專利名稱：用于制備聚(5-羥基戊酸)和5碳化合物的綠色工藝和組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明大體上涉及產(chǎn)生含有5-羥基戊酸的聚羥基烷酸和其共聚物以及含有5個(gè)碳原子的化學(xué)中間物(C5化合物)的轉(zhuǎn)基因生物體。相關(guān)申請(qǐng)案的交叉參考本申請(qǐng)案主張2008年12月12日申請(qǐng)的美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)案第61/122，250號(hào)的權(quán)益和優(yōu)先權(quán)，且容許該案按全文引用并入本文中。
背景技術(shù)：
聚羥基烷酸(Polyhydroxyalkanoate，PHA)是可用于制備(但不限于)以下各物的生物可降解塑料膜(例如包裝膜、農(nóng)用膜、覆膜(mulch film))、高爾夫球球座、球帽和蓋板、農(nóng)用支座和支柱、紙和紙板涂層(例如用于杯子、盤子、盒子等)、熱成形產(chǎn)品(例如托盤、容器、乳酪罐、花盆、面碗、模具等)、外殼(例如用于電子物品)、袋子(例如垃圾袋、食品雜貨袋、食品袋、堆肥袋等)、衛(wèi)生用品(例如尿布、女用衛(wèi)生產(chǎn)品、失禁產(chǎn)品、一次性擦拭片等)和用于丸粒狀產(chǎn)品(例如丸粒狀肥料、除草劑、殺蟲劑、種子等)的涂層。PHA也已用于開發(fā)生物醫(yī)療裝置，包括縫合線、修復(fù)裝置、修復(fù)補(bǔ)片(impair patch)、吊帶、心血管補(bǔ)片、整形外科用針(orthopedic pin)、粘附阻隔膜(adhesion barrier)、支架、引導(dǎo)組織修復(fù)/再生裝置、關(guān)節(jié)軟骨修復(fù)裝置、神經(jīng)導(dǎo)管、肌腱修復(fù)裝置、 骨髓支架和傷口敷料。聚羥基烷酸可由發(fā)酵工藝制造。現(xiàn)有的用于制造聚羥基烷酸的發(fā)酵方法利用在特定基質(zhì)上培養(yǎng)的野生型或轉(zhuǎn)基因微生物來產(chǎn)生所需的PHA聚合物組合物。在許多情況下， 相關(guān)聚合物是3-羥基丁酸的(D)-異構(gòu)物與另一種3-、4_或5-羥基酸共聚合得到的共聚物。產(chǎn)生的這些共聚物是以顆粒形式包括在細(xì)胞內(nèi)，并且是無(wú)規(guī)共聚物。共聚物聚(3-羥基丁酸-共-5- 15 ! Sl) (poly (3-hydroxybutyrate-co-5-hydroxyvalerate)，PHB5HV) 和均聚物聚(5-羥基戊酸)(polyG-hydroxyvalerate)，P5HV)適用作工業(yè)材料和塑料， 且其優(yōu)點(diǎn)在于，其為生物可降解且可生物再吸收的材料。迄今為止，已經(jīng)通過將如5-羥基戊酸(5HV)或1，5-戊二醇等石油來源的5碳基質(zhì)饋給微生物來產(chǎn)生這些材料，這種微生物能夠?qū)⑦@些基質(zhì)代謝成活化的單體5HV輔酶A，并使其在PHA聚合酶的作用下聚合形成 PHB5HV或P5HV聚合物，由這些方法產(chǎn)生的PHB5HV和P5HV聚合物只是部分由可再生資源制得，并且因5碳石油基質(zhì)的成本很高而相當(dāng)昂貴。亟需使用非石油性可再生碳基質(zhì)作為產(chǎn)生PHV5HV和P5HV聚合物的原料，從而降低成本并提供完全由可再生資源制成的材料。還需要開發(fā)用于產(chǎn)生這些聚合物且減少溫室氣體產(chǎn)生的工藝。適合的可再生資源包括由農(nóng)業(yè)得到的碳水化合物原料，包括一種或一種以上選自以下各物的原料淀粉、蔗糖、葡萄糖、乳糖、果糖、木糖、麥芽糖、阿拉伯糖，以及氨基酸原料，包括賴氨酸和脯氨酸。因此，本發(fā)明的一個(gè)目的是提供能在野生型或遺傳工程改造過的聚羥基烷酸制造者中引入基因，以產(chǎn)生可合成例如5-羥基戊酸等單體的新品系的重組生物體和工藝，這些新品系合成的單體都是由非石油來源的基質(zhì)制造。本發(fā)明另一目的是提供穩(wěn)定工程改造可合成含有5-羥基戊酸作為唯一成分或作為共聚單體的PHA的重組生物體的技術(shù)和程序。本發(fā)明另一目的是提供穩(wěn)定工程改造可合成例如5-氨基戊酸(5AP)、戊二酸和1， 5戊二醇(1，5 pentanediol,PDO)等5碳化合物的重組生物體的技術(shù)和程序。

發(fā)明內(nèi)容
