專利名稱：：淡水魚類肌球蛋白調節(jié)輕鏈mRNA表達量快速檢測試劑盒及其檢測方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及的魚類肌球蛋白調節(jié)輕鏈基因表達量的快速檢測試劑盒，其中的試劑包括如下(l)PCR擴增反應液包括10XPCR反應緩沖液、0.1-0.4mmol/LdNTP(含dTTP)、2-4mmol/L硫酸鎂、l-2UTaq酶、0.2-0.6翻1/L上游引物、0.2-0.6翻1/L下游引物、1X0.2XSY服GreenI染料其中10XPCR反應緩沖液含有100mmol/LpH8.8的三羥基甲基氨基甲烷一鹽酸、500mmol/L氯化鉀和1%曲拉通X-100;其中目的基因引物和內參基因引物參數(shù)如表1。表1用于熒光定量分析的目的基因引物和內參基因引物參數(shù)<table>tableseeoriginaldocumentpage4</column></row><table>其中上游引物、下游引物、SYBRGreenI染料的體積比為1:1:1;其中dNTP內的四種脫氧核糖核酸的混合物的質量比為dTTP:dATP:dGTP:dCTP=1:1:1:1。(2)對照cDNA實驗組上面所述PCR擴增反應液，每管24uL的最佳組成為2.5uLIOXPCR反應緩沖液、2uL2.5mmol/LdNTP(四種脫氧核糖核酸的混合物)、2uL25mmol/L硫酸鎂、luL10umol/L目的基因上游引物、luL10umol/L目的基因下游引物、luLSYBRGreenI染料、0.3uLTaq酶、14.2uLddH20(滅菌雙蒸水)。對照組上面所述PCR擴增反應液，每管24uL的最佳組成為2.5uL10XPCR反應緩沖液、2uL2.5mmol/LdNTP(四種脫氧核糖核酸的混合物)、2uL25mmol/L硫酸鎂、luL10umol/L內參基因上游引物、luL10umol/L內參基因下游引物、luLSYBRGreenI染料、0.3uLTaq酶、14.2uLddH20(滅菌雙蒸水)。使用上述試劑盒檢測魚類肌球蛋白調節(jié)輕鏈表達量的方法，依次包括下列步驟(1)_(3):(1)待檢樣品總RNA提取及cDNA第一鏈的合成采用Trizol—步抽提法提取待檢樣品總RNA，然后用反轉錄試劑盒進行cDNA第一鏈的合成；(2)魚類肌球蛋白調節(jié)輕鏈的實時熒光PCR擴增A.在裝有24uL分別含目的基因引物、內參基因引物的兩支PCR擴增反應液A的反應管中加入luL待檢樣品cDNA，混勻。B.將PCR反應管放入熒光定量PCR儀，按下述反應條件完成PCR擴增95°ClOs，l個循環(huán)；95°C5s，1個循環(huán)，預變性；58°C20s退火延伸，45個循環(huán)，PCR擴增。(3)應用熒光定量PCR儀隨機軟件，分析擴增結果，比較表達量的多少。第一步判斷能否檢測出肌球蛋白調節(jié)輕鏈。如待測樣品出現(xiàn)擴增曲線，且Ct值小于或等于41，陰性對照、陽性對照和空白對照結果正常者，則可判定該樣品檢出肌球蛋白輕鏈。如待測樣品Ct值大于或等于45，陰性對照、陽性對照和空白對照結果正常者，則可判定該樣品未檢出肌球蛋白輕鏈。如待測樣品Ct值在41—45之間，應重作實時熒光PCR擴增。再次擴增后的結果Ct值仍小于45，且陰性對照、陽性對照和空白對照結果正常者，則可判定該樣品檢出肌球蛋白輕鏈；再次擴增后的結果Ct值大于45，且陰性對照、陽性對照和空白對照結果正常者，則可判定該樣品未檢出肌球蛋白調節(jié)輕鏈。第二步通過比較閾值法來測定目的基因的相對表達量。根據(jù)數(shù)學推導得出，肌球蛋白調節(jié)輕鏈基因的量=2—AACt，在該公式中，Ct是熱循環(huán)儀檢測到反應體系中熒光信號的強度值，AACt=(Ct目的基因_Ct管家基因)實驗組-(Ct目的基因-Ct管家基因)對照組。