專利名稱：一種奶山羊weaver基因的單核苷酸多態(tài)性及其檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及奶山羊單核苷酸多態(tài)性(SNP)分子標(biāo)記的篩查和檢 測(cè)，特別涉及一種奶山羊weaver基因的單核苷酸多態(tài)性及其檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
羊奶具有很高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，不含過(guò)敏原，營(yíng)養(yǎng)成分均衡，易消化吸收，與人乳蛋白 質(zhì)組成相似，在國(guó)際營(yíng)養(yǎng)界被譽(yù)為“奶中之王”。但是，我國(guó)羊奶的生產(chǎn)同發(fā)達(dá)國(guó)家相比差距 巨大，主要是因?yàn)槲覈?guó)優(yōu)秀奶山羊品種種源不足和種群遺傳品質(zhì)較差。應(yīng)用分子標(biāo)記的現(xiàn)代育種技術(shù)是加快良種選育和提高種群遺傳品質(zhì)，從而增加奶 山羊的產(chǎn)奶量和改善乳品質(zhì)的先進(jìn)的有效的方法。應(yīng)用分子標(biāo)記育種首先是在DNA水平上 篩查和檢測(cè)與奶山羊泌乳性狀密切相關(guān)的遺傳標(biāo)記，其次是建立其基因多態(tài)性的快速檢測(cè) 方法；然后實(shí)現(xiàn)遺傳標(biāo)記輔助選擇和實(shí)現(xiàn)早期診斷選擇近年來(lái)，人們發(fā)展了許多用于探尋分子遺傳標(biāo)記的方法，最常見(jiàn)的有單鏈構(gòu)象多 態(tài)技術(shù)(SSCP)、PCR-RFLP和直接測(cè)序技術(shù)等，但SSCP操作繁瑣、耗時(shí)長(zhǎng)，結(jié)果易造成誤判； 普通的PCR-RFLP方法要求待測(cè)多態(tài)性位點(diǎn)是某一特定酶切位點(diǎn)，應(yīng)用范圍局限；直接測(cè)序 技術(shù)成本較高。在哺乳動(dòng)物中，weaver基因編碼G蛋白偶聯(lián)內(nèi)向整流鉀通道蛋白的亞單元，屬于 內(nèi)向整流鉀通道四個(gè)亞家族中的一員，在各種組織中廣泛分布，特別在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中與 多種受體偶聯(lián)。Weaver基因在腦、心、腎和分泌細(xì)胞功能執(zhí)行過(guò)程中扮演著非常重要的角 色，同時(shí)它也間接地調(diào)控生長(zhǎng)激素和胰島素的分泌。奶牛的weaver綜合癥是奶牛品種中存的一種常染色體單隱性基因控制的遺傳 缺陷。但一些研究表明，weaver基因與奶牛產(chǎn)奶性狀存在顯著的相關(guān)。Hoeschele和 Meinert報(bào)道攜帶weaver癥狀的母牛的平均產(chǎn)奶量較正常純合子高673. 6Kg，乳脂率高 26. OKg(Hoeschele IiMeinert TR. Association of geneticdefects with yield and type traits :The weaver locus effect on yield. J Dairy Sci，1990，73 :2503_2515·)。單雪 松等研究表明，該基因的BMS2321和TGLA116微衛(wèi)星位點(diǎn)對(duì)乳蛋白量、乳蛋白率的影響分別 達(dá)到0. 01的極顯著水平和0. 05的顯著水平(單雪松，張沅，李寧.奶牛微衛(wèi)星基因座與產(chǎn) 奶性能關(guān)系的研究· 2002，29 (5) =430-433.)。而對(duì)同源動(dòng)物奶山羊的產(chǎn)奶性狀的基因研究來(lái)說(shuō)，奶山羊weaver基因的分子遺 傳變異特性的基礎(chǔ)研究，不僅有利于遺傳缺陷的控制，還有助于探明奶山羊產(chǎn)奶性狀的遺 傳基礎(chǔ)，從而進(jìn)一步探尋應(yīng)用分子遺傳標(biāo)記輔助選擇來(lái)提高奶山羊生產(chǎn)性能的方法。但至 今，weaver綜合癥的分子遺傳機(jī)制在奶山羊中的研究國(guó)內(nèi)外都沒(méi)有報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明解決的問(wèn)題在于利用DNA池測(cè)序的方法篩查奶山羊weaver基因的目的DNA 序列的多態(tài)性，尋找與奶山羊泌乳性狀相關(guān)的SNP作為分子標(biāo)記，提供一種奶山羊weaver基因的單核苷酸多態(tài)性及其檢測(cè)方法，以此作為奶山羊分子育種和標(biāo)記輔助選擇的分子遺 傳標(biāo)記，加快良種選育速度。