專利名稱：北京鴨表皮干細胞的分離和培養(yǎng)方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種鴨表皮干細胞的分離和培養(yǎng)方法，具體地說是利用北京鴨背部皮 膚進行分離和培養(yǎng)、傳代培養(yǎng)并鑒定。屬于細胞生物學領域。
背景技術：
隨著科技的發(fā)展和人們物質(zhì)生活需求的不斷提高，畜牧業(yè)生產(chǎn)正朝著高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、 抗逆、抗病及集約化的方向快速轉變和發(fā)展。在大多數(shù)發(fā)達國家里，由于人們過于追求經(jīng)濟 利益等緣故，大量繁育的畜禽只是少數(shù)經(jīng)濟價值高的品種和雜交種，因而，導致了很多產(chǎn)量 不高、品質(zhì)不佳、抗逆和抗病力差的地方品種瀕臨滅絕，甚至滅絕。雖然相關的國際組織、政 府部門和專家學者對畜禽遺傳資源的保存和管理工作相當重視，但畜禽種質(zhì)資源仍在大量 喪失，遺傳多樣性遭到了前所未有的破壞，并且危機程度日益加劇。據(jù)統(tǒng)計，全球6165個畜禽品種中，有740(12. 00% )個已經(jīng)滅絕、513(8. 16% )個 瀕臨滅絕、1092 (17. 71% )個瀕危、有1407(22. 18% )個狀況不清楚，只有2395 (38. 8% ) 個處于非危機狀態(tài)。1999年已經(jīng)滅絕、瀕臨滅絕及瀕危的品種占品種總數(shù)的比例較1995年 所占的比例分別增加了 82. 09%,37. 54%U9. 02%。據(jù)2000年聯(lián)合國糧農(nóng)組織(FAO)與聯(lián) 合國環(huán)境規(guī)劃署的報道，目前全球畜禽品種以每周減少2個品種的速度在喪失，在被FAO所 記錄的2576個畜禽品種中，幾乎半數(shù)被認為是瀕危畜禽資源，約有1350個品種面臨滅絕， 使世界畜禽種質(zhì)資源出現(xiàn)越來越狹窄的格局，因此挽救和保護瀕危畜禽品種已成為當務之急。我國動物遺傳資源豐富，是世界上畜種資源最豐富的國家之一。許多地方畜禽品 種以其優(yōu)良的遺傳性狀和特有的經(jīng)濟價值聞名于世，為世界畜牧業(yè)的發(fā)展作出了巨大的貢 獻。但由于近年來國外優(yōu)良畜禽品種大量引進、對地方品種的盲目雜交改良以及片面追逐 短期經(jīng)濟效益等多方面因素，地方畜禽品種受到嚴重沖擊，數(shù)量迅速減少。畜禽的品種及其演化往往是對人類勞動過程、膳食、宗教信仰、風俗習慣的記述， 是人類歷史文化的具體體現(xiàn)形式，具有一定的歷史文化價值。許多品種具有珍貴的DNA序 列、特殊的生理特性、獨特的抗病性以及適應性等，可作為科研模型的理想選擇。其遺傳多 樣性為育種學家提供了豐富的育種材料，創(chuàng)造了無限的選擇空間，降低了畜牧業(yè)所面臨的 風險和挑戰(zhàn)，增強了畜牧業(yè)內(nèi)在的韌性和外在的機遇，使人類游刃有余地應對自然環(huán)境和 市場的不斷變化，為畜牧業(yè)的發(fā)展注入無限的生機和活力。保護畜禽遺傳資源的多樣性，既 是中國可持續(xù)發(fā)展的需要，又是國際社會極為關注并為之努力工作的熱點。隨著體外培養(yǎng)技術和體細胞克隆技術的發(fā)展和不斷完善，為畜禽基因資源的保存 提供了新的方法和途徑，體細胞、干細胞保存等新方法逐漸成為資源保存較為理想的方法。要盡量全面、妥善地保護現(xiàn)有畜禽品種的種質(zhì)資源，其實質(zhì)就是使現(xiàn)有基因庫中 的基因資源盡量全面保存，根據(jù)動物遺傳資源多樣性在不同層次的特點，可以采取不同的 保種措施和方法，主要有活體保種法、保存基因和冷凍保存法等，畜禽胚胎干細胞以及成體 干細胞的研究為保護畜禽遺傳資源多樣性方面開辟了一條新的途徑。
