專利名稱：少突膠質(zhì)前體細胞的靶向細胞群及制備與使用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及少突膠質(zhì)前體細胞群的分離、鑒定、增殖、分化和移植。
背景技術(shù)：
中樞神經(jīng)系統(tǒng)(“CNS”)發(fā)育期間，多能神經(jīng)前體細胞，也被稱為神經(jīng)干細胞，增殖并瞬時產(chǎn)生分裂祖細胞，最終分化成組成成人大腦的細胞類型。干細胞(來自其他組織) 通常定義為具有自我更新(例如，形成更多的干細胞)、增殖、并分化成不同表型譜系的能力。在神經(jīng)干細胞中，包括神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細胞和少突膠質(zhì)細胞。神經(jīng)干細胞已從若干種哺乳動物，包括小鼠、大鼠、豬和人體中分離出。參見，例如，WO 93/01275,WO 94/09119、 W094/10292、W094/16718，以及 Cattaneo et al,MoI. Brain Res. ,42,pp. 161-66 (1996)，通過引述全部合并于本文中。少突膠質(zhì)細胞的主要功能是高等脊椎動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)軸突的髓鞘形成。少突膠質(zhì)前體細胞(OPCs)優(yōu)于少突膠質(zhì)細胞。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了富集的靶向少突膠質(zhì)前體細胞群(OPCs)，其可以進一步分化成少突膠質(zhì)細胞。根據(jù)一些實施方案，提供了少突膠質(zhì)前體細胞(OPCs)的細胞群，其充分富集了表達PDGFR α抗原的細胞。根據(jù)一些實施方案，靶向OPCs是PDGFRα +和又是⑶105—。根據(jù)一些實施方案，靶向細胞群富集OPCs，呈PDGFRa (PDGFRAa+)免疫陽性并且呈CD105免疫陰性(CD 105_)。 根據(jù)一些實施方案，靶向細胞群富集OPCs，呈PDGFRa免疫陽性(PDGFR a+)，并且呈⑶133 免疫陽性(⑶133+)，以及呈⑶105免疫陰性(CD 105_)。根據(jù)一些實施方案，靶向OPCs是PDGFRa +和又是A2B51。、A2B5—，或其混合物 (A2B51。勹。根據(jù)一些實施方案，靶向細胞群富集OPCs，呈PDGFR α免疫陽性(PDGFRA a+)， MCD 133免疫陽性(CD 133+)，并且呈A2B5免疫陰性(A2B5_)。根據(jù)一些實施方案，靶向 OPCs細胞群是？06 1^+、42851(^。根據(jù)其他一些實施方案，靶向OPCs細胞群是PDGFR a +、 CD133+、A2B5_。根據(jù)其他一些實施方案，靶向OPCs細胞群是PDGFR a+、CD133+，A2B5W_。根據(jù)其他一些實施方案，靶向OPCs細胞群是PDGFRa +、CD133+、A2B5—，PSA -NCAM—。根據(jù)一些其他實施方案，靶向OPCs細胞群是PDGFRa +、CD133+、A2B5W-、PSA-NCAM_。根據(jù)一些其他實施方案，靶向OPCs細胞群是PDGFRa +、CD133+、A2B5_、PSA-NCAMW-。根據(jù)一些其他實施方案，靶向 OPCs 細胞群是 PDGFR a +、CD133+、A2B5lo/\ PSA_NCAMW\根據(jù)一些實施方案，靶向OPCs是PDGFR a+、CD 105_，又是A2B51。、A2B5_，或其混合物(A2B5W_)。根據(jù)一些實施方案，靶向OPCs細胞群富集OPCs，呈PDGFRa免疫陽性 (PDGFR a +)，呈CD133免疫陽性(CD133.)，并且呈A2B5免疫陰性(A2B5—)，呈CD 105免疫陰性(CD105—)。根據(jù)一些實施方案，靶向OPCs細胞群是PDGFRa+、CD 105_、A2B5W_。根據(jù)一些其他實施方案，靶向OPCs細胞群是PDGFRa+、CD133+、CD 105_、A2B5_。根據(jù)其他一些實施方案，靶向 OPCs 細胞群是 PDGFR a+、CD133+、CD 105\A2B5lo/\PSA -NCAiT。根據(jù)其他一些實施方案，靶向 OPCs 細胞群是 PDGFR α +、CD133+、CD 105\ A2B5lo/\ PSA-NCAM-。根據(jù)一些其他實施方案，靶向OPCs細胞群是PDGFR α +、CD133+、CD 105\ A2B5\ PSA-NCAMw:根據(jù)其他一些實施方案，靶向 0PCs 細胞群是 PDGFR a+、CD133+、CD 105\A2B5lo/\PSA-NCAMlo/"0根據(jù)一些實施方案，鑒別、分離、或富集靶向少突膠質(zhì)前體細胞群的方法，將一種試劑接觸包含至少一個OPC的細胞群，這種試劑結(jié)合表達于OPC細胞表面的表面標記抗原。 根據(jù)優(yōu)選的實施方案，靶向少突膠質(zhì)前體細胞富集細胞群是通過將含有至少一個OPC的細胞群與結(jié)合PDGFRa的一種試劑接觸而得到。優(yōu)選地，該試劑是一種結(jié)合PDGFRα的抗體。 使用傳統(tǒng)的細胞分選技術(shù)，如通過免疫篩選(如，F(xiàn)ACS)，鑒別、分離、和/或富集細胞，其中試劑與PDGFR α抗原接觸被檢測到。根據(jù)一些實施方案，本發(fā)明提供了生產(chǎn)富集靶向少突膠質(zhì)前體細胞的細胞群的方法，用單克隆抗體接觸神經(jīng)細胞或神經(jīng)來源細胞，這種單克隆抗體結(jié)合不在靶向少突膠質(zhì)前體細胞內(nèi)的負篩擇標記；篩選結(jié)合單克隆抗體的細胞；并除去標記細胞。細胞群內(nèi)剩余細胞富集少突膠質(zhì)前體細胞。本領(lǐng)域的技術(shù)人員應認識到，一個負選擇標記是一個僅存在于非OPC細胞的標記物(如，抗原)。在多個實施方案中，單克隆抗體可能被熒光標記或者可能結(jié)合磁性粒子，并且篩選可通過熒光激活細胞分選、高梯度磁篩選、固定相吸脫附，或任何其他常用篩選技術(shù)。在優(yōu)選實施方案中，含有神經(jīng)或神經(jīng)來源細胞的細胞群是從懸浮培養(yǎng)、貼壁培養(yǎng)中獲得，或來自新鮮的神經(jīng)組織。這些方法還可能涉及使用第二抗體或系列抗體接觸剩余細胞進一步富集少突膠質(zhì)前體細胞的細胞群。舉例來說，靶向OPCs細胞群的富集可通過采用特異性結(jié)合CD 133的抗體接觸神經(jīng)或神經(jīng)來源細胞，隨后采用特異性結(jié)合PDGFR α的抗體接觸剩余細胞獲得富集呈⑶133和PDGFR α免疫陽性的少突膠質(zhì)前體細胞的細胞群。此外，神經(jīng)或神經(jīng)來源細胞培養(yǎng)基可與一種特異性結(jié)合PDGFR α的抗體接觸，產(chǎn)生富集了呈PDGFR α免疫陽性的OPCs細胞群。根據(jù)一些實施方案，本發(fā)明提供了分離少突膠質(zhì)前體細胞(OPC)的方法，通過從神經(jīng)或神經(jīng)來源細胞群篩選呈CD133免疫陽性的細胞(CD133+細胞)；從細胞群去除非免疫反應(CD133_)細胞；并從剩余細胞群中篩選至少一個細胞，該細胞是PDGFR α免疫陽性的腫6 1^+)，例如，結(jié)合單克隆抗體？06 1^。在其它實施方案中，本發(fā)明提供了生產(chǎn)富集少突膠質(zhì)前體細胞群的方法，通過用特異性結(jié)合PDGFR α的抗體接觸神經(jīng)或神經(jīng)來源細胞，篩選是PDGFRa “細胞的那些細胞，其中，與神經(jīng)或神經(jīng)來源細胞對比，所篩選的細胞富集少突膠質(zhì)細胞前體細胞。本領(lǐng)域的技術(shù)人員應認識到，神經(jīng)或神經(jīng)來源細胞可以從神經(jīng)球培養(yǎng)中獲得(細胞團或細胞聚集體)，或從貼壁培養(yǎng)中獲得。在一些實施方案中，這種方法還涉及從細胞群中去除PDGFRa Wmed細胞的步驟。根據(jù)一些實施方案，本發(fā)明提供了分離神經(jīng)或神經(jīng)來源細胞(OPC)的方法，通過從神經(jīng)或神經(jīng)來源細胞中篩選呈CD105免疫陰性的細胞(CD105_細胞)；從細胞群中去除非免疫陽性的細胞(CD105+)；從剩余細胞群中篩選至少一個細胞，該細胞呈PDGFRa免疫陽性(PDGFRa+)，例如，結(jié)合單克隆抗體PDGFRa。根據(jù)一些實施方案，本發(fā)明提供了分離少突膠質(zhì)前體細胞(OPC)的方法，通過從神經(jīng)或神經(jīng)來源細胞群中篩選呈PDGFRa免疫陽性的細胞(PDGFRa +細胞)，例如結(jié)合單克隆抗體PDGFR α ；從細胞群中去除非免疫陰性的細胞 (PDGFRa-)；并從剩余細胞群中篩選至少一個細胞，該細胞呈⑶105免疫陰性(⑶105_)。在其它實施方案中，本發(fā)明提供生產(chǎn)富集了少突膠質(zhì)前體細胞的細胞群，通過特異性結(jié)合PDGFR α的抗體接觸神經(jīng)或神經(jīng)來源細胞，神經(jīng)或神經(jīng)來源細胞包含至少一個多能神經(jīng)干細胞，其中，與神經(jīng)或神經(jīng)來源細胞對比，所篩選的細胞富集了少突膠質(zhì)細胞前體細胞。本領(lǐng)域的技術(shù)人員應了解，神經(jīng)或神經(jīng)來源細胞可以從神經(jīng)球培養(yǎng)中獲得(細胞團或細胞聚集體)，或從貼壁培養(yǎng)中獲得。在一些實施方案中，這種方法還涉及去除細胞群中的PDGFRawmed細胞的步驟。根據(jù)一些實施方案，本發(fā)明提供了生產(chǎn)富集少突膠質(zhì)前體細胞的方法，去除神經(jīng)或神經(jīng)來源細胞群中的分化細胞或成纖維細胞標記呈陽性的細胞(例如，CD1(^)。這可以通過用抗分化細胞標記的單克隆抗體接觸細胞群，并去除結(jié)合單克隆抗體的那些細胞來完成。所獲得的細胞群可能進一步使用本文所述的方法之一進行富集。通過非限制實施例， 該方法可涉及進一步富集少突膠質(zhì)前體細胞群的步驟，通過特異性結(jié)合PDGFRa的抗體接觸剩余細胞。在多種其他優(yōu)選實施方案中，部分可以任選通過剩余細胞中篩選的細胞進行富集，所篩選的細胞是PDGFR a +、CD 105_、CD133+、A2B5W-、PSA-NCAMW-和其混合物及組合。根據(jù)額外的實施方案，本發(fā)明提供了增殖富集少突膠質(zhì)前體細胞群的方法，將至少一個所選細胞引入到無血清培養(yǎng)基中，無血清培養(yǎng)基包含一個或多個生長因子，該生長因子選自由 LIF、EGF、bFGF、PDGF-AA、PDGF-AB、PDGF-BB、Sonic hedgehog (Shh)、IGFl、CTNF、 Noggin、和NT3，及其組合組成的組；增殖至少一個選自培養(yǎng)基的細胞。優(yōu)選地，增殖富集少突膠質(zhì)前體細胞群的方法包括將至少一個所選細胞引進到無血清培養(yǎng)基，無血清培養(yǎng)基包含一個或多個生長因子，生長因子選自PDGF-AA、NT3、bFGF、IGFl及其組合組成的組；增殖選自培養(yǎng)基的至少一個細胞。另外提供了增殖并分化靶向OPCs的方法。根據(jù)一些實施方案，誘導OPCs的增殖 (和分化)可以通過將細胞培養(yǎng)在懸浮液中或細胞附著在基板上培養(yǎng)來完成?？晒┻x擇地， 在適當條件下，OPCs的增殖和分化可按下列組合在宿主體內(nèi)被誘導(1)在體外增殖和分化，然后移植，⑵體外增殖，移植，然后體內(nèi)再增殖并且分化，⑶體外增殖，移植，體內(nèi)分化，以及(4)體內(nèi)增殖和分化。體內(nèi)或原位增殖和分化可涉及非手術(shù)方法，采用制藥操作使 OPCs在體內(nèi)增殖。根據(jù)一些實施方案，提供了治療或改善哺乳動物脫髓鞘或髓鞘形成不良性疾病或紊亂的方法，包括對哺乳動物給藥靶向OPC或靶向OPCs細胞群。哺乳動物優(yōu)選患有脫髓鞘或髓鞘形成不良性疾病，包括，但不限于，多發(fā)性硬化癥、急性播散性腦脊髓炎、彌漫性腦硬化、出血性壞死性腦炎，輻射誘導髓鞘形成病癥、橫貫性脊髓炎、Pelizaeus-Merzbacher病(PMD)、腦癱(CP)和腦白質(zhì)營養(yǎng)不良。疾病優(yōu)選多發(fā)性硬化癥、Pelizaeus-Merzbacher病，或腦癱。哺乳動物可以另外服用至少一種生物制劑， 它可提高OPCs數(shù)量和/或至少一個因素是眾所周知刺激少突膠質(zhì)細胞分化、生長、增殖、或存活。該OPCs，少突膠質(zhì)細胞促進因子(S)，生物試劑(S)，和/或其他因素( 可能以任何方式施用，接觸哺乳動物的該因子和/或/具有目標OPCs的試劑，例如全身(例如，皮下) 或原位。優(yōu)選的，OPCs、少突膠質(zhì)細胞促進因子(S)、生物劑(S)、和/或其他因子(S)，可施用進大腦，更優(yōu)選施藥進大腦側(cè)腦室或施藥進腦實質(zhì)。


圖1.采用甲基綠復染shiverer/scid小鼠加亮細胞核矢狀面。箭頭表示用人OPCs 注入腦部的3個區(qū)域?？s寫cc，胼胝體；fb，菌毛；cb，小腦。
