專利名稱：一種重組腺病毒及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及重組腺病毒，具體是一種含有東亞鉗蝎氯離子通道毒素(簡稱BmK CT)基因的重組腺病毒及其制備方法以及該重組腺病毒在制備治療神經(jīng)膠質(zhì)瘤藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
腦神經(jīng)膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中最常見的一種惡性腫瘤，常規(guī)的臨床治療主要以 外科手術(shù)切除，放療或者化療為主，不能徹底治療并且容易復(fù)發(fā)，治療過程中對患者自身也 有很大的損傷。隨著基因操作技術(shù)的發(fā)展，基因治療得到了廣泛的應(yīng)用。腺病毒載體攜帶 特定抑癌基因在癌癥治療方面有很明顯的優(yōu)勢。腺病毒最早在人體內(nèi)發(fā)現(xiàn)，可以感染大多 數(shù)的哺乳動物細(xì)胞并且穩(wěn)定表達(dá)目的蛋白，在正常的組織中通過免疫反應(yīng)可以消除，而且 腺病毒基因組不會整合到宿主細(xì)胞的基因組中，E1/E3區(qū)缺失的復(fù)制缺陷型病毒在哺乳動 物細(xì)胞內(nèi)不能正常復(fù)制且不會產(chǎn)生致病蛋白，提高了腺病毒載體在基因治療中的安全性。東亞鉗蝎氯離子通道毒素(BmK CT)由35個(gè)氨基酸組成，含4對二硫鍵，與從以色 列蝎L. quinquestriatus中提取的小電導(dǎo)氯離子通道抑制劑蛋白的同源性在60%以上。本 課題組前期的研究表明，大腸桿菌表達(dá)和純化的BmK CT蛋白可以通過抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞上的 基質(zhì)金屬蛋白酶-2 (matrix metalloproteinase-2,MMP-2)的表達(dá)，從而抑制了腫瘤細(xì)胞與 細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的黏附和降解，降低了腫瘤細(xì)胞的遷移能力。如何使優(yōu)化后的BmK CT基因?qū)氚屑?xì)胞內(nèi)并使其高效穩(wěn)定表達(dá)是BmK CT用于神 經(jīng)膠質(zhì)瘤治療所面臨的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。腺病毒載體是目前研究和臨床中使用最廣泛的具有高效 感染率和表達(dá)的基因表達(dá)載體，可在包裝細(xì)胞中獲得較高的病毒滴度，能感染分裂期和非 分裂期的細(xì)胞。并且，腺病毒載體因?yàn)槠渚哂修D(zhuǎn)移效率高、感染細(xì)胞譜廣、病毒滴度高和安 全的優(yōu)點(diǎn)，是基因疫苗、基因治療、組織工程等研究中重要的轉(zhuǎn)基因病毒載體。因此，將優(yōu)化 后的BmKCT基因整合到腺病毒基因組上包裝純化重組腺病毒是解決該問題的有效途徑。目前，國內(nèi)外已經(jīng)有關(guān)于腺病毒載體連接特定基因在神經(jīng)膠質(zhì)瘤，惡性腫瘤，前列 腺癌，肝癌，食管癌等的報(bào)道，但尚未發(fā)現(xiàn)有重組腺病毒介導(dǎo)的蝎氯離子通道毒素基因治療 神經(jīng)膠質(zhì)瘤的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種含有BmK CT基因的重組腺病毒；提供一種構(gòu)建該重 組腺病毒的方法；以及該重組腺病毒在制備治療神經(jīng)膠質(zhì)瘤藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明提供的一種重組腺病毒，AdEasy-I-BmK CT,已于2009年12月9日保藏在 中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號CGMCC No. 3499。該腺病毒可以在被感染的宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá)綠色熒光蛋白、東亞鉗蝎氯離子通道毒 素，且其基因組缺失E1/E3區(qū)，不會整合到宿主細(xì)胞的基因組中。本發(fā)明提供的一種重組腺病毒的構(gòu)建方法，包括如下步驟
