專利名稱：由人類多能干細(xì)胞產(chǎn)生間充質(zhì)干細(xì)胞的方法以及通過所述方法產(chǎn)生的間充質(zhì)干細(xì)胞的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種由人類多能干細(xì)胞誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞的方法、通過所述方法產(chǎn)生的間充質(zhì)干細(xì)胞以及包含間充質(zhì)干細(xì)胞的細(xì)胞治療產(chǎn)品。
背景技術(shù)：
干細(xì)胞是能夠分化為構(gòu)成有機(jī)體組織的多種細(xì)胞的細(xì)胞，且一般指分化之前的未分化細(xì)胞，其可獲自胚胎、胎兒和成人身體的各個(gè)組織。干細(xì)胞通過分化刺激(環(huán)境)分化為特定細(xì)胞；與因分化完成而引起其細(xì)胞分裂已停止的細(xì)胞不同，干細(xì)胞允許通過經(jīng)由細(xì) 胞分裂(自我更新)產(chǎn)生與其本身相同的細(xì)胞來進(jìn)行增殖(擴(kuò)增)；且由于在不同環(huán)境下或通過不同的分化刺激，干細(xì)胞可分化為其它細(xì)胞，因此干細(xì)胞在分化過程中具有可塑性。干細(xì)胞根據(jù)其分化能力可分為多能(pluripotent)、多效(multipotent)和單能(unipotent)干細(xì)胞。多能干細(xì)胞為具備全能性以分化為所有細(xì)胞的多能細(xì)胞，且這些多能干細(xì)胞包含胚胎干細(xì)胞(ES細(xì)胞)以及誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞(iPS細(xì)胞)等。成體干細(xì)胞可為多效和/或單能干細(xì)胞的實(shí)例。胚胎干細(xì)胞由早期胚胎發(fā)育中胚細(xì)胞的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)形成；具備全能性以分化為所有細(xì)胞從而使得其能夠分化為任何種類的組織細(xì)胞；可以永生和未分化狀態(tài)的形式培養(yǎng)；與成體干細(xì)胞不同，可通過生殖細(xì)胞的制備遺傳到下一代(湯姆遜(Thomson)等人，科學(xué)(Science)，282，1145-1147，1998 ;瑞比諾夫(Reubinoff)等人，自然生物技術(shù)(Nat,Biotechnol.)，18 ;399_404，2000)。通過在人類胚胎形成的時(shí)候僅分離并培養(yǎng)內(nèi)細(xì)胞團(tuán)來制備人類胚胎干細(xì)胞，且當(dāng)前，已從滅菌操作后剩余的冷凍胚胎中獲得全局制備的人類胚胎干細(xì)胞。為使用能夠分化為所有細(xì)胞的多能人類胚胎干細(xì)胞作為細(xì)胞治療產(chǎn)品，已進(jìn)行了各種嘗試；然而，這些嘗試尚未完全克服例如致癌和免疫排斥風(fēng)險(xiǎn)等高障礙。作為對(duì)這些嘗試的一種補(bǔ)充，最近已對(duì)誘導(dǎo)性多能干(iPS)細(xì)胞進(jìn)行了報(bào)道。包含在多能干細(xì)胞概念中的iPS細(xì)胞為通過去分化成體細(xì)胞獲得的細(xì)胞，所述成體細(xì)胞的分化以若干方式結(jié)束，因而在分化的早期階段恢復(fù)為胚胎樣狀態(tài)。到目前為止，已有報(bào)道稱鑒于基因表達(dá)和分化能力，去分化的細(xì)胞呈現(xiàn)出與胚胎干細(xì)胞(其為多能干細(xì)胞)幾乎相同的特性。這些iPS細(xì)胞還可使用自體細(xì)胞，因而排除了免疫排斥的風(fēng)險(xiǎn)，然而腫瘤發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)仍然是需要解決的問題。近來，已提供了具有免疫調(diào)節(jié)功能并且無腫瘤發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的間充質(zhì)干細(xì)胞作為用于解決這些問題的替代方法。間充質(zhì)干細(xì)胞為能夠分化為脂肪細(xì)胞、骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、肌細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、心肌細(xì)胞等的多效細(xì)胞，且已報(bào)道具有調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)的功能。間充質(zhì)干細(xì)胞可從各種組織分離出來并培養(yǎng)，但它們的能力和細(xì)胞表面標(biāo)記依據(jù)其來源而互不相同。因此，并不容易清楚地界定間充質(zhì)干細(xì)胞。然而，間充質(zhì)干細(xì)胞通常由可分化為骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞和肌細(xì)胞的細(xì)胞界定；具有螺旋形式；并且表達(dá)⑶73(+)、⑶105(+)、⑶34(-)和⑶45 (-)，這些是基本的細(xì)胞表面標(biāo)記。同時(shí)，為使間充質(zhì)干細(xì)胞用作細(xì)胞治療產(chǎn)品，再生醫(yī)學(xué)和/或細(xì)胞治療領(lǐng)域所需的約IXIO9最少數(shù)量的細(xì)胞需得到滿足。然而，在考慮用于設(shè)定條件和標(biāo)準(zhǔn)的實(shí)驗(yàn)時(shí)，實(shí)際需要的細(xì)胞數(shù)量進(jìn)一步增加。因此，體外實(shí)驗(yàn)中需要至少10次傳代以由獲自各種來源的現(xiàn)有間充質(zhì)干細(xì)胞提供所述量的細(xì)胞。在這種情況下，細(xì)胞變得老化并經(jīng)修飾，因此，它們可能不會(huì)再適于用作細(xì)胞治療產(chǎn)品。雖然已通過使用這些細(xì)胞來設(shè)定條件和標(biāo)準(zhǔn)，但可能會(huì)出現(xiàn)一些問題這些細(xì)胞可能在實(shí)際用于治療中之前就已變得枯竭，從而需要使用來自他人的間充質(zhì)干細(xì)胞，且在這種情況下，由于使用不同的細(xì)胞而需要進(jìn)行額外的實(shí)驗(yàn)。解決現(xiàn)有間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)的上述問題的最理想替代方法是使用人類多能干細(xì)胞來產(chǎn)生間充質(zhì)干細(xì)胞。然而，到目前為止，誘導(dǎo)人類多能干細(xì)胞分化為間充質(zhì)干細(xì)胞已需要由特定細(xì)胞因子(例如，BMP、bFGF)進(jìn)行誘導(dǎo)程序(這成本很高且需要控制濃度)或?qū)哂挟惙N病原體風(fēng)險(xiǎn)的異種飼養(yǎng)細(xì)胞(0P9小鼠細(xì)胞株)進(jìn)行誘導(dǎo)程序以及其后通過特定標(biāo)記(例如⑶73)進(jìn)行分選。此外，就通過這些方法產(chǎn)生的間充質(zhì)干細(xì)胞來說，很難維持其基本狀態(tài)且生產(chǎn)效率不高。此外，具有不同遺傳背景的人類多能干細(xì)胞具有不同的生理機(jī)制，從而無法使用用于誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞分化的現(xiàn)有方法(這些方法先前是在特定系中建立)。因此，為從具有不同遺傳起源的人類多能干細(xì)胞誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞具有一定的難度，需要開發(fā)和應(yīng)用其它的分化誘導(dǎo)方法。鑒于這些原因，在再生醫(yī)學(xué)和細(xì)胞治療領(lǐng)域中，間充質(zhì)干細(xì)胞在用作理想細(xì)胞治療產(chǎn)品時(shí)具有局限性。

