專利名稱：一種茶樹CsBDP抗逆基因及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種茶樹抗逆基因CsBDP cDNA序列的克隆及其應(yīng)用，其利用基因改良 技術(shù)培育新的茶葉品種，改善在各種脅迫環(huán)境中茶樹的抗逆性，提高茶葉的產(chǎn)量和質(zhì)量，屬 于基因工程技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
植物分子生物學(xué)的研究熱點(diǎn)之一是植物抗逆基因的發(fā)掘與利用。這些抗逆基因 的發(fā)現(xiàn)為通過(guò)基因工程技術(shù)實(shí)現(xiàn)植物的基因改良提供了豐富的材料。植物BURP結(jié)構(gòu)域 (BURP-domain)是由Hattori等人根據(jù)最初發(fā)現(xiàn)的含有此結(jié)構(gòu)域的四個(gè)植物蛋白命名。目 前隨著研究的深入，越來(lái)越多的植物BU RP-domain類蛋白被發(fā)現(xiàn)，這些成員組成了較為龐 大的植物BURP-domain類蛋白家族，這個(gè)蛋白家族的不同成員在植物的生長(zhǎng)、發(fā)育及對(duì)抗 脅迫環(huán)境的抗逆性功能中發(fā)揮著重要作用。最新的研究結(jié)果顯示，植物BURP-domain類蛋白家族可以劃分為BW2-1 ike、 USP-like、RD22-like、PGl β-like、BURP V,BURP VI 和 BURPVII 7 個(gè)亞族，不同亞族的蛋白 在植物的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮不同的作用。目前的研究表明，RD22-like亞族蛋白多與植 物的抗脅迫反應(yīng)(如干旱脫水和脫落酸誘導(dǎo))有關(guān)，即該亞族蛋白編碼基因?yàn)橹参锏目鼓婊颉２铇涫侵匾慕?jīng)濟(jì)作物，茶葉生產(chǎn)是一些地區(qū)的主要經(jīng)濟(jì)來(lái)源。因此，利用現(xiàn)代生 物學(xué)技術(shù)，特別是基因改良技術(shù)培育新的茶葉品種有重大意義。茶樹的生長(zhǎng)對(duì)于環(huán)境的要 求很高，生長(zhǎng)環(huán)境好壞直接決定了茶樹的生長(zhǎng)狀況以及茶葉品質(zhì)的高低。各種脅迫環(huán)境常 常會(huì)引起茶葉產(chǎn)量和質(zhì)量下降，因此研究茶樹的抗逆性，尤其是茶樹自身抗逆基因，具有非 常重要的意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的第一個(gè)問(wèn)題是提供一個(gè)茶樹BURP-domain類蛋白抗逆基因 (CsBDP)，其具有如序列表SEQ ID NO :1所示的基因序列。本發(fā)明解決上述技術(shù)問(wèn)題的技術(shù)方案如下一種茶樹CsBDP抗逆基因，通過(guò)設(shè)計(jì)一對(duì)簡(jiǎn)并引物RDOl和RD02進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其
主要特點(diǎn)是簡(jiǎn)并引物RD01，其序列為:5-GGA GAG GAR AAR TAT TGT GC-3 ；簡(jiǎn)并引物RD02，其序列為:5-TGT GGC ANA CNG CAN CTG CT-3 ；PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性:3min ；95°C變性30s，55°C退火45s，72°C延伸 20s, 35個(gè)循環(huán)；72°C終止延伸IOmin0擴(kuò)增反應(yīng)后得到序列長(zhǎng)度為304bp的CsBDP基因的保守序列片段。對(duì)CsBDP基因進(jìn)行5' RACE和3' RACE操作。根據(jù)已經(jīng)獲得的CsBDP保守片段 設(shè)計(jì)兩個(gè)基因特異性引物，其主要特點(diǎn)是
