專利名稱：一種果膠酶固定化的載體及固定化方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種果膠酶固定化載體及其制備方法，本發(fā)明還涉及果膠酶固定化 方法，屬于酶工程領域。
背景技術：
果膠酶是催化果膠質(zhì)分解的多種酶的總稱，它們被廣泛應用于食品加工、釀 酒、紡織等行業(yè)，已成為世界四大酶制劑之一。隨著我國食品工業(yè)的迅速發(fā)展，對果膠 酶的需求量日益增大，而目前果膠酶多為一次性使用。由于游離果膠酶對環(huán)境變化的 耐受力極低，易變性失活，且不宜與底物和產(chǎn)物分離，很大程度上限制了它的大規(guī)模應用。酶固定化是酶工程的新技術。固定化酶具有重復利用其催化活性，降低成本， 能實現(xiàn)連續(xù)自動化生產(chǎn)，提高產(chǎn)品質(zhì)量等優(yōu)點。目前關于固定化果膠酶的研究，雖然比 游離果膠酶在耐pH值穩(wěn)定性、熱穩(wěn)定性和貯存穩(wěn)定性等方面有較大提高，但由于固定化 載體強度等方面原因，仍存在酶活回收率低等不足，從而制約了固定化果膠酶在食品工 業(yè)生產(chǎn)中的應用。因此，進一步尋求實用、有效的果膠酶固定化載體和固定化方法仍然 是該領域的重要研究課題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之一是提供一種實用、有效的果膠酶固定化載體及其制備方法；本發(fā)明的目的之二是提供一種果膠酶固定化的方法；本發(fā)明的上述目的是通過以下技術方案來實現(xiàn)的1、一種果膠酶固定化的載體及其制備方法(1)本發(fā)明果膠酶固定化載體的組成果膠酶固定化的載體由以下組分構成海藻酸鈉水溶液，F(xiàn)e3O4磁粉、戊二醛水 溶液。為了達到更好的效果，優(yōu)選的各組分的濃度為海藻酸鈉水溶液-5%， Fe3O4磁粉0.2%-0.8%，戊二醛更優(yōu)選的各組分的濃度為海藻酸鈉水溶液 2%, Fe3O4 磁粉 0.6%，戊二醛 3%。海藻酸鈉是一種從海藻中提取的親水性膠態(tài)多聚糖，它是由β-(1，4)D-甘露 糖醛酸和α-(1，4) L-古羅糖醛酸組成的線性高分子化合物，其分子含有自由的羧基和 羥基，可溶于不同溫度的水中，溶于乙醇、乙醚及其他有機溶劑。海藻酸鈉可生物降 解，生物相容性好，穩(wěn)定、無毒、成膜性或成球性較好。海藻酸鈉既是一種安全的食品 添加劑，而且可作為仿生食品或療效食品的基材，也是最常用的囊材與載體材料。海藻酸鈉在市場上有售，例如國藥集團化學試劑有限公司等；凡從市場上購 買得到的海藻酸鈉都可用于本發(fā)明，均能達到本發(fā)明的技術效果。本發(fā)明中所述的Fe3O4磁粉制備方法為取等量的0.5mol/LFeCl2 · 4H20和0.5mol/L FeCl3 · 6H20溶液于燒杯中混勻，攪拌均勻后，快速加入一定量3mol/L的