發(fā)明內(nèi)容
技術(shù)問題本發(fā)明提供間充質(zhì)干細(xì)胞的高效率大規(guī)模生產(chǎn)方法，其通常適用于具有各種遺傳背景的人類多能干細(xì)胞。此外，本發(fā)明還提供通過所述方法產(chǎn)生的間充質(zhì)干細(xì)胞、包含間充質(zhì)干細(xì)胞的細(xì)胞治療產(chǎn)品以及用于由人類多能干細(xì)胞產(chǎn)生間充質(zhì)干細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)化培養(yǎng)系統(tǒng)。技術(shù)方案為解決上述問題，本發(fā)明提供由人類多能干細(xì)胞產(chǎn)生間充質(zhì)干細(xì)胞的方法，所述方法包含a)由人類多能干細(xì)胞形成胚胎體；b)使胚胎體附著到組織培養(yǎng)皿，然后誘導(dǎo)胚胎體自發(fā)分化為間充質(zhì)干細(xì)胞；以及c)執(zhí)行間充質(zhì)干細(xì)胞的連續(xù)增殖性培養(yǎng)，同時(shí)維持間充質(zhì)干細(xì)胞的一致性。具體來說，分化誘導(dǎo)可包含通過自體細(xì)胞因子回路的形成誘導(dǎo)自發(fā)分化以及具有使用培養(yǎng)基的特性，所述培養(yǎng)基包括人表皮生長(zhǎng)因子(hEGF)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、人堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(hFGF-B)、胰島素樣生長(zhǎng)因子(IGF-I)、氫化可的松(hydrocortisone)、抗壞血酸等，可使用類似物以維持并以增殖性方式培養(yǎng)經(jīng)分化誘導(dǎo)的間充質(zhì)干細(xì)胞。技術(shù)效果
本發(fā)明提供用于誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞分化和增殖性培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)化方法，不管其遺傳背景的差異如何，都能夠廣泛應(yīng)用于所有的人類多能干細(xì)胞。進(jìn)一步來說，本發(fā)明可以連續(xù)方式大規(guī)模生產(chǎn)間充質(zhì)干細(xì)胞，作為用于細(xì)胞治療產(chǎn)品的最佳資源，同時(shí)仍維持間充質(zhì)干細(xì)胞的一致性。進(jìn)一步來說，本發(fā)明能夠克服因異種飼養(yǎng)細(xì)胞的誘導(dǎo)而引起的異種病原體的風(fēng)險(xiǎn)以及可能由于熒光激活細(xì)胞分選器(FACS)進(jìn)行的分選而造成的細(xì)胞損傷，且允許以低成本得到間充質(zhì)干細(xì)胞的高效率生產(chǎn)。最終，本發(fā)明可通過使用人類多能干細(xì)胞，很容易地大規(guī)模生產(chǎn)間充質(zhì)干細(xì)胞(其可理想地用于再生醫(yī)學(xué)和細(xì)胞治療中)，從而實(shí)現(xiàn)細(xì)胞治療產(chǎn)品的實(shí)際用途。此外，本發(fā)明預(yù)計(jì)大大有助于對(duì)例如心血管病和神經(jīng)障礙等不治之癥的治療。


圖Ia顯示誘導(dǎo)人類多能干細(xì)胞分化為間充質(zhì)干細(xì)胞以及間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖性培養(yǎng)。圖Ib顯示通過利用聚合酶鏈反應(yīng),與7天胚胎體(embryonic bodies on day 7of culture)和 14天胚胎體(embryonic bodies on day 14 of culture)的間充質(zhì)分化相 關(guān)的基因表達(dá)差異的定量結(jié)果。圖Ic顯示通過對(duì)14天胚胎體染色，在間充質(zhì)分化的早期階段基因蛋白質(zhì)表達(dá)的驗(yàn)證結(jié)果。圖2a顯示在胚胎體附著時(shí)對(duì)14天胚胎體的分選。圖2b顯示在通用培養(yǎng)基中培養(yǎng)胚胎體時(shí)起始誘導(dǎo)分化為間充質(zhì)干細(xì)胞，通用培養(yǎng)基中不會(huì)添加外部細(xì)胞因子。圖2c和圖2d分別顯示在以不利用以及利用諾金(Noggin)(其為BMP拮抗劑)處理過的群組中分化為間充質(zhì)干細(xì)胞的誘導(dǎo)過程。圖3顯示EGM-2MV培養(yǎng)基與 -MEM培養(yǎng)基(其為用于培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞的現(xiàn)有培養(yǎng)基)之間的效率差異，這通過與細(xì)胞衰老相關(guān)的β-gal染色證實(shí)。圖4a顯示在EGM-2MV培養(yǎng)基中培養(yǎng)140天或更長(zhǎng)時(shí)間的間充質(zhì)干細(xì)胞的生長(zhǎng)模式。圖4b是本發(fā)明的間充質(zhì)干細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線，表明間充質(zhì)干細(xì)胞在體外培養(yǎng)時(shí)生長(zhǎng)，同時(shí)維持長(zhǎng)期活性。圖5a和圖5b顯示通過本發(fā)明的方法獲得的間充質(zhì)干細(xì)胞表達(dá)間充質(zhì)特有的標(biāo)記。圖6顯示在長(zhǎng)期體外培養(yǎng)后，本發(fā)明的間充質(zhì)干細(xì)胞的染色體分析結(jié)果。圖7a和圖7b顯示通過本發(fā)明的方法獲得的間充質(zhì)干細(xì)胞的分化能力的分析結(jié)
果O圖8a和圖Sb顯示通過本發(fā)明的方法獲得的間充質(zhì)干細(xì)胞是否形成畸胎瘤以及是否表達(dá)與免疫誘導(dǎo)相關(guān)的因子。圖9顯示通過利用缺血性心血管病小鼠模型觀測(cè)功能以便估計(jì)通過本發(fā)明的方法獲得的間充質(zhì)干細(xì)胞的功能性而獲得的結(jié)果。圖10顯示關(guān)于通過本發(fā)明的方法獲得的間充質(zhì)干細(xì)胞作為自體飼養(yǎng)細(xì)胞的可能性的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。圖11顯示對(duì)通過利用車醫(yī)院的3號(hào)人類胚胎干細(xì)胞株(CHA3_hESC)以及H9人類胚胎干細(xì)胞株(其具有與首爾國(guó)立大學(xué)醫(yī)院(Seoul National University Hospital)的人類胚胎干細(xì)胞不同的遺傳背景和培養(yǎng)環(huán)境)對(duì)本發(fā)明再現(xiàn)性的驗(yàn)證結(jié)果。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明針對(duì)通過利用人類多能干細(xì)胞產(chǎn)生間充質(zhì)干細(xì)胞的方法，所述方法包含a)由人類多能干細(xì)胞形成胚胎體；b)使胚胎體附著到組織培養(yǎng)皿，然后誘導(dǎo)胚胎體自發(fā)分化為間充質(zhì)干細(xì)胞；以及c)維持并以增殖性方式培養(yǎng)經(jīng)分化誘導(dǎo)的間充質(zhì)干細(xì)胞。