3
(1)利用偏愛密碼子表合成能在哺乳動物細(xì)胞中高效表達(dá)的東亞鉗蝎氯離子通道 毒素(BmK CT)基因，原始BmK CT基因的核苷酸序列為SEQ ID No. 1，優(yōu)化后的BmK CT基因 的核苷酸序列為SEQ ID No. 2 ；合成特異性引物上游5，-tt gat ate atg tgc ggc ccc tgc ttc_3，(見 SEQ ID No. 3)Tffif 5' -at ctc RaR tea gat acg gtt gca cag gc_3，( JAL SEQ ID No. 4)經(jīng)PCR擴(kuò)增獲得蝎氯離子通道毒素基因，且分別在5’端和3’端加上Xho I 和Hind III酶切位點(diǎn)并連接到中間載體pShuttle-IRES-hrGFP-2中獲得重組質(zhì)粒 pShuttle-IRES-hrGFP-2-BmKCT ；(2)將重組質(zhì)粒pShuttle-IRES-hrGFP-2-BmK CT用Pme I酶切線性化后轉(zhuǎn)化 含有腺病毒基因組PAdEasy-I的BJ5183細(xì)菌中發(fā)生同源重組，篩選出重組腺病毒基因組 PAdEasy-I-BmKCT后轉(zhuǎn)化到XLlO Gold細(xì)菌中大量復(fù)制，將重組的腺病毒基因組酶切線性 化后轉(zhuǎn)染AD293細(xì)胞，包裝復(fù)制后獲得重組腺病毒AdEasy-I-BmK CT ；(3)將步驟⑵獲得的重組腺病毒AdEasy-I-BmK CT感染AD293細(xì)胞并在細(xì)胞內(nèi) 大量擴(kuò)增，待細(xì)胞全部出現(xiàn)病變時(shí)收集細(xì)胞，-SO0C /37°C反復(fù)凍融3-4次使細(xì)胞裂解，收 集裂解液，CsCl密度梯度離心，取中間層透析去除病毒液中CsCl，獲得大量的重組腺病毒 AdEasy-I-BmK CT0體外實(shí)驗(yàn)使用不同劑量的病毒液感染C6細(xì)胞48小時(shí)后，利用流式細(xì)胞儀測定最 佳感染效率的劑量；同時(shí)用不同劑量不同時(shí)間點(diǎn)測量對C6細(xì)胞的毒性作用。在體實(shí)驗(yàn)利 用SD大鼠皮下C6膠質(zhì)瘤模型，分別注射重組腺病毒，對照組腺病毒和PBS，統(tǒng)計(jì)大鼠瘤塊大 ?。槐鶅銮衅瑹晒忡R下檢測GFP表達(dá)情況。本發(fā)明獲得的重組腺病毒對神經(jīng)膠質(zhì)瘤具有抑 制作用，可用于制備治療神經(jīng)膠質(zhì)瘤的藥物。本發(fā)明提供的含氯離子通道毒素(BmK CT)基因的重組腺病毒可以抑制神經(jīng)膠質(zhì) 瘤細(xì)胞的增殖和擴(kuò)散，腺病毒載體高效感染神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞并且作用時(shí)間長，使得蝎氯離 子通道毒素能穩(wěn)定表達(dá)并作用于膠質(zhì)瘤細(xì)胞，從而通過抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的生長和遷移來治 療神經(jīng)膠質(zhì)瘤。


圖IBmK CT基因的原始序列和優(yōu)化后的可在哺乳動物細(xì)胞內(nèi)高效表達(dá)的BmK CT
基因序列。圖2從pUC57質(zhì)?？寺mK CT基因并在其兩端分別加上EcoRV和Xho I酶切位 點(diǎn)設(shè)計(jì)合成的引物序列。圖3重組中間質(zhì)粒pShuttle-IRES-hrGFP-2-BmK CT的結(jié)構(gòu)示意圖。圖 4 中間質(zhì)粒 pShuttle-IRES-hrGFP-2-BmK CT 的鑒定。圖5重組腺病毒鑒定。圖6重組腺病毒基因組中BmK CT及其兩端序列的測序報(bào)告，下劃線為BmK CT基 因。圖7脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染腺病毒基因組后綠色熒光蛋白表達(dá)情況分析。圖SCsCl密度梯度離心后病毒所在位置示意圖。圖9重組及空腺病毒對大鼠神經(jīng)膠質(zhì)瘤C6細(xì)胞感染效率的檢測。