本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)一種奶山羊weaver基因的單核苷酸多態(tài)性，其基因多態(tài)性包括在奶山羊的weaver基因第99045位為T或C的堿基多態(tài)性；在奶山羊的weaver基因第99116位為T或C的堿基多態(tài)性。上述奶山羊weaver基因的單核苷酸多態(tài)性的檢測(cè)方法為以包含weaver基因的 待測(cè)奶山羊全基因組DNA為模板，以引物對(duì)P為引物，PCR擴(kuò)增奶山羊weaver基因；所述的引物對(duì)P為正向弓|物:gcatccaaga gtttccctg19 ；反向弓丨物:cttcacctca cctgggtcct gtaagc 26 ；用限制性內(nèi)切酶TaqI消化PCR擴(kuò)增產(chǎn)物之后，再對(duì)酶切后的片段進(jìn)行瓊脂糖凝膠 電泳，根據(jù)瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果鑒定奶山羊的weaver基因第99045位的堿基多態(tài)性；用限制性內(nèi)切酶Hhal消化PCR擴(kuò)增產(chǎn)物之后，再對(duì)酶切后的片段進(jìn)行瓊脂糖凝膠 電泳，根據(jù)瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果鑒定奶山羊的weaver基因第99116位的堿基多態(tài)性。所述的PCR擴(kuò)增的反應(yīng)程序?yàn)?4°C預(yù)變性5min ；94°C變性30s，56°C退火30s， 72°C延伸30s，35個(gè)循環(huán)；72°C延伸lOmin。所述的瓊脂糖凝膠的質(zhì)量濃度為3.0%。所述的根據(jù)瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果鑒定奶山羊的weaver基因第99045位的堿基多 態(tài)性為TT基因型表現(xiàn)為173bp條帶；TC基因型表現(xiàn)為173，98和75bp條帶；CC基因型表 現(xiàn)為98和75bp條帶。所述的根據(jù)瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果鑒定奶山羊的weaver基因第99116位的堿基多 態(tài)性為TT基因型表現(xiàn)為173bp條帶；TC基因型表現(xiàn)為173，148和25bp條帶；CC基因型表 現(xiàn)為148和25bp條帶。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明把DNA池測(cè)序篩查SNP與CRS-RFLP結(jié)合起來(lái)解決了 SSCP 的不穩(wěn)定性和普通RFLP的局限性，提供了一種用簡(jiǎn)單、快速、低成本、精確度高的，便于推 廣應(yīng)用的在DNA水平上篩查和檢測(cè)與奶山羊泌乳性狀密切相關(guān)的遺傳標(biāo)記，可用于奶山羊 的分子育種。本發(fā)明根據(jù)weaver基因的保守序列設(shè)計(jì)引物，分別以4種山羊品種的基因組DNA 池為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并對(duì)PCR產(chǎn)物純化，測(cè)序后得到如SEQ ID NO. 1的奶山羊的weaver 基因的部分序列。其中，在SEQ ID NO. 1中1-172位是部分內(nèi)含子4 ； 173-498位是外顯子 5 ；498-1212位是3端側(cè)翼區(qū)。在第912位、第983位存在SNP多態(tài)性。針對(duì)上述兩個(gè)SNP多態(tài)性，本發(fā)明還公開(kāi)了其篩查和檢測(cè)方法，通過(guò)設(shè)計(jì)特定的 引物PCR擴(kuò)增特定的限制性內(nèi)切酶RFLP鑒定，能夠簡(jiǎn)單、快速、成本低、精確的檢測(cè)其單核 苷酸的多態(tài)性。本發(fā)明對(duì)上述兩個(gè)SNP進(jìn)行了與產(chǎn)奶量的關(guān)聯(lián)分析，對(duì)2個(gè)奶山羊品種和2個(gè)絨 山羊樣品的SNP基因型進(jìn)行了檢測(cè)和基因頻率分析，結(jié)果表明兩個(gè)位點(diǎn)聯(lián)合檢測(cè)能夠成為 絨山羊與奶山羊的區(qū)分特征；對(duì)TaqI和Hhal多態(tài)位點(diǎn)與莎能奶山羊各胎泌乳量之間的方差分析表明，TaqI識(shí)別的SNP位點(diǎn)能夠成為提高奶山羊第一胎產(chǎn)奶量的分子標(biāo)記。