實時熒光定量PCR結束后，目的基因的量的實驗數(shù)據(jù)用Excel2003軟件進行初步處理，接著采用SPSS12.0或SASS軟件對所得表達豐度數(shù)據(jù)進行單因素方差分析(One-WayANOVA)，最后采用最小顯著差數(shù)法(LSD)進行多重比較，以對比樣品中調節(jié)輕鏈基因的表達量。本發(fā)明建立了淡水魚類肌球蛋白調節(jié)輕鏈mRNA表達量的實時熒光PCR檢測試劑盒及檢測方法。本試劑盒根據(jù)淡水魚類肌球蛋白調節(jié)輕鏈基因的保守序列，設計了特異性引物。該保守基因序列通過對Genebank登錄的各魚種肌球蛋白調節(jié)輕鏈基因的核酸序列的比對獲得，可保證不同魚種、不同組織、不同發(fā)育時期肌球蛋白輕鏈表達量的檢出。本發(fā)明采用Trizol—步抽提法提取RNA，該技術具有簡便、快速、需要量少但提取質量高的特點，采用實時熒光PCR法進行檢測，該技術具有特異性強、靈敏度高、操作簡便、定量準確的特點，因此特別適用于魚類樣品量少的肌球蛋白調節(jié)輕鏈基因表達量的對比。有益效果本發(fā)明建立了淡水魚類淡水魚類肌球蛋白調節(jié)輕鏈mRNA表達量的實時熒光PCR檢測試劑盒及檢測方法。本試劑盒根據(jù)淡水魚類淡水魚類肌球蛋白調節(jié)輕鏈基因的保守序列，設計了特異性引物。該保守基因序列通過對Genebank登錄的各魚種淡水魚類肌球蛋白調節(jié)輕鏈基因的核酸序列的比對獲得，可保證不同魚種、不同組織、不同發(fā)育時期淡水魚類肌球蛋白調節(jié)輕鏈表達量的檢出。本發(fā)明采用Trizol(Invitrogen)—步抽提法提取RNA，該技術具有簡便、快速、需要量少但提取質量高的特點，采用實時熒光PCR法進行檢測，該技術具有特異性強、靈敏度高、操作簡便、定量準確的特點，因此特別適用于魚類樣品量少的淡水魚類肌球蛋白調節(jié)輕鏈基因表達量的對比。圖1用實時熒光PCR技術檢測某待測草魚樣品cDNA，樣品的擴增曲線；圖2數(shù)據(jù)處理后胚胎發(fā)育時期MLC2mRNA相對表達量；圖3用實時熒光PCR技術檢測某待測鱖魚樣品cDNA，樣品的擴增曲線；圖4數(shù)據(jù)處理后胚胎發(fā)育時期MLClmRNA相對表達量。具體實施例方式為了使本發(fā)明實現(xiàn)的技術手段、創(chuàng)作特征、達成目的與功效易于明白了解，下面結合具體圖示，進一步闡述本發(fā)明。實施例1:按下列配方制作原腸階段(gastrula)和尾芽階段(tailbud)的草魚普通肌肌球蛋白調節(jié)輕鏈的實時熒光PCR檢測試劑盒包括10XPCR反應緩沖液、0.2mmol/LdNTP(含dTTP)、2mmol/L硫酸鎂、1.5UTaq酶、1X—0.2XSYBRGreenI染料、0.4umol/L上游引物0.4umol/L下游引物；其中10XPCR反應緩沖液含有100mmol/LpH8.8的三羥基甲基氨基甲烷一鹽酸、500mmol/L氯化鉀和1%曲拉通X—00;其中dNTlP內的四種脫氧核糖核酸的混合物的質量比為dTTP:dATP:dGTP:dCTP=1:1:1:1。按照以下程序進行檢測具體步驟如下1、采用Trizol—步抽提法提取不同階段草魚普通肌總RNA，并合成cDNA第一鏈(1)先在5mL離心管(DEPC處理)中加入lmLTrizol溶液，然后剪碎魚樣約100mg，置于該離心管中，高速勻漿至勻漿液透明而無顆粒。(2)將勻漿液轉移至1.5mL的離心管(DEPC處理)中，室溫靜置10min，使其充分裂解。(3)將第(2)步處理的樣品置于離心機內，12000rpm，4。C離心10min。