NaOH溶液，劇烈攪拌30分鐘，用磁鐵吸住燒杯底部，傾去上清液，用蒸餾水沖洗直至 中性，干燥即得Fe3O4磁核。本發(fā)明中所述的戊二醛為分析純級化學試劑，化學試劑公司有售。(2)本發(fā)明果膠酶固定化載體的制備方法配制濃度為2%海藻酸鈉水溶液，按海藻酸鈉與磁粉的質(zhì)量比4 1加入自制的 Fe3O4磁粉，攪拌均勻，用注射器注入到濃度CaCl2凝結液中，得到顆粒均勻、形狀規(guī) 整的小球，水洗至中性，丙酮洗滌，50°C真空干燥。取干燥的小球加入3%的戊二醛溶 液，使之浸沒，并于30°C振蕩2h，用水和丙酮反復洗滌，50°C真空干燥，得到交聯(lián)的磁 性海藻酸鈉復合小球載體。2、本發(fā)明的另外一個目的是提供一種果膠酶固定化的方法取本發(fā)明制備的交聯(lián)磁性海藻酸鈉復合小球載體，加入一定量果膠酶溶液，并 以pH為3-3.5的緩沖液定容構成固定化體系，于40°C下振蕩40-60min，用少量蒸餾水洗 滌后，置于0_4°C冰箱保存。對應用于果蔬加工的市售果膠酶，該固定體系中載體與酶的相對量，以每 IOOml體系溶液中載體2g，果膠酶15mg為宜；更優(yōu)選的固定條件為pH為3，震蕩時間 40-45min。實驗證明，本發(fā)明交聯(lián)磁性海藻酸鈉復合載體固定化果膠酶的酶活回收率達 90%以上，重復使用5次后的酶活力保留達68.7%。本發(fā)明對于果膠酶在果品加工等領 域具有廣泛應用前景。


圖1本發(fā)明磁性海藻酸鈉固定化果膠酶的最適溫度考察，及其與游離酶、非磁 性海藻酸鈉載體固定化酶受溫度影響的比較。圖2本發(fā)明磁性海藻酸鈉固定化果膠酶的最適pH值考察，及其與游離酶、非磁 性海藻酸鈉載體固定化酶受pH值影響的比較。圖3本發(fā)明磁性海藻酸鈉固定化果膠酶的溫度穩(wěn)定性考察，及其與游離酶、非 磁性海藻酸鈉載體固定化酶的溫度穩(wěn)定性比較。圖4本發(fā)明磁性海藻酸鈉固定化果膠酶的重復使用性考察，及其與非磁性海藻 酸鈉載體固定化酶重復使用性比較。
具體實施例方式下面結合具體實施例來進一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點和特點將會隨著描述 而更為清楚。但這些實施例僅是范例性的，并不對本發(fā)明的范圍構成任何限制。本領域 技術人員應該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對本發(fā)明技術方案的細節(jié) 和形式進行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護范圍內(nèi)。實驗例11.材料與方法1.1主要設備
離心機(LX3-64-01型)；恒溫水浴振蕩器(SHY-2A型)；分光光度計(722 型)；烘箱(DS-206型)；pH計CPHS-25型)；真空干燥箱(ZD79-A)；磁力加熱攪拌 器(CJJ78-1)離心機 LX3-64-01 型1.2主要實驗材料1.2.1 酶果膠酶(PC-3天津市利華酶制劑技術有限公司)1.2.2載體制備試驗材料海藻酸鈉(國藥集團化學試劑有限公司)；Fe304(自制)；戊二醛1.2.3其它材料果膠(G5325廈門興隆達化學試劑有限公司)；半乳糖醛酸3，5-二硝基水楊酸(DNS)苯酚氫氧化鈉氨水檸檬酸檸檬酸 鈉亞硫酸鈉酒石酸鉀鈉氯化鈣(均為分析純級)1.3主要試劑的配制1.3.11%果膠底物精確稱取果膠粉lg，用一定pH的檸檬酸_檸檬酸鈉緩沖液溶解，充分攪拌并定 容至100ml，4 °C冰箱冷藏。1.3.2果膠酶溶液精確稱取果膠酶lg，用一定pH值的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液溶解并定容至 100ml，得10mg/mL果膠酶溶液。1.3.3檸檬酸_檸檬酸鈉緩沖液取檸檬酸21.01g，用水溶解并定容至lOOOmL。取檸檬酸鈉29.41g，用水溶解并 定容至lOOOmL。