專利名稱：一種豬羊水干細(xì)胞系的建立及檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種細(xì)胞系的建立方法，尤其涉及一種豬羊水干細(xì)胞系的建立方法。
背景技術(shù)：
由于胚胎干細(xì)胞的研究受到倫理道德問(wèn)題的束縛與限制，很多研究者都在嘗試尋 找新的干細(xì)胞來(lái)源。2003年，Prusa等在羊水中發(fā)現(xiàn)0CT4陽(yáng)性細(xì)胞，表明羊水中可能存在 多能干細(xì)胞。2007年，Anthony等于Nature Biotechnology雜志上報(bào)道，他們找到了易于 獲得并有很強(qiáng)增殖能力的干細(xì)胞新來(lái)源。研究人員通過(guò)篩選并分離孕中期羊水中的CD117 陽(yáng)性細(xì)胞，得到少量具有胚胎干細(xì)胞特性的細(xì)胞。他們將這類細(xì)胞命名為羊水源干細(xì)胞 (Amniotic Fluid Stem Cell，AFS細(xì)胞)，包括胎兒皮膚、胎盤的羊膜、胎兒消化道、呼吸道、 泌尿生殖道的黏膜及上皮細(xì)胞。AFS細(xì)胞表達(dá)CD117表面標(biāo)記蛋白，該蛋白是干細(xì)胞因子 的細(xì)胞表面受體，在配子發(fā)生、黑素形成和造血細(xì)胞發(fā)生等過(guò)程中起重要作用。人胚胎干 細(xì)胞、原始生殖細(xì)胞和一些成體干細(xì)胞如神經(jīng)嵴細(xì)胞等，都表達(dá)⑶117表面標(biāo)記。實(shí)驗(yàn)結(jié)果 顯示，與ES細(xì)胞一樣，AFS細(xì)胞可在體外長(zhǎng)期培養(yǎng)，而普通的體細(xì)胞在體外只會(huì)存活一段時(shí) 間，隨后便會(huì)死亡。AFS細(xì)胞表達(dá)0ct4，且表達(dá)部分胚胎干細(xì)胞和成體干細(xì)胞標(biāo)記，因此，研 究人員認(rèn)為，AFS細(xì)胞處于ES細(xì)胞和成體干細(xì)胞的中間狀態(tài)。目前，已經(jīng)證實(shí)羊水來(lái)源的干細(xì)胞具有向多種細(xì)胞分化的能力例如采用地塞 米松、胰島素、異丁基甲基黃嘌呤和吲哚美辛誘導(dǎo)其分化為脂肪細(xì)胞；地塞米松、維生 素C-2-磷酸鹽導(dǎo)其分化為成骨細(xì)胞；地塞米松、維生素C-2-磷酸鹽、丙酮酸鈉、脯氨酸、 TGF-β等誘導(dǎo)其分化為軟骨細(xì)胞；成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子和巰基乙醇誘導(dǎo)其分化為神經(jīng) 系細(xì)胞，并證實(shí)了分化后的神經(jīng)細(xì)胞能夠分泌釋放多巴胺。臺(tái)灣學(xué)者Tsai等，通過(guò)兩步培養(yǎng)法成功地從孕中期羊水中通過(guò)貼壁培養(yǎng)分離出 具有多潛能間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)，具有神經(jīng)干細(xì)胞(neural stem cells,NSCs)的特性，在特定的誘導(dǎo)條件下可分化成脂肪細(xì)胞、成骨細(xì)胞及神經(jīng)細(xì)胞； 國(guó)內(nèi)學(xué)者李現(xiàn)鐸等，分離出MSCs并誘導(dǎo)成平滑肌和脂肪細(xì)胞。王晗學(xué)者等分離人的羊水 干細(xì)胞并誘導(dǎo)分化已得到類似于早期心肌細(xì)胞的分化細(xì)胞，表達(dá)α -actin, Tbx5、Nkx2. 5、 GATA4、α-MHC等心肌特異標(biāo)記基因。豬是我國(guó)重要經(jīng)濟(jì)動(dòng)物，而且是人類器官移植的最理想動(dòng)物，PAFS細(xì)胞醫(yī)學(xué)應(yīng)用 的優(yōu)勢(shì)在于它很容易獲取。