近年來，由于體外培養(yǎng)細胞在遺傳資源保存和生命科學研究等諸多方面具有巨大 的科學價值和應用價值，已引起各國政府高度重視。除美國外，日本大阪發(fā)酵所(IFO)德國 培養(yǎng)物保藏所(DSM)等都在逐漸擴大保藏范圍，將細胞培養(yǎng)物列入保藏對象。細胞是生物體最小的結構和功能單位。有機體每個細胞的核含有完整的遺傳信 息，這至少在理論上有可能使個別動物的遺傳信息以細胞或細胞核的形式保存。細胞可以 在超低溫條件下長期保存，即使活體動物消失，只要存在同種物種，通過胚胎移植、核移植 等技術就可以恢復這些遺傳資源。只要完整的保存了具有生物活性的細胞就相當于保存了 一個完整的動物個體所有遺傳信息。因此，畜禽基因資源的體細胞、干細胞保存作為一種新型、安全的離體保存方法切 實可行，不僅在細胞水平上將畜禽基因資源長期保存下來，而且為從細胞和分子水平研究 現(xiàn)代生物學和醫(yī)學，特別是動物分類、系統(tǒng)演化、物種起源及其它分子生物學研究提供了寶 貴的試驗材料。這對于保護瀕危動物和遺傳品質(zhì)優(yōu)秀的基因都具有重要意義。自國家“七五”計劃以來，北京鴨育種始終被列為國家重點科研項目。北京鴨是世 界著名的肉用型鴨品種，是我國優(yōu)良地方品種。鴨是鳥綱雁形目鴨科鴨亞科水禽的統(tǒng)稱。原 產(chǎn)于中國北京西郊，已有近300年的飼養(yǎng)歷史。除北京外，還分布于天津、上海、廣東、遼寧、 黑龍江、內(nèi)蒙古、山西、河南等地。1873年傳去美國，后又經(jīng)美國傳至歐洲和日本等。該品 種體型較大而緊湊勻稱，頭大頸粗，體寬、胸腹深、腿短，體軀呈長方形，前軀高昂，尾羽稍上 翹。公鴨有鉤狀性羽，兩翼緊附于體軀，羽毛純白略帶奶油光澤。喙和皮膚橙黃色，踱蹼為 橘紅色。目前采用農(nóng)戶分散飼養(yǎng)和一些大小不等的鴨場飼養(yǎng)。但是，由于近幾十年來自然 環(huán)境的污染和惡化，的種質(zhì)資源已經(jīng)嚴重匱乏，在絕大多數(shù)地區(qū)已經(jīng)滅絕，在小部分地區(qū) 也只還存在有限的數(shù)目，而目前人工繁育所面臨的多方面技術問題導致其繁育效果不佳， 我國北京鴨面臨瀕臨滅絕的危險。因此，為保護國家珍惜禽種，一個最優(yōu)的方法是對北京鴨 細胞的培養(yǎng)并加以保藏。但是，由于北京鴨表皮干細胞分離很困難，對培養(yǎng)環(huán)境十分敏感。若真皮和表皮未 分離而直接用組織塊法培養(yǎng)，其所獲得的干細胞數(shù)量極少，細胞類型多而雜，如?；祀s有大 部分的成纖維細胞和毛囊細胞，隨著培養(yǎng)時間的延長，培養(yǎng)物所含各種類型細胞間的生長 期限出現(xiàn)差異，成纖維細胞有經(jīng)過適應生長階段而加速繁殖生長，而目的細胞則死亡，或者 經(jīng)過逐步退化而至死亡。而第一代細胞培養(yǎng)技術核心問題是難以產(chǎn)業(yè)化或者說是規(guī)?；?產(chǎn)一是在工藝生產(chǎn)時不能大規(guī)模制備產(chǎn)品；二是非批量生產(chǎn)容易導致產(chǎn)品質(zhì)量的不均一 性；三是難以對同批生產(chǎn)進行生產(chǎn)和質(zhì)量控制。而采用玻璃瓶靜置或旋轉瓶的培養(yǎng)方法，也 已不能滿足所需細胞數(shù)量及其分泌產(chǎn)物。目前使用較多的反應器培養(yǎng)雖可以獲得高密度細 胞，但是擴大規(guī)模較難，只適合于少量、價值高的細胞培養(yǎng)。目前，常采用EB病毒轉化技術、貼壁培養(yǎng)法和膠原酶消化技術進行禽類品種體外 細胞的大量培養(yǎng)，但對比試驗結果表明EB病毒轉化技術對于禽類品種的體外細胞培養(yǎng)并 不適用，其培養(yǎng)的細胞活率及純度均不能達到所需標準，EB病毒轉化技術對于人類和靈長 類動物的細胞培養(yǎng)效果要優(yōu)于禽類細胞培養(yǎng)；膠原酶消化技術和貼壁培養(yǎng)法獲得的原代細 胞分別經(jīng)傳代后接種，細胞群體倍增時間(PDT)分別為35. 