圖2.在新生兒shiverer/scid小鼠中植入OPC的實施例。上排顯示scl21染色， 加亮所有供體來源細胞。下排顯示一系列完全相同部分進行MBP染色。劃出的虛線地區(qū)指出植入?yún)^(qū)和對應的髓鞘形成區(qū)。在該實施例中，靶向上丘。細胞系信息FBR 2711，P6，移植后第8周。使用的縮寫str，紋狀體；cc，胼胝體；sc，上丘。圖3.在新生兒shiverer/scid小鼠中植入MBP-GFP轉(zhuǎn)導的OPC的實施例。上排顯示綠色熒光蛋白染色，加亮活性轉(zhuǎn)錄MBP基因的供體來源細胞。下排顯示一系列完全相同部分進行MBP染色。小腦周圍劃出虛線地區(qū)，在右側(cè)放大顯示。請注意，MBP圖上如白色箭頭指出的小腦數(shù)字錯位。細胞系信息FBr 2703，P6，移植后第8周。使用的縮寫cb，小腦。
具體實施例方式除非另外定義，本文中使用的所有科技術(shù)語具有普遍被本發(fā)明所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員所理解的相同涵義。盡管類似于或等同于本文描述的方法和材料可以在本發(fā)明的實施或測試中使用，適宜的方法和材料在下文進行了描述。本文中提到的所有出版物、專利申請、 專利以及其他參考文獻通過引述全部合并于本文中。發(fā)生沖突情況下，本說明書，包括定義，將進行調(diào)節(jié)。此外，材料、方法和實施例只是舉例說明性的，不是故意限制。本發(fā)明的其它特征和優(yōu)勢從下面的詳細描述和權(quán)利要求書來看是顯而易見的。節(jié)標題在這里只用于組織目的，而不是被視為以任何方式限制主旨。定義為了促進理解本文所述的實施例，以下將參照本發(fā)明優(yōu)選實施方案，具體的語言將用來描述同樣的事情。本文使用的術(shù)語僅用于描述特定實施方案，而不是為了限制本發(fā)明的范圍。除非本文另外清楚說明，正如本公開內(nèi)容中使用的，單數(shù)形式的“a”、“an”和 “the”包括復數(shù)。因此，舉例來說，一種“細胞”的提法包括多種這種細胞，一種“抗體”的提法是一個或更多的抗體，等等。本文中所使用的術(shù)語“靶向細胞群”是指那些刻意被提純或富集的細胞。優(yōu)選地， 靶向細胞群是少突膠質(zhì)前體細胞，顯示如本文所述的獨特模式的細胞標記?！吧偻荒z質(zhì)細胞” (OLs)或少突神經(jīng)膠質(zhì)周知為中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)的成髓鞘膠質(zhì)細胞。術(shù)語“少突膠質(zhì)前體細胞”或“0PC”指的是未成熟的少突膠質(zhì)細胞，在一定條件下能夠分化成中樞神經(jīng)系統(tǒng)的成髓鞘膠質(zhì)細胞。該術(shù)語包括從原發(fā)性組織分離出來的少突膠質(zhì)前體細胞和體外培養(yǎng)成OPCs的細胞，以及少突膠質(zhì)前體細胞的后代，因此包括OPCs和子代 OPCs。術(shù)語“神經(jīng)干細胞”是用于未分化、多能、自我更新、神經(jīng)細胞的更普遍的術(shù)語。神經(jīng)干細胞是一種克隆多能干細胞，它能夠分化，適當條件下，具有自我更新能力，并且可以在其后代子細胞內(nèi)，可以分化形成神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細胞、和少突膠質(zhì)細胞。因此，神經(jīng)干細胞是“多能的”，因為干細胞后代具有多種分化途徑。神經(jīng)干細胞能夠自我維護，即伴隨每次細胞分裂，一個子細胞也將成為干細胞。神經(jīng)干細胞的非干細胞后代通常稱為“祖細胞”或“前體”細胞，能夠在一個或多個譜系內(nèi)產(chǎn)生多種細胞類型。術(shù)語“神經(jīng)祖細胞”或“神經(jīng)前體細胞”指的是源自神經(jīng)干細胞的未分化細胞，本身不是干細胞。一些祖細胞能產(chǎn)生后代，能夠分化成多種細胞類型。舉例來說，0-2A細胞是一種神經(jīng)膠質(zhì)祖細胞，生成少突膠質(zhì)細胞和II型星形膠質(zhì)細胞，因此，可稱為“雙向”祖細胞。祖細胞的一個顯著特點是，不像干細胞，它不會出現(xiàn)自我維護。此外， 祖細胞通常被認為是分化的特殊路徑，適當條件下，將最終分化成膠質(zhì)細胞或神經(jīng)元。術(shù)語“神經(jīng)細胞”或“神經(jīng)來源細胞”廣泛地指與有機體的中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)相關(guān)的細胞，例如神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細胞、和前體細胞。如本文中所使用的神經(jīng)細胞可能是從神經(jīng)組織分離出來或者源自神經(jīng)組織，以及任何細胞，不論其起源如何，至少具有神經(jīng)元或神經(jīng)膠質(zhì)表型的顯示，如對一個或多個神經(jīng)元或神經(jīng)膠質(zhì)標記進行染色，或者將分化成顯示神經(jīng)元或神經(jīng)膠質(zhì)標記的細胞。因此，術(shù)語可作為一般術(shù)語提到，舉例來說，被分離且體外培養(yǎng)的原代細胞，培養(yǎng)的源自神經(jīng)組織的永生細胞，神經(jīng)組織細胞；和/或者培養(yǎng)表現(xiàn)神經(jīng)表型的細胞。術(shù)語，就是包括所有表現(xiàn)神經(jīng)細胞表型和/或神經(jīng)組織中分離出的細胞。因此，術(shù)語神經(jīng)細胞還包括是神經(jīng)前體細胞和分化神經(jīng)細胞的細胞。本文中所使用的術(shù)語“神經(jīng)細胞”是指神經(jīng)元。術(shù)語“陽性選擇”是指具有親合力的試劑直接結(jié)合靶向細胞群從混合細胞群中除去靶向細胞群對進行靶向細胞群進行純化和富集的方法。相反，術(shù)語“陰性選擇”是指具有親合力的試劑直接結(jié)合非靶向細胞群從混合細胞群中除去非靶向細胞群對進行靶向細胞群進行純化和富集的方法。舉例來說，CD45是 T200/白細胞共同抗原。人中樞神經(jīng)系統(tǒng)干細胞(CNS-SC)，優(yōu)選那些可以誘發(fā)神經(jīng)球，并將其包含在內(nèi)的培養(yǎng)基，另外的特征是缺乏某些細胞表面標記如CD45。因此，識別CD45的試劑可能在陰性選擇方法中有助于去除非靶細胞?！霸寺∏颉笔怯赡X組織培養(yǎng)產(chǎn)生的神經(jīng)球。典型地，腦組織在適當培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)之前經(jīng)解剖并機械分離，形成神經(jīng)球。對示范性方法進行了描述，例如，美國專利 5，750，376，通過引述全部并入本文中?！按渭壣窠?jīng)球體”是由分離(傳代)原代神經(jīng)球體并在由單細胞形成神經(jīng)球體的條件下培養(yǎng)被分離的細胞而生成的一種神經(jīng)球體?！安溉閯游铩笔遣溉閯游锛彝?nèi)的任何成員。哺乳動物優(yōu)選靈長類動物、嚙齒類動物、貓、狗、家畜(如牛、羊、山羊、馬、豬)，最優(yōu)選人。一個“脫髓鞘疾病”或“髓鞘形成不良癥”是一種疾病、紊亂，或病癥，由髓磷脂數(shù)量不足造成或與其有關(guān)。脫髓鞘是髓鞘去除的過程，例如原來存在的髓磷脂的損失。沒有髓磷脂形成或者數(shù)量不足的髓磷脂形成，發(fā)生了髓鞘形成障礙，例如，由于功能失調(diào)的OPCs 或少突膠質(zhì)細胞(OLS)。脫髓鞘和髓鞘形成障礙的最終結(jié)果是髓鞘形成減少。這些疾病、紊亂或病癥的實施例包括，舉例來說，多發(fā)性硬化癥(包括復發(fā)和慢性進展型多發(fā)性硬化癥、 急性多發(fā)性硬化癥、視神經(jīng)脊髓炎(Devic病))、彌漫性腦硬化(包括Shilder彌漫性軸周腦炎和Balo同心圓性硬化)。脫髓鞘疾病或髓鞘形成障礙還包括多種疾病，其中脫髓鞘是由病毒感染、疫苗、脊髓損傷、和遺傳性疾病引發(fā)的。這些脫髓鞘疾病或髓鞘形成障礙的實施例包括急性播散性腦脊髓炎(患得麻疹、水痘、風疹、流感、腮腺炎之后發(fā)生的；或者接種狂犬病疫苗或牛痘疫苗之后發(fā)生的)、壞死性出血性腦炎(包括出血性白質(zhì)腦炎)和腦白質(zhì)營養(yǎng)不良(包括Krabbe globboid腦白質(zhì)營養(yǎng)不良、異染性腦白質(zhì)營養(yǎng)不良、腎上腺腦白質(zhì)營養(yǎng)不良、腎上腺脊髓神經(jīng)病變、腎上腺脊髓神經(jīng)病變，輻射誘導髓鞘化障礙、橫貫性脊髓炎，佩-梅病(PMD)，海綿狀腦白質(zhì)營養(yǎng)不良癥和亞歷山大病)。脫髓鞘疾病或髓鞘形成障礙優(yōu)選多發(fā)性硬化癥、腦性麻痹、彌漫性腦硬化、或佩-梅病(PMD)，并且，最優(yōu)選佩-梅病?！爸委煛被颉案纳啤笔侵笢p少或徹底消除了疾病或身體狀況的癥狀?！坝行┝俊笔且环N足以達到預期目的的治療劑用量。一種給定治療藥物的有效劑量會隨一些因素如藥物性質(zhì)、給藥途徑、接受這種治療劑的動物大小和動物品種以及給藥目的而有所不同。在個別情況下，有效劑量可能會由醫(yī)師根據(jù)本領(lǐng)域制定的方法憑經(jīng)驗確定。術(shù)語“腦室”是指中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)腦脊髓液流過的任何腔或者通道。因此，該術(shù)語不僅包括側(cè)腦室、第三腦室和第四腦室，也包括中央管、中腦水管和其他中樞神經(jīng)系統(tǒng)腔室。細胞標記本發(fā)明提供了鑒別、分離、或富集靶向少突膠質(zhì)前體細胞群的方法。少突膠質(zhì)前體細胞(OPCs)靶向細胞群的表征為細胞表面標記物的表達。雖然本領(lǐng)域普遍根據(jù)特定標記物將細胞稱為“陽性的“或”陰性的“，實際表達水平是數(shù)量性狀的。細胞表面的分子數(shù)量可以幾個對數(shù)級變化，仍然被定性為“陽性的”。本領(lǐng)域技術(shù)人員也應了解，那些細胞是陰性染色，標記物特異性試劑結(jié)合水平?jīng)]有檢測出不同于對照組，例如，同型匹配對照組；可表達少量標記物。染色水平的鑒別在細胞群之間存在微妙差別。細胞染色強度可以用流式細胞儀進行監(jiān)測，其中激光檢測定量水平的熒光染料 (與特異性試劑(如抗體)結(jié)合的細胞表面標記物的數(shù)量成正比)。流式細胞儀，或FACS， 也可基于結(jié)合特異性試劑的強度以及其他參數(shù)如細胞大小和光散射來分離細胞群。雖然染色的絕對水平可能不同于特定熒光染料和反應制劑，可以將數(shù)據(jù)歸一化到對照組。為了歸一化分布進行對照，每個細胞記錄為具有特定強度染色的數(shù)據(jù)點。這些數(shù)據(jù)點可根據(jù)對數(shù)坐標繪制，度量單位是任意的染色強度。在一個實施例中，細胞群中的最大細胞被指定為4個對數(shù)級(即10，000倍)，遠遠高于具有最低水平染色的細胞。當以這種方式繪制時，很明顯，最高對數(shù)級染色強度的細胞是亮的，而最低強度染色的細胞是陰性的?！暗汀比旧毎?，2-3個對數(shù)級(即100-1000倍)染色強度，可具有不同于陽性細胞和陰性細胞的屬性?？晒┻x擇的對照組可利用其表面具有確定密度的標記物的底物，舉例來說，制備的微珠或細胞株，提供了強度的陽性對照。“低，，標記表明，染色水平高于同型相匹配對照組的亮度，但并不像細胞群中通常發(fā)現(xiàn)的最明亮的染色細胞那么強。為界定特定抗體染色強度的目的，同型匹配對照將界定“非特異性”或“陰性”染色的信號強度。而任何導致信號強度高于對照組的染色被認為是“陽性”染色。劃定陰性和陽性染色的界線按常規(guī)設(shè)定，使得事件頻率在邊界左邊，低于邊界，邊界> 0. 99且< 1. 0。 陽性染色強度可以被進一步細分和歸類為低、中、高，分別定義任意標度從對照組邊界至最高記錄信號強度，并且確定在33^和66th百分點處劃分另兩條線。這些定義的組間低段、中段、高段測量的信號可以分別被命名為低、中、高染色強度。細胞分選使用細胞表面抗原分離、篩選、或富集少突膠質(zhì)前體細胞(OPCs)提供了靶向OPC 細胞群陽性免疫篩選和陰性免疫篩選，以及使用流式細胞儀表型分析靶向OPC細胞群的方法。制備大體純化的靶向OPC細胞群，經(jīng)PDGFR α結(jié)合，OPCs亞群從其他細胞中分離出來。 OPCs可能進一步通過結(jié)合本領(lǐng)域周知的其他表面標記物被分離。篩選出的表達PDGFRa抗原的細胞，舉例來說，可能通過本文中公開的其他靶向OPC標記物的陽性和陰性免疫篩選