具體來說，本發(fā)明可包含由人類多能干細(xì)胞形成胚胎體，且此可通過所屬技術(shù)領(lǐng)域中已知的一般方法實(shí)施。舉例來說，人類多能干細(xì)胞可用蛋白酶處理，隨后在不含堿性纖維母細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)的胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)基中以懸浮狀態(tài)培養(yǎng)。如本文使用的術(shù)語(yǔ)“干細(xì)胞”指代能夠以無限方式使細(xì)胞再生以便形成組織和器官的專一細(xì)胞的主細(xì)胞。干細(xì)胞是可發(fā)展的多效或多能細(xì)胞。干細(xì)胞可細(xì)胞分裂成兩個(gè)子干細(xì)胞，或一個(gè)子干細(xì)胞和一個(gè)轉(zhuǎn)化細(xì)胞，且隨后增殖為成熟和完整的組織細(xì)胞類型。這些干細(xì)胞可通過各種方法分類。最常用的方法之一取決于干細(xì)胞的分化能力。根據(jù)所述方法，干細(xì)胞可分為能夠分化為三胚層細(xì)胞的多能干細(xì)胞、能夠以有限方式分化為特定胚層或更多的多效干細(xì)胞以及僅能夠分化成特定胚層的單能干細(xì)胞。如本文使用的術(shù)語(yǔ)“多能干細(xì)胞”指代具有多能性的干細(xì)胞，所述多能干細(xì)胞能夠分化為構(gòu)成活體的所有三胚層，且其實(shí)例包含胚胎干細(xì)胞和誘導(dǎo)性多能干(iPS)細(xì)胞。成體干細(xì)胞可為多效或單能干細(xì)胞。如本文使用的術(shù)語(yǔ)“分化”指代一種過程，通過這一過程細(xì)胞在分裂期間的結(jié)構(gòu)或功能、細(xì)胞的增殖和生長(zhǎng)變得專一化，即細(xì)胞的形態(tài)或功能變化，使得有機(jī)體的細(xì)胞、組織等執(zhí)行其既定工作。一般來說，這是相對(duì)簡(jiǎn)單的系統(tǒng)被分成兩個(gè)或兩個(gè)以上性質(zhì)上不同的分系統(tǒng)的過程。分化指代一種狀態(tài)，在此狀態(tài)下，某種生物系統(tǒng)(其起初已經(jīng)是均質(zhì)的)的各部分在性質(zhì)上變得互不相同，或者由于上述原因而分裂為在性質(zhì)上明顯不同的部分或分系統(tǒng)，例如就卵(其起初是均質(zhì)的(homogeneous))個(gè)體發(fā)育而言,被分成頭、身體等,或細(xì)胞被分成肌細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞等，變得互不相同。本文使用的術(shù)語(yǔ)“胚胎體(EB) ”指代通過誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的分化而形成的聚集物。當(dāng)在不含堿性纖維母細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)的胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)基中不存在飼養(yǎng)細(xì)胞的情況下以懸浮狀態(tài)培養(yǎng)多能干細(xì)胞時(shí)，可產(chǎn)生胚胎體。通過上述方法制備的胚胎體已報(bào)道能夠分化為來自內(nèi)胚層、中胚層和外胚層的個(gè)體形成所必需的所有細(xì)胞，且此對(duì)應(yīng)于證明多能干細(xì)胞的多能性的體外方法之一。本發(fā)明可包含選擇培養(yǎng)14天的胚胎體以及誘導(dǎo)胚胎體分化為間充質(zhì)干細(xì)胞。具體來說，可選擇培養(yǎng)14天的胚胎體(其通過在不含bFGF的胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)基中以懸浮狀態(tài)培養(yǎng)人類多能干細(xì)胞而形成)，然后用于產(chǎn)生間充質(zhì)干細(xì)胞。培養(yǎng)7天的胚胎體通常用于從人類多能干細(xì)胞(通常為人類胚胎干細(xì)胞)誘導(dǎo)分化為間充質(zhì)干細(xì)胞的現(xiàn)有方法。然而，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，鑒于間充質(zhì)干細(xì)胞由人類多能干細(xì)胞產(chǎn)生，選擇培養(yǎng)14天的胚胎體而不是培養(yǎng)7天的胚胎體可提高分化誘導(dǎo)效率。具體來說，由于對(duì)培養(yǎng)7天和14天的胚胎體的基因表達(dá)的研究，已證實(shí)與早期間充質(zhì)分化相關(guān)的基因(短尾基因(braChyury)、BMPR等)和Sox 17 (其為早期心臟間充質(zhì)細(xì)胞中的重要基因)在培養(yǎng)14天的胚胎體中與培養(yǎng)7天的現(xiàn)有胚胎體相比，得到顯著高的表達(dá)(見圖lb)。根據(jù)以上結(jié)果可以看出，選擇培養(yǎng)14天的胚、胎體可誘導(dǎo)優(yōu)先分化為間充質(zhì)干細(xì)胞。另外，本發(fā)明還可包含使培養(yǎng)14天的胚胎體附著到組織培養(yǎng)皿，然后誘導(dǎo)胚胎體自發(fā)分化為間充質(zhì)干細(xì)胞。當(dāng)誘導(dǎo)人類多能干細(xì)胞分化為間充質(zhì)干細(xì)胞時(shí)，通常通過外部添加骨形態(tài)發(fā)生蛋白((BMP)-2)等來起始分化誘導(dǎo)。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，在不外部添加BMP-2等的情況下，當(dāng)通過使用例如杜爾伯科改良伊格爾培養(yǎng)基(Dulbecco' s Modified Eagle' sMedium,DMEM)培養(yǎng)基等通用細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)胚胎體時(shí)，誘導(dǎo)自發(fā)分化為間充質(zhì)干細(xì)胞(見圖2b)。關(guān)于此機(jī)制，本發(fā)明人考慮到相關(guān)技術(shù)所已知BMP自動(dòng)回路形成的可能性(其為間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)因子)，然后為證明此，通過利用諾金(其為BMP拮抗劑)進(jìn)行的處理觀測(cè)間充質(zhì)干細(xì)胞分化的誘導(dǎo)過程(見圖2c和圖2d)。在未用諾金處理的群組中誘導(dǎo)分化為間充質(zhì)干細(xì)胞(見圖2c)。然而，觀測(cè)到間充質(zhì)祖細(xì)胞并不出現(xiàn)于經(jīng)諾金處理的群組中(見圖2d)，而且在傳代培養(yǎng)時(shí)，由于細(xì)胞無法重新附著，因此細(xì)胞培養(yǎng)是不可能的。根據(jù)上述結(jié)果可以看出，當(dāng)培養(yǎng)14天的胚胎體在其附著后在通用培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)，即使不存在外部添加細(xì)胞因子的情況，也會(huì)誘導(dǎo)自發(fā)分化為間充質(zhì)干細(xì)胞，且這是由于BMP回路系統(tǒng)的自我調(diào) 節(jié)。另外，本發(fā)明可包含通過使用含有細(xì)胞因子的培養(yǎng)基維持并以增殖性方式培養(yǎng)經(jīng)分化誘導(dǎo)的間充質(zhì)干細(xì)胞。