圖1是本發(fā)明的技術(shù)流程示意圖；圖2是本發(fā)明中PCR克隆篩選到的奶山羊weaver基因的99045位C-T突變的SNP 多態(tài)性測(cè)序結(jié)果圖；圖3是本發(fā)明中PCR克隆篩選 到的奶山羊weaver基因的99116位C-T突變的SNP 多態(tài)性測(cè)序結(jié)果圖；圖4是本發(fā)明用來(lái)檢測(cè)SNP多態(tài)性的PCR引物設(shè)計(jì)和擴(kuò)增產(chǎn)物中SNP位點(diǎn)突變的 示意圖，其中方框中表示突變位點(diǎn)、帶波浪下劃線為內(nèi)切酶識(shí)別序列，小寫(xiě)“g”是引入的錯(cuò) 配堿基；圖5是本發(fā)明多態(tài)性檢測(cè)的PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖譜，其中瓊脂糖凝膠濃度 為 1.0% ；圖6是本發(fā)明中奶山羊weaver基因第99045位的TaqI-RFLP的三種基因型電泳 結(jié)果，瓊脂糖凝膠濃度為3. 0% ；其中，T1T2基因型表現(xiàn)為173，98和75bp條帶，T1T1基因型 表現(xiàn)為98和75bp條帶，T2T2基因型表現(xiàn)為173bp條帶；圖7是本發(fā)明中奶山羊weaver基因3端側(cè)翼區(qū)的Hhal-CRS-RFLP的三種基因型 電泳結(jié)果，瓊脂糖凝膠濃度3. 0% ；其中，H1H2基因型表現(xiàn)173，148和25bp條帶，H1H1基因 型表現(xiàn)為148和25bp條帶，H2H2基因型表現(xiàn)為173bp條帶；由于25bp較小，故在瓊脂糖電 泳分析中看不到，但不影響判別基因型。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明根據(jù)weaver基因的保守序列設(shè)計(jì)引物，分別以4種山羊品種的基因組DNA 池為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并對(duì)PCR產(chǎn)物純化，測(cè)序后得到如SEQ ID NO. 1的奶山羊的weaver 基因的部分序列。其中，在SEQ ID NO. 1中1-172位是部分內(nèi)含子4 ； 173-498位是外顯子 5;498-1212是3端側(cè)翼區(qū)。在第912位、第983位存在SNP多態(tài)性。下面對(duì)本發(fā)明做詳細(xì) 說(shuō)明，所述是對(duì)本發(fā)明的解釋而不是限定。a、山羊weaver基因部分DNA序列的克隆及其多態(tài)性的檢測(cè)1、山羊血樣的采集及處理取山羊血樣10mL，加入0. 5mol/L的EDTA 500 μ L抗凝，緩慢顛倒3次后放入冰 盒，-80°C保存?zhèn)溆?。本發(fā)明采用了 4種山羊品種，包括2中奶山羊和絨山羊，具體為1)關(guān)中奶山羊血樣440份采自陜西省西安市三原塔南保種場(chǎng)；2)薩能奶山羊血樣268份采自陜西省寶雞市千陽(yáng)縣薩能奶山羊繁育中心(201 份)和西北農(nóng)林科技大學(xué)奶山羊場(chǎng)(67份)；3)陜北白絨山羊血樣192份采自陜西省橫山縣陜北白絨山羊種羊場(chǎng)；4)新疆白絨山羊血樣119份采自新疆維吾爾自治區(qū)烏魯木齊地區(qū)；2、血樣基因組DNA的提取(1)將冷凍血樣室溫解凍，轉(zhuǎn)移500 μ L至1. 5mL Eppendorf管，加入等體積PBS緩沖液，充分混勻，12000r/min離心IOmin (4°C )，棄去上清液，重復(fù)上述步驟至上清液透明、
沉淀呈淡黃色。(2)在離心管中加入DNA抽提緩沖液500 μ L，搖動(dòng)，使血細(xì)胞沉淀脫離離心管管 壁，37°C水浴Ih0 DNA抽提緩沖液的配制0. 6057g的Tris、18. 612g的EDTA和2. 5g的SDS 加超純水500mL，滅菌、調(diào)pH至8. 0。4°C保存?zhèn)溆谩?3)加蛋白酶K 3yL(20mg/mL)并混勻，55°C過(guò)夜至澄清，尚未澄清者，可補(bǔ)加 ι μ L蛋白酶κ混勻繼續(xù)消化至澄清。(4)將反應(yīng)液冷卻至室溫，加Tris-飽和酚500 μ L，溫和搖動(dòng)離心管20min，使其充 分混勻；4°C，12000r/min離心lOmin，將上清液轉(zhuǎn)入另一 1. 5mL離心管中，重復(fù)一次。(5)加氯仿500 μ L，充分混勻20min，4°C，12000r/min離心lOmin，將上清液轉(zhuǎn)入另 一 1. 5mL離心管中。(6)加0. 1倍體積的NaAc緩沖液及2倍體積的冰冷的無(wú)水乙醇，混合轉(zhuǎn)動(dòng)離心管 直至白色的絮狀沉淀析出，_20°C保存30 60min。(7)4°C，12000r/min離心lOmin，棄去上清液，用70 %的冰冷乙醇漂洗DNA沉淀2次。(8) 40C，12000r/min離心lOmin，棄去上清液，室溫下使乙醇揮發(fā)干凈。