圖10RT-PCR檢測BmK CT基因在宿主細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)情況。圖1IMTT法檢測AdEasy-I-BmK CT和AdEasy-cGFP腺病毒抑制C6細(xì)胞的曲線。圖12AdEasy_I-BmK CT和AdEasy-cGFP腺病毒在動物腫瘤模型中的抑制實(shí)驗(yàn)。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1重組腺病毒的構(gòu)建(I)BmK CT基因的優(yōu)化合成及鑒定和中間質(zhì)粒pShuttle-IRES-hrGFP-2_BmK CT的 構(gòu)建及鑒定根據(jù)哺乳動物偏愛密碼子表優(yōu)化已知的BmK CT基因序列，交上海生工生物工程技 術(shù)有限公司人工合成并克隆在載體PUC57中，在該序列的兩端分別加入Xho I和HindIII 酶切位點(diǎn)，以便酶切鑒定(圖1)。將攜帶優(yōu)化后的BmK CT基因的克隆載體pUC57轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a大量擴(kuò)增，提 取質(zhì)粒并進(jìn)行PCR和酶切鑒定。設(shè)計(jì)引物，利用PCR方法在BmK CT基因兩端加上EcoRV和Xho I酶切位點(diǎn)(圖2)， 將PCR產(chǎn)物經(jīng)酶切后回收；同時(shí)對中間載體pShuttle-IRES-hrGFP-2進(jìn)行EcoR V和Xho I 雙酶切，酶切產(chǎn)物回收；用酶切后的PCR產(chǎn)物和載體，按比例混合，用T4連接酶16°C過夜連 接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a，涂含卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基平板，37°C過夜培養(yǎng)，挑取 單菌落在LB液體培養(yǎng)基中大量培養(yǎng)，純化質(zhì)粒做PCR鑒定和酶切鑒定(圖4)，圖中A圖為 構(gòu)建的重組中間質(zhì)粒pShuttle-IRES-hrGFP-2-BmK CT的PCR檢測電泳圖。M =DNA標(biāo)準(zhǔn)分 子量；1 以重組質(zhì)粒為模板擴(kuò)增得到BmK CT基因產(chǎn)物，129bp ；2 以空載體為模板的PCR擴(kuò) 增產(chǎn)物；B圖為重組質(zhì)粒EcoRV和Xho I酶切鑒定。(2)重組腺病毒pAdEasy-l-BmK CT基因組的構(gòu)建及鑒定構(gòu)建好的腺病毒中間載體pShuttle-IRES-hrGFP-2-BmK CT用Pme I酶切線性化 后酚氯仿抽提，純化線性化的中間載體，轉(zhuǎn)化攜帶有PAdEasy-I的BJ5183細(xì)菌，涂含卡那 霉素的LB固體培養(yǎng)基平板，37°C過夜培養(yǎng)，挑取單菌落在LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)，純化重組的 pAdEasy-I-BmK CT并轉(zhuǎn)化XLlOGold細(xì)菌大量培養(yǎng)，純化質(zhì)粒做PCR鑒定和酶切鑒定(圖 5)，圖中A圖為重組腺病毒AdEasy-I-BmK CT基因組中外源基因BmK CT的PCR檢測電泳 圖。M =DNA標(biāo)準(zhǔn)分子量；1、2 以重組腺病毒基因組為模板檢測到BmK CT基因的PCR產(chǎn)物， 129bp ；3 空腺病毒基因組為模板檢測的PCR產(chǎn)物；4 以水為模板的PCR陰性對照；5 以重 組中間載體為模板的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物(陽性對照)；B圖為Pac I酶切鑒定。并測序證實(shí)構(gòu)建 成功(圖6)。(3)重組腺病毒的包裝，大量擴(kuò)增和純化用限制性內(nèi)切酶Pac I將pAdEasy-l-BmK CT酶切線形化后，酚氯仿抽提，無水乙 醇沉淀，溶解到40 μ 1無菌水中備用。培養(yǎng)AD293細(xì)胞，待AD293細(xì)胞有80% -90%以上匯 合時(shí)，將線性化的pAdEasy-l-BmK CT加入到等量的脂質(zhì)體Lipofectamine2000中，37°C孵 育5-6小時(shí)，轉(zhuǎn)染AD293細(xì)胞，轉(zhuǎn)染12小時(shí)后換上新鮮配置的細(xì)胞培養(yǎng)基(含有15% FBS 的DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液)。