在本發(fā)明中，含有人表皮生長(zhǎng)因子(hEGF)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、人堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(hFGF-B)、胰島素樣生長(zhǎng)因子(IGF-I)、氫化可的松以及抗壞血酸等的微脈管內(nèi)皮細(xì)胞2型培養(yǎng)基(EGM-2MV，瑞士巴塞爾龍沙(Lonza5Basel,Switzerland))培養(yǎng)基用作間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)基。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)當(dāng)使用EGM-2MV培養(yǎng)基替代廣泛用作現(xiàn)有間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基的a -MEM培養(yǎng)基時(shí)，間充質(zhì)干細(xì)胞的活性在其體外培養(yǎng)中維持得相對(duì)較長(zhǎng)。為使用間充質(zhì)干細(xì)胞作為細(xì)胞治療產(chǎn)品，如上所述提供足量的細(xì)胞必須放在首位，且為了此目的，需要對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞傳代培養(yǎng)。然而，重復(fù)的傳代培養(yǎng)可能會(huì)導(dǎo)致間充質(zhì)干細(xì)胞衰老，引起其分裂能力降低，因而可能會(huì)失去其活性(分化能力)。在這點(diǎn)上，已證實(shí)與已用作現(xiàn)有間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基的a -MEM培養(yǎng)基相比，本發(fā)明的EGM-2MV培養(yǎng)基具有優(yōu)越的活性保留能力(見圖3)。具體來說，由于通過實(shí)施β -gal染色來在細(xì)胞衰老時(shí)為其染色，已看到更多細(xì)胞的β -gal染色得以完成，且與通過使用EGM-2MV培養(yǎng)基培養(yǎng)的間充質(zhì)干細(xì)胞相比，在通過使用a -MEM培養(yǎng)基培養(yǎng)的間充質(zhì)干細(xì)胞中細(xì)胞的尺寸變得非常大。一般來說已知的是，在干細(xì)胞體外培養(yǎng)時(shí)，由于細(xì)胞衰老引起的細(xì)胞非生長(zhǎng)與細(xì)胞的增大相關(guān)。這意味著，當(dāng)通過使用a -MEM培養(yǎng)基培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞時(shí)，間充質(zhì)干細(xì)胞的衰老加速，因而間充質(zhì)干細(xì)胞失去分化能力。另外，本發(fā)明提供通過本發(fā)明的方法產(chǎn)生的間充質(zhì)干細(xì)胞。間充質(zhì)干細(xì)胞可分化為骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞和肌細(xì)胞等，且由螺旋形式和基本細(xì)胞表面標(biāo)記(SH2 (+)、SH3 (+)、CD34(-)和CD45(-))的表達(dá)程度界定。通過本發(fā)明的方法獲得的來源于首爾國(guó)立大學(xué)醫(yī)院人類胚胎干細(xì)胞(亞洲I號(hào)，男性，STO飼養(yǎng)細(xì)胞)的間充質(zhì)干細(xì)胞在三次不同試驗(yàn)的情況下得出相同的結(jié)果，這通過熒光激活細(xì)胞分選器以及通過功能分化證實(shí)。本發(fā)明提供用于誘導(dǎo)分化和增殖培養(yǎng)的標(biāo)準(zhǔn)化方法，這通?？捎糜谟删哂懈鞣N遺傳起源的人類多能干細(xì)胞產(chǎn)生間充質(zhì)干細(xì)胞。在這點(diǎn)上，對(duì)車醫(yī)院的人類胚胎干細(xì)胞(亞洲2號(hào)，男性，MEF飼養(yǎng)細(xì)胞)以及H9人類胚胎干細(xì)胞(西方人，女性，MEF飼養(yǎng)細(xì)胞)執(zhí)行本發(fā)明的方法，這些干細(xì)胞具有與首爾國(guó)立大學(xué)醫(yī)院的人類胚胎干細(xì)胞不同的遺傳起源，且從那里獲得相同的結(jié)果。也就是說，為誘導(dǎo)由具有各種遺傳背景和/或培養(yǎng)環(huán)境的人類多能干細(xì)胞分化間充質(zhì)干細(xì)胞，通?？墒褂帽景l(fā)明的標(biāo)準(zhǔn)化方法。另外，本發(fā)明提供包含通過本發(fā)明的方法獲得的間充質(zhì)干細(xì)胞的細(xì)胞治療產(chǎn)品。具體來說，細(xì)胞治療產(chǎn)品可用于形成脂肪細(xì)胞、骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、肌細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞以及心肌細(xì)胞，且根據(jù)環(huán)境分化為各種細(xì)胞。如本文使用的術(shù)語(yǔ)“細(xì)胞治療產(chǎn)品”指代用于治療、診斷以及預(yù)防的藥物，包括通過分離、培養(yǎng)和專業(yè)化操作(美國(guó)FDA指導(dǎo))而由人類制備的細(xì)胞或組織，且更具體來說指代用于治療、診斷以及預(yù)防的藥物，其通過包含對(duì)自體、同源或異源體外活細(xì)胞進(jìn)行增殖或分選或通過其它方法修飾細(xì)胞生物特性的任何過程制備，以便恢復(fù)細(xì)胞或組織的功能。細(xì)胞治療產(chǎn)品根據(jù)細(xì)胞分化的程度主要分為體細(xì)胞治療產(chǎn)品和干細(xì)胞治療產(chǎn)品，且本發(fā)明特別針對(duì)干細(xì)胞治療產(chǎn)品。
另外，本發(fā)明提供用于由具有各種遺傳起源的人類多能干細(xì)胞產(chǎn)生間充質(zhì)干細(xì)胞的系統(tǒng)。所述系統(tǒng)包含a)培養(yǎng)人類多能干細(xì)胞以及選擇培養(yǎng)14天的胚胎體；b)使胚胎體附著到組織培養(yǎng)皿且通過利用DMEM+FBS培養(yǎng)基誘導(dǎo)來培養(yǎng)胚胎體，從而誘導(dǎo)胚胎體的分化；c)以及通過使用含有人表皮生長(zhǎng)因子(hEGF)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、人堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(hFGF-B)、胰島素樣生長(zhǎng)因子(IGF-I)、氫化可的松以及抗壞血酸的培養(yǎng)基來維持并以增殖性方式培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞。另外，本發(fā)明提供用于培養(yǎng)人類多能干細(xì)胞的飼養(yǎng)細(xì)胞。培養(yǎng)時(shí)，需要飼養(yǎng)細(xì)胞來以連續(xù)方式維持人類多能干細(xì)胞的未分化狀態(tài)。來源于小鼠胚胎的成纖維細(xì)胞已優(yōu)選用作用于人類多能干細(xì)胞的現(xiàn)有飼養(yǎng)細(xì)胞。然而，由于當(dāng)多能干細(xì)胞將用于臨床時(shí)，各種病原體的種間滲透已被視為是一個(gè)問題，因此來源于人類的若干細(xì)胞已經(jīng)報(bào)道可能用作飼養(yǎng)細(xì)胞作為替代方法。然而，這仍無法克服不足不可能完全排除異源病原體；本質(zhì)上需要外來因子來維持未分化狀態(tài)(例如，bFGF、IGF和ACTIVIN等);以及不可能連續(xù)提供細(xì)胞用于長(zhǎng)期培養(yǎng)。