(9)干燥后的DNA溶于80 100 μ L的TE-緩沖液或超純水，4°C保存直至DNA完 全溶解，0. 8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其質(zhì)量，-80°C保存。3、DNA池的構(gòu)建用紫外光光度計(jì)測(cè)定DNA樣品在260歷、280歷處的OD值。計(jì)算DNA含量和OD26tl/ OD280的比值。如0D26(i/0D28(i比值小于1. 6，說(shuō)明樣品中含有較多的蛋白質(zhì)或酚，則應(yīng)進(jìn)行純 化；若比值大于1. 8，則應(yīng)該考慮去除RNA純化。DNA 濃度(ng) = 50 X OD260 值 X 稀釋倍數(shù)DNA檢測(cè)完畢后，取出一定的量稀釋至50ng/μ L，然后從關(guān)中奶山羊品種30個(gè)濃 度為50ng/ μ L DNA樣品中取10 μ L混合構(gòu)建成品種DNA池；按照同樣的方法也構(gòu)建薩能奶山羊、陜北白絨山羊、新疆白絨山羊品種DNA池。4、擴(kuò)增引物設(shè)計(jì)由于山羊weaver基因的序列至今未知，故從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中(http://www.ncbi. nlm. nih. gov/)獲得同源動(dòng)物牛的GenBank登錄號(hào)為NW_001493808的weaver基因DNA 序列，以該基因序列保守區(qū)序列為參考利用Primer 5. O設(shè)計(jì)山羊weaver基因3端側(cè)翼區(qū) 1212bp片段的PCR引物對(duì)，其引物對(duì)序列如下正向弓丨物tctgttcctc cctgttac 18;反向弓I物:tcagaacaga aatgcctact 20。5、PCR克隆山羊的weaver基因分別以4個(gè)山羊品種的DNA池為模版，用上述設(shè)計(jì)的引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR總 反應(yīng)體系為25 μ L，見(jiàn)表1 ；PCR總反程序，見(jiàn)表2。表1本發(fā)明的PCR反應(yīng)體系 表2PCR反應(yīng)程序 6、PCR產(chǎn)物純化和測(cè)序PCR擴(kuò)增完成之后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，然后進(jìn)行PCR產(chǎn)物的切膠回收及純化在
紫外燈下從瓊脂糖凝膠上切下含目的片段的凝膠，放入1. 5mL離心管中，然后用PCR產(chǎn)物回
收純化試劑盒(北京天根生物公司)純化PCR產(chǎn)物，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，具體步驟如
下1)首先向吸附柱中加入500 μ L平衡液BL，12000rpm離心1分鐘，倒掉收集管中的
廢液，將吸附柱重新放回收集管中。2)將單一的目的DNA條帶從瓊脂糖凝膠中切下放入干凈的離心管中，稱取重量。3)向膠塊中加入等體積溶液PC，60°C水浴放置10分鐘左右，其間不斷溫和地上下
翻轉(zhuǎn)離心管，以確保膠塊充分溶解。4)將上一步所得溶液加入一個(gè)吸附柱中，12000rpm離心1分鐘，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放入收集管中。5)向吸附柱中加入700 u L漂洗液，12000rpm離心1分鐘，倒掉廢液，將吸附柱重
新放入收集管中。6)向吸附柱中加入500 u L漂洗液，12000rpm離心1分鐘，倒掉廢液，將離心吸附 柱放入收集管中，12000rpm離心2分鐘，盡量除去漂洗液。將吸附柱置于室溫或50°C溫箱 數(shù)分鐘，徹底晾干。7)將吸附柱放到一個(gè)干凈的離心管中，向吸附膜中間位置懸空滴加適量的洗脫緩 沖液，室溫放置2分鐘。12000rpm離心1分鐘收集DNA溶液。8)為了提高DNA的回收量，可將離心得到的溶液重新加回離心吸附柱中，重復(fù)步 馬聚7 o把以四個(gè)品種DNA池為模板的PCR純化產(chǎn)物送上海生物工程有限公司進(jìn)行雙向測(cè) 序。山羊weaver基因目的片段1212bp的測(cè)序結(jié)果如SEQ ID NO. 1所示。對(duì)測(cè)序峰圖進(jìn)行分析，其中在同一位點(diǎn)有兩個(gè)不同峰的是發(fā)生了單核苷酸突變； 如圖2左起第4個(gè)位點(diǎn)、圖3所左起第4個(gè)位點(diǎn)均為發(fā)生了單核苷酸的突變，出現(xiàn)了 C、T兩 種檢測(cè)結(jié)果，即本發(fā)明篩查到了奶山羊weaver基因的2個(gè)SNP多態(tài)性，分別為在奶山羊 的weaver基因第99045位(SEQ IDN0. 