轉(zhuǎn)染3天后熒光顯微鏡下觀察，可以看到有部分細(xì)胞內(nèi)表達(dá)綠色熒 光(圖7A)，8天后觀察到表達(dá)綠色熒光的細(xì)胞明顯增多(圖7B)，15天后觀察到成堆的細(xì) 胞表達(dá)綠色熒光(圖7C)，待綠色熒光達(dá)到95%以上時(shí)收集細(xì)胞。-80°C /37°C反復(fù)凍融4次，5500rpm離心收集上清(含重組腺病毒)。將上清侵染3瓶(75cm2)AD293細(xì)胞擴(kuò)增腺 病毒，4天后觀察到細(xì)胞葡萄串樣聚集并開始脫落且綠色熒光在95%以上時(shí)(圖7D)，收集 細(xì)胞，同上處理后侵染30瓶(75cm2)AD293細(xì)胞大量擴(kuò)增，3天后觀察細(xì)胞狀態(tài)如圖5D時(shí)， 600g離心收集細(xì)胞后，收集上清，4°C保存，沉淀中加入15ml PBS, -80°C /37°C反復(fù)凍融4 次，6000rpm離心5分鐘收集上清，氯化銫密度梯度35000rpm離心(圖8)，1小時(shí)后繼續(xù)吸 取中間病毒層氯化銫密度梯度35000rpm離心2小時(shí)，吸取中間層，用IL無菌透析液(1M MgCl2, Iml ； 1MPH7. 4Tric_HCl，IOml ；甘油，IOOml ；去離子水補(bǔ)足 1L)4°C透析 24 小時(shí)，重復(fù) 透析2次，分裝重組腺病毒液-80°C保存。實(shí)施例2重組腺病毒抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖和擴(kuò)散的實(shí)驗(yàn)(1)重組腺病毒的濃度測定及純度鑒定腺病毒濃度測定采用光密度測定方法，設(shè)空白管為PBS 960 μ 1，10% SDS 40 μ 1 ； 測定管為PBS 860 μ 1，重組病毒液100 μ 1，10% SDS 40 μ 1。56°C孵育1小時(shí)后，離心取上 清。紫外分光光度計(jì)測定0D260值和0D280值，病毒滴度=A260X稀釋倍數(shù)X IO12 vp/ml ； A260/A280比值反映了腺病毒純度，> 1. 3說明腺病毒純度較高。本實(shí)驗(yàn)包裝的病毒測定 A260 = 0. 246，A280 = 0. 170 ；病毒滴度為 2. 46 X IO12, A260/A280 = 1. 45，純度較高。重組腺病毒的鑒定采用提取純化后的Ad-BmK CT病毒DNA和對照組AchcGFP病毒 DNA為模板，進(jìn)行PCR鑒定。(2)體外對大鼠神經(jīng)膠質(zhì)瘤C6細(xì)胞的感染效率及外源蛋白表達(dá)的測定利用流式細(xì)胞儀和熒光顯微鏡檢測10，20，50，100M0I重組腺病毒和對照組腺病 毒對C6細(xì)胞的感染效率。具體方法為10瓶(25cm2) C6細(xì)胞培養(yǎng)至70%匯合時(shí)更換新鮮培 養(yǎng)基，且隨機(jī)5瓶分別加入0，10，20，50，100M0I重組腺病毒AdEasy-I-BmK CT,另外5瓶分 別加入0，10，20，50，100M0I對照組腺病毒AdEasy-cGFP ；12小時(shí)后更換新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培 養(yǎng)至48小時(shí)熒光顯微鏡觀察；收集細(xì)胞，PBS洗滌細(xì)胞2遍后流式檢測；重復(fù)3遍統(tǒng)計(jì)感染 效率數(shù)據(jù)(見圖9)。圖中=A :10-100M0I AdEasy-I-BmK CT腺病毒感染C6細(xì)胞48小時(shí)的流 式評價(jià)；B :10-100M0I AdEasy-cGFP腺病毒感染C6細(xì)胞48小時(shí)的流式評價(jià)；C 重復(fù)感染測 定3次后標(biāo)準(zhǔn)差比較，#為最佳感染效率(AdEasy-I-BmK CT 92. 4士 1. 85% ；AdEasy-cGFP 91. 37士 1. 