載的序列中的一種寡核苷酸，嵌入性熒光色素標(biāo)記寡核苷酸探針為由序列號(hào)40所記載的序列形成的寡核苷酸；(vi)切斷用寡核苷酸為由序列號(hào)11所記載的序列形成的寡核苷酸，第一引物為由序列號(hào)21所記載的序列形成的寡核苷酸(需要說(shuō)明的是，第一引物的5’末端具有啟動(dòng)子序列)，第二引物為選自序列號(hào)31或32所記載的序列中的一種寡核苷酸，嵌入性熒光色素標(biāo)記寡核苷酸探針為選自序列號(hào)40或41所記載的序列中的一種寡核苷酸；(vii)切斷用寡核苷酸為由序列號(hào)12所記載的序列形成的寡核苷酸，第一引物為由序列號(hào)22所記載的序列形成的寡核苷酸(需要說(shuō)明的是，第一引物的5’末端具有啟動(dòng)子序列)，第二引物為選自序列號(hào)29或30所記載的序列中的一種寡核苷酸，嵌入性熒光色素標(biāo)記寡核苷酸探針為由序列號(hào)40所記載的序列形成的寡核苷酸；(viii)切斷用寡核苷酸為由序列號(hào)12所記載的序列形成的寡核苷酸，第一引物為由序列號(hào)22所記載的序列形成的寡核苷酸(需要說(shuō)明的是，第一引物的5’末端具有啟動(dòng)子序列)，第二引物為選自序列號(hào)31或32所記載的序列中的一種寡核苷酸，嵌入性熒光色素標(biāo)記寡核苷酸探針為選自序列號(hào)40或41所記載的序列中的一種寡核苷酸；(ix)切斷用寡核苷酸為由序列號(hào)13所記載的序列形成的寡核苷酸，第一引物為由序列號(hào)23所記載的序列形成的寡核苷酸(需要說(shuō)明的是，第一引物的5’末端具有啟動(dòng)子序列)，第二引物為選自序列號(hào)33或34所記載的序列中的一種寡核苷酸，嵌入性熒光色素標(biāo)記寡核苷酸探針為選自序列號(hào)42或43所記載的序列中的一種寡核苷酸；(χ)切斷用寡核苷酸為由序列號(hào)14所記載的序列形成的寡核苷酸，第一引物為由序列號(hào)24所記載的序列形成的寡核苷酸(需要說(shuō)明的是，第一引物的5’末端具有啟動(dòng)子序列)，第二引物為選自序列號(hào)33或34所記載的序列中的一種寡核苷酸，嵌入性熒光色素標(biāo)記寡核苷酸探針為選自序列號(hào)42或43所記載的序列中的一種寡核苷酸；
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(xi)切斷用寡核苷酸為由序列號(hào)15所記載的序列形成的寡核苷酸，第一引物為由序列號(hào)25所記載的序列形成的寡核苷酸(需要說(shuō)明的是，第一引物的5’末端具有啟動(dòng)子序列)，第二引物為選自序列號(hào)35或36所記載的序列中的一種寡核苷酸，嵌入性熒光色素標(biāo)記寡核苷酸探針為選自序列號(hào)44或45所記載的序列中的一種寡核苷酸；(xii)切斷用寡核苷酸為由序列號(hào)16所記載的序列形成的寡核苷酸，第一引物為由序列號(hào)26所記載的序列形成的寡核苷酸(需要說(shuō)明的是，第一引物的5’末端具有啟動(dòng)子序列)，第二引物為選自序列號(hào)35或36所記載的序列中的一種寡核苷酸，嵌入性熒光色素標(biāo)記寡核苷酸探針為選自序列號(hào)44或45所記載的序列中的一種寡核苷酸；(xiii)切斷用寡核苷酸為由序列號(hào)17所記載的序列形成的寡核苷酸，第一引物為由序列號(hào)27所記載的序列形成的寡核苷酸(需要說(shuō)明的是，第一引物的5’末端具有啟動(dòng)子序列)，第二引物為選自序列號(hào)37或38所記載的序列中的一種寡核苷酸，嵌入性熒光色素標(biāo)記寡核苷酸探針為由序列號(hào)46所記載的序列形成的寡核苷酸；(xiv)切斷用寡核苷酸為由序列號(hào)18所記載的序列形成的寡核苷酸，第一引物為由序列號(hào)28所記載的序列形成的寡核苷酸(需要說(shuō)明的是，第一引物的5’末端具有啟動(dòng)子序列)，第二引物為選自序列號(hào)37或38所記載的序列中的一種寡核苷酸，嵌入性熒光色素標(biāo)記寡核苷酸探針為由序列號(hào)46所記載的序列形成的寡核苷酸。