含5HV的PHA生物聚合物本發(fā)明提供用于產(chǎn)生包含5-羥基戊酸(5HV)單體的聚羥基烷酸(PHA)的重組宿主，以及由可再生碳基質(zhì)產(chǎn)生包含5HV單體的PHA的方法。還提供產(chǎn)生例如5-氨基戊酸 (5AP)、5HV、戊二酸和1，5戊二醇(PDO)等5碳化合物的某些重組宿主。一個(gè)實(shí)施例提供一種重組宿主，其表達(dá)編碼聚羥基烷酸(PHA)合成酶和5-羥基戊酸輔酶A(5HV-CoA)轉(zhuǎn)移酶或5HV-CoA合成酶的基因，以及至少一個(gè)編碼賴氨酸分解代謝路徑中涉及的異源酶的轉(zhuǎn)基因，其中當(dāng)向所述生物體提供選自賴氨酸、淀粉、蔗糖、葡萄糖、乳糖、果糖、木糖、麥芽糖、阿拉伯糖或其組合的可再生碳基質(zhì)時(shí)，宿主將產(chǎn)生含有5HV單體的 PHA聚合物；并且產(chǎn)生的5HV單體的量高于不存在所述轉(zhuǎn)基因表達(dá)的情形。示范性宿主表達(dá)一個(gè)或一個(gè)以上編碼賴氨酸2-單加氧酶、5-氨基戊酰胺酶、5-氨基戊酸轉(zhuǎn)氨酶、戊二酸半醛還原酶、5-羥基戊酸輔酶A轉(zhuǎn)移酶和聚羥基烷酸合成酶的基因，以產(chǎn)生含有5HV單體的PHA聚合物。優(yōu)選所述宿主在編碼戊二酸半醛脫氫酶的基因和/或編碼賴氨酸輸出蛋白的基因中具有缺失或突變。特別適合的宿主還能夠過量產(chǎn)生賴氨酸，并對(duì)如S-(2-氨基乙基)半胱氨酸等有毒賴氨酸類似物具有抗性。在另一實(shí)施例中，還由轉(zhuǎn)基因表達(dá)一個(gè)或一個(gè)以上編碼PHA合成酶、5HV_CoA轉(zhuǎn)移酶或5HV-CoA合成酶的基因。在另一實(shí)施例中，將賴氨酸與一種或一種以上選自淀粉、蔗糖、葡萄糖、乳糖、果糖、木糖、麥芽糖、阿拉伯糖或其組合的可再生碳基質(zhì)的組合饋給重組生物體，由此產(chǎn)生含有5HV的PHA聚合物，并由細(xì)胞回收得到所述聚合物。在另一實(shí)施例中，將一種或一種以上選自淀粉、蔗糖、葡萄糖、乳糖、果糖、木糖、麥芽糖、阿拉伯糖或其組合的可再生碳基質(zhì)饋給重組生物體，由此產(chǎn)生含有5HV的PHA聚合物，并由細(xì)胞回收得到所述聚合物。由重組宿主產(chǎn)生的聚合物可為5HV單體的均聚物或共聚物。優(yōu)選的共聚物為 PHB5HV。由重組宿主產(chǎn)生的其它有用聚合物為共聚物聚(3-羥基丙酸-共-5-羥基戊酸) 和聚(4-羥基丁酸-共-5-羥基戊酸)，以及均聚物P5HV。所述宿主可以是原核宿主或真核宿主。優(yōu)選的原核宿主為大腸桿菌、富養(yǎng)羅爾斯通氏菌(Ralstonia eutropha)、產(chǎn)喊弧菌(Alcaligenes latus)禾口谷氛酸棒桿菌 (C.glutamicum)。還提供由賴氨酸，或一種或一種以上選自淀粉、蔗糖、葡萄糖、乳糖、果糖、木糖、麥芽糖、阿拉伯糖或其組合的可再生碳基質(zhì)產(chǎn)生PHA聚合物的重組宿主。示范性宿主表達(dá)賴氨酸2-單加氧酶、5-氨基戊酰胺酶、5-氨基戊酸轉(zhuǎn)氨酶、戊二酸半醛還原酶、5-羥基戊酸輔酶A轉(zhuǎn)移酶和聚羥基烷酸合成酶，由此產(chǎn)生包括5HV的聚合物。這種聚合物是使用賴氨酸和一種或一種以上選自淀粉、蔗糖、葡萄糖、乳糖、果糖、木糖、麥芽糖和阿拉伯糖的可再生碳基質(zhì)作為原料產(chǎn)生。優(yōu)選所述宿主在編碼戊二酸半醛脫氫酶和賴氨酸輸出蛋白的基因中具有缺失。1，5-戊二醇的產(chǎn)生另一重組宿主經(jīng)遺傳工程改造成過量表達(dá)5-羥基戊酸輔酶A轉(zhuǎn)移酶、輔酶A依賴性丙醛脫氫酶和1，3-丙二醇脫氫酶，由此產(chǎn)生1，5戊二醇。1，5戊二醇是單獨(dú)使用5-羥基戊酸、賴氨酸、淀粉、蔗糖、葡萄糖、乳糖、果糖、木糖、麥芽糖和阿拉伯糖或使用其組合作為原料產(chǎn)生。優(yōu)選重組宿主在adhE、IdhA和ackA-pta中具有缺失，并表達(dá)編碼賴氨酸2_單加氧酶、5-氨基戊酰胺酶、5-氨基戊酸轉(zhuǎn)氨酶以及一個(gè)或一個(gè)以上戊二酸或琥珀酸半醛還原酶的基因。特別適合的宿主還能夠過量產(chǎn)生賴氨酸，并對(duì)如S-(2-氨基乙基)半胱氨酸等有毒賴氨酸類似物具有抗性。這種生物體優(yōu)選具有較低或無(wú)戊二酸半醛脫氫酶活性。本發(fā)明提供一種由可再生碳基質(zhì)產(chǎn)生1，5-戊二醇的方法，其中重組生物體被饋以可再生碳基質(zhì)，并產(chǎn)生1，5-戊二醇，將其分泌到培養(yǎng)基中，且由培養(yǎng)基回收1，5-戊二醇。在另一實(shí)施例中，本發(fā)明提供由可再生資源產(chǎn)生的1，5_戊二醇。戊二酸的產(chǎn)生本發(fā)明還提供由賴氨酸，或一種或一種以上選自淀粉、蔗糖、葡萄糖、乳糖、果糖、 木糖、麥芽糖和阿拉伯糖或其組合的可再生碳基質(zhì)過量產(chǎn)生戊二酸的重組宿主。示范性宿主表達(dá)編碼賴氨酸2-單加氧酶、5-氨基戊酰胺酶、5-氨基戊酸轉(zhuǎn)氨酶和一個(gè)或一個(gè)以上戊二酸半醛脫氫酶的基因。特別適合的宿主還能夠過量產(chǎn)生賴氨酸，并對(duì)如S- (2-氨基乙基) 半胱氨酸等有毒賴氨酸類似物具有抗性。本發(fā)明提供一種由可再生碳基質(zhì)過量產(chǎn)生戊二酸的方法，其中重組生物體被饋以選自賴氨酸、淀粉、蔗糖、葡萄糖、乳糖、果糖、木糖、麥芽糖和阿拉伯糖或其組合的可再生碳基質(zhì)，并過量產(chǎn)生戊二酸，將其分泌到培養(yǎng)基中，并由培養(yǎng)基回收戊二酸。