68% ) ；D 熒光鏡下觀察到的最佳感染效率(上面為AdEasy-I-BmK CT感染，下 面為AdEasy-cGFP感染)；E F =DAPI染核觀察在50M0I AdEasy-cGFP感染C6細(xì)胞148小時(shí) 的感染效率。利用RT-PCR檢測重組腺病毒在AD293細(xì)胞表達(dá)BmK CT的情況，用50M0I重組腺病 毒AdEasy-I-BmK CT和對照組腺病毒Ad-cGFP分別感染2瓶(25cm2) AD293細(xì)胞，48小時(shí)后 收集細(xì)胞，提取AD293細(xì)胞總RNA反轉(zhuǎn)錄cDNA，以cDNA為模板進(jìn)行PCR鑒定(圖10A)。同 時(shí)利用RT-PCR檢測50M0I重組腺病毒不同時(shí)間點(diǎn)在C6細(xì)胞中的表達(dá)量(圖10B)。圖IOA 檢測BmK CT在重組腺病毒感染AD293細(xì)胞后的表達(dá)情況。1 :50M0I AdEasy-cGFP感染細(xì) 胞48小時(shí)后，提取RNA反轉(zhuǎn)錄cDNA為模板PCR產(chǎn)物；2 :50M0I AdEasy-I-BmKCT感染細(xì)胞 48小時(shí)后，提取RNA反轉(zhuǎn)錄cDNA為模板PCR產(chǎn)物；3 正常AD293細(xì)胞提取RNA反轉(zhuǎn)錄cDNA 為模板PCR的產(chǎn)物(陰性對照)；4 重組中間載體為模板PCR的產(chǎn)物(陽性對照)；5 以水 為模板的空白對照；6 :DNA標(biāo)準(zhǔn)分子量；7-11 模板對應(yīng)1-5PCR檢測β-actin基因表達(dá)情 況；圖IOB 檢測50M0I AdEasy-I-BmK CT感染C6細(xì)胞后不同時(shí)間點(diǎn)表達(dá)量。1 β -actin空白對照；2-7 重組腺病毒感染12-72小時(shí)間隔12小時(shí)PCR檢測3 -actin ；8 :DNA標(biāo)準(zhǔn)分 子量；9-14 對應(yīng)2-7模板PCR檢測BmK CT基因；15 空白對照。(3)體外檢測重組腺病毒抑制C6細(xì)胞增殖的研究見圖11，MTT 法檢測 AdEasy-l-BmK CT 和 AdEasy-cGFP 腺病毒感染 C6 細(xì)胞 48 小時(shí)(A)，72小時(shí)(B)，96小時(shí)(C)在不同腺病毒濃度作用下的的抑制率曲線(半抑制率 IC50 在 48 小時(shí) AdEasy-l-BmK CT 50M0I, AdEasy-cGFP 200M0I ；72 小時(shí) AdEasy-l-BmK CT 25M0I, AdEasy-cGFP 80M0I ；AdEasy-l-BmK CT 25M0I, AdEasy-cGFP 50M0I)以及 48 小時(shí) AdEasy-l-BmK CT半抑制率的劑量50M0I不同時(shí)間點(diǎn)的抑制率曲線⑶。(4)體內(nèi)檢測重組腺病毒在荷瘤鼠內(nèi)抑制C6腫瘤生長的研究利用SD大鼠構(gòu)建了腋附側(cè)荷C6膠質(zhì)瘤動物模型，用以檢測重組腺病毒在體治療 效果。當(dāng)模型鼠的腫瘤塊體積長到約為2cm3，隨機(jī)分為3組，每組6只，分別在瘤塊原位皮 下注射了不同劑量的AdEasy-l-BmK CT，AdEasy-cGFP和PBS，4天后測量瘤塊體積，做體 積-時(shí)間、抑制率-時(shí)間依賴性曲線(圖12)。圖中A為注射病毒后時(shí)間-瘤塊體積依賴 性曲線，由于自身免疫，瘤塊體積整體趨向消減，但在4天可以看出AdEasy-l-BmK CT治療 組相比AdEasy-cGFP治療組和PBS對照組瘤塊體積消減幅度較大；B為注射病毒后時(shí)間-抑 制率曲線，顯示出在4天AdEasy-l-BmK CT對瘤塊體積的抑制率達(dá)到50%。SEQUENCE LISTING<110>山西大學(xué)<120> 一種重組腺病毒及其制備方法和應(yīng)用<130〉.<160>4<170>PatentIn version 3.5<210>1<211>111<212>DNA<213>Buthus matensii Karsch<400>1atgtgtgggc cttgctttac aacggatgct aatatggcaa ggaaatgtag ggaatgttgc 60ggaggtattg gaaaatgctt tggcccacaa tgtctgtgta accgtatatg a111<210>2<211>111<212>DNA<213>Aritifical<400>2atgtgcggcc cctgcttcac caccgacgcc aacatggccc gcaagtgccg cgagtgctgc 60ggcggcatcg gcaagtgctt cggcccccag tgcctgtgca accgtatctg a111<210>3<211>26<212>DNA