基因特性引物5' -GSP，其序列為5, -GCA TCG CTT GCC ATC TTCTTC ACT CCT T-3'；基因特性引物3' -GSP，其序列為5' -AGC CGT AGT GTG CCA TAAGCA AAA C-3'。5' RACE PCR反應(yīng)循環(huán)參數(shù)為94°C預(yù)變性anin ;95°C變性30s，64°C退火45s， 72°C延伸lmin，;35個(gè)循環(huán)；72°C終止延伸lOmin。3' RACEPCR反應(yīng)循環(huán)參數(shù)為94°C預(yù)變 性anin ；95°C變性30s，64°C退火45s，72°C延伸30s，35個(gè)循環(huán)；72°C終止延伸IOmin0通過(guò)5' RACE和3' RACE，分別獲得了長(zhǎng)度為918bp和659bp的CsBDP基因的5‘ 端和3'端序列(圖4)。將三段基因片段拼接后獲得了 CsBDP的全長(zhǎng)cDNA序列，如序列表 SEQ ID NO 1 所示。CsBDP 全長(zhǎng) 1333bp。本發(fā)明所要解決的第二個(gè)問(wèn)題是提供上述基因所編碼的蛋白質(zhì)CsBDP。其具有如 序列表SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列。本發(fā)明解決上述技術(shù)問(wèn)題的技術(shù)方案如下通過(guò)ORFinder軟件預(yù)測(cè)，CsBDP基因編碼一個(gè)337個(gè)氨基酸的多肽，如序列表SEQ ID NO 2 所示。本發(fā)明所要解決的第三個(gè)問(wèn)題是提供含有茶樹CsBDP基因的重組大腸桿菌。本發(fā)明解決上述技術(shù)問(wèn)題的技術(shù)方案如下首先將融合PC R 所需的 7 個(gè) DNA 片段(lacO/Pl、Iac0/P2、IacYl、lacY2、kanl、 kan2和CsBDP)進(jìn)行獨(dú)立擴(kuò)增。采用“兩步法”融合PCR構(gòu)建線性DNA打靶片段kan cassette 禾口 CsBDP_kan cassette。胃 征kan cassette 所需片段包括lacO/Pl，kanl 禾口 IacYl ；CsBDP-kan cassette 所需片段包括lacO/P2，CsBDP, kan2 和 lacY2 ；構(gòu)建后的 kan cassette 長(zhǎng) 1395bp(圖 6)，CsBDP-kan cassette 長(zhǎng) 2435bp (圖 7)。經(jīng)測(cè)序，兩個(gè)片段結(jié)構(gòu)和序列正確。經(jīng)過(guò)同源臂的雙交換，CsBDP-kan cassette和 kan cassette分別替換了野生型大腸桿菌MG 1655基因組上的IacZ基因，得到重組菌CK/ Δ IacZ 和對(duì)照菌 K/ Δ IacZ。采用PCR方法驗(yàn)證重組菌基因組結(jié)構(gòu)上的變化。本研究共設(shè)計(jì)了三對(duì)鑒定引 物CsBDP 基因內(nèi)部引物(CsBDP 146,5 ‘ -AAT GGA TGG AAG ATAAGA GCA CCG C-3 ‘ 和 CsBDP884，5' -GCA ACT GCT TCT GCC TTCGTT CCA T_3 ‘ ) ；kan 內(nèi)部引物(Kan45， 5' -GGT GGA GAG GCT ATT CGGCTA TGA C-3'和 Kan741，5' -GGC GAT ACC GTA AAG CA CGA GGAAG-3‘ ) ；IacZ 基因外部引物(lacI_out，5' -AGG AGA AGA TCG CCT CTATCG CCG T-3'和 lacY-out，5' -TGC GGC CTA TAT GGA TGT TGG AACC-3‘)。以重組大腸桿菌基因 組DNA為模板，使用不同的引物組合進(jìn)行PCR，并對(duì)PCR產(chǎn)物測(cè)序，結(jié)果顯示兩個(gè)重組菌已被 成功構(gòu)建(圖8)。本發(fā)明所要解決的第四個(gè)問(wèn)題是提供茶樹CsBDP基因的應(yīng)用。本發(fā)明解決上述技術(shù)問(wèn)題的技術(shù)方案如下通過(guò)測(cè)定重組菌在不同脅迫條件下的生長(zhǎng)速率來(lái)解釋茶樹CsB DP蛋白具有的抗 逆功能。