9h和48h。但前者操作步驟繁雜， 不適合于體外大規(guī)?；毎呐囵B(yǎng)，后者簡單易行，適合于體外大規(guī)模化細胞的培養(yǎng)。因此 建立細胞系以采用后者為佳。對于禽類細胞保藏而言，細胞純度及活性均有較高的要求，目前，貼壁培養(yǎng)方法存在諸多弊端，如方法單一、成本過高、細胞活性及純度偏低、細胞凍存復 蘇后死亡率過高等。因此，現(xiàn)在急需對其方法改進以使北京鴨表皮細胞達到高細胞活率高 純度的標準已得到很好的保藏并延續(xù)下去。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個目的是提供北京鴨表皮干細胞簡單易行的取材方法。本發(fā)明的另一目的在于提供上述干細胞的分離和培養(yǎng)方法。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取以下技術方案北京鴨表皮干細胞具有以下形態(tài)學特征具有未分化細胞的結構及形態(tài)特征，表 現(xiàn)為細胞體積小，呈球形，胞體透亮，折光性強，核質(zhì)比高，胞內(nèi)細胞器少。，一種北京鴨表皮干細胞的分離和培養(yǎng)方法，該方法包括下述步驟(1)取材將北京鴨處死后，抓緊其頭部與尾部，盡量把背部部位暴露得最大，可 以盡可能多的取材，并使其皮膚緊繃，有利于退毛。沿著逆毛方向拔毛，拔完較長的毛后，皮 膚上還有很多小絨毛，這時只要帶上手套在皮膚上輕輕蹭就能很干凈地把其除去。毛退干 凈后，用眼科剪把皮膚剪開，在用眼科鑷輕輕把皮膚撕下，放入分別加有100IU/mL青霉素 和鏈霉素的PBS中，盡快帶回無菌間。在細胞的分離和培養(yǎng)中，取材不僅僅是分離和培養(yǎng)的前提，而且是很關鍵的一 步。文獻報道，豬、羊是在耳中部血管相對較少處，刮毛消毒，用耳號鉗剪下一塊大小約 0. 5X0. 5cm2的皮膚；人是取水囊引產(chǎn)的健康孕20J8周胎兒的皮膚或成人整形外科手術 后剩余皮膚或包皮環(huán)切術后的包皮；鼠類是取胎兒或剛出生后不久的鼠背部皮膚。以上所 用這些取材方法都不適用于北京鴨。北京鴨沒有相對硬實的耳朵；北京鴨在胚胎10日齡后 毛發(fā)開始發(fā)育，取7-15日齡的胚胎在體式顯微鏡下剝?nèi)∑つw，在4°C消化過夜后，皮膚全部 成彌亂狀，根本無法把表皮與真皮分開；北京鴨一出生就有毛，不像鼠類。為了解決這一難 題，在剛開始實驗時，用刀片刮毛不僅刮不干凈，還容易把皮膚劃破?？赡苁区喥つw比較稚 嫩且太軟不容易固定。后來想辦法用寬膠帶粘貼時，不僅容易把皮粘貼破，而且比較費時。 需要強調(diào)的是退毛時，手套與鴨背一定要保證是干燥的，不然不僅毛退不干凈，培養(yǎng)時易 污染；而且還會含有很多毛囊細胞，導致細胞不純。(2)沖洗與消化皮樣在75%的酒精中浸泡30S后，用分別加有100IU/mL青霉素 和鏈霉素的PBS或0. 75%生理鹽水沖洗10次，每次5min。取沖洗干凈的皮樣，用眼科鑷夾 住其中一角并吊起，在干凈的皿上方把之剪成0. 2X0. 2cm2的小塊，然后用0. 2ml或Iml移 液器把組織周圍的PBS或0. 75%生理鹽水吸干，加入2. 5g/L的中性蛋白酶，于4°C冰箱中 消化。文獻中豬、羊是用柳葉刀輕刮皮膚表面以去除血污毛發(fā)少量死亡角質(zhì)化細胞。但 北京鴨皮膚用柳葉刀刮時易劃破。在實驗中發(fā)現(xiàn)用眼科剪的鈍面輕輕刮則不會出現(xiàn)類似的 問題。邊清洗邊小心分離皮下結締組織及大部分真皮。另外，與文獻中有所不同并需要強 調(diào)的是在整個沖洗過程中，由于不僅要輕輕刮去血污毛發(fā)少量死亡角質(zhì)化細胞，而且要保 證每個地方都清洗干凈，所以導致皮膚容易變形且卷曲甚至會卷成很多圈，故需要多次把 之分小，最后剪成0. 