在本發(fā)明的CK19 mRNA的測(cè)定方法中，需要各種酶(以單鏈RNA為模板的具有RNA 依賴性DNA聚合酶活性的酶(逆轉(zhuǎn)錄酶)、具有RNase H活性的酶、以單鏈DNA為模板的具有DNA依賴性DNA聚合酶活性的酶、以及具有RNA聚合酶活性的酶)。各酶可以使用兼有幾種活性的酶，也可以使用具有單一活性的多種酶。另外，不僅可以在以單鏈RNA為模板的具有RNA依賴性DNA聚合酶活性、RNase H活性和以單鏈DNA為模板的DNA依賴性DNA聚合酶活性三種活性的逆轉(zhuǎn)錄酶中添加具有RNA聚合酶活性的酶，而且可以根據(jù)需要進(jìn)一步添加具有RNase H活性的酶。上述逆轉(zhuǎn)錄酶優(yōu)選為分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)等中常用的AMV逆轉(zhuǎn)錄酶、 MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶、HIV逆轉(zhuǎn)錄酶或者它們的衍生物，最優(yōu)選AMV逆轉(zhuǎn)錄酶及其衍生物。另外， 作為上述具有RNA聚合酶活性的酶，可以例示分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)等中常用的噬菌體來(lái)源的T7 RNA聚合酶、T3 RNA聚合酶、SP6 RNA聚合酶以及它們的衍生物。在本發(fā)明的一個(gè)方式中，對(duì)試樣中的CK19 mRNA添加上述切斷用寡核苷酸，利用上述逆轉(zhuǎn)錄酶的RNase H活性在上述特定堿基序列的5’末端位點(diǎn)切斷上述RNA。以切斷后的上述RNA為模板、在上述第一和第二引物的存在下利用上述逆轉(zhuǎn)錄酶實(shí)施逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)時(shí)，第二引物與CK19 mRNA內(nèi)的特定堿基序列結(jié)合，并利用上述逆轉(zhuǎn)錄酶的RNA依賴性DNA 聚合酶活性進(jìn)行cDNA合成。所得到的RNA-DNA雙鏈，RNA部分由于上述逆轉(zhuǎn)錄酶的RNase H活性而被分解、解離，從而第一引物與上述cDNA結(jié)合。接著，利用上述逆轉(zhuǎn)錄酶的DNA依賴性DNA聚合酶活性，生成來(lái)源于特定堿基序列且5’末端具有啟動(dòng)子序列的雙鏈DNA。該雙鏈DNA在啟動(dòng)子序列下游含有特定堿基序列，利用上述RNA聚合酶生產(chǎn)來(lái)源于特定堿基序列的RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。該RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物成為利用上述第一和第二引物合成上述雙鏈DNA的模板，一系列的反應(yīng)連鎖地進(jìn)行，上述RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物逐漸被擴(kuò)增。為了使這樣的連鎖反應(yīng)進(jìn)行，作為上述各種酶所必需的已知要素，至少含有緩沖劑、鎂鹽、鉀鹽、核苷三磷酸、核糖核苷三磷酸這一點(diǎn)毋庸置疑。另外，作為用于調(diào)節(jié)反應(yīng)效率的添加劑，可以添加二甲亞砜(DMSO)、二硫蘇糖醇(DTT)、牛血清清蛋白(BSA)、糖等。