相反，來源于人類多能干細(xì)胞的間充質(zhì)干細(xì)胞(其根據(jù)本發(fā)明產(chǎn)生)可以連續(xù)方式提供具有同一背景的細(xì)胞，且作為自體飼養(yǎng)細(xì)胞，還可排除其它病原體的免疫排斥和/或滲透。此外，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)以下優(yōu)點(diǎn)當(dāng)來源于人類多能干細(xì)胞的間充質(zhì)干細(xì)胞(其根據(jù)本發(fā)明產(chǎn)生)用作飼養(yǎng)細(xì)胞時(shí)，不需要外來未分化的狀態(tài)維持因子。換句話說，已證實(shí)即使30或30次以上傳代期間不添加未分化的狀態(tài)維持因子，未分化的狀態(tài)也得以維持(見圖10)，且即使在為了維持未分化狀態(tài)而添加過量因子的情況下使用來源于人類的現(xiàn)有若干飼養(yǎng)細(xì)胞時(shí)，也無法獲得此顯著效應(yīng)“維持未分化狀態(tài)較長(zhǎng)時(shí)間”。在下文中，將參考以下實(shí)例詳細(xì)描述本發(fā)明。然而，以下實(shí)例僅用于例示本發(fā)明，因而本發(fā)明的范圍并不限于以下實(shí)例。很顯然，由所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員作出的各種修改均包含在本發(fā)明的技術(shù)范圍內(nèi)。[實(shí)例]實(shí)例I :由首爾國(guó)立大學(xué)醫(yī)院的人類胚胎干細(xì)胞產(chǎn)生間充質(zhì)干細(xì)胞(I)胚胎體的形成用分散酶(2mg/ml)對(duì)首爾國(guó)立大學(xué)醫(yī)院的人類胚胎干細(xì)胞(亞洲I號(hào)，男性，STO飼養(yǎng)細(xì)胞)(其維持未分化狀態(tài))進(jìn)行處理，接著通過精細(xì)操作分離，然后在不含bFGF的胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)基中以懸浮狀態(tài)培養(yǎng)14大。對(duì)培養(yǎng)7天和14天的胚胎體執(zhí)行基因分析，且通過利用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)定量與用于各胚胎體的間充質(zhì)分化相關(guān)的基因表達(dá)差異。已證實(shí)，短尾基因和BMPR(其為與早期間充質(zhì)分化相關(guān)的基因)以及Sox 17(其為早期心臟間充質(zhì)細(xì)胞中的重要基因)在培養(yǎng)14天的胚胎體中與培養(yǎng)7天的胚胎體相比，得到顯著高的表達(dá)(見圖lb)。另外，通過對(duì)培養(yǎng)14天的胚胎體進(jìn)行染色確定短尾基因的蛋白質(zhì)表達(dá)及其位置(見圖Ic)。(2)誘導(dǎo)分化為間充質(zhì)干細(xì)胞將通過14天懸浮培養(yǎng)制備的胚胎體附著到組織培養(yǎng)皿，然后誘導(dǎo)自然分化為間充質(zhì)干細(xì)胞。在圖2a中顯示在附著時(shí)對(duì)14天胚胎體的分選。附著后，一些胚胎體生長(zhǎng)得 很好(圖2a左圖)，而另一些胚胎體生長(zhǎng)得不好(圖2a右圖)。觀測(cè)到誘導(dǎo)分化為間充質(zhì)干細(xì)胞，同時(shí)胚胎體在包括杜爾伯科改良伊格爾培養(yǎng)基(DMEM)和胎牛血清(FBS，10% v/v(體積比上體積))的培養(yǎng)基中培養(yǎng)16天。在圖2b中顯示胚胎體附著后第3天和第7天的觀測(cè)結(jié)果。如從圖2b所見，已證實(shí)，當(dāng)在無細(xì)胞因子的通用培養(yǎng)基(DMEM+FBS)中培養(yǎng)胚胎體時(shí)，起始誘導(dǎo)胚胎體自發(fā)分化為間充質(zhì)干細(xì)胞。為了揭開分化誘導(dǎo)的機(jī)制，比較并觀測(cè)經(jīng)由利用諾金(其為BMP拮抗劑)處理誘導(dǎo)分化為間充質(zhì)干細(xì)胞的過程(見圖2c和圖2d)。已證實(shí)，在未用諾金處理的群組中誘導(dǎo)分化為間充質(zhì)干細(xì)胞(見圖2c)，而在以諾金處理的群組中未觀測(cè)到間充質(zhì)祖細(xì)胞(見圖2d)。從上述結(jié)果可以看出，在并未外部添加細(xì)胞因子的通用培養(yǎng)基中培養(yǎng)胚胎體時(shí)，誘導(dǎo)自發(fā)分化為間充質(zhì)干細(xì)胞是由BMP自動(dòng)反饋回路系統(tǒng)引起。(3)經(jīng)分化誘導(dǎo)的間充質(zhì)干細(xì)胞的維持和增殖性培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞(其在實(shí)例I的(2)中在附著后通過培養(yǎng)胚胎體16天而經(jīng)分化誘導(dǎo))利用酶(胰蛋白酶-EDTA，含EDTA 4Na的O. 25%胰蛋白酶)進(jìn)行處理，且分離成單細(xì)胞，隨后單細(xì)胞再附著到組織培養(yǎng)皿。隨后，通過使用500ml的培養(yǎng)基，在37°C下維持并以增殖性方式培養(yǎng)細(xì)胞，所述培養(yǎng)基包括O. 5ml的人表皮生長(zhǎng)因子(hEGF)、0. 5ml的血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、2ml的人堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(hFGF-B)、0. 5ml的胰島素樣生長(zhǎng)因子(IGF-I)、0. 2ml的氫化可的松以及O. 5ml的抗壞血酸，再加上470ml的基礎(chǔ)培養(yǎng)基。關(guān)于間充質(zhì)干細(xì)胞的活性在增殖性培養(yǎng)期間是否得到維持，通過實(shí)驗(yàn)相互比較本發(fā)明使用的EGM-2MV培養(yǎng)基與a -MEM培養(yǎng)基(其為現(xiàn)有的間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基)的活性維持能力。具體來說，對(duì)通過使用各培養(yǎng)基培養(yǎng)的細(xì)胞群組執(zhí)行與衰老相關(guān)的β-gal染色，且在圖3中顯示這些結(jié)果(培養(yǎng)和比較進(jìn)行一個(gè)月，且使用第7次培養(yǎng)傳代的細(xì)胞)。圖3中顯示，在通過使用a -MEM培養(yǎng)基培養(yǎng)的間充質(zhì)干細(xì)胞中相比于通過使用EGM-2MV培養(yǎng)基培養(yǎng)的間充質(zhì)干細(xì)胞中，更多細(xì)胞經(jīng)β-gal染色。這意味著，在通過使用a -MEM培養(yǎng)基培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞時(shí)，間充質(zhì)干細(xì)胞的衰老加速，因而間充質(zhì)干細(xì)胞失去分化能力，最終間充質(zhì)干細(xì)胞無法充當(dāng)細(xì)胞治療產(chǎn)品。然而，盡管傳代培養(yǎng)是連續(xù)的，但本發(fā)明EGM-2MV培養(yǎng)基的使用也能夠維持間充質(zhì)干細(xì)胞的活性較長(zhǎng)時(shí)間，因而與a -MEM培養(yǎng)基的使用相比，可相對(duì)改進(jìn)作為細(xì)胞治療產(chǎn)品的實(shí)用性。