2cmXl-2cm的條狀。(3)原代培養(yǎng)消化好以后，用分別加有100IU/mL青霉素和鏈霉素的PBS或0. 75 %生理鹽水沖洗4-5次，分離真皮和表皮。真皮面朝下貼于六孔板中或35mm培養(yǎng)皿中， 每孔(皿)3-4塊，塊與塊之間的距離在Icm左右為宜。用0. Iml或0. 2ml的移液器把組織塊 邊緣的PBS或0.75%生理鹽水吸走，在培養(yǎng)箱(37°C，5% CO2)中倒置20-30min。干置后，用 0. Iml或0. 2ml的移液器慢慢地且少量地添加培養(yǎng)基于組織塊周圍，每孔(皿)0. 2-0. 3mL· 第二天每孔補加培養(yǎng)液2mL，每3天換液一次。由于鴨的表皮非常薄，不像鼠類比較厚，故很容易粘在眼科鑷、皿的邊沿，所以取 分離好的表皮時，只需夾住其中的一個小角或讓其附在眼科鑷上即可，這樣不容易粘住。由 于鴨表皮很薄，不像鼠類的較厚，干置后添加培養(yǎng)基時要極其小心，不然容易漂起。(4)傳代培養(yǎng)典型的干細胞集落形成后2-3天，即可傳代。先用0.25%胰蛋 白酶消化4-5min，去消化液后，用細胞刮刀把細胞刮下來。再加0. 胰蛋白酶再次消化 10-15min，用含有血清的培養(yǎng)液中和，1500rpm離心10分鐘清洗。用培養(yǎng)基制成細胞懸液， 接種在鋪有IV型膠原的六孔板中或35mm培養(yǎng)皿中，37 °C、5% CO2和飽和濕度連續(xù)培養(yǎng)。以 后用同樣方法傳代。(5)鑒定制備細胞爬片，參照抗體說明書分別進行β 1-整合素、CKlO和CK19免疫熒光檢 測。Α.細胞爬片用PBS緩沖液(ρΗ7· 2 7. 4)清洗3次，每次5min。B. 4%的多聚甲醛固定30min，清洗3次，每次5min。C. 0. 2% TritonX-IOO 處理 lOmin，PBS 緩沖液(pH7. 2 7. 4)清洗 3 次，每次 5min。D.用含 3% BSA 的 PBS 在 37°C，封閉 30min。清洗 3 次，每次 5min。Ε.滴加適當稀釋的抗β 1-整合素、CKlO和CK19的-抗，置于濕盒內(nèi)，37°C保溫 30-40min。清洗 3 次，每次 5min。F.滴加稀釋后的FITC標記的羊抗鼠的二抗IgG，置于濕盒內(nèi)，37°C保溫40min。PBS 洗3次，每次5min。放置在激光共聚焦顯微鏡下觀察。上述北京鴨表皮干細胞的分離和培養(yǎng)方法，其中，步驟(1)中所述的北京鴨雛鴨 為1日齡。上述的北京鴨表皮干細胞的分離和培養(yǎng)方法，其中，步驟O)中所述的消化的具 體方法是剪好的2-3只北京鴨的皮膚一起放在一個60mm的平皿中，加入2. 5g/L中性蛋白 酶12-15ml，于4°C冰箱中消化12_13h。上述的北京鴨表皮干細胞的分離和培養(yǎng)方法，其中，步驟C3)初代培養(yǎng)所用的培 養(yǎng)基是由 DMEM/F12+20% FBS+15ng/ml EGF+20ng/mlIGF+5 μ g/ml 胰島素組成。上述的北京鴨表皮干細胞的分離和培養(yǎng)方法，其中，步驟(4)傳代培養(yǎng)用冷熱消 化相結合的方法，具體步驟是用PBS洗細胞2-3次后，用0. 25%胰蛋白酶消化4-5min，去 消化液后，用細胞刮刀把細胞刮下來。再加0. 胰蛋白酶在37°C消化8-lOmin后，在顯微 鏡下觀察，細胞成片嚴重或細胞團塊大的，再室溫消化4-5min。用含有血清的培養(yǎng)液中和， 1500rpm離心10分鐘清洗。用培養(yǎng)基制成細胞懸液，接種在鋪有IV型膠原的六孔板中或 35mm培養(yǎng)皿中，37°C、5% CO2和飽和濕度連續(xù)培養(yǎng)。本發(fā)明的優(yōu)點與效果本發(fā)明對于取材方法的改進調(diào)整，可以使培養(yǎng)出的表皮干細胞無毛囊細胞和成纖維細胞等雜質(zhì)細胞，細胞純度與現(xiàn)有技術相比有大幅提高。