1第912位)為T或C的堿基多態(tài)性，在第99116位 (SEQ ID NO. 1第983位)為T或C的堿基多態(tài)性。奶山羊weaver基因第99045位點(diǎn)由C突變?yōu)門，稱為> T2突變；第99116位點(diǎn) 由C突變?yōu)門，稱為氏> H2突變。b、奶山羊weaver基因> T2突變和氏> H2突變多態(tài)性的PCR-RFLP檢測(cè)當(dāng)?shù)?9045位點(diǎn)發(fā)生> T2突變時(shí)，即C突變?yōu)門，原來(lái)的TaqI限制性內(nèi)切酶識(shí) 別序列TCGA也相應(yīng)地變成TTGA，從而破壞了 TaqI限制性內(nèi)切酶識(shí)別序列；在99116位點(diǎn) 無(wú)論發(fā)生& > H2突變與否，與周圍的其他序列都不能形成內(nèi)切酶識(shí)別序列，這時(shí)需要通過(guò) 引物引入錯(cuò)配，使得引物3端和此處的突變型“HI”即“C”在PCR擴(kuò)增后形成一個(gè)Hhal限 制性內(nèi)切酶識(shí)別序列GCGC，這樣當(dāng)?shù)?9116位點(diǎn)發(fā)生氏> H2突變時(shí)，即C突變?yōu)門，內(nèi)切酶 識(shí)別序列GCGC相應(yīng)變成GTGC，從而破壞了 Hhal限制性內(nèi)切酶識(shí)別序列。1、RFLP-PCR 弓丨物設(shè)計(jì)針對(duì)SEQ ID NO. 1包含的第912位的> T2突變，利用Primer 5. 0進(jìn)行發(fā)計(jì)引 物，引物設(shè)計(jì)如圖4所示，上游的正向引物設(shè)計(jì)為gcatccaaga gtttccctg 19 ；針對(duì)SEQ ID NO. 1包含的第983位的氏> H2突變，利用引入酶切位點(diǎn)在線設(shè)計(jì)軟 件(http://helix, wustl. edu/dcaps/dcaps. html)進(jìn)行設(shè)計(jì)引物，引物設(shè)計(jì)如圖4所示，下 游的反向引物設(shè)計(jì)為cttcacctca cctgggtcct gtaaGc 26 ；G為引入錯(cuò)配的堿基，它與突變型“C”形成Hhal內(nèi)切酶識(shí)別序列；上述引物能夠擴(kuò)增了山羊weaver基因3端側(cè)翼區(qū)173bp片段，其擴(kuò)增的序列如圖 4所示，其中畫(huà)框表明的兩處“C > T”即為SNP多態(tài)性位點(diǎn)。2、PCR反應(yīng)條件PCR產(chǎn)物擴(kuò)增體系和反應(yīng)條件分別如前面表1和表2所述，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的1. 0%瓊脂糖凝膠電泳圖譜如圖5所示，可以清晰的看到173bp的條帶。3、PCR產(chǎn)物酶切及RFLP檢測(cè)對(duì)于PCR擴(kuò)增后的產(chǎn)物首先分別進(jìn)行TaqI酶切和HhaI酶切，然后根據(jù)電泳結(jié)果 判定其SNP多態(tài)性。20μ L 的 TaqI 酶切體系為10μ L PCR 產(chǎn)物，10 XBuffer (含 BSA) 2. 0 μ L， TaqI (IOU/ μ L) 1. 0 μ L，8. 0 μ L滅菌雙蒸水。將樣品混勻后離心，65°C水浴5小時(shí)，3. 0%的 瓊脂糖凝膠，120V電壓電泳1. 5小時(shí)，EB染色檢測(cè)酶切結(jié)果，用Kodak DC 120凝膠成像分 析系統(tǒng)照相分析，并判型、記錄其基因型；由于PCR擴(kuò)增的173bp片段中不包含其它的TaqI 酶切識(shí)別位點(diǎn)，因此與突變型“C”形成的酶切位點(diǎn)后，酶會(huì)將PCR擴(kuò)增片段切為兩個(gè)片段。20μ L 的 HhaI 酶切體系為10μ L PCR 產(chǎn)物，10 XBuffer (含 BSA) 2. 0 μ L， HhaI (IOU/ μ L)為1. 0 μ L，8. 0 μ L滅菌雙蒸水。將樣品混勻后離心，37°C水浴5小時(shí)，3. 0% 的瓊脂糖凝膠，120V電壓電泳1.5小時(shí)，EB染色檢測(cè)酶切結(jié)果，用Kodak DC 120凝膠成像分 析系統(tǒng)照相分析，并判型、記錄其基因型；由于PCR擴(kuò)增的173bp片段中不包含其它的TaqI 酶切識(shí)別位點(diǎn)，因此突變型“C”形成的酶切位點(diǎn)后，酶會(huì)將PCR擴(kuò)增片段切為兩個(gè)片段。