研究結(jié)果表明，PAFS細(xì)胞既可從產(chǎn)前診斷的羊水中提取，也可 以從產(chǎn)后的羊水中分離得到，而且抽取羊水過(guò)程并不會(huì)損害母體。因此，豬羊水來(lái)源的干細(xì) 胞為組織工程提供了一個(gè)新的種子細(xì)胞來(lái)源。重要的一點(diǎn)是豬以及很多動(dòng)物的ES細(xì)胞至今尚未建系，而羊水細(xì)胞是接近于ES 細(xì)胞的一種干細(xì)胞。我們可以利用羊水細(xì)胞代替ES細(xì)胞開(kāi)展許多研究工作，為動(dòng)物的遺傳 育種，拯救頻危動(dòng)物提供了極大的便利。并在研究細(xì)胞分化機(jī)制、臨床治療、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物等 方面有著重要的意義。國(guó)內(nèi)關(guān)于羊水干細(xì)胞的研究剛剛起步，還存在大量空白，僅在人羊水細(xì)胞分離培養(yǎng)，研究進(jìn)展等方面見(jiàn)到零星報(bào)道。關(guān)于羊水中細(xì)胞的類型、不同類型細(xì)胞的分選及羊水細(xì) 胞的誘導(dǎo)分化等問(wèn)題，還有待于進(jìn)一步探索。關(guān)于豬的羊水干細(xì)胞的分離培養(yǎng)及定向誘導(dǎo) 分化研究，在國(guó)內(nèi)外均為見(jiàn)到報(bào)道，有很大的研究?jī)r(jià)值及研究前景。

發(fā)明內(nèi)容
為了解決背景技術(shù)中所存在的技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種快速、有效、安全、分 離豬羊水干細(xì)胞的方法，可為組織工程研究提供新的種子細(xì)胞來(lái)源以及有望作為種子細(xì)胞 從事科研和生產(chǎn)應(yīng)用。
本發(fā)明的技術(shù)解決方案是一種豬羊水干細(xì)胞系的建立方法，其特征在于該方 法包括以下步驟1)羊水干細(xì)胞的原代分離培養(yǎng)；2)將分離培養(yǎng)的原代羊水干細(xì)胞進(jìn)行機(jī)械分離純化；3)檢測(cè)并將分離純化后的羊水干細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，建立豬羊水干細(xì)胞系，其具體實(shí) 現(xiàn)方式是3. 1)待分離純化后的羊水干細(xì)胞長(zhǎng)至融合時(shí)，棄去培養(yǎng)液，用PBS洗2-3遍，然后 用0. 25%胰蛋白酶+0. 04% EDTA細(xì)胞消化液在38°C條件下消化3_4分鐘；3. 2)等量細(xì)胞培養(yǎng)液中止消化；3. 3)將經(jīng)過(guò)消化的羊水干細(xì)胞在1000r/min離心5_10分鐘；3.4)棄上清，調(diào)整細(xì)胞濃度為1. OX IO5個(gè)/ml將細(xì)胞懸液接到細(xì)胞培養(yǎng)皿上，力口 細(xì)胞培養(yǎng)液；3.5)連續(xù)培養(yǎng)4-8代后，上皮樣細(xì)胞逐漸減少消失，90%以上表現(xiàn)為成纖維樣細(xì) 胞，細(xì)胞大量擴(kuò)增，即建成羊水干細(xì)胞系。上述步驟1)的具體實(shí)現(xiàn)方式是1. 1)收集懷孕母豬的羊水，連同子宮帶回，無(wú)菌打開(kāi)子宮，分出由胎衣完整包裹的 羊水備用，測(cè)量胎兒的大小，詳細(xì)記錄，然后抽取羊水；1. 2)用100目濾紗過(guò)濾，以除去較大的組織碎片，然后2000r/min，離心lOmin，棄