與二步酶消化法相比，組織貼壁培養(yǎng)法的北京鴨表皮干細胞培養(yǎng)效率和質(zhì)量有很 大的提高，只需少量組織就能培養(yǎng)出大量細胞，且表皮可以重復利用多次。這樣既節(jié)約了取 材成本，又大幅提高了工作效率。組織貼壁培養(yǎng)法所得細胞活力高，細胞傳代次數(shù)多。因此， 利用貼壁培養(yǎng)法培養(yǎng)北京鴨表皮干細胞具有明顯的優(yōu)勢。本發(fā)明培養(yǎng)的細胞生長速度快、 成活率高、外源基因表達率高，應用范圍廣。本發(fā)明在方法等各方面彌補了現(xiàn)有禽體細胞保存狀況不理想的情況，北京鴨表皮 干細胞的活率及純度的提升也使重要、瀕危北京鴨品種的基因資源以體外培養(yǎng)細胞的形式 得以長期保存。由于北京鴨種質(zhì)資源的匱乏，使得對于北京鴨在各領域內(nèi)的研究成為空白。而本 發(fā)明所述的北京鴨表皮干細胞的分離和培養(yǎng)可以為醫(yī)學、細胞和分子生物學等生命科學研 究提供大量的高品質(zhì)材料；并可以作為禽體細胞克隆育種的供體細胞；在農(nóng)業(yè)上可以豐富 地方禽品種改良以及地方優(yōu)良禽品種保種的手段；還可以作為是疫苗生產(chǎn)的主要原材料及 肝細胞培養(yǎng)的飼養(yǎng)層；同時可用于細胞凋亡及細胞融合研究之用。下面結合附圖及最佳實施方式對本發(fā)明做進一步說明，以使公眾對發(fā)明內(nèi)容有整 體和充分的了解，而并非對本發(fā)明保護范圍的限定。前述部分已經(jīng)充分公開了本發(fā)明可以 實施的保護范圍，因此凡依照本發(fā)明公開內(nèi)容進行的任何本領域公知的等同替換，均屬于 對本發(fā)明的侵犯。


圖1為北京鴨表皮干細胞顯微鏡下圖(100X)，A為原代表皮干細胞，B為傳代前 鴨表皮干細胞，C為鴨第一代表皮干細胞；圖2為ESCs免疫熒光檢測，其中，A. CK19陽性細胞(100X) ；B. β 1_整合素陽性 細胞(100Χ) ；C. CKlO 陰性細胞(200X)；
D，Ε，F(xiàn).分別為Α，B, C的相差照片
具體實施例方式實施例中所用的主要儀器及試劑來源北京鴨來源北京鴨采自中國農(nóng)業(yè)科學院北京畜牧獸醫(yī)研究所家禽試驗基地。(一 )主要儀器設備UCO2 培養(yǎng)箱Heraeus BB16UV ；2、DL-CJ-2N高性能無菌實驗臺哈爾濱；3、IX-71倒置相差顯微鏡，CX31生物顯微鏡，IX-71倒置相差熒光顯微鏡
Olympus；4、TDL-40B 低速離心機CENTERI⑶GE ；5、頗爾超純水器Pall-pruelab_plus ；6、電動移液器德國Accu-jet ；7、_70°C低溫冰箱美國 kelvinator ；8、激光掃描共聚焦顯微鏡尼康TE-2000-E ；
9、一次性塑料培養(yǎng)皿Corning10、電熱恒溫水浴鍋DK_S12型上海森信實驗儀器有限公司11、立式壓力蒸汽滅菌器LS_B75江陰濱江醫(yī)療設備廠( 二 )主要試劑UDMEM/F12 2、胰島素:sigma, No. 155003、EGF =Sigma, No. E96444、IGF-I =Sigma No. 37695、IV 型膠原(Fluka, No. 27663)，6> Dispase II (中性蛋白酶，Invitrogen，No. 17105-041)，7、β I-整合素抗體=Sigma, 8, CK19，CKlO 抗體=Arp, 9,胰蛋白酶(Trypsin 1 250),10、特級胎牛血清(Defined FBS) =Hyclone ；(三)表皮干細胞培養(yǎng)所用試劑1、DMEM/F12培養(yǎng)基超純?nèi)羲芙庖淮鶧MEM/F12干粉，1. 2g的NaHCO3,加水定 容至1L, pH為7. 2 7. 4，0. 45 μ m與0. 22 μ m濾膜過濾除菌后，500ml/瓶分裝，4°C貯存。