另外，研究當(dāng)通過使用EGM-2MV培養(yǎng)基培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞較長(zhǎng)時(shí)間時(shí)，是否能夠連續(xù)維持間充質(zhì)干細(xì)胞的一致性和活性，且其結(jié)果顯示在圖4中。圖4a顯示通過使用EGM-2MV培養(yǎng)基培養(yǎng)140天或更長(zhǎng)時(shí)間后的細(xì)胞，且其顯示細(xì)胞的生長(zhǎng)形態(tài)仍具有指紋圖案(這是間充質(zhì)干細(xì)胞的典型圖案)。圖4b顯示直到培養(yǎng)140天才出現(xiàn)連續(xù)且強(qiáng)烈的細(xì)胞分裂，且這表明間充質(zhì)干細(xì)胞的活性可以連續(xù)方式維持。綜上所述，可清楚地看出，當(dāng)經(jīng)分化誘導(dǎo)的間充質(zhì)干細(xì)胞在本發(fā)明的EGM-2MV培養(yǎng)基中維持并以增殖性方式培養(yǎng)時(shí)，間充質(zhì)干細(xì)胞的一致性和活性可維持較長(zhǎng)時(shí)間。實(shí)例2 :間充質(zhì)干細(xì)胞的表征(I)細(xì)胞表面標(biāo)記的分析已分析實(shí)例I中獲得的間充質(zhì)干細(xì)胞特有的細(xì)胞表面標(biāo)記是否得到表達(dá)。在抗原-抗體反應(yīng)后通過使用熒光激活的細(xì)胞分選器獲得的結(jié)果顯示在圖5中。IgG用作對(duì)照。根據(jù)圖5a已證實(shí)，在培養(yǎng)95天(D95)和培養(yǎng)129天(D129)的細(xì)胞中，間充質(zhì)干細(xì)胞所特有的標(biāo)記⑶73和⑶105仍大量表達(dá)。另外，對(duì)培養(yǎng)129天的間充質(zhì)干細(xì)胞執(zhí)行細(xì) 胞表面標(biāo)記分析，且這些結(jié)果顯示在圖5b中。根據(jù)圖5b已證實(shí)，⑶29、⑶44和⑶90 (其 為人類間充質(zhì)干細(xì)胞(hMSC)標(biāo)記)得到表達(dá)，但SSEAl、SSEA4、TRA-l-60和0CT-4(其為人類胚胎干細(xì)胞(hESC)標(biāo)記)與內(nèi)胚層和外胚層標(biāo)記(其它譜系標(biāo)記)均未得到表達(dá)。最終，根據(jù)本發(fā)明的方法，可清楚地顯示可選擇性誘導(dǎo)人類多能干細(xì)胞僅分化間充質(zhì)干細(xì)胞，且進(jìn)一步來說，可在細(xì)胞的長(zhǎng)期增殖性培養(yǎng)時(shí)維持間充質(zhì)干細(xì)胞的一致性。(2)核型分析通過利用G顯帶法(薩科內(nèi)(Saccone)等人,美國(guó)科學(xué)院院刊(Proc. Natl. Acad.Sci. USA)，89 =4913-4917,1992)分析實(shí)例I中獲得的間充質(zhì)干細(xì)胞(培養(yǎng)160天)的核型，且這些結(jié)果顯示在圖6中。根據(jù)圖6已證實(shí)，間充質(zhì)干細(xì)胞具有XY+44的正常核型。(3)間充質(zhì)干細(xì)胞的功能(分化能力)的驗(yàn)證為驗(yàn)證實(shí)例I中獲得的間充質(zhì)干細(xì)胞(培養(yǎng)129天)的分化能力，通過利用先前報(bào)道的方法(蒂齊亞諾 巴爾貝里(Tiziano Barberi)等人，公共科學(xué)圖書館 醫(yī)學(xué)(PLoSMedicine)，2 =0554-0560, 2005 年 6 月；以及凱斯· J ·佩尼克(Kitsie J. Penick)等人，生物技術(shù)(Biotechniques)，39 =687-691,2005)進(jìn)行分析。具體來說，誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞分化為脂肪細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、骨細(xì)胞和肌細(xì)胞，隨后通過免疫染色反應(yīng)研究各細(xì)胞所特有的基因表達(dá)。細(xì)胞分化結(jié)果顯示在圖7a中。通過利用抗原-抗體反應(yīng)，用油紅0(0il Red O)(其對(duì)脂肪細(xì)胞小滴染色)對(duì)脂肪細(xì)胞染色，且利用聚集蛋白聚糖和膠原蛋白II (這是軟骨細(xì)胞所特有的表達(dá)蛋白)對(duì)軟骨細(xì)胞染色。此外，利用抗原-抗體反應(yīng)，通過能夠證實(shí)礦物質(zhì)形成的馮科薩染色(Von Kossastaining)來證實(shí)骨細(xì)胞的分化，以及利用MYF 5 (這是肌細(xì)胞所特有的表達(dá)蛋白)來證實(shí)肌細(xì)胞的分化。另外，當(dāng)間充質(zhì)干細(xì)胞分化為脂肪細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、骨細(xì)胞和肌細(xì)胞時(shí)，利用PCR定量各細(xì)胞所特有的各基因表達(dá)，且這些結(jié)果顯示在圖7b中。根據(jù)圖7b已證實(shí)，脂肪細(xì)胞中的Serbf和PPAR Y，骨細(xì)胞中的ALP、骨鈣蛋白(Osteocalcin)和骨橋蛋白(Osteopontin),軟骨細(xì)胞中的聚集蛋白聚糖以及肌細(xì)胞中的MyoD分別得到表達(dá)。上述結(jié)果清楚表明，根據(jù)本發(fā)明的方法獲得的間充質(zhì)干細(xì)胞保留多能性以分化為脂肪細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、骨細(xì)胞和肌細(xì)胞。(4)利用免疫缺陷小鼠驗(yàn)證腫瘤發(fā)生
已證實(shí)通過利用實(shí)例I中的免疫缺陷小鼠獲得的本發(fā)明的間充質(zhì)干細(xì)胞是否會(huì)腫瘤發(fā)生。人類胚胎干細(xì)胞用于對(duì)照實(shí)驗(yàn)。具體來說，將首爾國(guó)立大學(xué)醫(yī)院IXlO7的間充質(zhì)干細(xì)胞和3X106的人類胚胎干細(xì)胞注入免疫缺陷小鼠，且在圖8a中顯示12周后的尸檢結(jié)果。根據(jù)圖8a已證實(shí)，在注入有首爾國(guó)立大學(xué)醫(yī)院人類胚胎干細(xì)胞的小鼠中產(chǎn)生畸胎瘤，且在注入有本發(fā)明的間充質(zhì)干細(xì)胞的小鼠中不會(huì)產(chǎn)生畸胎瘤。另外，已由FACS證實(shí)，與免疫誘導(dǎo)相關(guān)的因子并未得到表達(dá)，且這些結(jié)果顯示在圖8b中。IgG用作對(duì)照。根據(jù)圖Sb已證實(shí)，HLA-DR和HLA-DQ (其為因免疫原性的存在而表達(dá)的MHC II分子)不被表達(dá)為表面因子，且B7-2和B7-1 (其為與免疫誘導(dǎo)相 關(guān)的共模擬子(co-simulator))并未得到表達(dá)。綜上所述，已證實(shí)，即使在本發(fā)明的間充質(zhì)干細(xì)胞以胚胎干細(xì)胞(對(duì)照)大約三倍或三倍以上數(shù)量移植到小鼠中時(shí)，也不會(huì)誘發(fā)腫瘤，且即使在12周的長(zhǎng)期培養(yǎng)期間，與免疫誘導(dǎo)相關(guān)的因子也不會(huì)得到表達(dá)。因此，這清楚地表明，本發(fā)明的間充質(zhì)干細(xì)胞無腫瘤發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)。(5)利用缺血性心血管病模型進(jìn)行的功能性評(píng)估為評(píng)估從實(shí)例I獲得的本發(fā)明的間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)于缺血性心血管病的功能性，使用缺血性心血管病小鼠模型。