由于山羊?yàn)槎扼w動(dòng)物，當(dāng)發(fā)生T1 > T2突變時(shí)，可形成不同的基因型，分別為 T1Tp T1T2, T2T2(CC, TC、TT)；可以通過(guò)其酶切后的電泳圖來(lái)進(jìn)行判別，如圖6所示，其中各 個(gè)泳道從左到右依次為DNAMaker(其條帶分布由上到下依次為600、500、400、300、200、 IOObp)、T2T2, T1T2, T1T2, T1T1, T1T2, T1T1，其中純合子T2T2的兩條DNA鏈均不能被酶切，所以 表現(xiàn)為173bp的條帶；發(fā)生突變后的純合子T1T1的兩條鏈均能被酶切，所以表現(xiàn)為98bp和 75bp的條帶；雜合子T1T2的兩條鏈中的一條能夠被識(shí)別而另一條不能被識(shí)別，所以表現(xiàn)為 173,98和75bp三條帶；但是根據(jù)條帶的個(gè)數(shù)和條帶的大小，根據(jù)圖6能夠判定是否發(fā)生了 點(diǎn)突變，將三種基因型區(qū)分開(kāi)，從而檢測(cè)其SNP多態(tài)性。當(dāng)發(fā)生H1 > H2突變時(shí)，可能形成不同的基因型，分別為H1HpH1H^H2H2 (CC、TC、TT)， 可以通過(guò)其酶切后的電泳圖來(lái)進(jìn)行識(shí)別，如圖7所示，其中各個(gè)泳道從左到右依次為DNA Maker (其條帶分布由上到下依次為 600、500、400、300、200、IOObp)、H2H2、H1H1、H1H1、H1H2、 H1H2, H2H2，其中純合子H2H2的兩條DNA鏈均不能被酶切，所以表現(xiàn)為173bp的條帶；發(fā)生突 變后的純合子H1H1的兩條鏈均能被酶切，所以表現(xiàn)為148和25bp的條帶，但是由于25bp條 帶太小在電泳成像上沒(méi)有顯示；雜合子H1H2的兩條鏈中的一條能夠被識(shí)別而另一條不能被 識(shí)別，所以表現(xiàn)為173、148和25bp三條帶，其中25bp的條帶在圖7沒(méi)有顯示；但是根據(jù)條 帶的個(gè)數(shù)和條帶的大小，根據(jù)圖7能夠判定是否發(fā)生了點(diǎn)突變，將三種基因型區(qū)分開(kāi)，從而 檢測(cè)其SNP多態(tài)性。C、本發(fā)明制備的分子標(biāo)記在不同山羊群體多態(tài)性中的診斷應(yīng)用1、群體多態(tài)性中的診斷利用上述的SNP多態(tài)性檢測(cè)方法對(duì)薩能奶山羊268份DNA樣品、關(guān)中奶山羊440 份DNA樣品、陜北白絨山羊192份樣品和新疆白絨山羊119份分別進(jìn)行TaqI_RFLP(圖6) 和HhaI-CRS-RFLP(圖7)的基因型的鑒定。2、SNP位點(diǎn)的頻率統(tǒng)計(jì)分析基因型頻率是指一個(gè)群體中某一性狀的某種基因型個(gè)體數(shù)占總個(gè)體數(shù)的比率。Paa =NAA/N，其中Paa代表某一位點(diǎn)的AA基因型頻率；Naa表示群體中具有AA基因型的個(gè)體數(shù)；N為檢測(cè)群體的總數(shù)量?；蝾l率是指一個(gè)群體中某一基因數(shù)對(duì)其等位基因總數(shù)的相對(duì)比率。計(jì)算的公式
可以寫(xiě)成PA = (2NM+NAal+NAa2+......+NAan)/2N。式中，Pa表示等位基因A頻率，Naa表示群
體中具有AA基因型的個(gè)體數(shù)量，NAai表示群體中具有Aai基因型個(gè)體數(shù)量，al-an為等位基 因A的η個(gè)不同的復(fù)等位基因。統(tǒng)計(jì)結(jié)果見(jiàn)表3。表3四個(gè)山羊品種中weaver基因兩個(gè)多態(tài)位點(diǎn)的基因型和等位基因頻率 從表3可以看出乳用品種(莎能奶山羊和關(guān)中奶山羊)的!~2和!12等位基因頻率 較絨用品種(內(nèi)蒙古白絨山羊和陜北白絨山羊)高，這表明等位基因!~2、!12可能與泌乳性狀 相關(guān)。在絨用品種(內(nèi)蒙古白絨山羊和陜北白絨山羊)中不存在T2T2和H2H2基因型，這表 明T2T2和H2H2基因型可以作為絨山羊與奶山羊區(qū)分特征。3、基因效應(yīng)的關(guān)聯(lián)分析基因型數(shù)據(jù)TaqI識(shí)別的基因型(T1T1、T1T2和T2T2)HhaI 識(shí)別的基因型(H1H, H1H2 和 H2H2)生產(chǎn)數(shù)據(jù)胎次(第一胎、第二胎和第三胎)和年產(chǎn)奶量關(guān)聯(lián)分析模型利用SPSS(16.0)軟件分析基因位點(diǎn)、公畜、產(chǎn)羔季節(jié)、年齡和胎次因素與泌乳性 狀的相關(guān)性。先對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行描述分析，確定是否存在離群值，再利用最小二乘分析對(duì)數(shù)據(jù)校 正；根據(jù)數(shù)據(jù)特征，利用多元線性模型分析基因型效應(yīng)。