分裝保存。2、胰島素(胰島素)取50 μ 1濃鹽酸(36. 46g/mol, 1. 19g/mL)溶于60ml四蒸水 配為0. 01mol/L鹽酸，取0. 01mol/L鹽酸50ml溶解IOOmg胰島素粉劑，過濾分裝，得到分裝 濃度為ang/mL的分裝液，可根據(jù)需要繼續(xù)稀釋分裝，標記后于_20°C保存?zhèn)溆谩?、EGF 量取 HAc (60. 05g/mol, 1. 05g/mL) 57. 2 μ 1 溶于 IOOmL 四蒸水，得到 IOmmol/LHAc 100ml，稱取BSA第五組分0. 2g溶于上述溶液，得到含0. 2%的10mmol/L HAc 100mL，0. 22 μ m濾膜過濾后取20ml溶解200 μ g EGF，分裝為10 μ g/mL，0. ImL/支的儲備液， 標記后于_20°C保存?zhèn)溆谩?、EGF-I 取100 μ 1醋酸(0. 1Μ，已用0. 22 μ m微孔濾膜過濾除菌)充分溶解 EGF-1，用IOmlPBS使其充分溶解，0. 22微孔μ m濾膜過濾除菌，400 μ 1 一管分裝，-20°C冰 箱中密封保存，使用使用CEG培養(yǎng)液稀釋為最終濃度。5、IV型膠原ImL 5mg/mL的IV型膠原溶于99mL 0. 25%的HAc，過濾標記后_20°C 保存?zhèn)溆?，用前以PBS稀釋至需要濃度，鋪板后回收過濾，4°C保存。6,2. 5g/L Dispase 稱取 0. 25g Dispase 溶于 100ml PBS 中或基礎培養(yǎng)液(不可 加熱)，磁力攪拌器緩慢攪拌溶解，0. 22 μ m微孔濾膜過濾除菌并分裝。7、培養(yǎng)基DMEM/F12+20% FBS+15ng/ml EGF+20ng/ml IGF+5 μ g/ml 胰島素組成， 0. 22 μ m濾膜過濾除菌后，500ml/瓶分裝，4°C貯存。8、雙抗貯存液100萬IU的鏈霉素4支，80萬IU的青霉素5支溶于400ml滅菌去 離子水中。9、IXPBS 緩沖液=NaCl 4. 00g, KCl 0. 10g, Na2HPO4 · 12H20 1. 45g, KH2PO4 0. 10g, 加三蒸水定容至500ml，pH為7. 2，高壓滅菌密封后4°C貯存。10,0. 25% (質(zhì)量體積比)胰蛋白酶溶液1. 25g胰蛋白酶干粉溶于PBS中，定容 至500ml，pH為7. 2 7. 4，0. 22 μ m濾膜過濾除菌后，分裝，_20°C貯存。
11,0. 75% (質(zhì)量比)生理鹽水7. 5g NaCl溶于1000ml三蒸水，高壓滅菌30min。(四)鑒定所用抗體1、鼠抗3 1_整合素2、鼠抗 CK10，CK193、山羊抗鼠FITC標記二抗實施例1北京鴨表皮干細胞的分離和培養(yǎng)(1)取材將北京鴨雛鴨處死后，抓緊其頭部與尾部，并使其皮膚緊繃，沿著逆毛 方向拔毛，拔完較長的毛后，帶上手套在皮膚上輕輕蹭把小絨毛除去，毛退干凈后，用眼科 剪把皮膚剪開，在用眼科鑷輕輕把皮膚撕下放入分別加有100IU/mL青霉素和鏈霉素的PBS 中，盡快帶回無菌間；(2)沖洗與消化皮樣在75%的酒精中浸泡30S后，用分別加有100IU/mL青霉素 和鏈霉素的PBS或0. 75%生理鹽水沖洗10次，每次5min，在清洗的同時小心分離皮下結締 組織及大部分真皮，剪成0. 2cmX l-2cm的條狀，最后剪成0. 2X0. 2cm2的小塊，把皮膚組織 周圍的PBS或0. 75%生理鹽水吸干，加入2. 5g/L的中性蛋白酶于4°C冰箱中消化；(3)原代培養(yǎng)消化好以后，用分別加有100IU/mL青霉素和鏈霉素的PBS或 0. 75 %生理鹽水沖洗4-5次，分離真皮和表皮，真皮面朝下貼于六孔板中或35mm培養(yǎng)皿中， 每孔(皿)3-4塊，塊與塊之間的距離在Icm左右，用0. Iml或0. 