進一步純化。分離步驟可能包括磁分離，采用抗體包被磁珠，親和層析和采用附著于固體載體 (如平板)的抗體“淘選”，或者其他簡便技術(shù)。提供準確分離的技術(shù)包括熒光激活細胞分選機，它可能具有不同程度的摻雜，例如多種顏色通道、低角度和鈍光散射探測通道、阻抗通道等。死細胞染色后通過篩選被除去(碘化丙啶[PI]，LDQ。選取對所篩選細胞的存活沒有太大不利的任何技術(shù)。合宜地，抗體與標記物結(jié)合，以便分離特定細胞類型，如磁珠；生物素，高親和力結(jié)合抗生物素蛋白或者鏈霉親和素；熒光染料，可以與熒光激活細胞分選器一起使用；半抗原；和類似物質(zhì)?？赡懿捎枚嗌治雠cFACS或者多色分析與免疫磁性分離和流式細胞儀組合。利用多表面抗原，如PDGFR a+、CD 105—、CD133+、CD24—等，多色分析利于細胞分離。 熒光染料，發(fā)現(xiàn)在多色分析方法中采用，包括，舉例來說，藻膽蛋白，如藻紅蛋白和別藻藍蛋白；熒光素和得克薩斯紅。陰性標記表明，染色水平是同型匹配陰性對照組的亮度或低于其亮度，“dim”、“l(fā)o”或“l(fā)ow”標記表明，染色水平可能接近負染色的水平，但也可能比同型匹配對照組亮。舉例來說，PDGFR α抗體直接或間接地結(jié)合到磁化劑，如超順磁性微粒(微粒)。 通過使用如本領(lǐng)域周知的多種化學連接基團直接結(jié)合到磁性粒子上?？贵w可通過側(cè)鏈氨基或巰基和雜官能交聯(lián)試劑耦合至微粒上。大量的雜官能化合物用于連接實體。優(yōu)選的連接基團為與抗體上的活性巰基和磁性粒子上的活性氨基連接的3- -吡啶二硫)丙酸N-羥基琥珀酰亞胺酯(SPDP)或4-(N-馬來酰亞胺基甲基)環(huán)己烷-1-羧酸N-羥基琥珀酰亞胺酯(SMCC)。或者，抗體間接耦合于磁性粒子。該抗體可直接結(jié)合到半抗原上，半抗原特異性、 第二階段抗體結(jié)合于粒子上。適宜的半抗原的實施例包括，舉例來說，地高辛、地高辛配基、 FITC、二硝基苯基、硝基苯基、抗生物素蛋白、生物素等。半抗原結(jié)合蛋白質(zhì)的方法，例如，本領(lǐng)域已知的，市面上有售的用于這種結(jié)合的試劑盒。靶向OPC細胞群通過引入神經(jīng)或神經(jīng)來源細胞與抗體或結(jié)合表面標記物的試劑接觸進行篩選。舉例來說，抗體被添加到細胞樣本中。結(jié)合特定的細胞亞群所必需的抗體或其他試劑的用量由執(zhí)行測試分離和分析經(jīng)驗確定。舉例來說，細胞和抗體/試劑被孵育足夠長時間形成配合物，優(yōu)選至少約5分鐘，更優(yōu)選至少約10分鐘，通常不超過一個小時， 更通常不超過約30分鐘。這些細胞另外可以與對細胞表面標記物具有特異性的抗體或結(jié)合分子一起孵育，細胞標記物已知存在于OPCs中或不存在于OPCs中。標記的細胞按照特異性抗體制備所述進行分離。熒光標記抗體對流式細胞儀分離、免疫磁性細胞分選的磁性粒子、尤其高梯度磁性分選(HGMQ等等是有用的。示范性磁性分離器在WO 90/07380、PCT/US96/00953 JPEP 438520中進行了描述，通過引述其公開內(nèi)容合并于本文中。純化的細胞群可從任何適當培養(yǎng)基中收集。多種培養(yǎng)基市面有售并可以與5mM EDTA 一起使用，包括達氏修正依氏培養(yǎng)基(DMEM)，漢克平衡鹽緩沖液(HBSS)，Dulbecco ‘ s 磷酸緩沖鹽(DPBS)、RPMI、IMDM細胞培養(yǎng)基(IMDM)、磷酸鹽緩沖液(PBS)，等等，經(jīng)常附加小牛血清(FCS)、牛血清白蛋白(BSA)、人血清白蛋白(HSA)，等等。
靶向OPCs高度富集細胞群以這種方式獲得。所需的細胞會占細胞組合的30%或者30%以上，優(yōu)選為細胞群的50%或以上(例如，60%或以上，70%或以上，75%或以上， 80%或以上，85%或以上，90%或以上，95%以上)，更優(yōu)選為細胞群的90%或以上(例如， 92%或以上，94%或以上，96%或以上，或98%或以上)，最優(yōu)選為細胞群的95%或以上(例如，97%、99% )(大體純化的)。獲得的富集程度，實際采用的，取決于一些因素，包括，但不限于，篩選方法、生長方法、和/或放置在細胞培養(yǎng)基內(nèi)的細胞量。細胞的分離、富集、和篩選本發(fā)明提供了 OPCs的分離和鑒定。使用特異性結(jié)合PDGFR α的抗體或其他試劑， 本發(fā)明的方法可以用來從PDGFRa細胞中分離PDGFRa +細胞，抗體或試劑結(jié)合包含一小部分OPCs的神經(jīng)或神經(jīng)來源細胞群，然后篩選PDGFR α +細胞，與分選前的神經(jīng)或神經(jīng)來源細胞群比較，產(chǎn)生富集在PDGFR α +OPCs中所篩選出的細胞群。OPCs被分離出來的細胞群優(yōu)選為神經(jīng)組織，神經(jīng)組織分離出的細胞群，產(chǎn)生神經(jīng)細胞或神經(jīng)組織的細胞群，或者細胞培養(yǎng)基中的細胞群，例如，神經(jīng)球培養(yǎng)或者貼壁神經(jīng)干細胞培養(yǎng)中的細胞。少突膠質(zhì)細胞前體細胞(OPC)鑒別涉及采用結(jié)合細胞表面標記物的試劑接觸細胞群或神經(jīng)細胞群(或者包含神經(jīng)或神經(jīng)來源細胞的組織)，細胞表面標記物由 OPCs靶向細胞群表達。舉例來說，該方法可包括采用結(jié)合PDGFR α (如，一種單克隆抗體) 的試劑接觸神經(jīng)或神經(jīng)來源細胞群，并檢測結(jié)合PDGFR α的試劑和細胞表面上的PDGFRa 之間的接觸反應。靶向OPCs包括在試劑結(jié)合試劑的細胞群內(nèi)。這些細胞的鑒別可通過本領(lǐng)域已知的一些測試方法證實，證明細胞是，事實上，OPCs，如能夠增殖并分化為成熟的少突膠質(zhì)細胞。根據(jù)一些實施方案所述的OPCs可進一步表現(xiàn)為呈⑶105免疫陰性(⑶105_)。 因此，鑒別、分離、或富集少突膠質(zhì)前體細胞群的方法可以另外包括從神經(jīng)或神經(jīng)來源細胞中篩選呈⑶105免疫陰性的細胞(⑶105_細胞)，并從細胞群中去除⑶105+細胞。篩選 ⑶105—細胞之后，從現(xiàn)有細胞群中篩選出至少一個呈PDGFRα免疫陽性(PDGFRa+)的細胞。在備選方案中，本發(fā)明提供了分離少突膠質(zhì)前體細胞(OPC)的方法，通過從神經(jīng)或神經(jīng)來源細胞群篩選呈PDGFR α免疫陽性(PDGFRa+)的細胞，例如，結(jié)合單克隆抗體PDGFR α ； 從細胞群中去除呈免疫陰性(PDGFRa _)細胞，并從現(xiàn)有細胞群中篩選出呈免疫陰性CD 105 (⑶105_)的細胞，例如從細胞群中去除⑶105—細胞。根據(jù)一些實施方案所述的OPCs可進一步表現(xiàn)為呈⑶133免疫陽性(⑶133+)。 因此，鑒別、分離、或富集少突膠質(zhì)前體細胞群的方法可以另外包括從神經(jīng)或神經(jīng)來源細胞中篩選呈⑶133免疫陽性的細胞(⑶133+細胞)，并從細胞群中去除⑶133+細胞。篩選⑶ 133+細胞之后，從現(xiàn)有細胞群中篩選出至少一個PDGFRα免疫陽性(PDGFRa+)的細胞。因此，本發(fā)明進一步提供了從神經(jīng)組織或神經(jīng)干細胞培養(yǎng)基中富集靶向 OPCs (如，懸浮培養(yǎng)或貼壁培養(yǎng))的方法。本發(fā)明的方法和組合物是有利于從神經(jīng)組織中富集靶向0PC，其中干細胞和祖細胞出現(xiàn)頻率低，或者可能已經(jīng)所剩無幾，如后期胚胎、青少年和成人組織。因此，本領(lǐng)域的一個技術(shù)人員可以使用一種試劑結(jié)合包含了一部分OPCs的神經(jīng)或神經(jīng)來源細胞，這種試劑特異性結(jié)合如PDGFR α細胞，然后篩選出PDGFRa +細胞。 與篩選前的神經(jīng)或神經(jīng)來源細胞群比較，采用這種方式，篩選的PDGFRa +細胞在一部分 OPCs中富集。依據(jù)優(yōu)選的實施方案，靶向OPCs可基于中表達到高表達來進行定性(例如，PDGFR α med或者PDGFR α high)。舉例來說，基于中表達到高表達(PDGFR α med或者PDGFR α high)， 靶向OPCs包括在懸浮神經(jīng)球中分選出的PDGFRa +細胞中。靶向OPCs可進一步依據(jù)本發(fā)明所述的標記CD105、CD133、A2B5、PSA-NCAM、04、和/或NG2的表達來鑒別?；诒绢I(lǐng)域中已知的細胞標記表達，篩選細胞群的方法可用于篩選本發(fā)明的OPCs 細胞。舉例來說，PDGFRa +和/或⑶133+靶向細胞群的鑒別可能涉及采用結(jié)合到PDGFRa 和/或CD133的試劑接觸神經(jīng)細胞群(或組織，其包含神經(jīng)或神經(jīng)來源細胞)，檢測結(jié)合到 PDGFRa和/或⑶133的試劑和在細胞表面上的PDGFRa和/或⑶133之間的接觸。靶向 OPCs包括在該試劑結(jié)合的那些細胞群內(nèi)。而這些細胞的鑒別可以通過一些測試方法證實， 證明細胞是，事實上，OPCs，如它們能夠分化為成熟的少突膠質(zhì)細胞。細胞分選的利用傳統(tǒng)技術(shù)，如采用免疫反應篩選(例如，熒光激活細胞分離(FACS))，進行細胞的鑒別、分離和/ 或富集，其中試劑和PDGFRa抗原之間的接觸被檢測出。本領(lǐng)域中的一個技術(shù)人員將分離出的靶向OPC(S)引入到培養(yǎng)基中；培養(yǎng)基中分離出的靶向OPC(S)增殖；該條件下孵育分離出的靶向OPC(S)的后代細胞，其中被分離出的靶向OPC(S)分化為少突膠質(zhì)細胞；檢測到少突膠質(zhì)細胞的存在。分離出目標OPC(S)的特征是存在少突膠質(zhì)細胞。本領(lǐng)域已知的一些細胞標記也可用于OPCs細胞的陽性和陰性篩選。例如，抗人 CD45單克隆抗體(mAb)可以用來排除胎兒組織中的血液細胞污染。在某些情況下，抗人 CD34單克隆抗體(mAb)可以用來排除內(nèi)皮細胞和內(nèi)皮-神經(jīng)祖細胞配合物。在某些情況下，抗人CDM抗體可以用來排除不太可能誘發(fā)神經(jīng)球的那些細胞。這些抗體中一些可單獨使用、組合使用、或在本方法中按順序富集本文中公開的靶向細胞群。使用本文所公開的技術(shù)和方法，使用適宜抗體或優(yōu)選抗體系列，本領(lǐng)域中的一位技術(shù)人員可以通過免疫篩選得到靶向OPCs細胞群。根據(jù)一些實施方案，靶向細胞群包含至少30 %的PDGFR a +OPCs細胞，優(yōu)選至少50-70 %的PDGFRA a +OPCs細胞，更優(yōu)選大于90 % PDGFRa+OPCs細胞(例如，92%或以上，94%或以上，96%或以上，或98%或以上)。更優(yōu)選大體純化的PDGFR a +OPCs細胞群，包括至少95 %的PDGFR a +OPCs細胞(例如，97 %或 99% )。根據(jù)一些實施方案，靶向細胞群含有至少30%的PDGFRa +、⑶105_0PCs，優(yōu)選至少 50-70% 的 PDGFRa+、CD 105" OPCs，更優(yōu)選大于 90% 的 PDGFR a+、CD105- OPCs (例如，92% 或以上，94%或以上，96%或以上，或98%或以上)。最優(yōu)選大體純化的PDGFRa+、⑶105_ OPCs 細胞群，包括至少 95% 的 PDGFR a +、CD105_ OPCs (例如，97%或 99% ) 根據(jù)一些實施方案，靶向細胞群包含至少30%的PDGFRa +、A2B5_0PCs，優(yōu)選至少 50-70 % 的 PDGFR a +、A2B5"0PCs，更優(yōu)選大于 90 % 的 PDGFR a +、A2B5"0PCs (例如，92 % 或以上，94%或以上，96%或以上，或98%或以上)。最優(yōu)選大體純化的PDGFRa+、A2B5_ OPCs細胞群，包括至少95%的PDGFRa+、A2B5_ OPCs (例如，97%或99% )。根據(jù)一些實施方案，靶向細胞群又呈CD 105免疫陰性(CD 105_)。根據(jù)一些實施方案，靶向細胞群包含至少30%的？06 1^+42851°^^(^，優(yōu)選至少 50-70% 的 PDGFR a +、A2B5lo/_0PCs,更優(yōu)選大于 90% 的 PDGFR a +、A2B5lo/_ OPCs (例如，92% 或以上，94%或以上，96%或以上，或98%或以上)。最優(yōu)選大體純化的PDGFR a+、A2B5W_ OPCs細胞群，包括至少95%的PDGFR a+、A2B5W_ OPCs (例如，97%或99% )。根據(jù)一些實施方案，靶向細胞群又呈CD 105免疫陰性(CD 105_)。根據(jù)一些實施方案，靶向細胞群包含至少30%的PDGFR α med/hig\ A2B5_0PCs， 優(yōu)選至少 50-70 % 的 PDGFR α med/hig\ A2B5" OPCs，更優(yōu)選大于 90 % 的 PDGFR α med/hig\ A2B5_0PCs (例如，92%或以上，94%或以上，96%或以上，或98%或以上)。最優(yōu)選大體純化的 PDGFR α med/hig\A2B5"0PCs 細胞，包括至少 95% 的 PDGFR α med/hig\A2B5"0PCs (例如，97%或 99%)。根據(jù)一些實施方案，另外，靶向細胞群又呈CD 105免疫陰性(CD 105_)。根據(jù)一些實施方案，靶向細胞群包含至少30%的PDGFRa med/high、A2B5W_ OPCs，優(yōu)選至少 50-70 % 的 PDGFR a med/hig\ A2B5lo/" OPCs，更優(yōu)選大于 90 % 的 PDGFR a med/hig\ Α2Β51ο/" 0PCs(例如，92%或以上，94%或以上，96%或以上，或98%或以上)。最優(yōu)選大體純化的 PDGFRamed/high、A2B5w- OPCs 細胞群，包括至少 95% 的 PDGFR a med/high、A2B5w- OPCs,(例如， 97%或99%)。根據(jù)一些實施方案，靶向細胞群又呈⑶105免疫陰性(⑶105_)。根據(jù)一些實施方案，靶向細胞群包含至少30%的PDGFR a +、PSA-NCAM— OPCs，優(yōu)選至少 50-70 % 的 PDGFR a \PSA-NCAM"0PCs,更優(yōu)選大于 90 % 的 PDGFR a \PSA-NCAM"0PCs (例如，92%或以上，94%或以上，96%或以上，或98%或以上)。最優(yōu)選大體純化的PDGFRa +、 PSA-NCAM- 0 08細胞群，包括至少95%的？06 1^+、？54-^^11- OPCs,(例如，97%或99% )。 