模型如下Yijkimn = μ +Genotype^Sj+LS^LN^Age^Xn+eij^其中yijklm為個(gè)體表型記錄；LN1胎次效應(yīng)而為種公畜效應(yīng)；LSk 產(chǎn)羔季節(jié)效應(yīng)；Agem為年齡效應(yīng)；Xn為各種二級(jí)和二級(jí)以上互作效應(yīng)，如AgeXGenotype，SjXGenotype 等；euklmn為隨機(jī)誤差；運(yùn)用SPSS (16. 0)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，并用最小二乘法擬合線性模 型，對(duì)各基因型間產(chǎn)奶量指標(biāo)進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)。結(jié)果表明(見(jiàn)表4)在HhaI可識(shí)別的SNP位點(diǎn)，三種基因型對(duì)這三胎的泌乳量影 響均不顯著(P > 0. 05)；在TaqI可識(shí)別的SNP位點(diǎn)，對(duì)于第一胎T2T2和T1T2基因型個(gè)體的 泌乳量高于T1T1基因型個(gè)體且差異顯著(P < 0. 05)。三種基因型對(duì)第二、三胎的泌乳量影 響差異不顯著(P > 0. 05)，但T2T2和T1T2基因型個(gè)體的泌乳量略高于T1T1基因型個(gè)體的泌 乳量。說(shuō)明T2T2基因型可以成為一個(gè)提高奶山羊產(chǎn)奶量的分子遺傳標(biāo)記。表4TaqI和HhaI多態(tài)位點(diǎn)與莎能奶山羊各胎泌乳量之間的方差分析(kg) 注具有相同字母表示差異不顯著(P >0.05)，字母不同表示差異顯著(P < 0. 05)。核苷酸序列表<110>西北農(nóng)林科技大學(xué)<120> 一種奶山羊weaver基因的單核苷酸多態(tài)性及其檢測(cè)方法<210>1<211>1212<212>DNA<213> 奶山羊(Capra hircus)<220><221>y<222>(912,983)<400>1tctgttcctc cctgttacaa cagcctatgc aggtcacagt ctcaacacta cacgcagcag 60tactgcccag ctccctgagc ccccagtcag tgggaagcct gcacgtacgc acgtgtgcac 120acacacacac acacacacac acgcactaat ccttctactc tcctctctgc agggatgacg 180tgccaagctc gaagctccta catcaccagt gagatcctct gggggtaccg attcacgcct 240gtcctgacgc tggaggacgg gttctacgaa gttgactaca acagcttcca tgagacctac 300
gagaccagcaccccatctctcagcgccaaagagctggccgagttagccagcagggccgag360
ctgcccctgagctggtctgtctccagtaaactcaaccaacacgcagaactggagactgag420
gaggaggaaaagaaccctgaggagcagacggagagaaatggtgacgtggcaaacctagag480
aatgaatccaaagtttagtccccgggcccggggccgccccttctcctctccaacccccac540
cccccacccccgcaaccctgccttgtctctcattctctttcttgtctgtctgttactctg600
ttctttccttatatttcagtttggcattaccaggaaacaaatcttcaaggtgtaaaatat660
ctacctgccctctcagttagttcagattgacgaggtagcttgcagattgggttaaggcgt720
catatgccctcttttgtggtcccagcgtggtctcctcccgggatagagcacatctgacta780
gagatttacgctactcccttgcatgtgttgtaaaatagcagatcgctcaaaagggtgcat840
ccaagagtttccctgggatgtgacgaggaaggtctctggtgcctattcattcacgcagtg900
agacatggagtygagccctctgttttacacatctcaataaatttcatccacggggcgagg960
tgcttgccctctgtgggcattgyggttacaggacccaggtgaggtgaagacaaaaccctg1020
tacatatatatgccttatgtaattatcttcttttgcagttagtaacgaaacccagcatgt1080
acaaaagtgctgtagaacacaactgctaaatactgtacataggtgtaagatcaatgtagg1140
tttagatatataactagaaataagatcgacgaaaaaatgatccccaaagtacagtaggca1200