取一定量上述兩種溶液，混勻，用pH計測定其pH值，得所需pH值 緩沖溶液。1.3.4DNSi式齊[J將6.3000g 3，5- 二硝基水楊酸和 262mL2.0mol/LNaOH 溶液，加到 500mL 含有 182.0g酒石酸鉀鈉的熱水溶液中，再加5.0g苯酚、5.0g無水亞硫酸鈉，攪拌溶解，冷卻 后加蒸餾水定容至lOOOmL，保存于棕色瓶、置冰箱備用(放置72h后使用)。1.4果膠酶固定化載體_磁性海藻酸鈉復合小球的制備方法配制濃度為2%海藻酸鈉水溶液，按海藻酸鈉與磁粉的質(zhì)量比5 1加入自制的 Fe3O4磁粉，攪拌均勻，用注射器注入到濃度CaCl2凝結液中，得到顆粒均勻、形狀規(guī) 整的磁性海藻酸鈉復合小球，水洗至中性，丙酮洗滌，50°C真空干燥。取干燥的磁性海 藻酸鈉復合小球加入3%的戊二醛溶液，使之浸沒，并于30°C振蕩2h，用水和丙酮反復 洗滌，50°C真空干燥，得到交聯(lián)的磁性海藻酸鈉復合小球載體。1.5果膠酶固定化方法取0.5g磁性海藻酸鈉復合載體，加入0.5ml濃度為10mg/ml的酶液，用一定pH 的緩沖液定容25ml (體系酶濃度為0.20mg/ml)。40°C下振蕩lh，用少量蒸餾水洗掉未固 定上的酶，置于0-4°C冰箱保存。1.6酶活測定方法1.6.1基本原理
果膠酶在一定溫度、時間和條件下水解果膠，釋放出還原性半乳糖醛酸，與3， 5_ 二硝基水楊酸共熱產(chǎn)生棕紅色的氨基化合物，即發(fā)生顯色反應。在一定范圍內(nèi)，水解 生成D-半乳糖醛酸的量與吸光度成正比，與果膠酶活力成正比，通過分光光度計測定吸 光度，在540nm下測器吸光度，可以計算出果膠酶的活力。1.6.2測定方法于甲、乙兩支25mL比色管中分別加入果膠底物5ml，50°C水浴中預熱 5min；.向甲、乙管中分別加pH為3的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液4ml，向甲管加入Iml稀 釋酶液，立即搖勻，在50°C水浴中準確反應30min，再向乙管中加Iml稀釋酶液并立即置 沸水浴中煮沸5min，終止反應，冷卻；.分別取甲、乙管中反應液2ml于兩支25ml比色 管中，再各加2ml蒸餾水、5mlDNS試劑，混勻，沸水浴5min，取出，立即冷卻。加蒸 餾水定容至25ml。以標準空白為基準調(diào)零，540nm處測吸光度。固定化果膠酶酶活測定方法是將方法中的Iml稀釋酶液替換為相應量的固定化 果膠酶。1.6.3酶活計算以Ig酶粉或ImL酶液Ih從底物溶液中分解產(chǎn)生Img的半乳糖醛酸為一個酶活
單位計算酶活力
酶活(mg/hTIll) (A甲-A乙)xDrx5
Kxt式中Af :酶樣吸光度；Ai :酶空白吸光度；K 標準曲線的斜率；5 :測 定酶活時取了反應液的1/5 ； Dr 稀釋倍數(shù)；t 反應時間(h)1.7半乳糖醛酸標準曲線的繪制分別取濃度為1.0000g/L半乳糖醛酸標準溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、 1.4、1.6ml，用蒸餾水補至5ml，加5mlDNS，沸水浴5min，冷卻后，用蒸餾水定容至
25.0ml，以空白為參比調(diào)零，用分光光度計在540nm波長下測吸光度。以吸光度為縱坐 標，半乳糖醛酸含量為橫坐標，繪制標準曲線。表1半乳糖醛酸標準曲線數(shù)據(jù)表