上清，收集細(xì)胞。1. 3)將步驟2)中所收集的細(xì)胞加入含有5%血清+5%雙抗的PBS溶液中，混勻， 置38°C，5% C02培養(yǎng)箱中處理10分鐘，然后離心，收集細(xì)胞，重復(fù)3次。1. 4)將分離出的豬羊水細(xì)胞加入原代羊水細(xì)胞培養(yǎng)液接種于不同的培養(yǎng)皿中，置 于38°C、5% C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。上述原代羊水細(xì)胞培養(yǎng)液是α -MEM+15 % FBS+1 Ong BFGF+2mmo 1 /L谷胺酰胺 +100u/ml青霉素+100u/ml鏈霉素的培養(yǎng)液。上述步驟2)的具體實(shí)現(xiàn)方式是2. 1)將分離出的羊水細(xì)胞加入原代羊水細(xì)胞培養(yǎng)液三天后，觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況， 并記錄原代細(xì)胞貼壁時(shí)間及貼壁細(xì)胞數(shù)；2. 2)五天后觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，并半量換液；2. 3)在顯微鏡下用筆在培養(yǎng)皿上標(biāo)記出上皮樣細(xì)胞克隆的區(qū)域；2. 4)吸去培養(yǎng)液，用PBS洗1-2遍；
2. 5)用細(xì)胞刮刀將上皮樣細(xì)胞克隆刮掉，不要刮到成纖維樣克隆，然后補(bǔ)加培養(yǎng) 液，繼續(xù)培養(yǎng)；或者用細(xì)胞刮刀將成纖維樣克隆刮下，接到新的培養(yǎng)皿中，繼續(xù)培養(yǎng)。 上述步驟3. 4)中的細(xì)胞培養(yǎng)液是α -MEM+10% FBS+2mmol/L谷胺酰胺+100u/ml 青霉素+lOOu/ml鏈霉素的培養(yǎng)液。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是1、快速、有效、安全。本發(fā)明采用采用原代貼壁法和機(jī)械分離法，分離純化了豬羊 水干細(xì)胞，并建立一種快速、有效、安全的豬羊水干細(xì)胞分離方法。2.通過(guò)胚胎測(cè)量及后續(xù)細(xì)胞的培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)由4-8厘米的胎兒分離的羊水成功率最 高，并且細(xì)胞活性好。3、可實(shí)現(xiàn)了豬羊水干細(xì)胞體外長(zhǎng)期擴(kuò)增。依照本發(fā)明所提供的人羊水干細(xì)胞系的 建立方法，不需滋養(yǎng)層細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)了豬羊水干細(xì)胞體外長(zhǎng)期擴(kuò)增，已傳至22代，經(jīng)流式細(xì)胞 儀分析表明，分離的hAFS細(xì)胞傳至20代后核型正常，已凍存1 1. 5 X IO8個(gè)種子細(xì)胞，其 性能穩(wěn)定，遺傳性狀良好。并且經(jīng)免疫熒光、RT-PCR和流式細(xì)胞檢測(cè)表明，所分離的豬羊水 干細(xì)胞表達(dá)HLA-ABC，不表達(dá)HLA-DR ；表達(dá)ES細(xì)胞標(biāo)記基因Oct4、Nanog、和CD117、SSEA-4、 TRA-60.TRA-81 ；不表達(dá)SSEA-I ；表達(dá)間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志基因⑶90、⑶44等；不表達(dá)⑶34、⑶45、 ⑶54等造血細(xì)胞系標(biāo)志基因?？梢孕纬深惻唧w，并且類胚體堿性磷酸酶檢測(cè)陽(yáng)性，RT-PCR 分析表明具有分化為三胚層來(lái)源的各種細(xì)胞的潛能，體外可以誘導(dǎo)分化為脂肪細(xì)胞，神經(jīng) 細(xì)胞。