tttctgttctga121權(quán)利要求
一種奶山羊weaver基因的單核苷酸多態(tài)性，其特征在于，其基因單核苷酸多態(tài)性包括在奶山羊的weaver基因第99045位為T或C的堿基多態(tài)性；在奶山羊的weaver基因第99116位為T或C的堿基多態(tài)性。
2.權(quán)利要求1所述奶山羊weaver基因的單核苷酸多態(tài)性的檢測(cè)方法，其特征在于，包 括以下步驟以包含weaver基因的待測(cè)奶山羊全基因組DNA為模板，以引物對(duì)P為引物，PCR擴(kuò)增 奶山羊weaver基因；所述的引物對(duì)P為正向弓I物:gcatccaaga gtttccctg19 ；反向弓I物:cttcacctca cctgggtcct gtaagc 26 ；用限制性內(nèi)切酶TaqI消化PCR擴(kuò)增產(chǎn)物之后，再對(duì)酶切后的片段進(jìn)行瓊脂糖凝膠電 泳，根據(jù)瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果鑒定奶山羊的weaver基因第99045位的堿基多態(tài)性；用限制性內(nèi)切酶Hhal消化PCR擴(kuò)增產(chǎn)物之后，再對(duì)酶切后的片段進(jìn)行瓊脂糖凝膠電 泳，根據(jù)瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果鑒定奶山羊的weaver基因第99116位的堿基多態(tài)性。
3.如權(quán)利要求2所述的奶山羊weaver基因的單核苷酸多態(tài)性的檢測(cè)方法，其特征在 于，所述的PCR擴(kuò)增的反應(yīng)程序?yàn)?4°C預(yù)變性5min ；94°C變性30s，56°C退火30s，72°C延 伸30s，35個(gè)循環(huán)；72°C延伸lOmin。
4.如權(quán)利要求2所述的奶山羊weaver基因的單核苷酸多態(tài)性的檢測(cè)方法，其特征在 于，所述的瓊脂糖凝膠的質(zhì)量濃度為3. 0%。
5.如權(quán)利要求2所述的奶山羊weaver基因的單核苷酸多態(tài)性的檢測(cè)方法，其特征在 于，所述的根據(jù)瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果鑒定奶山羊的weaver基因第99045位的堿基多態(tài)性 為TT基因型表現(xiàn)為173bp條帶；TC基因型表現(xiàn)為173，98和75bp條帶；CC基因型表現(xiàn)為 98和75bp條帶。
6.如權(quán)利要求2所述的奶山羊weaver基因的單核苷酸多態(tài)性的檢測(cè)方法，其特征在 于，所述的根據(jù)瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果鑒定奶山羊的weaver基因第99116位的堿基多態(tài)性 為TT基因型表現(xiàn)為173bp條帶；TC基因型表現(xiàn)為173，148和25bp條帶；CC基因型表現(xiàn)為 148和25bp條帶。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種奶山羊weaver基因的單核苷酸多態(tài)性及其檢測(cè)方法，其基因多態(tài)性包括在奶山羊的weaver基因第99045位為T或C的堿基多態(tài)性；在奶山羊的weaver基因第99116位為T或C的堿基多態(tài)性。上述奶山羊weaver基因的單核苷酸多態(tài)性為以包含weaver基因的待測(cè)奶山羊全基因組DNA為模板，以引物對(duì)P為引物，PCR擴(kuò)增奶山羊weaver基因；用限制性內(nèi)切酶消化PCR擴(kuò)增產(chǎn)物之后，再對(duì)酶切后的片段進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，根據(jù)瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果鑒定奶山羊的單核苷酸多態(tài)性。該方法是一種在DNA水平上篩查和檢測(cè)與奶山羊泌乳性狀密切相關(guān)的分子遺傳標(biāo)記，可用于奶山羊的分子育種。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK101871006SQ20101000363
公開(kāi)日2010年10月27日 申請(qǐng)日期2010年1月5日 優(yōu)先權(quán)日2010年1月5日
發(fā)明者劉艷麗, 屈玉嬌, 李轉(zhuǎn)見(jiàn), 胡沈榮, 藍(lán)賢勇, 陳宏 , 陳忠琦, 雷初朝, 馬亮 申請(qǐng)人:西北農(nóng)林科技大學(xué)