2ml的槍頭把組織塊邊緣的 PBS或0. 75%生理鹽水吸走，在37°C，5% CO2的培養(yǎng)箱中倒置20-30min，干置后，用0. Iml 或0. 2ml的移液器慢慢地且少量地添加培養(yǎng)基于組織塊周圍，每孔(皿)0. 2-0. :3ml，第二天 每孔補加培養(yǎng)基2mL，每3天換液一次；(4)傳代培養(yǎng)典型的干細胞集落形成后2-3天即可傳代，先用0. 25%胰蛋白 酶消化4-5min，去消化液后，用細胞刮刀把細胞刮下來，再加0. 1 %胰蛋白酶再次消化 10-15min，用含有血清的培養(yǎng)液中和，1500rpm離心10分鐘清洗，用培養(yǎng)液制成細胞懸液， 接種在鋪有IV型膠原的六孔板中或35mm培養(yǎng)皿中，37 °C、5% CO2和飽和濕度連續(xù)培養(yǎng)，以 后用同樣方法傳代。實施例2北京鴨表皮干細胞的鑒定對實施例1培養(yǎng)的北京鴨表皮干細胞進行鑒定，方法及結論如下。一、細胞形態(tài)學觀察方法細胞在體外培養(yǎng)過程中，對細胞進行常規(guī)檢查，觀察細胞生長狀態(tài)、培養(yǎng)液 顏色變化情況以及細胞是否發(fā)生污染。結論如圖1(北京鴨表皮干細胞)所示，當細胞生長狀態(tài)良好時，其形態(tài)為典型的 鋪路石樣，細胞體積小，核質(zhì)比高、細胞器少，細胞呈球形，致密，在顯微鏡下折光性強、胞體 透亮，證明細胞生長健康旺盛。二、細胞活率測定方法檢測細胞的存活率可采用臺盼藍拒染試驗，將待檢細胞復蘇后制成細胞懸液，取 10 μ 1細胞懸液加人10 μ 1 臺盼藍染液，混勻。血球計數(shù)板計數(shù)，健康活細胞胞體完整， 細胞透明，不著色，凡著色呈藍色者均為死細胞。計數(shù)1000個細胞，計算細胞存活率。數(shù)二 種細胞總數(shù)，以活細胞占細胞總數(shù)的百分比反映細胞活力。
結論對北京鴨表皮干細胞進行細胞活率測定。結果表明細胞活率在92%-96%之間。三、表面標志鑒定制備細胞爬片，參照抗體說明書分別進行β 1-整合素、CKlO和CK19免疫熒光檢 測。Α.細胞爬片用PBS緩沖液(ρΗ7· 2 7. 4)清洗3次，每次5min。B. 4%的多聚甲醛固定30min，清洗3次，每次5min。C. 0. 2% TritonX-IOO 處理 lOmin，PBS 緩沖液(pH7. 2 7. 4)清洗 3 次，每次 5min。D.用含 3% BSA 的 PBS 在 37°C，封閉 30min。清洗 3 次，每次 5min。Ε.滴加適當稀釋的抗β 1-整合素、CKlO和CK19的一抗，置于濕盒內(nèi)，37°C保溫 30-40min。清洗 3 次，每次 5min。F.滴加稀釋后的FITC標記的羊抗鼠的二抗IgG，置于濕盒內(nèi)，37°C保溫40min。PBS 洗3次，每次5min。放置激光共聚焦顯微鏡下觀察。結論如圖2所示，北京鴨表皮干細胞β 1-整合素陽性，CK19陽性，CKlO陰性。以上結果說明了所培養(yǎng)的北京鴨表皮干細胞可以用于組織工程研究等領域。
權利要求
1.北京鴨表皮干細胞的分離和培養(yǎng)方法，包括以下步驟，(1)取材將北京鴨雛鴨處死后，抓緊其頭部與尾部，并使其皮膚緊繃，沿著逆毛方向 拔毛，拔完較長的毛后，帶上手套在皮膚上輕輕蹭把小絨毛除去，毛退干凈后，用眼科剪把 皮膚剪開，在用眼科鑷輕輕把皮膚撕下放入100IU/mL雙抗PBS中，盡快帶回無菌間；(2)沖洗與消化皮樣在75%的酒精中浸泡30S后，用分別加有100IU/mL青霉素和鏈 霉素的PBS或0. 75%生理鹽水沖洗10次，每次5min，在清洗的同時小心分離皮下結締組織 及大部分真皮，剪成0. 2cmX l-2cm的條狀，最后剪成0. 2X0. 2cm2的小塊，把皮膚組織周圍 的PBS或0. 75%生理鹽水吸干，加入2. 