根據(jù)一些實施方案，目標細胞群又呈⑶105免疫陰性(⑶105_)。根據(jù)一些實施方案，靶向細胞群包含至少30%的PDGFR a+、PSA-NCAMw_0PCs， 優(yōu)選至少 50-70 % 的 PDGFRa +、PSA-NCAMlo/_0PCs,更優(yōu)選大于 90 % 的 PDGFRa +、 PSA-NCAMw_0PCs(例如，92%或以上，94%或以上，96%或以上，或98%或以上)。最優(yōu)選大體純化的 PDGFR a +、PSA-NCAM1。" opCs 細胞群，包括至少 95% 的 PDGFR a +、PSA-NCAMlo/_ OPCs,(例如，97%或99% )。根據(jù)一些實施方案，目標細胞群又呈⑶105免疫陰性(⑶ 105，。根據(jù)一些實施方案，靶向細胞群包含至少30%的PDGFR a med/hig\ PSA-NCAM" OPCs， 優(yōu)選至少 50-70 % 的 PDGFR a med/hig\ PSA-NCAiT OPCs,更優(yōu)選大于 90 % 的 PDGFR a med/hig\ PSA-NCAM_ OPCs (例如，92%或以上，94%或以上，96%或以上，或98%或以上)。最優(yōu)選大體純化的PDGFR a med/hig\PSA-NCAM" OPCs 細胞群，包括至少 95% 的PDGFR a med/hig\PSA-NCAM" OPCs,(例如，97%或99% )。根據(jù)一些實施方案，靶向細胞群又呈⑶105免疫陰性(⑶ 105，。根據(jù)一些實施方案，靶向細胞群包含至少30%的PDGFR a med/hig\PSA-NCAMlo/"0PCs, 優(yōu)選至少 50-70 % 的 PDGFR a med/hig\ PSA-NCAMlo/"0PCs,更優(yōu)選大于 90 % 的 PDGFR a med/ high、PSA-NCAMw_0PCs (例如，92 %或以上，94 %或以上，96 %或以上，或98 %或以上)。 最優(yōu)選大體純化的 PDGFR a med/hig\ PSA-NCAMlo/"0PCs,包括至少 95 % 的 PDGFR a med/hig\ PSA-NCAMw_0PCs，(例如，97%或99% )。根據(jù)一些實施方案，靶向細胞群呈⑶105免疫陰性(CD 105")。根據(jù)一些實施方案，靶向細胞群包含至少30%的PDGFRa +、CD133+、A2B5w_0PCs， 優(yōu)選至少 50-70% 的 PDGFR a +、CD133+、A2B5lo/_0PCs,更優(yōu)選大于 90% 的 PDGFR a +、CD133+、 A2B5w_0PCs (例如，92%或以上，94%或以上，96%或以上，或98%或以上)。最優(yōu)選大體純化的 PDGFR a +、CD133+、A2B510廠OPCs 細胞群，包括至少 95 % 的 PDGFR a +、CD133+、 A2B5w_0PCs(例如，97%或99% )。根據(jù)一些實施方案，靶向細胞群又呈⑶105免疫陰性(CD 105，。根據(jù)一些實施方案，靶向細胞群包含至少30 %的PDGFRa +、⑶133+、 PSA-NCAMlo/_0PCs,優(yōu)選至少 50-70 % 的 PDGFRa +、CD133+、PSA-NCAMlo/_0PCs,更優(yōu)選大于 90 % 的 PDGFR a +、CD 133+、PSA-NCAMlo/_0PCs (例如，92 % 或以上，94 % 或以上，96 % 或以上， 或98%或以上)。最優(yōu)選大體純化的PDGFRa +、CD133+、PSA-NCAMw_0PCs細胞群，包括至少 95% 的 PDGFRa +、CD133+、PSA-NCAMw^PCs (例如，97%或 99% )。根據(jù)一些實施方案，靶向細胞群又呈CD 105免疫陰性(CD 105_)。根據(jù)一些實施方案，靶向細胞群包含至少30%的PDGFR a +、Α2Β51ο/\ PSA-NCAMlo/_0PCs,優(yōu)選至少 50-70 % 的 PDGFRa +、A2B5lo/\ PSA-NCAMlo/_0PCs,更優(yōu)選大于 90 % 的 PDGFR a +、A2B5lo/\ PSA-NCAMlo/_0PCs (例如，92 % 或以上，94 % 或以上，96 % 或以上， 或98%或以上)。最優(yōu)選大體純化的PDGFR a +、A2B5W_、PSA-NCAMw_0PCs細胞群，包括至少 95% 的 PDGFRa +、A2B5lo/\ PSA-NCAM1(^0PCs (例如，97%或 99% ) 根據(jù)一些實施方案， 靶向細胞群又呈⑶105免疫陰性(CD 1050 ο根據(jù)一些實施方案，靶向細胞群包含至少30%的PDGFR a med/hig\ A2B5 w_、 PSA-NCAM1(^0PCs，優(yōu)選至少 50-70% 的 PDGFR a med/hig\ A2B5lo/\ PSA-NCAMlo/_0PCs,更優(yōu)選大于 90 % 的 PDGFR a med/hig\A2B5lo/\PSA-NCAMlo/_0PCs (例如，92 %或以上，94%或以上，96 %或以上，或98%或以上)。最優(yōu)選大體純化的PDGFR a med/hig\ A2B5lo/\ PSA-NCAMw_0PCs細胞群，包括至少 95%的 PDGFRa med/hig\ A2B5lo/\ PSA-NCAMlo/_0PCs,(例如，97%或 99% )。根據(jù)一些實施方案，靶向細胞群又呈⑶105免疫陰性(⑶105_)。根據(jù)一些實施方案，靶向細胞群含有至少30%的PDGFRa+、04_0PCs，優(yōu)選至少 50-70 % 的 PDGFR a +、OfOPCs，更優(yōu)選大于 90 % 的 PDGFR a +、OfOPCs (例如，92 % 或以上， 94%或以上，96%或以上，或98%或以上)。最優(yōu)選大體純化的PDGFRa+OPCs細胞群、 04-0PCs細胞群，包括至少95%的PDGFRa+、04-()PCs (例如，97 %或99 % )。根據(jù)一些實施方案，靶向細胞群又呈⑶105免疫陰性(⑶105_)。富集程度，實際使用的，取決于一些因素，包括分選方法、增長方法、和/或培養(yǎng)基中放入的細胞量。深低溫保存和處理根據(jù)一些實施方案，本實施方案的OPCs可按常規(guī)程序深低溫保存。在一些實施方案中，深低溫保存涉及在冷凍介質(zhì)中冷凍約一個至一千萬個細胞，其中可能包括增殖培養(yǎng)基和抗氧化劑如NAC(0. 1至2mM，例如，0. 5mM，ImM等)。增殖培養(yǎng)基優(yōu)選無生長因子有絲分裂原。舉例來說，懸浮細胞可被離心分離，吸出一些生長介質(zhì)，用冷凍介質(zhì)取代。然后，細胞慢慢被凍結(jié)，例如，-80°C下放置在容器內(nèi)或冷凍在液氮中。細胞在37°C浴器內(nèi)旋轉(zhuǎn)解凍， 再懸浮在新鮮的增殖培養(yǎng)基中，并正常生長。根據(jù)一些實施方案，本實施方案的OPCs可以準備使用的形式(如醫(yī)藥級小瓶或容器)凍存。在一些實施方案中，OPCs在使用前解凍并培養(yǎng)。在一些實施方案中，OPCs在使用前解凍和在懸浮液中培養(yǎng)。在一些實施方案中，OPCs在使用前解凍并在貼壁基質(zhì)上培養(yǎng)。 解凍后培養(yǎng)期可能是1至M個小時。在一些實施方案中，解凍后培養(yǎng)期可能從1到2天。根據(jù)一些實施方案，本發(fā)明的OPCs可處于懸浮培養(yǎng)液中。根據(jù)一些實施方案，本發(fā)明的OPCs細胞從培養(yǎng)板脫離后(如，胰蛋白酶后處理)可處于懸浮培養(yǎng)液中。舉例來說，粘附的OPCs用胰蛋白酶處理脫離，并轉(zhuǎn)移到懸浮培養(yǎng)液中。OPCs保存在懸浮液的時間可稱為“保存”期。懸浮液中的保存期至少有以下3個原因的優(yōu)勢1)移植和/或冷凍保存之前將使細胞從潛在破壞性酶處理中恢復；幻動物手術(shù)安排中更靈活；幻等待移植的OPCs 能夠裝運到非現(xiàn)場處(實驗室或診所)。根據(jù)一些實施方案，保存期可能是2、4、6、8、12、18 或?qū)€小時。根據(jù)一些實施方案，保存期可能是1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10天。組織源任何合適的組織源可用于得到本發(fā)明的OPCs。成人中樞神經(jīng)系統(tǒng)已被證明包含具有增殖能力的少突膠質(zhì)前體細胞，適當?shù)臈l件下能長成為髓鞘少突膠質(zhì)細胞。因此，細胞群可以從后期胚胎、青少年和成年哺乳動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)組織得到，也可能從神經(jīng)干細胞現(xiàn)有培養(yǎng)基中得到，如Weiss申請的美國專利5，750，376，或者Johe申請的美國專利介紹 5，753，506中描述的。OPCs也可從能夠產(chǎn)生神經(jīng)組織的任何組織或細胞源中得到。在一個優(yōu)選的實施方案中，OPCs來自人。OPCs可從幾種哺乳動物的神經(jīng)或神經(jīng)來源細胞中分離得到，包括，但不限于，小鼠、大鼠、豬、非人靈長類動物、和人。神經(jīng)或神經(jīng)來源細胞可從胚胎、胎兒、產(chǎn)后、青少年、 成人神經(jīng)組織中得到，包括腦和脊髓。舉例來說，神經(jīng)或神經(jīng)來源細胞可以從大腦皮層、小腦、中腦、腦干、脊髓和心室，以及包括頸動脈體和腎上腺髓質(zhì)的PNS區(qū)域得到。其他優(yōu)先區(qū)域包括基底神經(jīng)節(jié)內(nèi)的區(qū)域，優(yōu)選由尾和殼組成的紋狀體，或多種細胞群如蒼白球、丘腦底核、基地核、黑質(zhì)致密部，以及來自發(fā)現(xiàn)襯里中樞神經(jīng)系統(tǒng)腦室的腦室組織，包括室管膜下區(qū)。在腦室下區(qū)和腹側(cè)神經(jīng)上皮是在成年動物中OPCs的優(yōu)選來源。除了 OPCs，存在于成人中樞神經(jīng)系統(tǒng)的細胞群，其表現(xiàn)出干細胞特性，能夠自我更新并產(chǎn)生成人中樞神經(jīng)系統(tǒng)的分化成熟細胞表型如少突膠質(zhì)細胞。這些干細胞被發(fā)現(xiàn)在整個中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)，尤其是在腦室下區(qū)和海馬齒狀腦回中，表明靶向OPCs細胞可從其中分離出的神經(jīng)或神經(jīng)來源細胞群的來源。神經(jīng)干細胞也從多種成人中樞神經(jīng)系統(tǒng)腦室區(qū)中分離出，包括額葉、圓錐脊髓、胸椎脊髓、腦干和丘腦下部。生長因子響應干細胞可以從小鼠、鼠、哺乳動物和人中樞神經(jīng)系統(tǒng)組織的神經(jīng)軸的許多區(qū)域分離出并且處于不同發(fā)展階段。這些細胞根據(jù)生長因子如EGF、堿性FGF(bFGF、 FGF-2)和轉(zhuǎn)化生長因子(TGFa)的應答而變化，可以未分化狀態(tài)在培養(yǎng)基內(nèi)保持并擴增一段較長時間。(參見，例如W093/01275和W094/16788，通過引述合并于本文中)。增殖OPCs可以在懸浮液或貼壁基質(zhì)上培養(yǎng)細胞誘發(fā)增殖。參見，例如，美國專利 5，750，376和5，753，506 (通過引述全部都合并于本文中)，這里描述的培養(yǎng)基。同種異體移植和自體移植都擬用于移植目的。通常情況下，本實施方案的OPCs在培養(yǎng)基中培養(yǎng)，使其生長和增殖。分離的OPCs 增殖的培養(yǎng)基可能為一種無血清培養(yǎng)基，其包含有效誘導增殖的一個或多個預定的生長因子。培養(yǎng)液可附加生長因子，該生長因子選自血小板衍生生長因子(PDGF)、表皮生長因子 (EGF)、堿性成纖維細胞生長因子(FGF-2，bFGF)、NT3、IGFl或其組合。培養(yǎng)基可進一步附加N2和B27。OPCs分化成少突膠質(zhì)細胞的條件包括在培養(yǎng)基內(nèi)涂有層粘連蛋白或?qū)诱尺B蛋白加纖維連接蛋白的表面上培養(yǎng)OPC后代，培養(yǎng)基含有胎牛血清(FBQ或T3(三碘甲狀腺氨酸)而無 EGF、bFGF、PDGF、NT3、IGFl 或 LIF。根據(jù)一些實施方案，本實施方案的OPCs可能為從初生組織源分離后被傳代1到20倍(如 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19 和 20 倍)，并可在懸浮液或