在將每只小鼠5X IO4的間充質(zhì)干細(xì)胞(培養(yǎng)129天)移植到具有上述疾病的小鼠中后，評(píng)估間充質(zhì)干細(xì)胞的功能性持續(xù)8周，并且在圖9中顯示這些結(jié)果。圖9a和圖9b顯示移植有間充質(zhì)干細(xì)胞的心臟以及未移植有間充質(zhì)干細(xì)胞的心臟。經(jīng)由MT染色觀測(cè)纖維化，且圖中的藍(lán)色部分表示纖維化。圖9a和圖9b顯示，與未移植有細(xì)胞的心臟組織(圖9b)相比，在移植有細(xì)胞的心臟組織(圖9a)中因心壁的纖維化而引起的變薄要更少。也就是說，缺血性心臟病中存在心壁的纖維化，因而壁變薄。然而，當(dāng)本發(fā)明的間充質(zhì)干細(xì)胞被移植時(shí)，可阻止因纖維化而引起的心壁變薄。另外，圖9c顯示損傷誘發(fā)區(qū)域中的心壁的纖維化部分用數(shù)字表示并量化的結(jié)果，且這清楚地表明，與不存在細(xì)胞移植的對(duì)照相比，細(xì)胞移植群組中的纖維化部分進(jìn)一步減少。圖9d顯示8周追蹤中的回波心電圖測(cè)量結(jié)果。第4周和第8周的兩個(gè)心電圖測(cè)量記錄可證實(shí)細(xì)胞移植群組中的心壁運(yùn)動(dòng)優(yōu)于對(duì)照組。LVEDD表示心臟舒張，以及LVFS表示心臟收縮，且由于LVEDD值較小以及LVFS值較大，因此心臟功能較好。根據(jù)結(jié)果已證實(shí)，當(dāng)本發(fā)明的間充質(zhì)干細(xì)胞移植到缺血性心血管病模型中時(shí)，心壁并不會(huì)變薄，且間充質(zhì)干細(xì)胞替代死亡組織，因而導(dǎo)致心臟功能障礙的纖維化區(qū)域減少，從而最終改進(jìn)缺血性心血管病。(6)作為自體飼養(yǎng)細(xì)胞的功能性的實(shí)驗(yàn)對(duì)實(shí)例I中獲得的本發(fā)明的間充質(zhì)干細(xì)胞可用作用于維持人類多能干細(xì)胞呈未分化狀態(tài)的飼養(yǎng)細(xì)胞的可能性進(jìn)行研究。在本實(shí)驗(yàn)中，在無bFGF(其為人類多能干細(xì)胞的未分化狀態(tài)維持因子)的情況下進(jìn)行培養(yǎng)。具體來說，通過使用根據(jù)本發(fā)明通過誘導(dǎo)首爾國(guó)立大學(xué)醫(yī)院3號(hào)人類胚胎干細(xì)胞株(SNUhES3)分化而獲得的間充質(zhì)干細(xì)胞(SNU3MSC-1)作為飼養(yǎng)細(xì)胞來培養(yǎng)首爾國(guó)立大學(xué)醫(yī)院3號(hào)人類胚胎干細(xì)胞株(SNUhES3)。已證實(shí)，當(dāng)在不存在未分化狀態(tài)維持因子(bFGF)的情況下培養(yǎng)人類胚胎干細(xì)胞時(shí)，盡管經(jīng)30或30次以上傳代培養(yǎng)，但人類胚胎干細(xì)胞的未分化狀態(tài)得到維持(見圖10)。從圖10可以看出，0CT-4、SSEA-4和TRA-l-60(其為人類多能干細(xì)胞標(biāo)記)甚至在30次傳代培養(yǎng)后仍得到表達(dá)，且這證明其未分化能力得到了完整維持。綜上所述，已證實(shí)，當(dāng)在培養(yǎng)人類多能干細(xì)胞時(shí)本發(fā)明的間充質(zhì)干細(xì)胞用作自體飼養(yǎng)細(xì)胞時(shí)，即使在不添加bFGF的情況下，多能干細(xì)胞的未分化能力也可連續(xù)維持，所述bFGF為在其現(xiàn)有培養(yǎng)期間維持多能干細(xì)胞的未分化能力所必需。實(shí)例3 :由車醫(yī)院的人類胚胎干細(xì)胞和H9人類胚胎干細(xì)胞產(chǎn)生間充質(zhì)干細(xì)胞以及其表征為確定本發(fā)明的間充質(zhì)干細(xì)胞的產(chǎn)生方法通常是否能夠應(yīng)用于具有不同遺傳背景和/或培養(yǎng)環(huán)境的人類多能干細(xì)胞(即其再現(xiàn)性)，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。通過與本發(fā)明的實(shí)例I相同的方法進(jìn)行所述實(shí)驗(yàn)，其中例外為使用車醫(yī)院的3號(hào)人類胚胎干細(xì)胞株(CHA3-hESC)和H9人類胚胎干細(xì)胞，其具有與首爾國(guó)立大學(xué)醫(yī)院的人類胚胎干細(xì)胞不同的遺傳背景和/或培養(yǎng)環(huán)境。具體來說，在培養(yǎng)14天的胚胎體附著后，在不外部添加細(xì)胞因子的通用培養(yǎng)基 中誘導(dǎo)自發(fā)分化為間充質(zhì)干細(xì)胞，隨后通過使用EGM-2MV培養(yǎng)基進(jìn)行維持和增殖性培養(yǎng)來獲得間充質(zhì)干細(xì)胞。圖11顯示通過使用車醫(yī)院的3號(hào)人類胚胎干細(xì)胞株(CHA3_hESC)和H9人類胚胎干細(xì)胞(其具有與首爾國(guó)立大學(xué)醫(yī)院的人類胚胎干細(xì)胞不同的遺傳背景和/或培養(yǎng)環(huán)境)，對(duì)本發(fā)明間充質(zhì)干細(xì)胞產(chǎn)生方法的再現(xiàn)性的驗(yàn)證結(jié)果。如從圖Ila和圖Ilb可見，來源于車醫(yī)院的間充質(zhì)干細(xì)胞(培養(yǎng)90天)以及來源于H9細(xì)胞的間充質(zhì)干細(xì)胞(培養(yǎng)90天)均呈現(xiàn)出間充質(zhì)干細(xì)胞的典型表型。另外，通過使用熒光激活細(xì)胞分選器進(jìn)行的蛋白質(zhì)表達(dá)的分析結(jié)果證實(shí)⑶105、⑶73、⑶29、⑶44和⑶90 (其為間充質(zhì)干細(xì)胞所特有的蛋白質(zhì))被視為陽(yáng)性，而SSEA-I、SSEA-4和TRA-1-60 (其為胚胎干細(xì)胞的特有標(biāo)記)以及CD45、CD34(其為來源于其它胚層的標(biāo)記)被視為陰性[見圖llc(D90，來源于車醫(yī)院的細(xì)胞的間充質(zhì)干細(xì)胞)以及圖lld(D90，來源于H9細(xì)胞的間充質(zhì)干細(xì)胞)]。另外,通過利用G顯帶法(薩科內(nèi)(Saccone)等人,美國(guó)科學(xué)院院刊(Proc. Natl.Acad. Sc i. USA), 89 :4913_4917，1992)，作為來源于車醫(yī)院的細(xì)胞的間充質(zhì)干細(xì)胞(培養(yǎng)90天)以及來源于H9細(xì)胞的間充質(zhì)干細(xì)胞(培養(yǎng)90天)的核型的分析結(jié)果，已證實(shí)它們均具有XY+44的正常核型(分別見圖Ile和圖Ilf)。根據(jù)上述結(jié)果，根據(jù)本發(fā)明由人類多能干細(xì)胞產(chǎn)生間充質(zhì)干細(xì)胞的方法被證明是培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)化方法，其通?？蓱?yīng)用于具有不同遺傳背景和/或培養(yǎng)環(huán)境的人類多能干細(xì)胞。產(chǎn)業(yè)利用性根據(jù)本發(fā)明，間充質(zhì)干細(xì)胞可以低成本大規(guī)模生產(chǎn)作為用于細(xì)胞治療產(chǎn)品的最佳資源，同時(shí)仍維持其一致性。最終，本發(fā)明可通過使用人類多能干細(xì)胞，很容易地大規(guī)模生產(chǎn)間充質(zhì)干細(xì)胞(其可理想地用于生殖醫(yī)學(xué)和細(xì)胞治療中)，從而實(shí)現(xiàn)細(xì)胞治療劑的實(shí)際用途。此外，本發(fā)明可大大有助于對(duì)例如心血管病和神經(jīng)障礙等不治之癥的治療。