(4)離心完畢，取上清液轉入另一新的DEPC處理的1.5mL離心管中。并加入0.2mL的氯仿，用力搖晃lmin，使其充分乳化，無分相，室溫靜置5min。(5)將第(4)步處理的樣品置于離心機內，12000rpm，4。C離心15min。(6)離心完畢，小心吸取上層水相至另一DEPC處理的1.5mL離心管中，加入等體積異丙醇，上下輕混幾次，冰上放置10min。然后再在12000rpm，4t:離心10min。(7)棄上清，用1ml75%乙醇洗滌沉淀。(8)棄75%乙醇，重復步驟(7)，并于8000rpm4。C離心10min。(8)棄75%乙醇，真空干燥5min，使剩余酒精完全揮發(fā)。(9)沉淀用100ii1DEPC處理H20溶解，_80"凍存或直接用于RT—PCR。取上述DNaseI處理過的總RNA樣品，利用反轉錄試劑盒進行cDNA第一鏈的合成，獲得樣品的cDNA，反轉錄產物(RTProducts)于-20。C保存?zhèn)溆?、待測樣品cDNA的實時熒光PCR擴增A.在裝有24uL分別含目的基因引物、內參基因引物的兩支PCR反應管中加入PCR反應液A和luL樣品cDNA，混勻。B.將PCR反應管放入熒光定量PCR儀，按下述反應條件完成PCR擴增95。C10s，1個循環(huán)，預變性;95。C5s，1個循環(huán)，變性;58°C20s退火延伸，45個循環(huán)，PCR擴增。3、應用熒光定量PCR儀隨機軟件，分析擴增結果，比較表達量的多少。樣品出現(xiàn)擴增曲線，見圖1。實驗數(shù)據(jù)經(jīng)過Excel2003軟件的初步處理，再采用SPSS12.0軟件對所得表達豐度數(shù)據(jù)進行單因素方差分析(0ne-WayAN0VA)并采用最小顯著差數(shù)法(LSD)進行多重比較，見圖2，發(fā)現(xiàn)原腸階段MLC2相對表達量與尾芽階段相比有差異(p<0.05)，即尾芽階段的MLC2要多。實施例2:按下列配方制作肌肉效應期和仔魚期鰱魚普通肌的肌球蛋白調節(jié)輕鏈基因的實時熒光PCR檢測試劑盒包括10XPCR反應緩沖液、0.2mmol/LdNTP(含dTTP)、2mmol/L硫酸鎂、1.5UTaq酶、0.4umol/L上游引物0.4umol/L下游引物、1X—0.2XSYBRGreenI染料；其中10XPCR反應緩沖液含有100mmol/LpH8.8的三羥基甲基氨基甲烷一鹽酸、500mmol/L氯化鉀和1%曲拉通X—100;其中dNTP內的四種脫氧核糖核酸的混合物的質量比為dTTP:dATP:dGTP:dCTP=2:1:1:1。按照以下程序進行檢測1、采用Trizol—步抽提法提取不同時期鱖魚普通肌的總RNA，并合成cDNA第一鏈(1)先在5mL離心管(DEPC處理)中加入lmLTrizol溶液，然后剪碎魚樣約100mg，置于該離心管中，高速勻漿至勻漿液透明而無顆粒。(2)將勻漿液轉移至1.5mL的離心管(DEPC處理)中，室溫靜置10min，使其充分裂解。(3)將第(2)步處理的樣品置于離心機內，12000rpm，4t:離心10min。(4)離心完畢，取上清液轉入另一新的DEPC處理的1.5mL離心管中，并加入0.2mL的氯仿，用力搖晃lmin，使其充分乳化，無分相，室溫靜置5min。(5)將第(4)步處理的樣品置于離心機內，12000rpm，4。C離心15min。(6)離心完畢，小心吸取上層水相至另一DEPC處理的1.5mL離心管中，加入等體積異丙醇，上下輕混幾次，冰上放置10min。然后再在12000rpm，4t:離心10min。(7)棄上清，用1ml75%乙醇洗滌沉淀。(8)棄75%乙醇，重復步驟(7)，并于8000rpm，4。C離心10min。(8)棄75%乙醇，真空干燥5min，使剩余酒精完全揮發(fā)。