者貼壁基板上培養(yǎng)細胞而誘發(fā)增殖。傳代(a. k.a，接種或分裂)通常涉及采用胰蛋白酶消化或機械手段從主要培養(yǎng)容器表面分離細胞。然后，由此產(chǎn)生的細胞懸液再細分，或補種， 成新的培養(yǎng)基。二級培養(yǎng)基定期檢查生長和進料，隨后可能繼代培養(yǎng)產(chǎn)生三級培養(yǎng)基等。細胞傳代之間次數(shù)變化，取決于增長速度。增殖培養(yǎng)基可以是本領(lǐng)域中已知的培養(yǎng)基，在無誘導其分化的情況下誘導OPCs 的增殖。本文的實施例3提供了用于增殖本實施方案的OPCs的示范性培養(yǎng)基。細胞傳代或分裂是維持細胞呈指數(shù)增長所必需的。細胞傳代或分裂的方法是本領(lǐng)域中眾所周知的。 OPCs可使用本領(lǐng)域中周知的任何已知方法進行傳代。分化當OPCs在分化的條件下培養(yǎng)，祖細胞分化為少突膠質(zhì)細胞。細胞的分化能夠采用本領(lǐng)域中已知的任何方法進行誘導，包括釋放三磷酸肌醇和細胞內(nèi)Ca2+、釋放甘油二酯、激活蛋白激酶C、和其他細胞激酶，以及類似方法。采用佛波醇酯處理，誘導分化的生長因子、 激素和其他化學信號可以誘導分化。生長因子耗盡可誘導分化，例如，通過去除有絲分裂原，細胞留在沒有介質(zhì)更新的培養(yǎng)基中，或者無傳代的情況?？梢酝ㄟ^在懸浮液或在粘附基質(zhì)上培養(yǎng)細胞實現(xiàn)誘導OPCs增殖(和分化)?；蛘?，在適當條件下，在宿主體內(nèi)，按照下列組合可誘發(fā)OPCs的增殖和分化(1)在體外增殖和分化，然后移植，⑵在體外增殖，移植，然后體內(nèi)再增殖和分化，⑶體外增殖，移植，體內(nèi)分化，以及(4)在體內(nèi)增殖和分化。在體內(nèi)或者原位增殖和分化可能涉及非手術(shù)方法，采用制藥操作讓OPCs在體內(nèi)增殖。涉及OPCs移植的這些方法在下文中進一步詳細討論。純化干細胞/祖細胞的使用。使用本文所述的方法鑒別靶向OPC細胞群在多種方法中是有效的，包括藥物篩選、診斷、移植和治療。OPCs可被用于重建宿主，宿主細胞已因疾病或受傷而喪失。細胞相關(guān)遺傳性疾病的治療可采用自體或異體OPCs的基因改造，以糾正基因缺陷或者治療而對疾病有抵抗力。或者，正常的異體OPCs可被移植。除了細胞相關(guān)那些疾病之外的疾病也可進行治療，這種疾病涉及一種特定的分泌物不足，如激素、酶、生長因子、或類似物質(zhì)。中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病包括許多病痛如神經(jīng)退行性疾病(例如，老年癡呆癥和帕金森氏)、急性腦損傷(例如，中風、局部缺血、顱腦損傷、腦性麻痹)和許多中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙(如抑郁癥、癲癇和精神分裂癥)。近年來，神經(jīng)退行性疾病已成為一個重要的問題，不斷擴大的老齡人口成為這些疾病的最大風險。這些疾病，包括，舉例來說，阿爾茨海默氏癥、多發(fā)性硬化癥(MQ、亨廷頓氏病、肌萎縮性脊髓側(cè)索硬化癥和帕金森氏病，關(guān)系到中樞神經(jīng)系統(tǒng)特定位置的神經(jīng)細胞變性，導致這些細胞或者大腦區(qū)域失去能力執(zhí)行其預定功能。通過特異性不同的生長因子，達到成熟、增殖并分化為少突膠質(zhì)細胞，少突膠質(zhì)祖細胞可被用作少突膠質(zhì)細胞的來源。靶向OPC細胞群也可能用在細胞分化和成熟相關(guān)的分離以及因素評估中。因此， 這些細胞可在檢測中使用，以確定培養(yǎng)基的活性，如條件培養(yǎng)基，評估液體的生長因子活性，參與建立譜系，或類似行為。靶向OPC細胞群可在液氮溫度下凍結(jié)并存儲較長時間，解凍，能夠被重復使用。這些細胞通常會被儲存在7. 5% DMSO和4% HSA (人血清白蛋白)中。一旦解凍，使用生長因子或OPC增殖和分化相關(guān)的細胞，這些細胞可被擴增。移植從神經(jīng)細胞群或神經(jīng)組織中獲得的靶向OPC細胞群可引入到哺乳動物中(例如， 通過移植)，尤其用于補償損失的或不正常的少突膠質(zhì)細胞。哺乳動物優(yōu)選是人、犬、貓、鼠、 羊、山羊、牛、馬、豬、或者非人類靈長類動物。最優(yōu)選的，哺乳動物是人。由于OPCs可能來自任何年齡的哺乳動物的腦組織，包括成人，優(yōu)選采用哺乳動物自己的組織自體移植生長神經(jīng)干細胞。同種異體和異種移植也是可能的，尤其是當移植部位在大腦或眼睛，由于血腦或血液視網(wǎng)膜屏障，免疫排斥反應不嚴重。在某些實施方案中，本實施方案的OPCs以至少大于IXlO2tl個總有核細胞等級的劑量移植，或至少在1019、或1018、或1017、或1016、或1015、或1014、或1013、或1012、或1011、或 101(1、或109、或108、或107、或106、或IO5個細胞等級。在一些實施方案中，本實施方案的OPCs 可能被移植劑量為 IX IO6 至 1X1012、1X IO6 至 IX IO9UX IO8 至 IX IO10UX IO9 至 IX 1012、 IX IO9至IX IOltl個細胞。在一些實施方案中，細胞配制在一個密封制藥瓶中，以備對患者給藥。靶向OPCs可被移植到哺乳動物體中并誘導少突膠質(zhì)細胞在體內(nèi)形成。因此，采用已有的方法，靶向OPC細胞群可在培養(yǎng)基中擴增，移植到哺乳動物體中，并在體內(nèi)接觸少突膠質(zhì)細胞促進因子產(chǎn)生少突膠質(zhì)細胞。任選地，通過對哺乳動物給藥已知用于增加OPCs數(shù)量的一些生物制劑，移植的OPCs能夠在體內(nèi)再擴增。根據(jù)一些實施方案，本發(fā)明的OPCs是介于傳代后1至5天內(nèi)被移植，優(yōu)選在傳代后1至2天內(nèi)被移植。本實施方案的OPCs可能以細胞團或沒有關(guān)聯(lián)的細胞懸液移植。使用這種方式獲得的細胞的移植數(shù)據(jù)(未顯示)是健康的，導致含有大量的髓鞘少突膠質(zhì)細胞的移植。根據(jù)一些實施方案，本實施方案的OPCs在傳代后可在制藥瓶內(nèi)的懸浮液中保存 10分鐘至5天(例如，30分鐘、1小時、2小時、4小時、8小時、12小時、24小時、36小時、48 小時、3天、4天等)，以備對患者給藥。本實施方案一些OPCs在懸浮液中的劑量可能至少在大于IXlO20個總有核細胞的等級，或至少在1019、或1018、或1017、或1016、或1015、或1014、或 1013、或1012、或1011、或1010、或109、或108、或107、或106、或IO5個細胞的等級。在一些實施例中，本實施例的OPCs在懸浮液中的劑量可能在IX IO6至IX IO12UX IO6至IXlO9UX IO8 至IX IO10UX IO9至IX IO12UX IO9至IX IOltl個細胞之間。在一些實施方案中，細胞配制在一個密封制藥瓶中，以備對患者給藥。少突膠質(zhì)細胞促進因子或生物制劑可通過本領(lǐng)域的任何適宜路線給藥，包括，舉例來說，口服、局部給藥、直腸給藥、陰道給藥、鞘內(nèi)注射、血管內(nèi)給藥、靜脈注射、肌肉注射、 腹腔給藥、透皮給藥、皮層內(nèi)給藥、皮下給藥、鼻腔給藥或吸入給藥。給藥途徑主要取決于試劑的性質(zhì)。舉例來說，GM-CSF能夠穿越血腦屏障，因此它可以全身給藥，以及施藥給大腦。 優(yōu)選的給藥方法是注射(例如，用針或?qū)Ч?或輸液。按照常規(guī)技術(shù)，靶向OPCs可移植給患者中樞神經(jīng)系統(tǒng)，舉例來說，美國專利 5，082，670和5，618，531，公開內(nèi)容通過引述合并于本文中，或者移植進體內(nèi)的任何其他適宜部位。在一些實施方案中，OPCs直接移植到中樞神經(jīng)系統(tǒng)。實質(zhì)和鞘內(nèi)位置也被考慮。 應了解，中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)確切部位會根據(jù)疾病狀態(tài)而變化。根據(jù)一些實施方案，OPCs可能在植入前積聚，或可能直接以分離的單個細胞被采用。當使用OPC聚集體時，移植優(yōu)選使用約10-500微米直徑的小尺寸聚集體進行移植，優(yōu)選直徑40-50微米。優(yōu)選地，從約100萬個細胞至約10億個細胞被移植。舉例來說，總數(shù)約100萬、約500萬、約1000萬、約2500萬、約5000萬、約7500萬、約1億、約2. 5億、約5 億、約7. 50億，或者約10億個細胞被移植。OPCs優(yōu)選引入到哺乳動物的大腦或脊髓中，尤其是在少突膠質(zhì)細胞不足和/或功能失調(diào)的位置，舉例來說，已脫髓鞘軸突周圍。人體中，脫髓鞘區(qū)域一般與斑塊結(jié)構(gòu)有關(guān)。采用磁共振成像(MRI)可視化。這些細胞也可能被移植到中樞神經(jīng)系統(tǒng)其它區(qū)域。一個特別有效的方法是移植到在另一半球靶病變的“鏡像”位置，因為細胞已知有效地通過胼胝體遷移到對側(cè)半球的相應位置。根據(jù)一些實施方案，OPCs直接引入到大腦或脊髓區(qū)域。OPCs直接引入可使用本領(lǐng)域中已知的任何方法實施。因此，根據(jù)一些實施方案，OPCs通過注射引入到靶向大腦區(qū)域。 優(yōu)選地，OPCs引入到嚴重有髓的大腦區(qū)域(白質(zhì)豐富)。菌毛是沿海馬內(nèi)側(cè)邊緣的主條帶的白質(zhì)。白質(zhì)構(gòu)成了大腦深部的主體及脊髓表面部分。胼胝體是大腦中的最大白質(zhì)結(jié)構(gòu)， 連接左、右大腦半球。在一些實施方案中，靶向腦區(qū)包括菌毛、胼胝體、大腦腳、內(nèi)囊、脊髓、 腦干、運動皮質(zhì)、嗅皮質(zhì)、體感皮層、前扣帶回、下顳葉、背外側(cè)前額葉皮層和延髓?；屹|(zhì)聚集體，如基底神經(jīng)節(jié)(尾狀核、殼核、蒼白球、丘腦底核、伏隔核)和腦干核 (紅核、黑質(zhì)、顱神經(jīng)核)分布在大腦白質(zhì)內(nèi)。這些區(qū)域也是靶向腦區(qū)。靶向腦區(qū)包括，但不限于，端腦(大腦半球、前腦)、間腦(丘腦、下丘腦、上丘腦、prethalamus或丘腦底部和前頂蓋)、中腦(腦)、小腦、橋腦和延髓。中腦包括頂蓋(下丘和上丘)和大腦腳(中腦被蓋、小腿腦瘤、黑質(zhì))。黑質(zhì)是基底神經(jīng)節(jié)的一部分；基底神經(jīng)節(jié)的其他部分包括紋狀體(尾狀核、殼核和伏隔核)、蒼白球和丘腦底核。靶向腦區(qū)可能包括腦干、紋狀體、內(nèi)囊、尾狀核和殼核。OPCs的遺傳改良本實施例OPCs細胞可通過遺傳改良提供一種治療有效的生物活性分子。在一些實施方案中，遺傳改良OPCs可能被移植或引入到如上所述需要治療的主體內(nèi)。在某些實施方案中，本實施方案的OPCs細胞可能進行遺傳改良表達一種特殊形式的髓鞘蛋白脂質(zhì)(PLP)，如在自體移植中。此外，本實施方案的OPCs可進行遺傳改良表達下列中一個或多個端粒酶(防止端粒侵蝕)、生長因子、成形素、酶、抗凋亡基因(例如， SHH 蛋白、FGF2、NT3、BDNF, PDGF, IGF、NGF)、arylsuphatase A(異染性腦白質(zhì)病變)、半乳糖神經(jīng)鞘氨醇酶(krabbe' s)、超氧化物歧化酶和抗氧化防御的其他蛋白，和Bcl_XL。根據(jù)已知的方法，本文中描述的OPCs可進行遺傳工程或改良。術(shù)語“遺傳改良”是指通過引進外來DNA穩(wěn)定或瞬時改變細胞基因型。DNA可為合成的，或者天然來源，可包含基因，部分基因，或者其他有效的DNA序列。術(shù)語“遺傳改良”并不意味著包括自然存在改變，例如通過自然病毒活性、天然基因重組、或類似情況而發(fā)生。使用標準技術(shù)，目的基因(例如，編碼一種生物活性分子的基因)可插入到適宜表達載體的克隆位點。這些技術(shù)是本領(lǐng)域中的技術(shù)人員眾所周知的。參見，例如，W094/16718， 通過引述合并于文本中。包含目的基因的表達載體可被用來轉(zhuǎn)染預期細胞株。標準轉(zhuǎn)染技術(shù)如磷酸鈣共沉淀、DEAE-葡聚糖轉(zhuǎn)染、電穿孔、基因槍法、或病毒轉(zhuǎn)染可被采用。市售哺乳動物轉(zhuǎn)染試劑盒可從如Mratagene公司購買。人腺病毒轉(zhuǎn)染可按照Berg et al. Exp. Cell Res.，192， pp. (1991)中描述的方法完成。同樣，脂質(zhì)體基轉(zhuǎn)染可以按照Cattaneo，MoI. Brain Res.， 42，pp. 161-66(1996)中描述的方法完成。一個宿主/表達載體的多種組合可以用來表達編碼目的生物活性分子的基因。參見，例如，美國專利5，545, 723，通過引述合并于本文中，適宜的細胞基生產(chǎn)表達載體。生物活性分子的表達增加，可以使用本領(lǐng)域中已知擴增方法通過增加或擴增轉(zhuǎn)基因拷貝數(shù)實現(xiàn)。這種擴增方法包括，如DHFR擴增(參見，例如，Kaufman et al.申請的美國專利No. 4，470，461)或谷氨酰胺合成酶(“GS”)擴增(參見，例如，美國專利5，122，464， 歐洲公開申請EP 338，841)，通過引述全部合并于本文中。本領(lǐng)域中已知的任何表達載體可用于表達生物活性分子。在一些實施方案中，慢病毒衍生載體對外源基因傳輸尤其有效。這種慢病毒載體是本領(lǐng)域已知的。在一些實施方案中，外源基因可能需要將其引入到靶向OPCs表達中。這種基因可能在影響最佳共表達的組成型或誘導啟動子控制下。外源DNA可能通過病毒載體(逆轉(zhuǎn)錄病毒、改性皰疹病毒、皰疹病毒、腺病毒、腺相關(guān)病毒、慢病毒和類似病毒)或直接DNA轉(zhuǎn)染(脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染、CaPO4R 染、DEAE-葡聚糖、電穿孔和類似方法)引入到前體細胞中。本實施方案的OPCs可能通過基因改良用于藥物篩選目的或用于檢測少突膠質(zhì)細胞或OPC譜系。在一些實施方案中，OPCs可使用一個或多個報告基因進行基因改良。這些報告基因包括熒光蛋白基因(例如，綠色熒光蛋白、黃色熒光蛋白、藍色熒光蛋白、青色熒光蛋白，等等)、DsRed2、mCherry、tdTomato和AmCyanl。優(yōu)選的啟動子包括以下啟動子中的一個或多個MBP、CNPase, 0Lig2、SoxlO、Pip、和 PDGFR 啟動子。