體內(nèi)注射裸鼠分化實(shí)驗(yàn)，未形成畸胎瘤，說(shuō)明致瘤性低，與報(bào)道的人羊水干細(xì)胞一致。4、可為組織工程研究提供新的種子細(xì)胞來(lái)源。本發(fā)明根據(jù)建立細(xì)胞系的要求按細(xì) 胞系的定義成功的建立了豬羊水干細(xì)胞系，為今后干細(xì)胞研究開(kāi)辟了新方向，有望作為種 子細(xì)胞從事科研和生產(chǎn)應(yīng)用。5.豬的ES細(xì)胞至今尚未建系，羊水細(xì)胞是最接近ES細(xì)胞的一種細(xì)胞，可以代替 ES細(xì)胞進(jìn)行一些研究。


圖1 (a)是本發(fā)明的孕早期的胎兒形態(tài)圖；圖1 (b)是本發(fā)明的豬原代羊水細(xì)胞中的成纖維樣克隆50X ；圖1(c)是本發(fā)明的原代細(xì)胞中的上皮樣克隆50X ；圖1 (d)是本發(fā)明的pl2代豬羊水干細(xì)胞50X ；圖2(a)是本發(fā)明的p6代豬羊水干細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線圖；圖2(b)是本發(fā)明的p6代豬羊水干細(xì)胞的細(xì)胞周期圖；圖3 (a)是本發(fā)明的豬羊水干細(xì)胞0CT4陽(yáng)性200 X ；圖3 (b)是本發(fā)明的豬羊水干細(xì)胞Nanog陽(yáng)性200 X ；圖3 (C)是本發(fā)明的豬羊水干細(xì)胞SSEA-I陰性200 X ；圖3⑶是本發(fā)明的豬羊水干細(xì)胞SSEA-3陽(yáng)性200 X ；圖3 (E)是本發(fā)明的豬羊水干細(xì)胞Tra-60陽(yáng)性200 X ；圖3 (F)是本發(fā)明的豬羊水干細(xì)胞Tra-81陽(yáng)性200 X ；圖4(a)是本發(fā)明的豬羊水干細(xì)胞類胚體染色陽(yáng)性200X ；圖4(b)是本發(fā)明的豬羊水干細(xì)胞向脂肪誘導(dǎo)油紅O染色陽(yáng)性200X ；
圖4(c)是本發(fā)明的豬羊水干細(xì)胞向神經(jīng)誘導(dǎo)6h形態(tài)學(xué)觀察200X ；
具體實(shí)施例方式本發(fā)明提供了一種豬羊水干細(xì)胞系的建立方法，該方法包括以下步驟1、豬羊水干細(xì)胞的原代分離培養(yǎng)，分析哪個(gè)時(shí)期羊水細(xì)胞最好1)從屠宰場(chǎng)收集 懷孕母豬的羊水，連同子宮帶回實(shí)驗(yàn)室。先無(wú)菌打開(kāi)子宮，分出由胎衣完整包裹的羊水，測(cè) 量胎兒的大小，詳細(xì)記錄，然后用注射器抽取羊水。2)用100目濾紗過(guò)濾，以除去較大的組 織碎片，然后2000r/min，離心lOmin，棄上清，收集細(xì)胞。3)將所收集的細(xì)胞加入含有5% 血清+5%雙抗的PBS溶液中，混勻，置38°C ,5% CO2培養(yǎng)箱中處理10分鐘，然后離心，收集 細(xì)胞，重復(fù)3次。將分離出的豬羊水細(xì)胞根據(jù)羊水體積的大小加入原代羊水細(xì)胞培養(yǎng)液，該培養(yǎng)液 是 α -MEM+15% FBS+10ngBFGF+2mmol/L 谷胺酰胺+100u/ml 青霉素+100u/ml 鏈霉素的培養(yǎng)液。2、將分離培養(yǎng)的原代羊水干細(xì)胞進(jìn)行機(jī)械分離純化將分離出的豬羊水細(xì)胞培養(yǎng) 3天后，在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，并記錄原代細(xì)胞貼壁時(shí)間及貼壁細(xì)胞數(shù)；5天 后觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，并半量換液。