例如，使用AMV逆轉(zhuǎn)錄酶和T7 RNA聚合酶時(shí)，優(yōu)選將反應(yīng)溫度設(shè)定在35至65°C 的范圍內(nèi)，更優(yōu)選設(shè)定在40至60°C的范圍內(nèi)，進(jìn)一步優(yōu)選的方式是反應(yīng)溫度為43°C。上述 RNA擴(kuò)增步驟在一定溫度下進(jìn)行，可以將反應(yīng)溫度設(shè)定為逆轉(zhuǎn)錄酶和RNA聚合酶顯示出活性的任意溫度。擴(kuò)增后的RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物量可以通過(guò)已知的核酸測(cè)定方法進(jìn)行測(cè)定。作為上述測(cè)定方法，可以列舉使用了電泳或液相色譜法的方法、利用以可檢測(cè)的標(biāo)記標(biāo)記后的核酸探針的雜交法等。但是，這些方法的操作均為多個(gè)步驟，而且由于將擴(kuò)增產(chǎn)物取出到體系外進(jìn)行分析，因此成為二次污染的原因的、擴(kuò)增產(chǎn)物向環(huán)境中飛散的危險(xiǎn)性大。為了克服這些問(wèn)題，優(yōu)選使用被涉及成當(dāng)其與目的核酸互補(bǔ)結(jié)合時(shí)熒光特性發(fā)生變化的寡核苷酸探針。作為該寡核苷酸探針，可以使用被稱為分子信標(biāo)(molecular beacon)的、利用了 FRET的已知的探針，但從探針設(shè)計(jì)和探針合成的容易性出發(fā)，作為更優(yōu)選的方法，可以列舉如下方法 在以嵌入性熒光色素標(biāo)記的、且被設(shè)計(jì)成當(dāng)其與目的核酸形成互補(bǔ)的雙鏈時(shí)由于嵌入性熒光色素部分嵌入上述互補(bǔ)的雙鏈部分而熒光特性發(fā)生變化的寡核苷酸探針的存在下，實(shí)施上述核酸擴(kuò)增步驟，并測(cè)定熒光特性的變化(參見(jiàn)專利文獻(xiàn)9和非專利文獻(xiàn)11)。作為上述嵌入性熒光色素，沒(méi)有特別的限定，可以使用常用的噁唑黃、噻唑橙、溴化乙錠以及它們的衍生物等。作為上述熒光特性的變化，可以列舉熒光強(qiáng)度的變化。例如， 已知在噁唑黃的情況下，通過(guò)插入雙鏈DNA中，510nm的熒光(激發(fā)波長(zhǎng)490nm)顯著地增加。上述嵌入性熒光色素標(biāo)記寡核苷酸探針具有如下結(jié)構(gòu)在與上述RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物上的目的RNA互補(bǔ)的寡核苷酸中，末端、磷酸二酯部或堿基部分通過(guò)適當(dāng)?shù)倪B接子結(jié)合有嵌入性熒光色素，進(jìn)而以防止自3’末端的羥基開(kāi)始的延伸為目的對(duì)該3’末端的羥基進(jìn)行適當(dāng)?shù)男揎?參見(jiàn)專利文獻(xiàn)9和非專利文獻(xiàn)11)。嵌入性熒光色素對(duì)寡核苷酸的標(biāo)記，可以通過(guò)已知的方法向寡核苷酸中導(dǎo)入官能團(tuán)，從而使嵌入性熒光色素結(jié)合到寡核苷酸上(參見(jiàn)專利文獻(xiàn)9和非專利文獻(xiàn)11)。另外，作為上述官能團(tuán)的導(dǎo)入方法，還可以使用市售的Label-ON Reagents (Clontech公司制)等。作為本發(fā)明的一個(gè)方式，提供如下方法向試樣中添加至少含有5’末端具有T7啟動(dòng)子序列(序列號(hào)47)的第一引物、第二引物、嵌入性熒光色素標(biāo)記寡核苷酸探針、切斷用寡核苷酸、AMV逆轉(zhuǎn)錄酶、T7 RNA聚合酶、緩沖劑、鎂鹽、鉀鹽、核苷三磷酸、核糖核苷三磷酸、 二甲亞砜(DMSO)的擴(kuò)增試劑，在反應(yīng)溫度為40至60°C (優(yōu)選43°C)的一定溫度下使其反應(yīng)，同時(shí)經(jīng)時(shí)地測(cè)定反應(yīng)液的熒光強(qiáng)度。在上述方式中，由于經(jīng)時(shí)地測(cè)定熒光強(qiáng)度，因此可以確認(rèn)到熒光增加顯著的任意時(shí)間結(jié)束測(cè)定，且通?？梢允购怂釘U(kuò)增和測(cè)定在總計(jì)30分鐘以內(nèi)結(jié)束。