圖1是繪示可由可再生資源以生物方式產(chǎn)生的各種5碳分子的示意圖，在一些實(shí)例中，這些基于可再生資源的分子可使用標(biāo)準(zhǔn)化學(xué)方法相互轉(zhuǎn)變并用以借助化學(xué)聚合方法制備聚合物等。圖2A是繪示合成含有5-羥基戊酸的聚羥基烷酸聚合物，以及例如5-氨基戊酸 (5-AP0)、戊二酸、δ -戊內(nèi)酯(δ -valerolactone, DVL)和1，5戊二醇等5碳化合物的生物化學(xué)路徑的示意圖。還繪示可能需要去除或降低活性(如十字形(X)所指示)以使上文所列所需產(chǎn)物達(dá)到最佳碳通量的競(jìng)爭(zhēng)性代謝路徑。圖2B繪示催化以下生物合成反應(yīng)的酶(1)賴氨酸2-單加氧酶，EC 1. 13. 12.2 ； (2) 5-氨基戊酰胺酶(也稱為δ -氨基戊酰胺酶)，EC 3. 5. 1. 30 ； (3) 5-氨基戊酸轉(zhuǎn)氨酶(也稱為δ -氨基戊酸轉(zhuǎn)氨酶)，EC 2. 6. 1. 48 ； (4)琥珀酸半醛還原酶(也稱為5-氧代戊酸還原酶)，EC 1. 1. 1.61 ； (5)輔酶A轉(zhuǎn)移酶，EC 2. 8. 3. η； (6)?；o酶 A 合成酶，EC 6. 2. 1. 3 ； (7) PHA 合成酶，EC 2. 3. 1. η ； (8) β -酮?；o酶A硫解酶，EC 2. 3. 1.9 ； (9)乙酰乙?；o酶A還原酶，EC 1. 1. 1. 36 ； (10)戊二酸-半醛脫氫酶，EC 1.2. 1.20。圖3是繪示由L-賴氨酸經(jīng)由尸胺和5-氨基戊醛合成5-氨基戊酸的替代途徑的生物化學(xué)路徑的示意圖。圖4是繪示由L-脯氨酸合成5-氨基戊酸的生物化學(xué)路徑的示意圖。圖5是繪示由α -酮戊二酸合成戊二酸半醛(用以產(chǎn)生5-羥基戊酸和其衍生物以及戊二酸的代謝中間物)的生物化學(xué)路徑的示意圖。圖6是繪示由草酰乙酸(TCA循環(huán)的中間物)合成L-賴氨酸的生物化學(xué)路徑的示意圖。圖7是繪示合成1，5戊二醇的生物化學(xué)路徑的示意圖。圖8Α是繪示時(shí)間(分鐘)與經(jīng)處理的菌株3291的細(xì)胞培養(yǎng)物的總離子豐度的關(guān)系的色譜圖。圖8Β是經(jīng)處理的菌株3291的細(xì)胞培養(yǎng)物的離子譜圖，其繪示質(zhì)荷比“m/z” 與所述細(xì)胞培養(yǎng)物的離子豐度(相對(duì)單位)的關(guān)系。
具體實(shí)施例方式I.定義下一節(jié)中將定義和闡明本文中使用的多個(gè)術(shù)語(yǔ)。術(shù)語(yǔ)“PHA共聚物”是指由至少兩種不同的羥基烷酸單體構(gòu)成的聚合物。術(shù)語(yǔ)“PHA均聚物”是指由單一羥基烷酸單體構(gòu)成的聚合物。本文中使用的“載體”是一種復(fù)制子，例如質(zhì)粒、噬菌體或柯斯質(zhì)粒(cosmid)，其中可插入另一 DNA區(qū)段以引起插入的區(qū)段的復(fù)制。載體可以是表達(dá)載體。本文中使用的“表達(dá)載體”是包括一個(gè)或一個(gè)以上表達(dá)控制序列的載體。本文中使用的“表達(dá)控制序列”是控制和調(diào)控另一 DNA序列的轉(zhuǎn)錄和/或翻譯的 DNA序列。本文中使用的“可操作地連接”是指并入遺傳構(gòu)建體中以使表達(dá)控制序列能有效地控制相關(guān)編碼序列的表達(dá)。本文中使用的“轉(zhuǎn)化”和“轉(zhuǎn)染”涵蓋借助此項(xiàng)技術(shù)中已知的多種技術(shù)將核酸引入細(xì)胞中。本文中使用的“過量產(chǎn)生”是指與未工程改造過的生物體相比較，工程改造過的生物體產(chǎn)生更多量的特定化合物。本文中使用的術(shù)語(yǔ)“可再生原料”、“可再生碳基質(zhì)”和“可再生基質(zhì)”都可互換使用?！百|(zhì)?！笔峭ㄟ^在前面加小寫字母“P”和/或在后面加大寫字母和/或數(shù)字表示。本文中使用的術(shù)語(yǔ)“異源”是指來自另一宿主。所述另一宿主可為相同或不同物種。II.用于產(chǎn)生聚羥基烷酸和5碳化合物的代謝路徑本發(fā)明提供的重組生物體具有用于產(chǎn)生含有5-羥基戊酸的聚羥基烷酸聚合物， 以及例如5-氨基戊酸(5AP)、5-羥基戊酸(5HV)、戊二酸和1，5戊二醇(PDO)等5碳化合物的生物化學(xué)路徑的酶。原核或真核宿主經(jīng)遺傳工程改造成表達(dá)由基于可再生資源的原料產(chǎn)生5-羥基戊酸、其聚合物或所揭示的5碳化合物所需的酶。下文將提供產(chǎn)生所需產(chǎn)物的酶促路徑。A. 5-氨基戊酸