治療許多神經(jīng)系統(tǒng)疾病都與髓鞘和神經(jīng)元動態(tài)平衡和功能中的缺陷有關(guān)。這些脫髓鞘疾病或病癥或脫髓鞘紊亂的實施例包括，但不限于，多發(fā)性硬化癥(包括復發(fā)和慢性進展型多發(fā)性硬化癥、急性多發(fā)性硬化癥、視神經(jīng)脊髓炎(Devic' s病))、彌漫性腦硬化(包括Shilder彌漫性軸周腦炎和Balo同心圓性硬化)。脫髓鞘疾病還包括多種疾病，其中脫髓鞘是由病毒感染、疫苗、脊髓損傷、和遺傳性疾病引發(fā)的。這些脫髓鞘疾病或髓鞘形成障礙的實施例包括，但不限于，急性播散性腦脊髓炎(患得麻疹、水痘、風疹、流感、腮腺炎之后發(fā)生的；或者接種狂犬病疫苗或牛痘疫苗之后發(fā)生的)、壞死性出血性腦炎(包括出血性白質(zhì)腦炎)和腦白質(zhì)營養(yǎng)不良(包括Krabbe globboid腦白質(zhì)營養(yǎng)不良、異染性腦白質(zhì)營養(yǎng)不良、腎上腺腦白質(zhì)營養(yǎng)不良、腎上腺脊髓神經(jīng)病變、腎上腺脊髓神經(jīng)病變，輻射誘導髓鞘化障礙、橫貫性脊髓炎，佩-梅病(PMD)，海綿狀腦白質(zhì)營養(yǎng)不良癥和亞歷山大病)。脫髓鞘疾病或髓鞘形成障礙優(yōu)選多發(fā)性硬化癥、腦性麻痹、彌漫性腦硬化、或佩-梅病(PMD)，并且，最優(yōu)選佩-梅病。本發(fā)明的細胞和方法可以有效地治療多種神經(jīng)退行性疾病、脫髓鞘疾病和/或脫髓鞘紊亂。假定這些細胞將取代宿主體內(nèi)病變、損壞或功能喪失的組織。或者，移植的組織可能增加內(nèi)源性影響宿主組織的功能。根據(jù)一些實施方案，提供了提高體內(nèi)少突膠質(zhì)細胞生產(chǎn)的方法，在導致少突膠質(zhì)細胞形成條件下，給哺乳動物施用靶向OPCs。產(chǎn)生的少突膠質(zhì)細胞具有哺乳動物體內(nèi)髓鞘形成(或髓鞘再生)脫髓鞘神經(jīng)元的能力，從而哺乳動物體內(nèi)髓鞘發(fā)育不良性疾病和/或脫髓鞘疾病是可以治愈或改善。根據(jù)一些實施方案，提供了提高體內(nèi)少突膠質(zhì)細胞生產(chǎn)的方法，通過鑒別和分離靶向OPCs細胞群，促進其增殖的條件下培養(yǎng)靶向OPCs細胞群，在導致少突膠質(zhì)細胞形成條件下給哺乳動物施用靶向OPCs。產(chǎn)生的少突膠質(zhì)細胞具有哺乳動物體內(nèi)髓鞘形成(或髓鞘再生)脫髓鞘神經(jīng)元的能力，從而哺乳動物體內(nèi)髓鞘發(fā)育不良性疾病和/或脫髓鞘疾病是可以治愈或改善。根據(jù)一些實施方案，提供了提高體內(nèi)少突膠質(zhì)細胞生產(chǎn)的方法，通過鑒別和分離靶向OPCs細胞群，促進其增殖的條件下培養(yǎng)靶向OPCs細胞群，靶向OPCs細胞群分化成少突膠質(zhì)細胞，在導致少突膠質(zhì)細胞形成條件下給哺乳動物施用靶向OPCs。產(chǎn)生的少突膠質(zhì)細胞具有哺乳動物體內(nèi)髓鞘形成(或髓鞘再生)脫髓鞘神經(jīng)元的能力，從而哺乳動物體內(nèi)髓鞘發(fā)育不良性疾病和/或脫髓鞘疾病是可以治愈或改善。根據(jù)一些實施方案，提供了提高體內(nèi)少突膠質(zhì)細胞生產(chǎn)的方法，通過鑒別和分離靶向OPCs細胞群，在導致少突膠質(zhì)細胞形成條件下給哺乳動物施用靶向OPCs。產(chǎn)生的少突膠質(zhì)細胞具有哺乳動物體內(nèi)髓鞘形成(或髓鞘再生)脫髓鞘神經(jīng)元的能力，從而哺乳動物體內(nèi)髓鞘發(fā)育不良性疾病和/或脫髓鞘疾病是可以治愈或改善。藥物篩選本發(fā)明的OPCs也可用在藥物篩選和藥物發(fā)現(xiàn)的方法中。本領(lǐng)域已知的任何細胞基藥物篩選方案可與本發(fā)明的OPCs結(jié)合使用。多種檢測可用于此目的，包括毒理學試驗； 蛋白質(zhì)結(jié)合免疫測試；細胞生長、分化和功能活性的確定；激素產(chǎn)生，類似測試。該檢測可在體外、原位、體內(nèi)和間接體內(nèi)進行。舉例來說，本發(fā)明的OPCs可用在藥物篩選方法中，包括a)選自富集靶向OPC細胞群；b)對非人的哺乳動物移入所產(chǎn)生的富集細胞群；c)對非人的哺乳動物施用一種測試化合物；和d)施用上述測試化合物的移入哺乳動物和未施用上述測試化合物的對照非人哺乳動物進行比較。根據(jù)一些實施方案，本發(fā)明提供了一種篩選化合物的方法，這種化合物影響富集靶向少突膠質(zhì)前體細胞的細胞群的生物功能，包括(a)測試化合物接觸由權(quán)利要求1所述的方法獲得的靶向少突膠質(zhì)前體細胞；(b)檢測少突膠質(zhì)前體細胞生物功能的變化。生物功能變化可能包括，但不限于，下列中的一種或多種變化髓鞘、分化為少突膠質(zhì)細胞、增殖率、細胞遷移、細胞活力、基因表達、蛋白表達、培養(yǎng)基中蛋白質(zhì)水平、去分化、生長特性，和/ 或細胞形態(tài)。通過向至少一個、通常多個細胞樣本中加入藥劑篩選藥劑的生物活性。測量響應該藥劑的參數(shù)變化，結(jié)果與參照培養(yǎng)基比較，例如，存在和不存在藥劑的情況，使用其他藥物獲得，等等。藥物可方便地加入到溶液中，或易于可溶解形式，加入到細胞培養(yǎng)基內(nèi)。這些藥物可加在流動體系中，如流體，間歇或連續(xù)的，或者，單獨地或增量地向另外的靜態(tài)溶液中加入化合物丸劑。在流動體系中，使用兩種液體，其中一種是生理中性溶液，另一種加入了測試化合物的是相同溶液。第一種液體穿過細胞，隨后第二種液體穿過細胞。在單一溶液中方法中，測試丸加到細胞外圍介質(zhì)中。培養(yǎng)基成分的整體濃度不應隨著丸劑加入顯著改變，或者在流動方法中兩種溶液之間濃度不應隨著丸劑加入顯著改變。多種方法可以用于定量所選定的標記物。為了測量分子的數(shù)量，一種簡便方法使用檢測基團標記分子，這可能具有熒光、發(fā)光、放射性、酶活性，等等，尤其是特異性結(jié)合與高親和力的熒光基團的分子都是極易標記生物分子、結(jié)構(gòu)或細胞類型。免疫熒光基團可不僅直接結(jié)合特定蛋白質(zhì)，而且結(jié)合特異性構(gòu)象、裂解產(chǎn)品，或者像磷酸化位點的改變。單個肽和蛋白質(zhì)可以設(shè)計自動發(fā)熒光，如通過細胞內(nèi)表達的綠色熒光蛋白嵌合體。因此，對抗體進行改良，提供作為其一部分結(jié)構(gòu)的一種熒光染料。根據(jù)所選擇的標記，不采用熒光標記， 采用如放射免疫法(RIA)或酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)、同質(zhì)酶免疫測定法，以及相關(guān)的非酶法技術(shù)測量參數(shù)。核酸量化，尤其是信使RNAs，也作為參數(shù)。采用雜交技術(shù)測量，取決于核酸核苷酸序列。這些技術(shù)包括聚合酶鏈反應方法，以及基因芯片技術(shù)。封裝本領(lǐng)域已知的任何封裝方案可用于本發(fā)明的OPCs。本發(fā)明的OPCs可能被封裝并且用于運載生物活性分子，根據(jù)已知的封裝技術(shù)，包括微膠囊(參見，例如，美國專利 4，352，883 ；4, 353，888 ；和5，084，350，通過引述合并于本文中)，大膠囊(參見，例如，美國專利 5，284，761,5, 158，881,4, 976，859 和 4，968，733 和公布的 PCT 專利申請 W092/19195、 WO 95/05452，通過引述都合并于本文中)。如果OPCs 被封裝，大膠囊如美國專利 5，284，761 ；5, 158，881 ；4, 976，859 ； 4，968，733 ；5, 800，828和公布的PCT專利申請WO 95/05452中描述的大膠囊，優(yōu)選通過引述都合并于本文中。設(shè)備中細胞數(shù)量可以變化。優(yōu)選地，每個設(shè)備包含IO3-IO9個細胞，最優(yōu)選IO5-IO7個細胞。大量大膠囊裝置可植入到患者體內(nèi)；優(yōu)選1個至10個裝置。下列實施例為了舉例說明性的，但不限制于，本發(fā)明的方法和組合物。在本實施方案的精神和范圍內(nèi)，通常在治療中遇到的條件和參數(shù)變化進行適當修正和更改對本領(lǐng)域中技術(shù)人員將變得顯而易見的。實施例1 :PDGFR陽件細胞的篩詵胎兒大腦(16-20孕周)采用膠原酶/透明質(zhì)酸酶和胰蛋白酶組合進行酶處理，生成一種單細胞懸液。細胞再懸浮在Hank' s平衡鹽溶液中，并用⑶133抗體染色，Hank' s 平衡鹽溶液含有ImM丙酮酸鈉和0.1%人血清白蛋白(染色緩沖液)。富集模式下，CD133+ 細胞無菌條件下使用BD流式細胞儀進行分選。CD133+富集片斷進行離心分離，再懸浮在染色緩沖液中，用1 100的兔抗PDGFRa多克隆抗體(IgG)4°C下孵育2個小時。染色緩沖液沖洗兩次后，PDGFRa標記細胞孵育多克隆羊抗兔IgG-FITC抗體(Caltag)。純化模式下，PDGFRa陽性(FITC標記)細胞無菌條件下使用BD流式細胞儀進行分選。分選細胞在涂有聚-L-鳥氨酸、層粘連蛋白和纖維連接蛋白的培養(yǎng)瓶內(nèi)DMEM培養(yǎng)基中孵育，DMEM培養(yǎng)基添加了 B27、N2、NAC、L-谷氨酰胺、丙酮酸鈉、FGF2、PDGF-AA和NT3 (完全培養(yǎng)基)，添加或沒有添加胰島素樣生長因子1。輕度胰蛋白酶處理和同一培養(yǎng)基中再接種達到細胞傳代。用于PDGFRa陽性細胞純化的另一種方法使用小鼠單克隆抗體1 50 PDGFR α -PE (Wiarmingen公司)4°C下對全部腦細胞(有CD 133富集或者沒有CD 133富集)染色2個小時，隨后，使用BD流式細胞儀進行純化無菌分選。實施例2 ⑶105陰性細胞的篩選⑶105細胞作為篩選標記是基于本發(fā)明者發(fā)現(xiàn)，純化PDGFRa +細胞的培養(yǎng)基以比其它更快的速度擴增。這種加速增長一般伴隨著具有不同于少突膠質(zhì)細胞祖細胞形態(tài)的細胞類型的外觀?；谛螒B(tài)和培養(yǎng)基中的加速增長，這些細胞很可能是PDGFRa+成纖維細胞； 包含介質(zhì)的FGF2中成纖維細胞生長優(yōu)勢是被證實。此外，除了耗盡有絲分裂原，成纖維細胞也可能不適應培養(yǎng)基，在體外和體內(nèi)，影響少突膠質(zhì)細胞祖細胞到少突膠質(zhì)細胞的生長動力學和分化過程。成纖維細胞的存在，因此降低了獲得少突膠質(zhì)細胞祖細胞擴增培養(yǎng)基的效率。我們預期，尤其是在受污染細胞具有生長優(yōu)勢情況下，確定更純凈和同種少突膠質(zhì)細胞祖細胞群。因此，啟動搜索成纖維細胞內(nèi)特異性表達細胞表面標記，用于將其區(qū)分于 PDGFRa+少突膠質(zhì)祖細胞。一組抗體用與于對含有成纖維細胞和少突膠質(zhì)細胞的混合物的培養(yǎng)基進行染色。結(jié)果顯示，單克隆抗體至⑶105，識別出糖蛋白endoglin，是將PDGFRa + 細胞群細分成兩個亞群的有效試劑PDGFRa+CD 105+(成纖維細胞)和PDGFRa+CD 105_ (少突膠質(zhì)前體細胞)。胎兒來源的人少突膠質(zhì)前體細胞的分選方案包括兩種抗體，CD 105-APC和 PDGFRa-PE0采用兩種抗體方案產(chǎn)生多種細胞批。結(jié)果表明，這些細胞批具有相似的生長特性和少突膠質(zhì)細胞分化潛能。此外，成纖維細胞的出現(xiàn)沒有在這些培養(yǎng)基中觀察到，直到第15代，最高傳代檢測到。結(jié)果表明，CD 105是獲得預期的少突膠質(zhì)前體細胞群中使用的有效陰性篩選標記物。實施例3 =OPCs增殖介質(zhì)增殖培養(yǎng)基采用下列組分按照指定濃度制備組分最終濃度DMEM，谷氨酰胺 Gnvitrogen 公司，cat#25030_081) 2mM，丙酮酸鈉(Sigma 公司，cat#S8636)，ImM, NAC (Sigma 公司，cat#A9165)，ImM, N2 補充 Qnvitrogen 公司，cat#17502_048 ；含有鐵傳遞蛋白、胰島素、腐胺、硒和孕激素)，B27補充anvitrogen公司，cat#17504-044)，20ng/ml人 bFGF (Biosource 公司，cat#PHG0024), 20ng/ml PDGF-AA (Peprotech, cat#100_13A)，IOng/ ml NT3 (Peprotech 公司，cat#450_03)，100ng/ml IGFl (Peprotech 公司，cat#AF-100_l 1)。實施例4 :QPCs分化在第一個分化方案中，通過加入三碘甲狀腺氨酸CH)物理去除或耗盡細胞培養(yǎng)基中的生長因子有絲分裂原，OPCs增殖被誘導分化。少突膠質(zhì)細胞染色方案如下少突膠質(zhì)細胞04染色。細胞采用一抗至04 (雜交瘤細胞上清液，小鼠單克??；按 1 2比例使用)在室溫下孵育30分鐘。細胞用0. IM PBS洗滌一次，pH值=7. 4。細胞用冰冷的4 %多聚甲醛固定20分鐘。細胞用0. IM PBS5在分鐘內(nèi)洗滌2次，pH值=7. 4。室溫下， 細胞制備在0. IM PBS稀釋的10%馬血清(“HS”)中封閉30min，pH值=7.4。細胞用第二抗體(驢抗小鼠IgG/Alexa488，按1 500比例使用，Invitrogen公司，Cat#A21202)孵育； 或者，采用羊抗小鼠IgM/Alexa488 anvitrogen公司，Cat#A21042)孵育，黑暗中室溫下用