作為本發(fā)明的一個(gè)方式，測(cè)定上述試樣中的CK19 mRNA，通過(guò)比較所得到的熒光強(qiáng)度比的信息和測(cè)定已知濃度的CK19 RNA時(shí)熒光強(qiáng)度比的信息，能夠算出試樣中存在的特定堿基序列的量(對(duì)象RNA拷貝數(shù))。特定堿基序列的檢測(cè)，可以采用例如對(duì)進(jìn)行了一定時(shí)間的上述反應(yīng)的反應(yīng)液使用可與特定堿基序列互補(bǔ)地結(jié)合的固定化和標(biāo)記化探針的夾心分析法，但如前所述，優(yōu)選使用與特定堿基序列特異性地結(jié)合的嵌入性熒光色素標(biāo)記寡核苷酸探針的方法。另外，由于該探針不阻礙上述RNA擴(kuò)增反應(yīng)，因此特別優(yōu)選在其存在下實(shí)施上述特定堿基序列的擴(kuò)增、并監(jiān)測(cè)特定堿基序列的擴(kuò)增情況的方法。而且，在嵌入性熒光色素標(biāo)記寡核苷酸探針共存下進(jìn)行特定堿基序列的擴(kuò)增時(shí)，為了不使該探針部分發(fā)揮作為延伸反應(yīng)的引物的功能，例如優(yōu)選在其3’末端附加羥基乙酸或生物素等。然后，通過(guò)熒光檢測(cè)器測(cè)定擴(kuò)增反應(yīng)中該嵌入性熒光色素標(biāo)記寡核苷酸探針與特定堿基序列結(jié)合而產(chǎn)生的熒光信號(hào)，將由其曲線(profile)得到的信息(例如熒光色素產(chǎn)生的熒光的強(qiáng)度達(dá)到一定強(qiáng)度為止所需要的反應(yīng)時(shí)間等)與由已知量的標(biāo)準(zhǔn)RNA的曲線得到的信息進(jìn)行比較，由此能夠確認(rèn)是否存在特定堿基序列、或者由擴(kuò)增后的特定堿基序列的量(RNA拷貝數(shù))推測(cè)試樣中存在的特定核酸序列的量(對(duì)象RNA拷貝數(shù))。另外，上述測(cè)定試劑中所含的全部試樣可封入一個(gè)容器中這一點(diǎn)值得特別說(shuō)明。 即，只要實(shí)施將一定量的試樣分注到所述一個(gè)容器中的操作，則此后可以自動(dòng)地測(cè)定CK19 mRNA。為了例如能從外部測(cè)定熒光色素產(chǎn)生的信號(hào)，只要該容器的至少一部分由透明的材料構(gòu)成即可，可在分注試樣后可密封的容器在防止污染方面特別優(yōu)選。上述方式的RNA擴(kuò)增/測(cè)定方法由于可以一個(gè)階段、在一定溫度下實(shí)施，因此可以說(shuō)是比RT-PCR簡(jiǎn)便且適合自動(dòng)化的方法。根據(jù)本發(fā)明，CK19 mRNA的高特異性、高靈敏度、 快速、簡(jiǎn)便、在一定溫度下且以一個(gè)階段直接進(jìn)行擴(kuò)增/檢測(cè)成為可能。在本發(fā)明中，基于試樣中的目的RNA(CK19基因的mRNA)，合成5’末端具有DNA依賴性RNA聚合酶的啟動(dòng)子區(qū)域的雙鏈DNA，以上述DNA為模板生成大量的單鏈RNA，并且生成的單鏈RNA量顯著地增大，用嵌入性熒光色素標(biāo)記后的寡核苷酸探針與生成的單鏈RNA 互補(bǔ)結(jié)合，由此測(cè)定熒光增加，在上述的步驟中，通過(guò)分析熒光強(qiáng)度增加的過(guò)程，能簡(jiǎn)便且快速地確定初始RNA量。本發(fā)明的CK19 mRNA測(cè)定方法中，核酸擴(kuò)增和測(cè)定的時(shí)間在30分以內(nèi)，其與已知的利用RT-PCR法(通常2小時(shí)以上)、NASBA法(90分鐘以上)、TMA法(90 分鐘以上)、RT-LAMP法(通常30至60分鐘左右)的測(cè)定相比，具有同等以上的快速性。另外，提供用于以一個(gè)階段的操作擴(kuò)增/檢測(cè)CK19基因的mRNA的寡核苷酸，即提供用于擴(kuò)增CK19 mRNA的寡核苷酸、以及用于檢測(cè)CK19 mRNA的寡核苷酸，由此，能夠?yàn)樯瘜W(xué)/分子生物學(xué)/醫(yī)療領(lǐng)域等提供利用了上述寡核苷酸的簡(jiǎn)便、快速且高靈敏度的CK19 mRNA表達(dá)細(xì)胞的測(cè)定方法、以及定量試劑。