待細(xì)胞出現(xiàn)上皮樣細(xì)胞克隆和成纖維樣細(xì)胞克隆，兩種 克隆分界明顯時(shí)，用機(jī)械分離法進(jìn)行分選1)在倒置顯微鏡下用筆在培養(yǎng)皿上標(biāo)記出上皮 樣細(xì)胞克隆的區(qū)域；2)吸去培養(yǎng)液，用PBS洗1-2遍；3)用消過(guò)毒的細(xì)胞刮刀將上皮樣細(xì)胞 克隆刮掉，在操作中不要刮到成纖維樣克隆，然后補(bǔ)加培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)?；蛘咭部梢杂眉?xì) 胞刮刀將成纖維樣克隆刮下，接到新的培養(yǎng)皿中，繼續(xù)培養(yǎng)，以上兩種方法都可以得到較純 的細(xì)胞克隆。4)可以重復(fù)上面的第3)步，如此反復(fù)，直到獲得成纖維樣克隆。3、檢測(cè)并進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，建立豬羊水干細(xì)胞系。具體實(shí)現(xiàn)方式是1)待細(xì)胞長(zhǎng)至 融合時(shí)，棄去培養(yǎng)液，用PBS洗2-3遍，然后用0. 25%胰蛋白酶+0. 04% EDTA細(xì)胞消化液 38°C消化3-4分鐘；2)等量細(xì)胞培養(yǎng)液中止消化，1000r/min離心5_10分鐘；3)棄上清， 調(diào)整細(xì)胞濃度為1. OX IO5個(gè)/ml將細(xì)胞懸液接到60培養(yǎng)皿上。加細(xì)胞培養(yǎng)液，成份為 α -MEM+10% FBS+2mmol/L谷胺酰胺+100u/ml青霉素+100u/ml鏈霉素；重復(fù)步驟3)，連續(xù) 培養(yǎng)4 8代后，上皮樣細(xì)胞逐漸減少消失，90%以上表現(xiàn)為成纖維樣細(xì)胞，細(xì)胞大量擴(kuò)增。參見(jiàn)圖1，用以上方法獲得的豬羊水干細(xì)胞，并穩(wěn)定傳代到22代，細(xì)胞形態(tài)沒(méi)有發(fā) 生改變。經(jīng)多次分離發(fā)現(xiàn)，孕早期(胎兒在3-5cm)時(shí)容易分離，且孕早期細(xì)胞比孕晚期的 活性強(qiáng)。對(duì)分離培養(yǎng)的羊水干細(xì)胞的進(jìn)一步檢測(cè)方法1、群體倍增時(shí)間的測(cè)定及細(xì)胞周期的檢測(cè)，測(cè)得本株豬羊水干細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線及 細(xì)胞周期；具體方法是 1)取p6代細(xì)胞，消化制成細(xì)胞懸液，接種于24孔板，每天抽取3孔進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)， 計(jì)算平均值，繪制生長(zhǎng)曲線，計(jì)算群體倍增時(shí)間，公式為TD = t X lg2/ (IgNt-IgNO)TD 細(xì)胞群體倍增時(shí)間；t 培養(yǎng)時(shí)間；NO 接種后的細(xì)胞數(shù)；Nt 培養(yǎng)t小時(shí)后的細(xì) 胞數(shù)。