權(quán)利要求
1.一種由人類多能干細(xì)胞產(chǎn)生間充質(zhì)干細(xì)胞的方法，所述方法包括 a)由人類多能干細(xì)胞形成胚胎體； b)使所述胚胎體附著到培養(yǎng)皿以誘導(dǎo)所述胚胎體自發(fā)分化為間充質(zhì)干細(xì)胞；以及 c)以增殖性方式培養(yǎng)所述間充質(zhì)干細(xì)胞，同時(shí)維持所述間充質(zhì)干細(xì)胞的一致性。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其中將步驟a)的所述人類多能干細(xì)胞培養(yǎng)14天以形成所述胚胎體。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其中在含有胎牛血清的杜爾伯科改良伊格爾培養(yǎng)基的堿性組分中培養(yǎng)步驟b)的所述胚胎體，從而誘導(dǎo)其分化。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其中通過在不添加外部細(xì)胞因子的情況下形成自體細(xì)胞因子回路而出現(xiàn)步驟b)的所述自發(fā)分化的誘導(dǎo)。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中所述自體細(xì)胞因子為骨形態(tài)發(fā)生蛋白。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其中通過使用含有人表皮生長(zhǎng)因子、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子、人堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、胰島素樣生長(zhǎng)因子、氫化可的松以及抗壞血酸的培養(yǎng)基來培養(yǎng)步驟c)的所述間充質(zhì)干細(xì)胞。
7.一種間充質(zhì)干細(xì)胞,其由根據(jù)權(quán)利要求I到6中任一權(quán)利要求所述的方法產(chǎn)生。
8.一種細(xì)胞治療產(chǎn)品，其包括根據(jù)權(quán)利要求7所述的間充質(zhì)干細(xì)胞。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的細(xì)胞治療產(chǎn)品，其中所述細(xì)胞治療產(chǎn)品形成選自由脂肪細(xì)胞、骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、肌細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞以及心肌細(xì)胞組成的群組中的細(xì)胞。
10.一種使用由根據(jù)權(quán)利要求I到6中任一權(quán)利要求所述的方法產(chǎn)生的間充質(zhì)干細(xì)胞的方法，其作為用于培養(yǎng)細(xì)胞的飼養(yǎng)細(xì)胞。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中所述細(xì)胞為人類多能干細(xì)胞。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中所述人類多能干細(xì)胞經(jīng)受30次傳代培養(yǎng)。
13.一種用于培養(yǎng)細(xì)胞的飼養(yǎng)細(xì)胞，其包括由根據(jù)權(quán)利要求I到6中任一權(quán)利要求所述的方法產(chǎn)生的間充質(zhì)干細(xì)胞。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的飼養(yǎng)細(xì)胞，其中所述細(xì)胞為人類多能干細(xì)胞。
15.一種用于由人類多能干細(xì)胞產(chǎn)生間充質(zhì)干細(xì)胞的試劑盒，所述試劑盒包括 a)胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)基，其不含堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子； b)杜爾伯科改良伊格爾培養(yǎng)基，其含有10%(v/v)的胎牛血清；以及 c)培養(yǎng)基，其含有人表皮生長(zhǎng)因子、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子、人堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、胰島素樣生長(zhǎng)因子、氫化可的松以及抗壞血酸。
16.一種用于由人類多能干細(xì)胞產(chǎn)生間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)系統(tǒng)，所述培養(yǎng)系統(tǒng)包含 a)培養(yǎng)人類多能干細(xì)胞并選擇培養(yǎng)14天的胚胎體； b)使所述胚胎體附著到組織培養(yǎng)皿并通過使用含有胎牛血清的杜爾伯科改良伊格爾培養(yǎng)基培養(yǎng)基培養(yǎng)所述胚胎體，從而誘導(dǎo)所述胚胎體分化為間充質(zhì)干細(xì)胞；以及 c)通過使用含有人表皮生長(zhǎng)因子、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子、人堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、胰島素樣生長(zhǎng)因子、氫化可的松以及抗壞血酸的培養(yǎng)基維持并以增殖性方式培養(yǎng)所述間充質(zhì)干細(xì)胞。
全文摘要
本發(fā)明涉及提供由人類多能干細(xì)胞產(chǎn)生間充質(zhì)干細(xì)胞的方法，所述方法包含以下步驟a)由人類多能干細(xì)胞形成胚胎體；b)使所述胚胎體附著到培養(yǎng)皿以誘導(dǎo)所述胚胎體自然分化為間充質(zhì)干細(xì)胞；以及增殖c)執(zhí)行所述間充質(zhì)干細(xì)胞的連續(xù)增殖性培養(yǎng)，同時(shí)仍維持所述間充質(zhì)干細(xì)胞的一致性。此外，本發(fā)明涉及提供用于誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞分化的標(biāo)準(zhǔn)化方法，不管其遺傳背景差異如何，都可廣泛應(yīng)用于所有人類多能干細(xì)胞。最終，本發(fā)明可通過使用人類多能干細(xì)胞以連續(xù)方式大規(guī)模生產(chǎn)再生醫(yī)學(xué)和干細(xì)胞治療所必需的間充質(zhì)干細(xì)胞。因此，可從而實(shí)現(xiàn)細(xì)胞治療產(chǎn)品的實(shí)際用途，且進(jìn)一步來說，本發(fā)明預(yù)計(jì)大大有助于對(duì)例如心血管病和神經(jīng)障礙等不易治療病癥的治療。
文檔編號(hào)C12N5/02GK102686724SQ200980163164
公開日2012年9月19日 申請(qǐng)日期2009年10月28日 優(yōu)先權(quán)日2009年10月27日
發(fā)明者姜炫在, 樸永培, 李銀珠, 金孝洙 申請(qǐng)人:財(cái)團(tuán)法人首爾大學(xué)校產(chǎn)學(xué)協(xié)力團(tuán)