(9)沉淀用100ii1DEPC處理H20溶解，_80"凍存或直接用于RT—PCR。取上述DNaseI處理過的總RNA樣品，利用反轉錄試劑盒進行cDNA第一鏈的合成，獲得樣品的cDNA，反轉錄產物(RTProducts)于-20。C保存?zhèn)溆谩?2)待測魚樣cDNA的實時熒光PCR擴增A.分別在兩支PCR反應管中加入24uL分別含目的基因MLC2、內參基因GAPDH的PCR反應液和luL樣品cDNA，混勻。B.將PCR反應管放入熒光定量PCR儀，按下述反應條件完成PCR擴增95°ClOs，l個循環(huán)；95°C5s，1個循環(huán)，預變性；58°C20s退火延伸，45個循環(huán)，PCR擴增。(3)應用熒光定量PCR儀隨機軟件，分析擴增結果，，比較表達量的多少。樣品出現(xiàn)擴增曲線，見圖3。實驗數(shù)據(jù)經(jīng)過Excel2003軟件的初步處理，再采用SPSS12.0軟件對所得表達豐度數(shù)據(jù)進行單因素方差分析(0ne-WayAN0VA)并采用最小顯著差數(shù)法(LSD)進行多重比較，見圖4發(fā)現(xiàn)肌肉效應階段MLC2相對表達量與仔魚階段相比有顯著差異(P<0.05)，即仔魚階段的MLC2要多。權利要求淡水魚類肌球蛋白調節(jié)輕鏈mRNA表達量快速檢測試劑盒，其特征在于，PCR擴增反應液A包括10×PCR反應緩沖液、0.1-0.4mmol/LdNTP(含dTTP)、2-4mmol/L硫酸鎂、1--2UTaq酶、0.2-0.6umol/L上游引物、0.2-0.6umol/L下游引物、1×0.2×SYBRGreenI染料；其中10×PCR反應緩沖液含有100mmo/LpH8.8的三羥基甲基氨基甲烷--鹽酸、500mmol/L氯化鉀和1％曲拉通x--100；2.根據(jù)權利要求l中所述的淡水魚類肌球蛋白調節(jié)輕鏈mRNA表達量快速檢測試劑盒，其特征在于，所述的上游引物、下游引物、SYBRGreenI染料的體積比為1:1:1。3.根據(jù)權利要求1中所述的淡水魚類肌球蛋白調節(jié)輕鏈mRNA表達量快速檢測試劑盒，其特征在于，所述的dNTP內的四種脫氧核糖核酸的質量比為dTTP:dATP:dGTP:dCTP=1:1:1:1。4.快速檢測魚類淡水魚類肌球蛋白調節(jié)輕鏈基因表達量的方法，其特征在于，依次包括下列步驟(1)待檢樣品總RNA提取及cDNA第一鏈的合成；(2)魚類淡水魚類肌球蛋白調節(jié)輕鏈的實時熒光PCR擴增；A.在裝有24uLPCR擴增反應液A的反應管中加入luL待檢樣品DNA，混勻；B.將PCR反應管放入熒光PCR儀，按下述反應條件完成PCR擴增；95°ClOs，l個循環(huán)，預變性;95°C5s，l個循環(huán)，變性;58°C20s，退火延伸，45個循環(huán)，PCR擴增。(3)應用熒光定量PCR儀隨機軟件，分析擴增結果，比較表達量的多少。全文摘要本發(fā)明為淡水魚類肌球蛋白調節(jié)輕鏈mRNA表達量快速檢測試劑盒及其檢測方法，試劑盒包括PCR擴增反應液A、對照cDNA；PCR擴增反應液A含有10×PCR反應緩沖液、硫酸鎂、dNTP(含dUTP)、Taq酶、上游引物、下游引物、SYBRGreenI染料，魚類淡水魚類肌球蛋白調節(jié)輕鏈基因表達量的快速檢測方法包括魚的總RNA提取、魚類肌球蛋白基因的實時熒光PCR擴增和結果判定。本發(fā)明的優(yōu)點是需要量少、快速、特異性強、靈敏度高、操作簡便、重復性好。文檔編號C12Q1/68GK101736086SQ20101002200公開日2010年6月16日申請日期2010年1月5日優(yōu)先權日2010年1月5日發(fā)明者周瑞雪,張建社,蒙濤,褚武英,趙發(fā)蘭,陳敦學申請人:長沙學院