5-氨基戊酸(5AP)可由L-賴氨酸(一種α -氨基酸)按兩個(gè)酶促步驟產(chǎn)生，其中5-氨基戊酰胺作為中間物(圖幻。這些酶中的第一個(gè)酶賴氨酸2-單加氧酶是各種假單胞菌(pseudomonad)菌株的賴氨酸降解路徑中的第一個(gè)酶促步驟(武田(Takeda)和早石(Hayaishi)，生物化學(xué)雜志(J. Biol. Chem.) 241 =2733-2736 ； (1966)；早石，細(xì)菌學(xué)評(píng)述(Bacteriol. Rev.) 30 :720-731 (1966)；瑞茲(Reitz)和洛德維爾(Rodwell)，生物化學(xué)雜志(J.Biol Chem. )245 :3091-3096(1970)；弗拉西納(Flashner)和馬希(Massey), 生物化學(xué)雜志(J. Biol. Chem. )249 :2579-2586(1974))。在惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)中鑒別出了編碼賴氨酸2-單加氧酶的基因，且將所述基因稱為davB(雷維勒 (Revelles)等人，細(xì)菌學(xué)雜志(J. Bacteriol.) 187 :7500-7510 (2005)) 第二個(gè)酶促步驟將5-氨基戊酰胺轉(zhuǎn)變成5AP，并由5-氨基戊酰胺酶催化(瑞茲(Reitz)等人，分析生物化學(xué)(Anal. Biochem.) 28 =269-272 (1969)；瑞茲和洛德維爾(Rodwell)，生物化學(xué)雜志 (J. Biol. Chem.) 245 =3091-3096 (1970))，這種酶是由惡臭假單胞菌中的davA所編碼(雷維勒(Revelles)等人，細(xì)菌學(xué)雜志(J. Bacteriol.) 187 :7500-7510 (2005))
如圖3中所示，可利用替代性路徑，經(jīng)3個(gè)酶促反應(yīng)將L-賴氨酸轉(zhuǎn)變成5AP，這3個(gè)酶促反應(yīng)包括賴氨酸脫羧酶，用以產(chǎn)生尸胺；腐胺轉(zhuǎn)氨酶，用以形成5-氨基戊醛；和Y -氨基丁醛脫氫酶，用以生物合成5AP。如圖4中所略述，也可由L-脯氨酸代替L-賴氨酸，經(jīng)2個(gè)酶促反應(yīng)產(chǎn)生5AP，這2 個(gè)酶促反應(yīng)包括脯氨酸消旋酶，用以生物合成D-脯氨酸；和脯氨酸還原酶，用以形成5AP。B. 5-羥基戊酸如圖2中所略述，另一 5碳化合物5HV的生物合成可由5AP經(jīng)2個(gè)酶促步驟進(jìn)行。5AP經(jīng)5AP轉(zhuǎn)氨酶(瑞茲(Reitz)和洛德維爾(Rodwell)，生物化學(xué)雜志(J. Biol. Chem.) 245 :3091-3096(1970))和經(jīng)鑒別且名為davT的來自惡臭假單胞菌的基因(埃斯派諾-優(yōu)吉爾(Espinosa-Urgel)和拉莫斯(Ramos)，應(yīng)用與環(huán)境微生物學(xué)(Appl. Environ. Microbiol. )67 :5219-5224(2001))轉(zhuǎn)變成戊二酸半醛。如實(shí)例7中所略述，克隆數(shù)個(gè)重組半醛還原酶基因，并進(jìn)行測(cè)試以研究哪一基因編碼的酶將戊二酸半醛有效轉(zhuǎn)變成5HV。人們發(fā)現(xiàn)，假定蛋白ATEG 00539可有效催化此反應(yīng)，并由此將其重新命名為針對(duì)戊二酸半醛還原酶的gsaR。在一些嗜熱細(xì)菌和包括酵母在內(nèi)的低級(jí)真菌中，賴氨酸是經(jīng)由α-氨基酮己二酸路徑合成(許(Xu)，細(xì)胞生物化學(xué)與生物物理學(xué)(Cell Biochem.Biophys. )46 43-64(2006))，其中2-酮己二酸是第四個(gè)中間物且因此是例如戊二酸和5HV等C5化合物以及含5HV的PHA聚合物的潛在前體。如圖5中所示，這一路徑由α-酮戊二酸和乙酰輔酶A開始以生物合成2-酮己二酸。經(jīng)顯示，表達(dá)這4種酶的重組大腸桿菌宿主菌株可產(chǎn)生 2-酮己二酸(安迪(Andi)等人，生物化學(xué)(Biochem.)43 :11790-11795(2004)；賈(Jia)等人，生物化學(xué)雜志(Biochem. J.) 396 =479-485(2006)；宮崎(Miyazaki)等人，生物化學(xué)雜志 (J.Biol. Chem. )278 :1864-1871 (2003))。由于α -酮戊二酸與2-酮己二酸的結(jié)構(gòu)類似，故 2-酮己二酸可在α-酮戊二酸脫氫酶作用下轉(zhuǎn)變成戊二酰輔酶Α。又因?yàn)殓牾］o酶A與戊二酰輔酶A的結(jié)構(gòu)類似，使得戊二酰輔酶A可在例如琥珀酰輔酶A合成酶(SucD)等琥珀酸半醛(succinic semialdehyde, SSA)脫氫酶作用下發(fā)生轉(zhuǎn)變(索林(SShling)和古特差克(Gottschalk)細(xì)菌學(xué)雜志(J. Bacteriol. ) 178 :871-880 (1996))。