HS稀釋1小時。細胞用0. IM PBS于黑暗中5分鐘內(nèi)洗滌2次。用封固劑(Vectashield 封固劑，載體實驗室，Cat#H-1000)面向下將細胞固定在載玻片上或者留在培養(yǎng)孔內(nèi)量化和評定染色并于4°C下保存。在某些情況下，Hoechst (核染色)染色可按照如下使用。上述準備的細胞用 Hoechst液(按照1 10000比例用0. 皂角苷稀釋，Sigma公司，Cat#S4521)洗滌。室溫下，細胞在Hoechst液中孵育5分鐘，隨后用0. IM PBS洗滌2次。實施例5 =OPCs分化在第二分化方案中，通過去除生長因子有絲分裂原并加入血清誘導OPCs分化。該分化方案產(chǎn)生高產(chǎn)量少突膠質(zhì)細胞培養(yǎng)基。在第三分化方案中，通過去除生長因子有絲分裂原并加入30nM T3(Sigma公司， cat#T5516)誘導OPCs分化。該分化方案產(chǎn)生高產(chǎn)量少突膠質(zhì)細胞培養(yǎng)基。實施例6 封裝如果封裝OPCs，可采用下列步驟中空纖維由聚醚砜(PEQ制得，外徑720米，壁厚 100 米(AKZO-Nobel Wuppertal，德國)。這些纖維在美國專利 4，976，859 和 4，968，733 中進行了描述，通過引述合并于本文中。該纖維用于截留分子量。PES #5膜，具有大約^Okd MWC0,偶爾使用。在其他研究中，PES #8膜，具有大約90KD MWC0,也可使用。該裝置通常包括1)半透聚醚砜中空纖維膜，AKZO Nobel Faser AG公司制造；2) 輪軸膜結(jié)構(gòu)；3)光固化丙烯酸甲酯(LCM)樹脂前端；和4)有機硅系繩。使用的半透膜通常具有以下特點內(nèi)徑500+30m壁厚100+15m扯斷力100+15cN 斷裂伸長率44+10%液壓滲透率63+8 (ml/min τα mmHg) nMWCO (右旋糖酐)280+20kd。該裝置組件是市面有售的。該LCM膠由Ablestik實驗室(Newark，Del.)提供； Luxtrak粘合劑LCM23和LCMM)。系繩由特種有機硅材料加工商(Robles，Calif.)提供。 系繩尺寸是外徑0. 79mm X內(nèi)徑0. 43mm X長度202mm。該裝置形狀如下內(nèi)表面有選擇性滲透皮膚。壁上有一個開孔泡沫結(jié)構(gòu)。外表面有一個開放式結(jié)構(gòu)，孔達1.5米，占外表面的 30+5% ο纖維材料第一次切成5厘米長段，用光敏聚合的丙烯酸膠(LCM_25，ICI)密封每一段的遠端。經(jīng)環(huán)氧乙烷滅菌和除氣，利用漢密爾頓注射器，使用25號針頭從附加進樣口向纖維段填充IO4-IO7個細胞的懸浮液，或者液體培養(yǎng)基，或者水凝膠基質(zhì)(例如，膠原蛋白溶液(ZydernT)，藻酸鈉，瓊脂或殼聚糖)。膠囊的近端使用同種丙烯酸膠密封。有機硅系繩(特種有機硅制造，Taunton，Ma.)(內(nèi)徑690m ；外徑1. 25mm)放置在便于操作和取出裝置的纖維近端處。實施例7 =OPCs移植靶向OPCs可被移植到嚙齒動物大腦中，用于評估移植可行性、整合、移植細胞的表型，以及健康動物體內(nèi)細胞移植相關(guān)的行為改變。移植按照標準技術(shù)執(zhí)行。舉例來說，成年老鼠用戊巴比妥鈉麻醉G5mg/kg，腹腔注射)，安置在Kopf立體定位儀中。中線切口設(shè)計在頭皮中和螺旋鉆孔用于注射細胞。使用連接在10 μ 1漢密爾頓注射器上的玻璃毛細管將靶向OPCs移植到大鼠紋狀體內(nèi)。每個動物接收到約250，000-500, 000個細胞，總體積為2 μ 1。傳代后1_2天細胞被移植，細胞懸液由5-20個細胞的未分化的OPC細胞群構(gòu)成。植入之后，皮膚被縫合。實施例8 =OPCs移植到患有脫髓鞘疾病的嚙齒動物模型中靶向OPCs可能被移植到嚙齒動物大腦中，用于評估移植可行性、整合、移植細胞的表型，以及損傷或患病動物體內(nèi)細胞移植相關(guān)的行為改變。移植按照標準技術(shù)執(zhí)行。舉例來說，新生兒老鼠或小鼠低溫麻醉，安置在Kopf立體定位儀中。中線切口設(shè)計在頭皮中和螺旋鉆孔用于注射細胞。使用連接在10μ1漢密爾頓注射器上的玻璃毛細管將靶向OPCs移植到動物的胼胝體、菌毛、大腦腳和/或脊髓中。每個動物接收到約300，000-600, 000個細胞，總體積為6 μ 1。傳代后細胞立即移植或1_2天后移植，細胞懸液由5-20個細胞的未分化的OPC細胞群構(gòu)成。植入之后，皮膚被縫合或者釘住?；蛘撸律鷥夯蛏倌阺hiverer小鼠低溫麻醉或者采用異氟醚麻醉，安置在Kopf立體定位儀中。中線切口設(shè)計在頭皮中和螺旋鉆孔用于注射細胞。使用連接在ΙΟμΙ漢密爾頓注射器上的玻璃毛細管將靶向OPCs移植到老鼠的胼胝體、菌毛、大腦腳和/或脊髓中。每個動物接收到約300，000-600, 000個細胞，總體積為6 μ 1。傳代后細胞立即移植或1_2天后移植，細胞懸液由未分化的單個OPC或者5-20個細胞群構(gòu)成。植入之后，皮膚被縫合或者釘住。^MM 9 : 用革F狗OPCs后代體夕卜治療神經(jīng)退行t牛疾病常規(guī)吸入流產(chǎn)后，從胎兒腦組織得到靶向OPCs，收集進無菌收集裝置中。按照實施例1或2所述，2x4x1毫米組織被解剖分離。然后，靶向OPCs增殖。靶向OPC后代神經(jīng)移植進血型匹配并患有神經(jīng)退行性疾病的宿主體內(nèi)。使用BRW電腦斷層掃描(CT)立體定向引導完成手術(shù)。病人靜脈注射咪唑安定與局部麻醉suppiemencea。該病人進行CT掃描，建立接受移植區(qū)域的坐標。注射插管由17號不銹鋼外層插管和19號細針組成。插入腦內(nèi)校正坐標，然后取出并替換為19號注射插管，19號注射插管預裝了 30yL組織懸液。插管被撤回時，細胞以3 μ L/分鐘的速度慢慢注入。多個立體定位核芯針穿過目標區(qū)，相隔約4毫米。病人進行CT掃描檢查術(shù)后出血或水腫。手術(shù)后不同時間間隔進行神經(jīng)評價，以及PET 掃描，確定被植入細胞的代謝活性。^MM 10 用磷丐轉(zhuǎn)染講行革F,向OPC fsimimu靶向OPC后代按照本文所述方法繁殖。然后，使用磷酸鈣轉(zhuǎn)染技術(shù)轉(zhuǎn)染細胞。為了標準磷酸鈣轉(zhuǎn)染，細胞機械分離成單個細胞懸液，涂在組織培養(yǎng)基處理過的器皿上，匯合度50% (50，000-75，000個細胞/厘米2)，并且附著過夜。改進后的磷酸鈣轉(zhuǎn)染程序執(zhí)行如下用TE將含有DNA (15-25微克)的無菌TE緩沖液(IOmM Tris, 0. 25mM EDTA, pH 值=7. 5)稀釋至 440 μ L，向 DNA/TE 緩沖液中加入 60 μ 1 的2Μ氯化鈣(pH值至5. 8，IM HEPES緩沖液)。總體積500 μ 1的2XHeBS (HEPE S-緩沖鹽水；275mM氯化鈉，IOmM氯化鉀，1.4mM磷酸氫二鈉，12mM葡萄糖，40mM HEPES緩沖劑粉末，pH 值=6. 92)滴加到該混合物中。該混合物室溫下放置20分鐘。細胞用IX HeBS和Iml沉淀 DNA的磷酸鈣溶液進行簡單洗滌，加入到每個培養(yǎng)板內(nèi)，細胞在37°C下孵育20分鐘。孵育之后，IOmis完全培養(yǎng)基添加到細胞中，培養(yǎng)板又放置在孵化器內(nèi)(37°C，充有9.5% CO2) 3-6 個小時。DNA和培養(yǎng)基在孵化期結(jié)束被抽除，而細胞用完全培養(yǎng)基洗滌3次，然后放回到孵化器中。實施例11 使用病毒載體進行靶向OPCs的遺傳改良靶向OPCs按照本文所述方法增殖，然后用含有除了報告基因如GFP(綠色熒光蛋白)之外的目的基因的慢性病毒載體感染。慢病毒懸浮液加入到培養(yǎng)基里，OPCs增殖并孵育對個小時。M個小時后，培養(yǎng)基被除去，用新鮮培養(yǎng)基替換，OPCs又孵育3天。收集細胞，離心分離，用流式細胞儀分選表達目的基因的細胞。陽性細胞返回到增殖培養(yǎng)基。采用前述實施例中描述的程序，轉(zhuǎn)導OPC后代移植到嚙齒動物或人患者體內(nèi)。實施例12 =OPCs移植到脊髓損傷的嚙齒動物模型中靶向OPCs可能被移植到嚙齒動物脊髓中，評估移植可行性、整合、移植細胞的表型，以及脊髓損傷動物體內(nèi)細胞移植相關(guān)的行為改變。動物接受椎體高度T9椎板切除手術(shù)。使用脊髓打擊器(精密系統(tǒng)和儀表，列克星敦，肯塔基州)，動物則受到50千達因(KD)脊髓挫傷損傷。脊髓損傷七天后，使用的Basso、 BeattieJP Bresnahan評分表(BBB評分法)測試小鼠，隨機接受OPCs或載體對照。使用貼附到納米管注射器上的斜面輕型微吸管，將細胞從病灶中心前后兩側(cè)注入。每個動物接收5萬至8萬個細胞。實施例13 =OPCs移棺到MS嚙齒類動物樽型中髓鞘少突膠質(zhì)細胞糖蛋白(MOG)誘導小鼠實驗性自身免疫性腦脊髓炎(EAE)是研究多發(fā)性硬化癥的臨床和病理特點被廣泛接受的模型。移植按照標準技術(shù)執(zhí)行。舉例來說，MOG誘導EAE影響的成年老鼠用異氟醚氣體麻醉，并安置在Kopf立體定位儀中。中線切口設(shè)計在頭皮中和螺旋鉆孔用于注射細胞。使用連接在10 μ 1漢密爾頓注射器上的玻璃毛細管將靶向OPCs移植到動物胼胝體、菌毛、大腦腳、側(cè)腦室空間和/或脊髓中。每個動物接收到約300，000-600, 000個細胞，總體積為 6 μ 1。傳代后細胞立即移植或1-2天后移植，細胞懸液由未分化的單個OPC或者5-20個細胞群構(gòu)成。植入之后，皮膚被縫合或者釘住。
_0] t施例14:擴增PDGFR+CD105_/J>突膠質(zhì)細胞湘(OPC)細朐群移入能力的鑒定為了確定是否FACS被分離，體外擴增少突膠質(zhì)細胞祖細胞存活，遷移，并具有體內(nèi)髓鞘化的能力，使用shiverer小鼠、脫髓鞘的嚙齒類動物模型，進行一系列移植研究。 shiverer小鼠天然具有大部分mbp基因缺失，導致不完全的中樞神經(jīng)系統(tǒng)髓鞘形成。為了避免人體細胞異種排斥反應，shiverer小鼠與免疫缺陷的NOD-Scid小鼠回交。研究兩種不同的shiverer/Scid年齡組的少突膠質(zhì)細胞祖細胞植入青少年(P21-P30)和新生兒 (PO-Pl)。ShivererAcid小鼠有大約8周相對較短的壽命，因此研究的移植后最長的時間點針對新生兒注射是8周和幼年注射是5周。少突膠質(zhì)祖細胞生長為單層。為了準備用于移植的細胞，采用類似于傳代OPCs的方案之后，使用胰蛋白酶OPCs從燒瓶中剝離。然后，細胞接觸到胰蛋白酶抑制劑阻止蛋白水解消化，用培養(yǎng)液洗滌兩次，再懸浮在體外培養(yǎng)基中，體外培養(yǎng)基含有最終密度IO5個細胞/ μ 1的抗氧化劑NAC (ImM)。對OPCs以懸浮培養(yǎng)形式在胰蛋白酶處理后保存至少一天的能力進行測試。懸浮液中的保存期1天有以下3個原因的優(yōu)勢1)移植和/或冷凍保存之前將使細胞從潛在破壞性酶處理中恢復；幻動物手術(shù)安排中更靈活；幻等待移植的OPCs能夠裝運到非現(xiàn)場處 (實驗室或診所)。最后，考慮到OPCs的臨床應用潛力，對深低溫冷凍保存后OPCs的植入能力和髓鞘化潛力進行了測試，取得積極成果。實施例15 移植少年或新生兒shiverer/Scid小鼠放置在立體定位框架內(nèi)，1 μ IOPC懸浮液注射在2-3大腦位置，雙側(cè)注射注射/小鼠)。注射靶向胼胝體、菌毛和小腦腳(見圖1)， 髓鞘型動物的腦區(qū)嚴重髓鞘化(白質(zhì)豐富)，但shiverer/Scid小鼠嚴重脫髓鞘。小鼠在不同時間點死掉，直到第8周，使用單克隆抗體SC 121分析小鼠腦部存在的人體細胞，使用 MBP抗體分析存在的人來源少突膠質(zhì)細胞，能夠形成髓鞘的小鼠神經(jīng)軸突。由于shiverer 小鼠突變，刪除了大部分MBP基因，MBP蛋白不是由小鼠少突膠質(zhì)細胞產(chǎn)生，因此抗MBP抗體檢測到的任何MBP是來自人。表15-1-源自4種不同供體組織的4種OPC細胞株中獲得的植入數(shù)據(jù)匯總。
供體ID,年齡傳代測試
shiverer 年全部#移植存在供體髓鞘產(chǎn)生
2657,18 周 2703,18 周
2710,18 周 2711，18 周
3，13&14 6，9’14，15&16
4，6，11&12
齡組幼年
幼年&新生兒
新生兒新生兒
Shi/Scid小鼠細 胞 MBP+
10
4個幼年+15 個新生兒 2 16
SC121h 10/10 19/19
2/2 16/16
10/10 19/19