組別12345678半乳糖醛酸含量(mg)0.20.40.60.81.01.21.41.6吸光度A0.0170.1040.2050.3100.4210.5400.6520.757由表1計算得標準曲線回歸方程為Y = 0.5379X-0.1086 ；相關系數(shù)R2 = 0.9985。1.8酶活回收率的計算
酶活回收率=醜化果膠_活力X·。/。 ^游離果膠酶的活力
根據(jù)1.6方法測得未經(jīng)固定的游離果膠酶活力為57613mg/hXml。2.試驗方法及結果以本發(fā)明的磁性海藻酸鈉復合小球載體和固定化方法固定化果膠酶，考察不同 固定條件下固定化酶的活力及酶活回收率。2.1體系pH因素對酶活的影響以磁性海藻酸鈉復合小球載體，按1.5方法固定化果膠酶，實驗分為5組，各組 定容所用緩沖溶液的pH值分別為2.5、3.0、3.5、4.0、4.5。按1.6方法測酶活力，結果 見表2。表2不同pH值條件下固定化果膠酶的酶活
權利要求
1. 一種果膠酶固定化的載體及固定化方法，載體包括以下彼此獨立的各組分組成 海藻酸鈉、Fe3O4磁粉、戊二醛水溶液。
2.按照權利要求1所述的果膠酶固定化的載體，其特征在于，各組分的濃度分別為 海藻酸鈉水溶液1 % _5 %，F(xiàn)e3O4磁粉0.2 % -0.8 %，戊二醛1 % -7 % ；
3.按照權利要求2所述的果膠酶固定化的載體，其特征在于，各組分的濃度分別為 海藻酸鈉水溶液2 %，F(xiàn)e3O4磁粉0.6 %，戊二醛3 % ；
4.權利要求1所述果膠酶固定化載體的制作方法，包括(1)配制海藻酸鈉水溶液， 加入自制的Fe3O4磁粉，攪拌均勻，用注射器注入到CaCl2凝結液中，得到顆粒均勻、形 狀規(guī)整的磁性海藻酸鈉復合小球，水洗至中性，丙酮洗滌，50°C真空干燥。(2)取干燥的 磁性海藻酸鈉復合小球加入戊二醛溶液，使之浸沒，并于30°C振蕩2h，用水和丙酮反復 洗滌，50°C真空干燥，得到交聯(lián)的磁性海藻酸鈉復合小球載體。
5.權利要求1所述的固定化方法，包括將交聯(lián)的磁性海藻酸鈉復合小球載體、果 膠酶溶液，及一定pH的緩沖溶液定容的固定體系，40°C下振蕩40-60分鐘，用少量蒸餾 水洗滌后，置于0_4°C冰箱保存。
6.權利要求5所述的固定化方法，固定體系中載體與酶的相對量，以每IOOml溶液中 載體2g，果膠酶15-20mg為宜；固定體系pH為3.0-3.5。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種果膠酶固定化的載體及固定化方法，屬于酶工程領域。本發(fā)明果膠酶固定化載體由海藻酸鈉、Fe3O4、戊二醛組成。其制備方法包括配制2％海藻酸鈉水溶液，加入一定量Fe3O4磁粉，攪勻，用注射器注入到1％濃度CaCl2水溶液中，得到顆粒均勻、規(guī)整的小球，經(jīng)水洗、干燥后，浸沒于3％戊二醛溶液，30℃振蕩2h，水洗，干燥，即可。將以載體、果膠酶液及一定pH的緩沖液構成的體系，于40℃下振蕩一小時，蒸餾水洗滌，得固定化酶，于0-4℃冰箱保存。實驗證明，本發(fā)明載體固定化果膠酶的酶活回收率達90％以上，重復使用5次后的酶活力保留達68.7％。本發(fā)明對于果膠酶在果品加工等領域具有廣泛應用前景。
文檔編號C12N11/00GK102010858SQ20101003379
公開日2011年4月13日 申請日期2010年1月14日 優(yōu)先權日2010年1月14日
發(fā)明者厲重先, 李祖明, 李鴻玉 申請人:北京聯(lián)合大學