實(shí)施例以下，通過(guò)實(shí)施例更具體地說(shuō)明本發(fā)明，但這些僅僅是示例，本發(fā)明并不限于這些實(shí)施例。實(shí)施例1標(biāo)準(zhǔn)RNA的制備后述的實(shí)施例中使用的CK19 RNA(以下記為標(biāo)準(zhǔn)RNA)通過(guò)(1)至⑵所示的方法進(jìn)行制備。(1)克隆在 GenBank 中登記的 CK19 的堿基序列(GenBank Accession No. NM_002276、1490個(gè)堿基)中的第160至1353位堿基(1194個(gè)堿基)的雙鏈DNA。(2)以(1)中制備的雙鏈DNA為模板，實(shí)施體外轉(zhuǎn)錄。接著通過(guò)DNase I處理將該雙鏈DNA完全消化，然后提純并制備RNA。該RNA通過(guò)測(cè)定260nm下的吸光度而定量。實(shí)施例2嵌入性熒光色素標(biāo)記寡核苷酸探針的制備制作用嵌入性熒光色素標(biāo)記了的寡核苷酸探針。使用Label-ON Reagents (Clontech公司制)將氨基導(dǎo)入序列號(hào)39所記載的序列的自5’末端起第9位的 T、序列號(hào)40所記載的序列的自5’末端起第12位的T、序列號(hào)41所記載的序列的自5’末
16端起第13位的A、序列號(hào)42所記載的序列的自5’末端起第13位的C、序列號(hào)43所記載的序列的自5’末端起第7位的T、序列號(hào)44所記載的序列的自5’末端起第11位的G、序列號(hào)45所記載的序列的自5’末端起第10位的C、序列號(hào)46所記載的序列的自5’末端起第 9位的G的位置，進(jìn)而用生物素修飾3’末端。對(duì)上述氨基標(biāo)記作為嵌入性熒光色素的噁唑黃，制備噁唑黃標(biāo)記寡核苷酸探針(序列號(hào)39至46)(參見(jiàn)Ishiguro, T. et al.，Nucleic Acids Res.，24，4992-4997 (1996).(非專利文獻(xiàn) 12))。實(shí)施例3 CK19 RNA的測(cè)定(之1)使用表1中示出的組合中[1]至[28]所示的切斷用寡核苷酸、第一引物、第二引物、嵌入性熒光色素標(biāo)記寡核苷酸探針(以下記為INAF探針)，通過(guò)(1)至(4)所示的方法，進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)RNA的測(cè)定。需要說(shuō)明的是，表1中，序列號(hào)19至22是序列號(hào)1的部分序列， 序列號(hào)23和24是序列號(hào)2的部分序列，序列號(hào)25和26是序列號(hào)3的部分序列，序列號(hào)27 和28是序列號(hào)4的部分序列，序列號(hào)29至32是序列號(hào)5的部分序列，序列號(hào)33和34是序列號(hào)6的部分序列，序列號(hào)35和36是序列號(hào)7的部分序列，序列號(hào)37和38是序列號(hào)8 的部分序列。表權(quán)利要求