2)取pl2代細(xì)胞消化制成懸液，離心收細(xì)胞，用70%的酒精固定過(guò)夜，200目紗布 過(guò)濾，加50ng/ul的PI上流式機(jī)檢測(cè)。參見(jiàn)圖2，豬羊水干細(xì)胞的群體倍增時(shí)間為34.07小時(shí)；P12代細(xì)胞Gl期為 42. 901，G2 期為 11. 121，S 期為 45. 978。根據(jù)細(xì)胞群體倍增時(shí)間及流式周期檢測(cè)得出，本株豬羊水干細(xì)胞增值較快，細(xì)胞 在多次傳代后仍具有較強(qiáng)的增值能力，同時(shí)細(xì)胞核型正常，沒(méi)有異倍體出現(xiàn)。2、PCR檢測(cè)特異性標(biāo)志基因，在RNA水平上檢測(cè)豬羊水干細(xì)胞的特異性標(biāo)志基因， 鑒定其是否具有胚胎干細(xì)胞的特性。具體方法是收集不同代次的豬羊水干細(xì)胞，離心，然后加入Iml Trizol，震蕩，室 溫處理5-10min，再加入0. 2ml氯仿，室溫處理5min，10000r/min，4°C離心lOmin，此時(shí)溶液 分為3層，吸取上清液約0. 45ml，在加入等體積異丙醇，室溫靜置20-30min，10000r/min, 4°C離心lOmin，棄上清。加入預(yù)冷的75%乙醇1ml，混勻10000r/min，4°C離心lOmin，棄上 清，真空干燥3-4min，加入適量的DEPC水溶解，并測(cè)OD值。隨后，按Revert AidTM First Strand cDNA 合成試劑盒合成 cDNA 鏈。通過(guò) PCR 檢測(cè) 0CT4、NANOG、CDl 17、CD90、CD45、 HLA-ABC的表達(dá)，內(nèi)參為β -actin。結(jié)論分離的本株不同代次的豬羊水干細(xì)胞，表達(dá)0CT4、NANOG,⑶117、⑶90、 HLA-ABC,不表達(dá)⑶45，說(shuō)明本株細(xì)胞表達(dá)胚胎干細(xì)胞和間充質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)志，不表達(dá)造血干 細(xì)胞標(biāo)志。3、熒光檢測(cè)，在蛋白水平上檢測(cè)PAFS特異性標(biāo)志基因，進(jìn)一步鑒定其是否具有胚 胎干細(xì)胞的特性。具體方法是取第8代細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光染色，4%多聚甲醛室溫固定細(xì)胞30min ；0. 2 % tritonlOO打孔10分鐘，洗兩次，每次5-lOmin，加5% BSA,室溫封閉30min ；分別滴加 Oct-4、Nanog、SSEA-1/4, TRA-60, TRA-81，抗體(設(shè)滴加 PBS 組為陰性對(duì)照)，4°C過(guò)夜；滴 加FITC標(biāo)記的二抗，室溫下孵育60min. Leica倒置顯微鏡下觀察照相。結(jié)論參見(jiàn)圖3，本株豬羊水干細(xì)胞0CT4、NANOG、SSEA-4、TRA-60、TRA-81抗原檢測(cè)陽(yáng)性， 而SSEA-I陰性，進(jìn)一步證明了本株豬羊水干細(xì)胞具有胚胎干細(xì)胞的特性，即表達(dá)胚胎干細(xì) 胞的特異標(biāo)志物。4、豬羊水干細(xì)胞體外分化潛能檢測(cè)，檢測(cè)本株豬羊水干細(xì)胞是否具有在體外分化 為多種細(xì)胞的能力。具體方法是1)豬羊水干細(xì)胞可以形成類胚體，并對(duì)類胚體進(jìn)行檢測(cè)。用1 %的瓊脂處理塑料培養(yǎng)皿，待用。消化收集6代PAFS細(xì)胞，按3X 105/mL密度 接種，加入培養(yǎng)液，于38°C，5 % C02飽和濕度懸浮培養(yǎng)，觀察并小心搖晃吹打，避免類胚體 之間聚集和貼壁?；蛘哒{(diào)整細(xì)胞密度為300-500個(gè)/20ul在培養(yǎng)皿蓋上做懸滴培養(yǎng)，培養(yǎng) 兩天，收集形態(tài)較好的類胚體，待剛剛貼壁后(或懸浮染色)，加入新鮮配制的堿性磷酸酶 染色液，30min內(nèi)鏡下觀察著色情況。2)豬羊水干細(xì)胞可以定向分化為中胚層的脂肪細(xì)胞