5g/L的中性蛋白酶于4°C冰箱中消化；(3)原代培養(yǎng)消化好以后，用分別加有100IU/mL青霉素和鏈霉素的PBS或0.75 % 生理鹽水沖洗4-5次，分離真皮和表皮，真皮面朝下貼于六孔板中或35mm培養(yǎng)皿中，每孔 (皿)3-4塊，塊與塊之間的距離在Icm左右，用0. Iml或0. 2ml的槍頭把組織塊邊緣的PBS 或0. 75%生理鹽水吸走，在37°C，5% CO2的培養(yǎng)箱中倒置20-30min，干置后，用0. Iml或 0. 2ml的移液器慢慢地且少量地添加培養(yǎng)基于組織塊周圍，每孔(皿)0. 2-0. :3ml，第二天每 孔補加培養(yǎng)基2mL，每3天換液一次；(4)傳代培養(yǎng)典型的干細胞集落形成后2-3天即可傳代，先用0.25%胰蛋白酶消化 4-5min，去消化液后，用細胞刮刀把細胞刮下來，再加0. 胰蛋白酶再次消化10-15min， 用含有血清的培養(yǎng)液中和，1500rpm離心10分鐘清洗，用培養(yǎng)液制成細胞懸液，接種在鋪有 IV型膠原的六孔板中或35mm培養(yǎng)皿中，37°C、5 % CO2和飽和濕度連續(xù)培養(yǎng)，以后用同樣方 法傳代。
2.根據(jù)權利要求1所述的北京鴨表皮干細胞的分離和培養(yǎng)方法，其特征在于，步驟(1) 中所述的北京鴨雛鴨為1日齡。
3.根據(jù)權利要求1所述的北京鴨表皮干細胞的分離和培養(yǎng)方法，其特征在于，步驟(2) 中所述的消化的具體方法是剪好的2-3只北京鴨的皮膚一起放在一個60mm的平皿中，加 Λ 2. 5g/L中性蛋白酶12-15ml，于4°C冰箱中消化12_13h。
4.根據(jù)權利要求1所述的北京鴨表皮干細胞的分離和培養(yǎng)方法，其特征在于，步驟(3) 原代培養(yǎng)所用的培養(yǎng)基是由 DMEM/F12+20% FBS+15ng/ml EGF+20ng/mlIGF+5 μ g/ml 胰島 素組成。
5.根據(jù)權利要求1所述的北京鴨表皮干細胞的分離和培養(yǎng)方法，其特征在于，步驟(4) 傳代培養(yǎng)用冷熱消化相結合的方法，具體步驟是用PBS洗細胞2-3次后，用0. 25%胰蛋 白酶消化4-5min，去消化液后，用細胞刮刀把細胞刮下來，再加0. 胰蛋白酶在37°C消化 8-lOmin后，在顯微鏡下觀察，細胞成片嚴重或細胞團塊大的，再室溫消化4-5min，用含有 血清的培養(yǎng)液中和，1500rpm離心10分鐘清洗，用培養(yǎng)液制成細胞懸液，接種在鋪有IV型膠 原的六孔板中或35mm培養(yǎng)皿中，37°C、5% CO2和飽和濕度連續(xù)培養(yǎng)。
6.根據(jù)權利要求1所述的北京鴨表皮干細胞的分離和培養(yǎng)方法，其特征在于，步驟(4) 傳代培養(yǎng)所用的培養(yǎng)基是由 DMEM/F12+20% FBS+15ng/ml EGF+20ng/mlIGF+5 μ g/ml 胰島 素組成。
全文摘要
本發(fā)明提供了鴨表皮干細胞的分離和培養(yǎng)方法，包括以下步驟取材，沖洗與消化，原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)。通過本發(fā)明方法制備的北京鴨表皮干細胞可為組織工程、基因工程、細胞工程、免疫學和分子生物學等生命科學研究提供種子細胞；不僅在農(nóng)業(yè)上能豐富并改良地方品種，同時在保護畜禽遺傳資源多樣性方面開辟了一條新的途徑；還可作為疫苗生產(chǎn)的主要原材料。
文檔編號C12N5/071GK102120983SQ201010033940
公開日2011年7月13日 申請日期2010年1月7日 優(yōu)先權日2010年1月7日
發(fā)明者侯玲玲, 關偉軍, 呂春榮, 白春雨, 鄭楊, 馬月輝 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學院北京畜牧獸醫(yī)研究所