1.一種試樣中的細(xì)胞角蛋白19(以下記為“CK19”)mRNA的測(cè)定方法，其特征在于， 所述測(cè)定方法使用了具有與CK19 mRNA內(nèi)的特定堿基序列的一部分同源的序列的第一引物、以及具有與特定堿基序列的一部分互補(bǔ)的序列的第二引物，其中第一或第二引物中任意一個(gè)的5’末端附加有RNA聚合酶的啟動(dòng)子序列，且所述測(cè)定方法包括下述的步驟(1)以RNA為模板利用具有RNA依賴性DNA聚合酶活性的酶合成與特定堿基序列互補(bǔ)的cDNA的步驟；(2)利用具有核糖核酸酶H(RNaSeH)活性的酶將所述(1)的反應(yīng)中得到的RNA-DNA雙鏈的RNA分解的步驟(單鏈DNA的生成)；(3)以單鏈DNA為模板利用具有DNA依賴性DNA聚合酶活性的酶生成具有可轉(zhuǎn)錄所述特定堿基序列或與所述特定堿基序列互補(bǔ)的序列的RNA的啟動(dòng)子序列的雙鏈DNA的步驟；(4)利用具有RNA聚合酶活性的酶以所述雙鏈DNA為模板生成RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的步驟；(5)通過(guò)使該RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物成為所述(1)的反應(yīng)中的cDNA合成的模板而連鎖地生成 RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的步驟；和(6)測(cè)定所述RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物量的步驟，并且，所述第一和第二引物為以下的任意一組(i)所述第一引物為由以序列號(hào)1表示的堿基序列中的至少15個(gè)連續(xù)的堿基形成的寡核苷酸，所述第二引物為由以序列號(hào)5表示的堿基序列中的至少15個(gè)連續(xù)的堿基形成的寡核苷酸；( )所述第一引物為由以序列號(hào)2表示的堿基序列中的至少15個(gè)連續(xù)的堿基形成的寡核苷酸，所述第二引物為由以序列號(hào)6表示的堿基序列中的至少15個(gè)連續(xù)的堿基形成的寡核苷酸；(iii)所述第一引物為由以序列號(hào)3表示的堿基序列中的至少15個(gè)連續(xù)的堿基形成的寡核苷酸，所述第二引物為由以序列號(hào)7表示的堿基序列中的至少15個(gè)連續(xù)的堿基形成的寡核苷酸；和(iv)所述第一引物為由以序列號(hào)4表示的堿基序列中的至少15個(gè)連續(xù)的堿基形成的寡核苷酸，所述第二引物為由以序列號(hào)8表示的堿基序列中的至少15個(gè)連續(xù)的堿基形成的寡核苷酸。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的CK19mRNA的測(cè)定方法，其特征在于，所述第一和第二引物為以下的任意一組(i)所述第一引物為由以序列號(hào)19至22中任意一個(gè)表示的堿基序列中的至少15個(gè)連續(xù)的堿基形成的寡核苷酸，所述第二引物為由以序列號(hào)29至32中任意一個(gè)表示的堿基序列中的至少15個(gè)連續(xù)的堿基形成的寡核苷酸；( )所述第一引物為由以序列號(hào)23或24表示的堿基序列中的至少15個(gè)連續(xù)的堿基形成的寡核苷酸，所述第二引物為由以序列號(hào)33或34表示的堿基序列中的至少15個(gè)連續(xù)的堿基形成的寡核苷酸；(iii)所述第一引物為由以序列號(hào)25或26表示的堿基序列中的至少15個(gè)連續(xù)的堿基形成的寡核苷酸，所述第二引物為由以序列號(hào)35或36表示的堿基序列中的至少15個(gè)連續(xù)的堿基形成的寡核苷酸；和(iv)所述第一引物為由以序列號(hào)27或28表示的堿基序列中的至少15個(gè)連續(xù)的堿基形成的寡核苷酸，所述第二引物為由以序列號(hào)37或38表示的堿基序列中的至少15個(gè)連續(xù)的堿基形成的寡核苷酸。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的CK19mRNA的測(cè)定方法，其特征在于，所述(6)的步驟 (測(cè)定RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物量的步驟)，通過(guò)在熒光色素標(biāo)記寡核苷酸探針存在下測(cè)定所述熒光特性的變化而實(shí)現(xiàn)，所述熒光色素標(biāo)記寡核苷酸探針被設(shè)計(jì)成當(dāng)其與目的RNA形成互補(bǔ)的雙鏈時(shí)熒光特性發(fā)生變化。