C.戊二酸如圖2中所略述，5碳化合物戊二酸的生物合成是由戊二酸半醛經(jīng)由脫氫酶反應(yīng)進(jìn)行(伊斯奇赫(Ischihara)等人，生物化學(xué)雜志(J. Biol. Chem.)(東京(Tokyo))49 154-157(1961)；瑞茲(Reitz)和洛德維爾(Rodwell)，生物化學(xué)雜志(J. Biol. Chem.) 245 3091-3096(1970))。經(jīng)鑒別，在惡臭假單胞菌中，davD基因編碼此戊二酸半醛脫氫酶活性(埃斯派諾-優(yōu)吉爾(hpinosa-Urgel)和拉莫斯(Ramos)，應(yīng)用與環(huán)境微生物學(xué) (Appl. Environ. Microbiol.) 67 :5219-5224 (2001)；雷維勒(Revelles)等人，細(xì)菌學(xué)雜志(J. Bacteriol. ) 186 =3439-3446 (2004)) 0戊二酸可用于制備例如聚酯、聚酯多元醇和聚酰胺等聚合物。奇數(shù)個(gè)碳原子(即5個(gè))可用于例如減少聚合物的彈性。另外，1， 5-戊二醇是一種常用塑化劑，并且是通過戊二酸和其衍生物氫化來制造聚酯的前體(維勒 (Werle)和莫拉維茲(Morawietz)，“多元醇(Alcohols,Polyhydric)“，烏爾曼工業(yè)化學(xué)百科全書(Ullmann' s Encyclopedia of Industrial Chemistry) :2002，威立出版公司 (Wiley-VCH)魏恩海姆(ffeinheim.)，DOI 10. 1002/14356007. a01_305)。D.聚(5-羥基戊酸)由聚(5-羥基戊酸)(又稱為P(5HV))PHA組成的均聚物的生物合成可由5HV經(jīng)由5-羥基戊酸輔酶A進(jìn)行。兩種不同的酶促反應(yīng)可催化第一步驟，即如休斯曼(Huisman) 等人(美國(guó)專利第7，229，804號(hào))、索林(85111丨叩)和古特差克(Gottschalk)(細(xì)菌學(xué)雜志(J. Bacteriol.) 178 :871-880 (1996))以及艾克曼斯(Eikmanns)和布克爾(Buckel) (霍佩-賽勒生物化學(xué)(Biol. Chem. Hoppe-Seyler) 371 :1077-1082 (1990))所述的輔酶A轉(zhuǎn)移酶；或如范貝倫(van Beilen)等人(分子微生物學(xué)(Molec. Microbiol. )6 3121-3136(1992))所述的輔酶A合成酶。由例如富養(yǎng)羅爾斯通氏菌phaCl所編碼的PHA聚合酶可催化5-羥基戊酸輔酶A聚合(皮普斯(Peoples)和辛斯凱(Sinskey)，生物化學(xué)雜志(J. Biol. Chem. )264 :15298-15303(1989))?；蛘?，可如休斯曼(Huisman)等人(美國(guó)專利第6，316，26號(hào))所述使用W!aC3/C5合成酶融合蛋白。E.聚(3-羥基丁酸-共-5-羥基戊酸)包括聚(3-羥基丁酸-共-5-羥基戊酸)(又稱為P(3HB_共-5HV))在內(nèi)的共聚物的生物合成可通過供應(yīng)3-羥基丁酰輔酶A (3-hydroxybutyry I-CoA，3HB-CoA)和 5-HV-CoA單體前體分子來進(jìn)行。如圖2中所略述，3HB-CoA可由乙酰輔酶A經(jīng)2個(gè)酶促步驟生物合成(i.) β-酮?；o酶A硫解酶反應(yīng)，其使用適合的基因，例如(但不限于)來自富養(yǎng)羅爾斯通氏菌的WctB (斯拉特(Slater)等人，細(xì)菌學(xué)雜志(J. Bacteriol. ) 180 (8) 1979-1987 (1998))，將乙酰輔酶A轉(zhuǎn)變成乙酰乙?；o酶A (西村(Nishimura)等人，生物化學(xué)雜志(J.Biol. Chem. ) 116 :21-27(1978))；和(ii.)乙酰乙酰基輔酶A還原酶反應(yīng)，其使用適合的基因，例如(但不限于)來自巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium)的phaB(麥克庫(kù)爾(McCool)和坎儂(Cannon)，細(xì)菌學(xué)雜志(J. Bacteriol.) 181 (2) :585-592 (1999))， 將乙酰乙?；o酶A轉(zhuǎn)變成3HB-CoA(福井(Fukui)等人，生物化學(xué)與生物物理學(xué)論文集 (Biochim. Biophys. Acta) 917 :365-371 (1987))。如上文所略述，可利用多種PHA合成酶合成PHA共聚物。F.賴氨酸圖6略述大腸桿菌中賴氨酸代謝的生物合成路徑。圖中心的虛線和實(shí)線分別表示L-賴氨酸的變構(gòu)反饋抑制和轉(zhuǎn)錄阻遏，其為增加重組宿主細(xì)胞(例如大腸桿菌)中L-賴氨酸產(chǎn)量所需的遺傳修飾提供目標(biāo)。G.l，5_ 戊二醇圖7提供由5HV產(chǎn)生1，5_戊二醇(PDO)的綜述。5HV可在如休斯曼(Huisman) 等人(美國(guó)專利第7，229，804號(hào))、索林(Sehling)和古特差克(Gottschalk)(細(xì)菌學(xué)雜志(J. Bacteriol.) 178 :871-880(1996))以及艾克曼斯(Eikmanns)和布克爾(Buckel) (霍佩-賽勒生物化學(xué)(Biol. Chem. Hoppe-Seyler) 371 :1077-1082 (1990))所述的輔酶A轉(zhuǎn)移酶；或如范貝倫(van Beilen)等人(分子微生物學(xué)(Molec. Microbiol. )6 3121-3136(1992))所述的輔酶A合成酶作用下轉(zhuǎn)變成5HV_CoA。