將p6代的豬羊水細(xì)胞形成類胚體培養(yǎng)3天后，挑取好的類胚體接于塑料培養(yǎng)皿上，讓其貼壁，加誘導(dǎo)液(配方)，每?jī)商彀肓繐Q液，觀察誘導(dǎo)情況。
3)豬羊水干細(xì)胞可以定向分化為外胚層的神經(jīng)細(xì)胞將p6代的細(xì)胞接于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中貼壁培養(yǎng)，在倒置顯微鏡下每天觀察細(xì)胞 生長(zhǎng)情況，當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)到約60%時(shí)，用含有l(wèi)mmol/L β -ME的羊水基礎(chǔ)培養(yǎng)液預(yù)誘導(dǎo)24h。PBS 洗3次，然后換5mmol/L，10mmol/L的無(wú)血清的α -MEM液誘導(dǎo)，觀察誘導(dǎo)效果。結(jié)論1)參見(jiàn)圖4(a)，豬羊水干細(xì)胞形成的類胚體變紅，AP陽(yáng)性。2)參見(jiàn)圖4(b)，脂肪誘導(dǎo)九天后在細(xì)胞核周圍出現(xiàn)大量脂滴，油紅0染色陽(yáng)性。3)參見(jiàn)圖4(c)，加正式誘導(dǎo)液4_6h后，觀察細(xì)胞變圓，有多個(gè)細(xì)胞突起，RT-PCR 檢測(cè)FGF5，CD56外胚層特異性基因表達(dá)陽(yáng)性，免疫熒光檢測(cè)抗神經(jīng)微絲(NF)，巢蛋白 (nestin)表達(dá)陽(yáng)性。進(jìn)一步證明了豬羊水干細(xì)胞具有胚胎肝細(xì)胞的特性，在體外能分化為不同的組織 和細(xì)胞的潛能。5、豬羊水干細(xì)胞體內(nèi)分化潛能檢測(cè)，檢測(cè)本株羊水細(xì)胞的致瘤性具體方法是將豬羊水干細(xì)胞P6代，p8代，P12代細(xì)胞消化，制成3 X 106/0. 2ML注射入裸鼠背 部，同時(shí)注射小鼠的胚胎干細(xì)胞做陽(yáng)性對(duì)照。參見(jiàn)圖5，六周后，陽(yáng)性對(duì)照長(zhǎng)出腫瘤，而豬羊 水干細(xì)胞未長(zhǎng)出腫瘤。結(jié)論羊水干細(xì)胞與胚胎干細(xì)胞相比，致瘤性低。
權(quán)利要求
一種豬羊水干細(xì)胞系的建立方法，其特征在于該方法包括以下步驟1)羊水干細(xì)胞的原代分離培養(yǎng)；2)將分離培養(yǎng)的原代羊水干細(xì)胞進(jìn)行機(jī)械分離純化；3)將分離純化后的羊水干細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)和檢測(cè)，建立豬羊水干細(xì)胞系，其具體實(shí)現(xiàn)方式是3.1)待分離純化后的羊水干細(xì)胞長(zhǎng)至融合時(shí)，棄去培養(yǎng)液，用PBS洗2-3遍，然后用0.25％胰蛋白酶+0.04％EDTA細(xì)胞消化液在38℃條件下消化3-4分鐘；3.2)等量細(xì)胞培養(yǎng)液中止消化；3.3)將經(jīng)過(guò)消化的羊水干細(xì)胞在1000r/min離心5-10分鐘；3.4)棄上清，計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度為1.0×105個(gè)/ml將細(xì)胞懸液接到培養(yǎng)皿上，加細(xì)胞培養(yǎng)液；3.5)連續(xù)培養(yǎng)4-8代后，上皮樣細(xì)胞逐漸減少消失，90％以上表現(xiàn)為成纖維樣細(xì)胞，細(xì)胞大量擴(kuò)增，即建成羊水干細(xì)胞系。