專利名稱：細胞分離技術的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及從細胞群體，如細胞培養(yǎng)物中去除非存活細胞的方法，適合在這些方法中使用的組合物，還涉及這樣的組合物以及多種其他系統(tǒng)和試劑盒的用途。
背景技術：
細胞會由于多種原因死亡，包括控制所有組織中細胞數量的正常生理過程。細胞死亡可以通過自然生理過程(最著名的是細胞凋亡)發(fā)生，也可以通過細胞培養(yǎng)中的，例如由培養(yǎng)容器中的剪應力引起的意外損傷(壞死)發(fā)生。在我們體內，死亡的細胞被吞噬細胞，如巨噬細胞有效的清除，否則它們可能引起組織損傷而且會促進疾病的進展。如果這些細胞保持未被清除的狀態(tài)(如通常發(fā)生在細胞培養(yǎng)中的)，凋亡的細胞進一步壞死(有時被稱為“繼發(fā)性壞死”)。這種進展以細胞質膜完整性的失去為特征?，F(xiàn)有的細胞存活率檢驗方法多種多樣，或簡單或復雜。例如，最簡單的檢驗方法， 如活細胞拒染，檢測被存活細胞排除的染料進入死細胞的能力。常用的這樣的染料例子是臺盼藍、碘化丙啶和溴化乙錠。更復雜的檢驗方法包括大分子的釋放，如乳酸脫氫酶(LDH)， 其活性可以通過其在適合的顯色底物上的活性來檢測。然而，這些檢驗方法局限于檢測細胞死亡的壞死階段，因為其均需要細胞質膜完整性的失去來獲得陽性結果。給定時間細胞群體真實存活率的完整評價需要同時檢測正在死亡(凋亡)和死亡(壞死)的細胞。給定時間細胞群體真實存活率的完整評價需要同時檢測正在死亡(凋亡)和死亡(壞死)的細胞。正在死亡、凋亡細胞的檢驗通常是復雜的，需要多個步驟(例如TUNEL-type法檢驗或半胱天冬酶活化檢驗)，而這些步驟可能引起如假陽性的技術問題。一種常用的方法利用了凋亡的特征，細胞質膜磷脂不對稱性的早期改變。磷脂結合蛋白，膜聯(lián)蛋白V，在胞外Ca2+ 濃度相對高的情況下與在細胞質膜完整性失去之前快速暴露于凋亡細胞表面的磷脂、磷脂酰絲氨酸(PS)結合?？贵w介導的PS檢測，例如通過Immunosolv的imab6單克隆抗體，避免了對胞外Ca2+的需求。目前，可實現(xiàn)從細胞培養(yǎng)物中選擇性去除正在死亡的/死亡的細胞的方法和試劑盒范圍有限。其包括，例如，Miltenyi試劑盒和Immunosolv生產的imab6 連接Dead-Cert 納米粒子。盡管可以使用這些試劑和試劑盒，仍然需要新的改進的技術，因為盡管像臺盼藍的染料能夠用于準確檢測或標記死亡細胞，但其不能夠突出正在死亡的細胞。此外，膜聯(lián)蛋白V是依賴Ca2+的，因而其不方便在生物生產里常用的懸浮培養(yǎng)中可能出現(xiàn)的低Ca2+的環(huán)境中進行檢測。除上述之外，還需要控制非存活細胞，改進細胞培養(yǎng)物和細胞儲存和運輸的存活率的額外方法。也需要細胞系建立和生產的改進的方法。降低死細胞引起的本底存活率以及改進轉染效率的方法也是對先前技術的顯著改進。還需要控制處于凋亡晚期的細胞的方法，因為產生生長因子，如乳鐵蛋白的早期的凋亡細胞可對其周圍環(huán)境有積極的影響[BournaZou，208#3517]。發(fā)明簡述
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本發(fā)明基于發(fā)現(xiàn)在細胞死亡中某些細胞組分數量會增加(或其與某些外源化合物的可接觸性增加)。此外，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)這些細胞組分能夠與某些化合物結合，特別是，例如，非蛋白化合物。因此，由于正在死亡的和/或死亡的細胞擁有比存活細胞更多的此類結合部位，本發(fā)明提供了適合用于從存活細胞中分離正在死亡的，和/或壞死/死亡的細胞的方法和組合物。第一方面，本發(fā)明提供了一種從細胞群體中去除非存活細胞的方法，所述的方法包括在適于使化合物和細胞培養(yǎng)物中存在的非存活細胞連接的條件下，使細胞群體與化合物接觸的步驟，以及從所述細胞群體中去除至少部分化合物的步驟，其中的化合物不是蛋白性質的化合物。術語“蛋白性質的”化合物是指包括蛋白、多肽、氨基酸和/或抗體/抗體片段。因此，應當理解本發(fā)明第一方面提供的化合物不是蛋白、多肽、氨基酸或抗體/抗體片段。本領域技術人員能理解細胞群體可能包括存活的、正在死亡的、和/或壞死(死亡)的細胞，而且應理解正在死亡的，壞死或死亡的細胞以下統(tǒng)稱為“非存活的細胞”。此外，術語“細胞群體”包括含有例如，真核細胞如哺乳動物，尤其是人細胞的細胞培養(yǎng)物。這方面，本發(fā)明可以提供了適用于這些細胞類型群體和/或在專門細胞類型，例如，干細胞(成人和/或胚胎干細胞)、心臟細胞、上皮細胞、內皮細胞、皮膚(真皮)細胞、 神經細胞、肌肉細胞、循環(huán)(即血液)系統(tǒng)細胞和/或其他細胞類型，例如，淋巴細胞、骨細胞和/或軟骨細胞培養(yǎng)物的方法和組合物。例子示于表1。表1 :已經成功展示了使用本發(fā)明去除非存活細胞的細胞類型實例。