5HV可在丙醛脫氫酶或醇脫氫酶，例如來自鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimurium)的pduP(利爾(Leal), 微生物學(xué)年鑒(Arch. Microbiol.) 180 =353-361 (2003))或來自大腸桿菌的eutE(斯卡利(Skraly)，WO專利第2004/0M876號(hào))作用下轉(zhuǎn)變成5-羥基戊醛。5-羥基戊醛可在1，3_丙二醇脫氫酶或醇脫氫酶，例如來自肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae) 的 dhaT (童(Tong)等人，應(yīng)用與環(huán)境微生物學(xué)(App 1. Environ. Microbiol.) 57 (12) 3541-3546(1991))作用下轉(zhuǎn)變成 PD0。H. 5-羥基戊酸-共-3-羥基丙酸含有5-羥基戊酸-共-羥基丙酸的共聚物可由5HV制備。用表達(dá)聚羥基烷酸和 5-羥基戊酸輔酶A轉(zhuǎn)移酶的核酸轉(zhuǎn)染fadR+型(脂肪酸降解(fatty acid degradation, FAD)受阻遏)或fadR—型(組成性FAD)大腸桿菌K12菌株。優(yōu)選大腸桿菌菌株包括 MG1655 和 LS5218(斯帕特(Spratt)等人，細(xì)菌學(xué)雜志(J. Bacteriol.) 146(3) 1166-1169(1981))。如表 6 中所示，GC-FID 分析表明，LS5218[pMS93]產(chǎn)生 6. 4% dew PHA, 且聚合物組成為52% 5HV和48% 3HP。另一方面，MG1655 ^)MS93]產(chǎn)生63. 1% dew PHA，這種PHA只由5HV組成。此外，LS5218[pMS93]的GC-MS分析證實(shí)了聚合物樣品中3HP的存在。因此，LS5218中的活性FAD系統(tǒng)能夠由Na5HV合成3HP。III.用于產(chǎn)生聚羥基烷酸和5碳化合物的轉(zhuǎn)基因生物體的產(chǎn)生用于產(chǎn)生聚羥基烷酸和5碳化合物的轉(zhuǎn)基因生物體是使用此項(xiàng)技術(shù)中已知的常規(guī)技術(shù)產(chǎn)生。A.用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因P(5HV)制造者的基因下表IA中提供了宿主菌株中經(jīng)克隆和/或評(píng)估的產(chǎn)生含5HV的PHA和5碳化合物的基因，以及適宜的酶學(xué)委員會(huì)編號(hào)(Enzyme Commission number, EC編號(hào))和參考資料。如下文進(jìn)一步論述，一些基因是針對(duì)密碼子優(yōu)化合成，而其它基因是由天然或野生型生物體的基因組DNA經(jīng)由PCR克隆。表1A.微生物宿主菌株中產(chǎn)生含5HV的PHA和5碳化合物的基因。
權(quán)利要求
1.一種重組生物體，其經(jīng)遺傳工程改造成將戊二酸半醛或5-氨基戊酸轉(zhuǎn)變成5碳單體、其聚合物或共聚物，其中所述重組生物體表達(dá)至少一種或一種以上編碼一種或一種以上選自由以下各物組成的群組的酶的基因賴氨酸2-單加氧酶，EC 1. 13. 12. 2 ；5-氨基戊酰胺酶(S -氨基戊酰胺酶)，EC 3. 5. 1. 30 ;5_氨基戊酸轉(zhuǎn)氨酶(δ -氨基戊酸轉(zhuǎn)氨酶)，EC 2. 6. 1. 48 ；賴氨酸脫羧酶，EC 4. 1. 1. 18 ；琥珀酸半醛還原酶(又稱為戊二酸半醛還原酶)， EC 1. 1. 1. 61 ；輔酶 A 轉(zhuǎn)移酶，EC 2. 8. 3. 14 和 EC 2. 8. 3. η ；酰基輔酶 A合成酶，EC 6. 2. 1. 3 ； PHA合成酶，EC 2. 3. Ln 酮酰基輔酶A硫解酶，EC 2. 3. 1. 9 ；乙酰乙?；o酶A還原酶，EC 1. 1. 1. 36 ；戊二酸-半醛脫氫酶，EC 1. 2. 1. 20 ；丙醛脫氫酶，EC 1. 2. 1. 3 ；醇脫氫酶， EC 1. 1. 1. 1 ；1，3_丙二醇脫氫酶，EC 1. 1. 1. 202，且其中與未經(jīng)修飾的生物體相比較，所述重組生物體產(chǎn)生較多的戊二酸半醛或5-氨基戊酸，且其中所述戊二酸半醛或5-氨基戊酸經(jīng)所述重組生物體轉(zhuǎn)變成所述5碳單體、其聚合物或共聚物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組生物體，其中所述5碳單體選自由戊二酸、1，5戊二醇、 5-氨基戊酸和5-羥基戊酸組成的群組。
3.根據(jù)權(quán)利要求1至2中任一權(quán)利要求所述的重組生物體，其中所述聚合物或共聚物包含聚羥基烷酸。
4.根據(jù)權(quán)利要求1至3中任一權(quán)利要求所述的重組生物體，其中所述單體包含5-羥基戊酸。