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的豬羊水干細(xì)胞系的建立方法，其特征在于所述步驟1)的具 體實(shí)現(xiàn)方式是1.1)收集懷孕母豬的羊水，連同子宮帶回，無(wú)菌打開(kāi)子宮，分出由胎衣完整包裹的羊水 備用，測(cè)量胎兒的大小，詳細(xì)記錄，然后抽取羊水；1.2)用100目濾紗過(guò)濾，以除去較大的組織碎片，然后2000r/min，離心lOmin，棄上清， 收集細(xì)胞。1.3)將步驟2)中所收集的細(xì)胞加入含有5%血清+5%雙抗的PBS溶液中，混勻，置 38°C,5% CO2培養(yǎng)箱中處理10分鐘，然后離心，收集細(xì)胞，重復(fù)3次。1.4)將分離出的豬羊水細(xì)胞加入原代羊水細(xì)胞培養(yǎng)液接種于不同的培養(yǎng)皿中，置于 38°C>5% C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的豬羊水干細(xì)胞系的建立方法，其特征在于所述原代羊水細(xì)胞培養(yǎng)液是 α -MEM+15% FBS+10ng BFGF+2mmol/L 谷胺酰胺 +100u/ml 青霉素 +100u/ml 鏈 霉素的培養(yǎng)液。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的豬羊水干細(xì)胞系的建立方法，其特征在于所述步驟2)的具體實(shí)現(xiàn)方式是2.1)將分離出的羊水細(xì)胞加入原代羊水細(xì)胞培養(yǎng)液三天后，觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，并記 錄原代細(xì)胞貼壁時(shí)間及貼壁細(xì)胞數(shù)；2. 2)五天后觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，并半量換液；2. 3)在顯微鏡下用筆在培養(yǎng)皿上標(biāo)記出上皮樣細(xì)胞克隆的區(qū)域；2. 4)吸去培養(yǎng)液，用PBS洗1-2遍；2. 5)用細(xì)胞刮刀將上皮樣細(xì)胞克隆刮掉，不要刮到成纖維樣克隆，然后補(bǔ)加培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)；或者用細(xì)胞刮刀將成纖維樣克隆刮下，接到新的培養(yǎng)皿中，繼續(xù)培養(yǎng)。
5.據(jù)權(quán)利要求1所述的豬羊水干細(xì)胞系的建立方法，其特征在于所述步驟3.4)中的細(xì)胞培養(yǎng)液是α -MEM+10% FBS+2mmol/L谷胺酰胺+100u/ml青霉素+100u/ml鏈霉素的培養(yǎng)液。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種豬羊水干細(xì)胞系的建立方法，該方法包括以下步驟1)羊水干細(xì)胞的原代分離培養(yǎng)；2)將分離培養(yǎng)的原代羊水干細(xì)胞進(jìn)行機(jī)械分離純化；3)檢測(cè)并將分離純化后的羊水干細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，建立豬羊水干細(xì)胞系，本發(fā)明提供了一種快速、有效、安全、分離豬羊水干細(xì)胞的方法，可為組織工程研究提供新的種子細(xì)胞來(lái)源以及有望作為種子細(xì)胞從事科研和生產(chǎn)應(yīng)用。
文檔編號(hào)C12R1/91GK101798566SQ20101001357
公開(kāi)日2010年8月11日 申請(qǐng)日期2010年1月8日 優(yōu)先權(quán)日2010年1月8日
發(fā)明者盧智娟, 張淑金, 成德, 王華巖, 高志敏 申請(qǐng)人:西北農(nóng)林科技大學(xué)