2/2 16/16注射了含有人細胞(SC121染色確定)的OPCs的所有幼年和新生兒動物測試了所有年齡段。當MBP染色時，所有動物也證實陽性染色(參見圖2，系列部分SC121和MBP染色的一個實施例)。也測試了使用慢病毒載體基因改良的OPCs的可能性。為證明該想法，在MBP啟動子控制下，我們使用了表達報告基因GFP的慢病毒載體(綠色熒光蛋白)。直接目測觀察 OPCs (無抗體染色)，OPCs活躍轉(zhuǎn)錄MBP基因(亮綠色細胞)，并具有成熟的髓鞘化少突膠質(zhì)細胞形貌(如具有像電纜的形貌，與軸突束平行排列)。圖3顯示MBP-GFP OPCs移植的 shiverer/Scid小鼠的一個實施例，移植后第8周死掉。體內(nèi)研究表明，新生兒和青少年shiverer小鼠是適于測試擴增OPCs的植入和髓鞘形成能力的模型。沒有觀察到新生兒和青少年shiverer/scid小鼠之間植入質(zhì)量的主要差異。體內(nèi)研究表明，OPCs植入和髓鞘形成未顯著受到傳代數(shù)量的影響；例如，注射供體2703的新生兒，在人細胞總數(shù)量和髓鞘化程度上沒有性質(zhì)上的區(qū)別，表明效力(能夠植入和髓鞘化的能力)沒有隨著第16次傳代而減少，最大傳代數(shù)被測出。體內(nèi)研究表明，新鮮傳代的OPCs(從未凍結(jié))的效力與相同傳代或類似傳代的預先深低溫冷凍保存的OPCs的效力對比時，植入和髓鞘化沒有主要性質(zhì)上的差別。雖然只有新生動物移植了先前深低溫冷凍保存的細胞，我們并不期望在少年動物中得到不同的結(jié)果。這一結(jié)果表明，在效力沒有檢測到任何損失的情況下OPC培養(yǎng)可以深低溫保存。同樣， 由于停藥時間1天，沒有效力損失(植入或髓鞘化能力)，這表明該方案可以被用來促進以備用形式OPC培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移至非現(xiàn)場處。等同物本發(fā)明的一個或多個實施方案在上述描述中進行了闡述。雖然相似或等同于本文中描述的方法和材料可在本發(fā)明的實施或測試中使用，對優(yōu)選的方法和材料進行了描述。 本發(fā)明的其他特征、目標、和優(yōu)勢從描述和權(quán)力要求書來看是顯而易見的。在說明書和附加權(quán)利要求書中，除非另外清楚說明，單數(shù)形式包括復數(shù)。除非另外規(guī)定，本文中使用的所有科技術(shù)語具有普遍被本發(fā)明所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員所理解的相同涵義。
權(quán)利要求
1.一種源自神經(jīng)或神經(jīng)來源細胞的富集靶向少突膠質(zhì)前體細胞(OPCs)的細胞群，其中細胞群富集靶向OPCs，靶向OPCs是PDGFR α +和⑶105—，其中細胞群中至少30%的細胞是靶向OPCs。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的細胞群，靶細胞也是PSA-NCAMW_。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的細胞群，靶細胞也是A2B5W_。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的細胞群，靶細胞也是CD133+。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的OPCs細胞群，其中細胞群中至少50%的細胞是靶向OPCs。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的OPCs細胞群，其中細胞群中至少70%的細胞是靶向OPCs。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的OPCs細胞群，其中細胞群中至少90%的細胞是靶向OPCs。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的OPCs細胞群，其中靶向OPCs是PDGFRa+、CD105_、CD133+、 A2B5-。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的OPCs細胞群，其中靶向OPCs是PDGFRa+、CD 105_、CD133+、 A2B5lo/\ PSA-NCAM—。
10.一種由神經(jīng)或神經(jīng)來源細胞生產(chǎn)富集靶向少突膠質(zhì)前體細胞(OPCs)的細胞群的方法，包括使用結(jié)合細胞表面抗原的至少一種試劑接觸神經(jīng)或神經(jīng)來源細胞，靶向OPCs表達細胞表面抗原，其中靶向OPCs是PDGFR a +和⑶105_，其中細包群富集包含至少30%的靶向OPC。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中靶向OPCs也是PSA-NCAMW_。
12.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中靶細胞也是A2B5W_。
13.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中靶細胞也是CD133+。
14.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法進一步包括選擇性除去非靶向細胞群陰性篩選靶向 OPCs。
15.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中靶向OPCs是PDGFRa +、CD 105_、CD133+、A2B5_。
16.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中靶向OPCs是PDGFRa+、CD105_、CD133+、 A2B5lo/\ PSA-NCAM—。
17.一種增加細胞培養(yǎng)基中靶向少突膠質(zhì)前體細胞(OPCs)數(shù)量的方法，包括培養(yǎng)細胞群來提高細胞培養(yǎng)基中靶向OPCs的數(shù)量，該細胞群包括至少30%的靶向OPCs，其中靶向 OPCs 是 PDGFRa+ 和 CD105-。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，其中靶向OPCs也是PSA-NCAMW_。
19.根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，其中靶細胞也是A2B5W_。
20.根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，其中靶細胞也是CD133+。
21.根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，其中靶向OPCs是PDGFRα +、CD 105_、CD133+、A2B5_。
22.根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，其中靶向OPCs是PDGFRa+、CD105_、CD133+、 A2B5lo/\ PSA-NCAM—。
23.根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法進一步包括使用有效劑量的至少一種生物試劑接觸 OPCs，這種生物試劑能夠提高OPCs的數(shù)量。
24.根據(jù)權(quán)利要求23所述的方法，其中生物試劑選自白血病抑制因子(LIF)、表皮生長因子(EGF)、堿性成纖維細胞生長因子(FGF-2，bFGF)、IGFl、NT3、Shh、CTNF, PDGF-AA或其組合組成的組。
25.—種增殖少突膠質(zhì)前體細胞(OPCs)的方法，包括在無血清培養(yǎng)基中增殖OPCs，該無血清培養(yǎng)基包含有效誘導OPC增殖的一個或多個預先確定的生長因子，其中(a)細胞群包括OPCs，OPCs是PDGFR α +和⑶105— ； (b)在誘導分化條件下，該細胞產(chǎn)生分化成少突膠質(zhì)細胞的后代細胞。
26.根據(jù)權(quán)利要求25所述的方法，其中靶向OPCs也是PSA-NCAMW_。
27.根據(jù)權(quán)利要求25所述的方法，其中靶細胞也是A2B5W_。
28.根據(jù)權(quán)利要求25所述的方法，其中靶細胞也是CD133+。
29.根據(jù)權(quán)利要求25所述的方法進一步包括OPCs在培養(yǎng)條件下誘導少突膠質(zhì)細胞分化而產(chǎn)生正分化和已分化的少突膠質(zhì)細胞。
30.一種包括由權(quán)利要求25所述方法產(chǎn)生的少突膠質(zhì)前體細胞(OPCs)的組合物。
31.一種包括由權(quán)利要求25所述方法產(chǎn)生的正分化或已分化的少突膠質(zhì)前體細胞的組合物。
32.—種治療遭受中樞神經(jīng)系統(tǒng)軸突脫髓鞘相關(guān)疾病的哺乳動物個體的方法，包括向哺乳動物個體體內(nèi)引入治療該疾病的有效劑量的權(quán)利要求1所述的富集OPCs的細胞群。
33.根據(jù)權(quán)利要求32所述的方法，其中哺乳動物是人。
34.根據(jù)權(quán)利要求32所述的方法，其中OPCs通過細胞移植對該哺乳動物個體給藥。
35.根據(jù)權(quán)利要求32所述的方法，其中該疾病是多發(fā)性硬化癥、 Pelizaeus-Merzbacher病、腦癱、輻射誘導髓鞘形成病癥、急性播散性腦脊髓炎、橫貫性脊髓炎、脫髓鞘遺傳疾病、脊髓損傷、病毒誘導脫髓鞘疾病、進行性多灶性白質(zhì)病、人淋巴 T-細胞病毒I (HTLVI)-相關(guān)脊髓病、或者營養(yǎng)代謝紊亂。
36.根據(jù)權(quán)利要求32所述的方法，其中該疾病是多發(fā)性硬化癥、 Pelizaeus-Merzbacher ；
37.一種治療遭受中樞神經(jīng)系統(tǒng)軸突脫髓鞘相關(guān)疾病的哺乳動物個體的方法，包括向哺乳動物個體體內(nèi)引入治療該疾病的有效劑量的權(quán)利要求1所述的OPCs。
38.根據(jù)權(quán)利要求37所述的方法，其中哺乳動物是人。
39.根據(jù)權(quán)利要求37所述的方法，其中OPCs通過細胞移植對該哺乳動物個體給藥。
40.根據(jù)權(quán)利要求37所述的方法，其中該疾病是多發(fā)性硬化癥、急性播散性腦脊髓炎、 橫貫性脊髓炎、脫髓鞘遺傳疾病、脊髓損傷、病毒誘導脫髓鞘疾病、進行性多灶性白質(zhì)病、人淋巴τ-細胞病毒I (HTLVI)-相關(guān)脊髓病、或者營養(yǎng)代謝紊亂。
41.一種治療遭受中樞神經(jīng)系統(tǒng)軸突脫髓鞘相關(guān)疾病的哺乳動物個體的方法，包括向哺乳動物個體體內(nèi)引入治療該疾病的有效劑量的由權(quán)利要求21所述方法制備的正在分化或已分化的少突膠質(zhì)細胞。
42.根據(jù)權(quán)利要求41所述的方法，其中哺乳動物是人。
43.根據(jù)權(quán)利要求41所述的方法，其中正在分化或已分化的少突膠質(zhì)細胞通過細胞移植對該哺乳動物個體給藥。
44.根據(jù)權(quán)利要求41所述的方法，其中該疾病是多發(fā)性硬化癥、急性播散性腦脊髓炎、 橫貫性脊髓炎、脫髓鞘遺傳疾病、脊髓損傷、病毒誘導脫髓鞘疾病、進行性多灶性白質(zhì)病、人淋巴T-細胞病毒I (HTLVI)-相關(guān)脊髓病、或者營養(yǎng)代謝紊亂。
45.一種篩選化合物的方法，這種化合物影響富集靶向少突膠質(zhì)前體細胞的細胞群的生物功能，其包括(a)測試化合物接觸由權(quán)利要求1所述方法獲得的靶向少突膠質(zhì)前體細胞；(b)檢測少突膠質(zhì)前體細胞生物功能的變化。
46.根據(jù)權(quán)利要求45所述的方法，其中上述靶向少突膠質(zhì)前體細胞是PDGFRa+、CD 105_、A2B5W_、PSA-NCAMW_、和 CD 133+。
47.根據(jù)權(quán)利要求45所述的方法，其中上述靶向少突膠質(zhì)前體細胞是PDGFRa+、CD 105\A2B5-、和 CD133+。
48.根據(jù)權(quán)利要求45所述的方法，其中上述靶向少突膠質(zhì)前體細胞是PDGFRa+、CD 105_、A2B5W_、PSA-NCAM—、禾口 CD 133+。
49.根據(jù)權(quán)利要求45所述的方法，其中選自由髓鞘、分化為少突膠質(zhì)細胞、增殖率、細胞遷移、細胞活力、基因表達、蛋白表達、培養(yǎng)基中蛋白質(zhì)水平、去分化、生長特性，和/或細胞形態(tài)組成的組的至少一個特征發(fā)生變化。
50.一種生產(chǎn)富集少突膠質(zhì)前體細胞的細胞群的方法，包括(a)用特異性結(jié)合PDGFRa的抗體接觸包括一個或多個多能中樞神經(jīng)干細胞的神經(jīng)或神經(jīng)來源細胞；(b)篩選上述神經(jīng)或神經(jīng)來源細胞，神經(jīng)或神經(jīng)來源細胞是PDGFRahi,其中與神經(jīng)或神經(jīng)來源細胞對比，所篩選細胞富集了少突膠質(zhì)前體細胞。
51.根據(jù)權(quán)利要求50所述的方法，其中上述神經(jīng)或神經(jīng)來源細胞從神經(jīng)球培養(yǎng)或貼壁培養(yǎng)中獲得。
52.根據(jù)權(quán)利要求50所述的方法，其中上述方法進一步包括去除是PDGFRα Wmed的那些細胞的步驟。
53.根據(jù)權(quán)利要求50所述的方法，其中上述方法進一步包括去除是CD105_的那些細胞的步驟。
全文摘要
本申請?zhí)峁┝烁患邢蛏偻荒z質(zhì)前體細胞(OPCs)的細胞群的方法，少突膠質(zhì)前體細胞(OPCs)可以分化成少突膠質(zhì)細胞。靶向OPCs可擴增，并且任選誘導其分化成少突膠質(zhì)細胞。靶向OPCs及其后代有益于治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)軸突脫髓鞘相關(guān)疾病。
文檔編號C12N5/079GK102325878SQ200980157408
公開日2012年1月18日 申請日期2009年12月23日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月23日
發(fā)明者A·卡佩拉, 內(nèi)田伸子 申請人:斯特姆塞爾思加利福尼亞有限公司