5.根據(jù)權(quán)利要求1至4中任一權(quán)利要求所述的重組生物體，其中所述重組生物體將 5-氨基戊酸轉(zhuǎn)變成戊二酸半醛。
6.根據(jù)權(quán)利要求1至5中任一權(quán)利要求所述的重組生物體，其中所述重組生物體將賴氨酸轉(zhuǎn)變成5-氨基戊酸。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的重組生物體，其中將所述賴氨酸饋給所述生物體。
8.根據(jù)權(quán)利要求1至7中任一權(quán)利要求所述的重組生物體，其中用于構(gòu)建所述重組生物體的生物體經(jīng)過修飾以相對(duì)于未經(jīng)修飾的生物體過量產(chǎn)生賴氨酸。
9.根據(jù)權(quán)利要求1至8中任一權(quán)利要求所述的重組生物體，其中所述重組生物體對(duì)有毒賴氨酸類似物S-(2-氨基乙基)半胱氨酸具有抗性。
10.根據(jù)權(quán)利要求1至8中任一權(quán)利要求所述的重組生物體，其中所述重組生物體表達(dá)賴氨酸反饋抗性二氫吡啶二羧酸合成酶。
11.根據(jù)權(quán)利要求1至9中任一權(quán)利要求所述的重組生物體，其中所述重組生物體表達(dá)賴氨酸反饋抗性天冬氨酸激酶III。
12.根據(jù)權(quán)利要求8至1所述的重組生物體，其中所述生物體被饋以可再生碳基質(zhì)。
13.根據(jù)權(quán)利要求1至12中任一權(quán)利要求所述的重組生物體，其中所述重組生物體經(jīng)進(jìn)一步工程改造以抑制或阻斷賴氨酸輸出。
14.根據(jù)權(quán)利要求1至13中任一權(quán)利要求所述的重組生物體，其中所述重組生物體表達(dá)或過量表達(dá)戊二酸半醛脫氫酶且所述5碳單體是戊二酸。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的重組生物體，其中所述戊二酸半醛脫氫酶是由選自由 davD、ynel和gabD組成的群組的基因編碼。
16.根據(jù)權(quán)利要求1至13中任一權(quán)利要求所述的重組生物體，其中所述重組生物體將戊二酸釋放到細(xì)胞外環(huán)境中。
17.根據(jù)權(quán)利要求1至13所述的重組生物體，其中所述生物體經(jīng)過修飾以降低或消除戊二酸半醛脫氫酶活性，且所述5碳單體不是戊二酸。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的重組生物體，其中所述戊二酸半醛脫氫酶是通過缺失或破壞一個(gè)或一個(gè)以上選自由davD、yneI和gabD或其同系物組成的群組的基因來減少或消除。
19.根據(jù)權(quán)利要求1至13和17至18中任一權(quán)利要求所述的重組生物體，其中所述重組生物體將5-羥基戊酸釋放到所述細(xì)胞外環(huán)境中。
20.根據(jù)權(quán)利要求17至18所述的重組生物體，其中所述重組生物體在所述細(xì)胞外環(huán)境中釋放5-羥基戊酸，且所述5-羥基戊酸與δ -戊內(nèi)酯相平衡。
21.根據(jù)權(quán)利要求1至13和17至18中任一權(quán)利要求所述的重組生物體，其中所述重組生物體將5-羥基戊酸轉(zhuǎn)變成5-羥基戊酸輔酶Α。
22.根據(jù)權(quán)利要求1至13和21中任一權(quán)利要求所述的重組生物體，其中所述重組生物體將5-羥基戊酸輔酶A轉(zhuǎn)變成聚羥基烷酸。
23.根據(jù)權(quán)利要求1至13和21中任一權(quán)利要求所述的重組生物體，其中所述重組生物體將5-羥基戊酸轉(zhuǎn)變成1，5戊二醇。
24.根據(jù)權(quán)利要求1至13和21中任一權(quán)利要求所述的重組生物體，其中所述重組生物體將5-羥基戊酸轉(zhuǎn)變成聚(5-羥基戊酸)或其共聚物。
25.根據(jù)權(quán)利要求M所述的重組生物體，其中所述共聚物選自由聚(3-羥基丙酸-共-5HV)、聚(3-羥基丁酸-共-5HV)和聚(4-羥基丁酸-共-5HV)組成的群組。
26.根據(jù)權(quán)利要求1至25中任一權(quán)利要求所述的重組生物體，其中所述重組生物體是原核生物。
27.根據(jù)權(quán)利要求1至沈中任一權(quán)利要求所述的重組生物體，其中所述重組生物體是大腸桿菌。
28.根據(jù)權(quán)利要求1至25中任一權(quán)利要求所述的重組生物體，其中所述重組生物體是真核微生物。
29.一種由賴氨酸產(chǎn)生聚合物的重組生物體，其中所述重組生物體經(jīng)過遺傳工程改造以表達(dá)至少一種選自由以下各物組成的群組的酶以產(chǎn)生包含5-羥基戊酸單體的聚羥基烷酸賴氨酸2-單加氧酶，EC 1. 13. 12. 2 ；5-氨基戊酰胺酶(δ -氨基戊酰胺酶)，EC3.5. 1. 30 ；5-氨基戊酸轉(zhuǎn)氨酶(δ -氨基戊酸轉(zhuǎn)氨酶)，EC 2. 6. 1. 48 ；賴氨酸脫羧酶，EC4.1. 1. 18 ；琥珀酸半醛還原酶(又稱為戊二酸半醛還原酶)，EC 1.1.1.61 ；輔酶A轉(zhuǎn)移酶， EC 2. 8. 3. 14 和 EC 2. 8. 3. η ；?；o酶 A 合成酶，EC 6. 2. 1. 3 ；PHA 合成酶，EC 2. 3. 1. η。