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的測(cè)定方法，其特征在于，所述熒光色素標(biāo)記寡核苷酸探針為通過(guò)連接子結(jié)合了嵌入性熒光色素的嵌入性熒光色素標(biāo)記寡核苷酸探針。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的測(cè)定方法，其特征在于，所述嵌入性熒光色素標(biāo)記寡核苷酸探針含有由序列號(hào)39至46所示的任意一個(gè)堿基序列中或者其互補(bǔ)序列中的至少15個(gè)連續(xù)的堿基形成的寡核苷酸。
6.根據(jù)權(quán)利要求1至5中任一項(xiàng)所述的CK19mRNA的測(cè)定方法，其特征在于，在所述 (1)的步驟(以RNA為模板利用具有RNA依賴性DNA聚合酶活性的酶合成與特定堿基序列互補(bǔ)的cDNA的步驟)之前，進(jìn)行如下步驟以CK19 mRNA中的特定堿基序列為模板，使用(i)切斷用寡核苷酸，其具有與所述特定堿基序列中的第一引物的同源區(qū)域的5’末端位點(diǎn)重疊的區(qū)域、以及與所述特定堿基序列中的從該位點(diǎn)向5’方向的相鄰的區(qū)域互補(bǔ)的序列；和( )具有核糖核酸酶H (RNase H)活性的酶，在所述特定堿基序列的5’末端位點(diǎn)切斷所述RNA。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的測(cè)定方法，其特征在于，所述切斷用寡核苷酸為由以序列號(hào)9 至18中任意一個(gè)表示的堿基序列形成的寡核苷酸。
8.一種寡核苷酸，其特征在于，其為用于特異性地?cái)U(kuò)增或檢測(cè)CK19 mRNA的寡核苷酸， 該寡核苷酸含有由序列號(hào)1至8或序列號(hào)39至46所示的任意一個(gè)堿基序列中或者其互補(bǔ)序列中的至少15個(gè)連續(xù)的堿基形成的寡核苷酸。
9.一種CK19 mRNA的測(cè)定試劑，其特征在于，含有至少一種權(quán)利要求8所述的寡核苷酸。
全文摘要
細(xì)胞角蛋白19的mRNA的擴(kuò)增/檢測(cè)方法，在RNA擴(kuò)增步驟中，通過(guò)被設(shè)計(jì)成當(dāng)其與擴(kuò)增后的RNA形成互補(bǔ)的雙鏈時(shí)信號(hào)特性發(fā)生變化的寡核苷酸探針，經(jīng)時(shí)地測(cè)定擴(kuò)增后的RNA產(chǎn)物量，其中，所述RNA擴(kuò)增步驟包括如下步驟使用由具有與細(xì)胞角蛋白19 mRNA中的一部分同源的序列的第一引物、具有與該細(xì)胞角蛋白19 mRNA中的一部分互補(bǔ)的序列的第二引物(第一或第二引物中任意一個(gè)的5’末端附加有啟動(dòng)子序列)構(gòu)成的寡核苷酸的組合，通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄酶，生成含有啟動(dòng)子序列的雙鏈DNA，以該雙鏈DNA為模板、利用RNA聚合酶生成RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，接著以該RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為利用所述逆轉(zhuǎn)錄酶合成DNA的模板，生成所述雙鏈DNA。
文檔編號(hào)C12N15/09GK102301003SQ200980155678
公開(kāi)日2011年12月28日 申請(qǐng)日期2009年11月30日 優(yōu)先權(quán)日2008年11月28日
發(fā)明者大仲悟, 尾本大輔, 林俊典, 齊藤壽一 申請(qǐng)人:東曹株式會(huì)社