權利要求
1.一種從細胞群體中去除非存活細胞的方法，所述方法包括在適于使化合物和細胞培養(yǎng)物中存在的非存活細胞連接的條件下，使細胞群體與化合物相接觸的步驟，以及從所述細胞群體中去除至少部分化合物的步驟，其中的化合物不是蛋白性質的化合物。
2.權利要求1的方法，其中細胞群體是細胞培養(yǎng)物。
3.前面任意權利要求的方法，其中化合物是能夠與存在于非存活細胞上或非存活細胞中的細胞組分結合的化合物。
4.前面任意權利要求的方法，其中化合物能與細胞死亡時數量和/或可接觸性增加的細胞組分相結合。
5.前面任意權利要求的方法，其中化合物是多糖。
6.前面任意權利要求的方法，其中化合物是葡聚糖或其類似物、變體或衍生物。
7.前面任意權利要求的方法，其中化合物是包括羧化和/或氨基葡聚糖的化合物。
8.權利要求1-7的方法，其中化合物被包裝進細胞群體可加入的柱或者在細胞群體可加入的柱中提供。
9.權利要求1-7的方法，其中化合物與加入細胞群體的支架材料粘附、連接、固定和/ 或其他方式相聯(lián)系。
10.權利要求1-9的方法，其中化合物以顆粒的形式提供，例如微粒子或納米粒子。
11.權利要求10的方法，其中微粒子或納米粒子采用直徑10-500nm的小珠子或微球的形式。
12.權利要求11的方法，其中微粒子或納米粒子包括多糖或由多糖組成。
13.權利要求12的方法，其中微粒子或納米粒子包括葡聚糖或由葡聚糖組成。
14.權利要求10-13的方法，其中微粒子或納米粒子進一步包括磁性材料。
15.權利要求14的方法，其中微粒子或納米粒子包括葡聚糖包裹的磁性核心。
16.前述任意權利要求的方法，其中化合物被標簽或標記過。
17.前述任意權利要求的方法，其中至少部分化合物通過過濾、密度分離、流式細胞儀 /細胞分選和/或親和層析技術被從細胞群體中去除。
18.權利要求14-16的方法，其中至少部分化合物通過使用磁場被從細胞群體中去除。
19.前述任意權利要求的方法，方法包括第一步驟，其中細胞群體與阻斷緩沖劑相接觸，阻斷緩沖劑含有能夠連接存在于非存活細胞上或非存活細胞中的細胞組分的化合物， 化合物的濃度被制成能阻斷全部(或基本上全部)存在于存活細胞和/或正在死亡的細胞上的所述細胞組分，但留下許多存在于非存活細胞和/或正在死亡的細胞上或非存活細胞和/或正在死亡的細胞中的所述細胞組分暴露或非封閉。
20.非蛋白化合物用于從細胞群體中去除非存活細胞的用途。
21.權利要求20的用途，其中細胞群體選自細胞系；儲存或運輸的細胞群體以及原代細胞制備品或培養(yǎng)物組成的組。
22.權利要求20的用途，其中細胞群體被用于基于細胞的檢驗或被轉染。
23.權利要求20的用途，其中細胞群體用于產生或生產細胞產品。
24.葡聚糖在標記或標簽非存活細胞中的用途。
25.權利要求24的用途，其中葡聚糖被進一步修飾以包含可檢測的標簽。
26.標記、標簽和/或識別非存活細胞的方法，所述方法包括步驟(d)在適于使葡聚糖分子和細胞群體中存在的非存活細胞連接的條件下，使細胞群體與可選擇修飾(即標簽或標記)的葡聚糖分子相接觸；(e)去除未連接的葡聚糖分子；和(f)檢測連接了葡聚糖分子的細胞；其中，連接葡聚糖分子的細胞包括非存活細胞。
27.葡聚糖分子和/或經修飾包含了一個以上的額外化合物的葡聚糖分子在將所述額外化合物定位到死亡或正在死亡的細胞中的用途。
28.權利要求27的用途，其中額外的化合物選自由藥物；毒素；蛋白(如抗體或類似物)和核酸(例如反義核酸，微RNA，siRNA, iRNA等)組成的組。
29.葡聚糖和/或修飾的葡聚糖分子在治療細胞增殖和/或分化紊亂中的用途。
30.將化合物定位到非存活細胞的體外方法，所述方法包括在適于使修飾的葡聚糖分子和細胞群體中存在的非存活細胞連接的條件下，使細胞群體與經過修飾包含一個以上要被定位到非存活細胞的額外化合物的葡聚糖分子接觸的步驟。
31.從細胞群體中去除非存活細胞的試劑盒，所述試劑盒包括非蛋白化合物，使用的指示和/或其他緩沖劑和試劑。
全文摘要
第一方面，本發(fā)明提供了從細胞群體中去除非存活細胞的方法，所述方法包括在適于使化合物和細胞培養(yǎng)物中存在的非存活細胞連接的條件下，使細胞群體與化合物相接觸，并從所述細胞群體中去除至少部分化合物，本發(fā)明進一步提供適合在這些方法中使用的組合物，還提供了這樣的組合物以及多種其他系統(tǒng)和試劑盒的用途。
文檔編號C12N5/00GK102333860SQ200980157379
公開日2012年1月25日 申請日期2009年12月23日 優(yōu)先權日2008年12月24日
發(fā)明者克里斯托夫·格雷戈里, 約翰·龐德 申請人:易優(yōu)諾生物科技有限責任公司