30.根據(jù)權(quán)利要求四所述的重組生物體，其中所述重組生物體不產(chǎn)生賴氨酸。
31.根據(jù)權(quán)利要求四所述的重組生物體，其中所述重組生物體不表達(dá)功能性戊二酸半醛脫氫酶活性。
32.一種由賴氨酸產(chǎn)生1，5_戊二醇的重組生物體，其中所述重組生物體經(jīng)過遺傳工程改造以表達(dá)至少一種選自由以下各物組成的群組的酶賴氨酸2-單加氧酶，EC 1.13. 12.2 ;5_氨基戊酰胺酶(δ-氨基戊酰胺酶)，EC 3. 5. 1. 30 ;5_氨基戊酸轉(zhuǎn)氨酶 (δ -氨基戊酸轉(zhuǎn)氨酶)，EC 2. 6. 1. 48 ；賴氨酸脫羧酶，EC 4. 1. 1. 18 ；琥珀酸半醛還原酶 (又稱為戊二酸半醛還原酶)，EC 1. 1. 1.61 ；輔酶A轉(zhuǎn)移酶，EC 2.8.3. 14和EC 2. 8. 3. η ；?；o酶A合成酶，EC 6.2. 1.3 ；和丙醛脫氫酶，EC 1.2. 1.3 ；醇脫氫酶，EC 1. 1. 1. 1 ；1，3_丙二醇脫氫酶，EC 1. 1. 1.202。
33.根據(jù)權(quán)利要求32所述的重組生物體，其中所述重組生物體不產(chǎn)生賴氨酸。
34.根據(jù)權(quán)利要求32所述的重組生物體，其中所述重組生物體不表達(dá)功能性戊二酸半醛脫氫酶活性。
35.一種由賴氨酸產(chǎn)生聚合物的方法，其包含將賴氨酸和其它可再生碳原料饋給根據(jù)權(quán)利要求四所述的重組生物體，由此產(chǎn)生所述聚合物。
36.一種產(chǎn)生基于5碳的單體、其聚合物或共聚物的方法，其包含將賴氨酸或其它可再生碳原料提供給根據(jù)權(quán)利要求1所述的遺傳工程改造過的細(xì)胞，其中所述遺傳工程改造過的細(xì)胞經(jīng)工程改造以產(chǎn)生比未經(jīng)修飾細(xì)胞多的戊二酸半醛或 5-氨基戊酸，且其中所述戊二酸半醛或5-氨基戊酸經(jīng)所述遺傳工程改造過的細(xì)胞轉(zhuǎn)變成5 碳單體、其聚合物或共聚物。
37.根據(jù)權(quán)利要求36所述的方法，其中所述可再生碳原料選自淀粉、蔗糖、葡萄糖、乳糖、果糖、木糖、麥芽糖和阿拉伯糖，或其組合。
38.根據(jù)權(quán)利要求36所述的方法，其中所述單體選自由戊二酸、1，5-戊二醇和5-羥基戊酸組成的群組。
39.根據(jù)權(quán)利要求36中任一權(quán)利要求所述的方法，其中所述聚合物包含聚羥基烷酸。
40.根據(jù)權(quán)利要求39所述的方法，其中所述聚羥基烷酸包含5-羥基戊酸。
41.根據(jù)權(quán)利要求40所述的方法，其中所述聚羥基烷酸選自聚(5-羥基戊酸)、聚 (3-羥基丙酸-共-5HV)、聚(3-羥基丁酸-共-5HV)和聚(4-羥基丁酸-共-5HV)。
42.根據(jù)權(quán)利要求39所述的方法，其進(jìn)一步包含回收所述聚羥基烷酸、其聚合物或共聚物。
43.根據(jù)權(quán)利要求42所述的方法，其中聚羥基烷酸聚合物或共聚物是通過溶劑萃取或水性處理來回收。
44.一種由可再生碳基質(zhì)過量產(chǎn)生戊二酸的方法，其中對(duì)根據(jù)權(quán)利要求1至12所述的重組生物體饋以選自賴氨酸、淀粉、蔗糖、葡萄糖、乳糖、果糖、木糖、麥芽糖和阿拉伯糖或其組合的可再生碳基質(zhì)，及戊二酸過量產(chǎn)生，被分泌到培養(yǎng)基中并自其中回收。
45.一種由可再生碳基質(zhì)產(chǎn)生的1，5戊二醇。
全文摘要
本發(fā)明提供用于產(chǎn)生聚羥基烷酸的重組宿主以及由可再生碳基質(zhì)產(chǎn)生聚羥基烷酸的方法。還提供產(chǎn)生例如5-氨基戊酸(5AP)、5-羥基戊酸(5HV)、戊二酸和1，5戊二醇(PDO)等5碳化合物的某些重組宿主。一個(gè)實(shí)施例提供一種重組宿主，其表達(dá)編碼選自由聚羥基烷酸合成酶和5-羥基戊酸輔酶A(5HV-CoA)轉(zhuǎn)移酶組成的群組的異源酶的基因，其中所述宿主產(chǎn)生含有5-羥基戊酸的聚合物。優(yōu)選所述宿主表達(dá)聚羥基烷酸合成酶和5HV-CoA轉(zhuǎn)移酶二者。所述宿主可以是原核宿主或真核宿主。優(yōu)選的原核宿主是大腸桿菌。由所述重組宿主產(chǎn)生的聚合物可為5-羥基戊酸的均聚物或共聚物。優(yōu)選的共聚物為聚(3-羥基丁酸-共-5-羥基戊酸)。
文檔編號(hào)C12N9/88GK102317437SQ200980156872
公開日2012年1月11日 申請(qǐng)日期2009年12月14日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月12日
發(fā)明者F·斯科拉里, J·比克邁耶, T·M·拉姆塞耶爾, W·R·法莫爾, 常東云, 陸晨峰 申請(qǐng)人:麥特波力克斯公司