<213>Aritifical
<400>3
ttgatatcat gtgcggcccc tgcttc26
<210>4
<211>28
<212>DNA
<213>Aritifical
<400>4
atctcgagtc agatacggtt gcacaggc28
8
權(quán)利要求
一種能在哺乳動物細(xì)胞中高效表達(dá)的東亞鉗蝎氯離子通道毒素(BmK CT)的基因，其特征在于，核苷酸序列為SEQ ID No.2。
2.一種重組腺病毒，含有核苷酸序列為SEQ ID No. 2的基因。
3.如權(quán)利要求2的重組腺病毒，其特征在于保藏號CGMCCNo. 3499。
4.如權(quán)利要求3所述的重組腺病毒的構(gòu)建方法，其特征在于，包括如下步驟(1)利用偏愛密碼子表合成能在哺乳動物細(xì)胞中高效表達(dá)的東亞鉗蝎氯離子通道毒素 基因(BmK CT)；合成特異性引物上游-tt gat ate atg tgc ggc ccc tgc ttc_3'-at ctc gag tea gat acg gtt gca cag gc_3，經(jīng)PCR擴(kuò)增獲得蝎氯離子通道毒素基因，且分別在5’端和3’端加上Xho I 和Hind III酶切位點(diǎn)并連接到中間載體pShuttle-IRES-hrGFP-2中獲得重組質(zhì)粒 pShuttle-IRES-hrGFP-2-BmKCT ；(2)將重組質(zhì)粒pShuttle-IRES-hrGFP-2-BmKCT用Pme I酶切線性化后轉(zhuǎn)化含 有腺病毒基因組pAdEasy-Ι的BJ5183細(xì)菌中發(fā)生同源重組，篩選出重組腺病毒基因組 PAdEasy-I-BmKCT后轉(zhuǎn)化到XLlO Gold細(xì)菌中大量復(fù)制，將重組的腺病毒基因組酶切線性 化后轉(zhuǎn)染AD293細(xì)胞，包裝復(fù)制后獲得重組腺病毒AdEasy-I-BmK CT ；(3)將步驟(2)獲得的重組腺病毒AdEasy-I-BmKCT感染AD293細(xì)胞并在細(xì)胞內(nèi)大 量擴(kuò)增，待細(xì)胞全部出現(xiàn)病變時(shí)收集細(xì)胞，-SO0C /37°C反復(fù)凍融3-4次使細(xì)胞裂解，收集 裂解液，CsCl密度梯度離心，取中間層透析去除病毒液中CsCl，獲得大量的重組腺病毒 AdEasy-I-BmK CT0
5.如權(quán)利要求2或3所述的重組腺病毒在制備治療神經(jīng)膠質(zhì)瘤藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
利用哺乳動物偏愛密碼子表優(yōu)化并合成東亞鉗蝎氯離子通道毒素(BmK CT)基因，將其克隆到腺病毒中間載體中獲得含該毒素基因的重組質(zhì)粒pShuttle-IRES-hrGFP-2-BmK CT，將該重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到含有腺病毒骨架基因組的大腸桿菌BJ5183中，同源重組后獲得pAdEasy-1-BmK CT，重組的腺病毒基因組轉(zhuǎn)染到AD293細(xì)胞中，經(jīng)包裝和純化獲得含東亞鉗蝎氯離子通道毒素基因的重組腺病毒顆粒AdEasy-1-BmK CT。氯離子通道毒素對神經(jīng)膠質(zhì)瘤有抑制作用，以腺病毒為載體可以提高對神經(jīng)膠質(zhì)瘤的感染效率和作用時(shí)間，該重組腺病毒作為藥物在神經(jīng)膠質(zhì)瘤的基因治療方面有良好的應(yīng)用前景。
文檔編號C12N15/12GK101921769SQ201010033368
公開日2010年12月22日 申請日期2010年1月11日 優(yōu)先權(quán)日2010年1月11日
發(fā)明者付月君, 張志云, 杜軍, 楊仁佳, 柴寶峰, 梁愛華, 王偉, 申泉 申請人:山西大學(xué)