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，重組菌在高堿環(huán)境中以及熱擊處理后的生長(zhǎng)都要好于對(duì)照菌，并且二者 生長(zhǎng)速率的差異具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。由此可以看出，CsBDP在重組菌中的表達(dá)提高了重組菌對(duì)于這兩種脅迫環(huán)境的耐受能力，說(shuō)明茶樹CsBDP基因具有抗堿功能，并且當(dāng)宿主 菌受到熱擊后，CsBDP基因?qū)τ谒拗骷?xì)胞具有保護(hù)作用。由此可見(jiàn)，茶樹CsBDP基因在植物 基因工程中具有重要的應(yīng)用價(jià)值。 本發(fā)明的有益效果是茶樹是重要的經(jīng)濟(jì)作物，茶葉生產(chǎn)是一些地區(qū)的主要經(jīng)濟(jì) 來(lái)源。因此，利用現(xiàn)代生物學(xué)技術(shù)，特別是基因改良技術(shù)培育新的茶葉品種有重大意義。茶 樹的生長(zhǎng)對(duì)于環(huán)境的要求很高，生長(zhǎng)環(huán)境好壞直接決定了茶樹的生長(zhǎng)狀況以及茶葉品質(zhì)的 高低。各種脅迫環(huán)境常常會(huì)引起茶葉產(chǎn)量和質(zhì)量下降。目前的研究表明，RD22-like亞族蛋 白多與植物的抗脅迫反應(yīng)(如干旱脫水和脫落酸誘導(dǎo))有關(guān)，即該亞族蛋白編碼基因?yàn)橹?物的抗逆基因。因此研究茶樹的抗逆性，尤其是茶樹自身抗逆基因，具有非常重要的意義。


圖1為本發(fā)明茶樹總RNA電泳圖。圖2為本發(fā)明茶樹總cDNA電泳圖。圖3為本發(fā)明CsBDP保守片段09Ibp)電泳圖。M, DNA marker ；lane 1，CsBDP 保守片段·圖4為本發(fā)明CsBDP兩端RACE片段電泳圖。M, DNA marker ；lane 1,3' RACE 產(chǎn)物片段；lane 2，5' RACE 產(chǎn)物片段.圖5為本發(fā)明四個(gè)BURP-domain蛋白的系統(tǒng)發(fā)生分析。利用DNAMAN 6. 0. 40 軟件，采用 maximum likelihood 方法對(duì) 29 個(gè) BURP-domain 類蛋白家族蛋白進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析，每條序列使用GenBank登錄號(hào)進(jìn)行注釋。圖6為本發(fā)明通過(guò)“兩步法”融合PCR構(gòu)建的kan cassette電泳圖。M, DNA marker ；lane 1, kan cassette.圖7為本發(fā)明通過(guò)“兩步法”融合PCR構(gòu)建的CsBDP-kan cassette電泳圖。M,DNA marker ；lane 1, CsBDP-kan cassette.圖8為本發(fā)明PCR鑒定重組菌CK/ Δ IacZ和K/ Δ IacZ。Μ, DNA marker ；lane 1，2，3，利用引物對(duì) CsBDP146/CsBDP884 分別擴(kuò)增野生型 MG 1655，重組菌 K/Δ IacZ 和 CK/Δ IacZ 的基因組 DNA ；lane4，5，6，利用引物對(duì) CsBDP146/ kan741分別擴(kuò)增野生型MG1655，重組菌K/ Δ IacZ和CK/ Δ IacZ的基因組DNA ；lane 7,8,9, 利用引物對(duì)LacI-out/CsBDP884分別擴(kuò)增野生型MG1655，重組菌K/ Δ IacZ和CK/ Δ IacZ ； lane 10，11，12，利用引物對(duì)CsBDP146/kan741分別擴(kuò)增野生型MG1655,重組菌K/ Δ IacZ 和CK/ Δ IacZ的基因組DNA ； lane 7，8，9，利用引物對(duì)kan45/LacY_out分別擴(kuò)增野生型 MG1655,重組菌 K/ Δ IacZ 和 CK/ Δ IacZ 的基因組 DNA.圖9為本發(fā)明RT-PCR驗(yàn)證CsBDP和kan在重組菌株中的表達(dá)。M, DNA marker ；lane 1,3,5,利用引物對(duì) CsBDP146/CsBDP884 分別擴(kuò)增野生型 MG 1655，重組菌 K/Δ IacZ 和 CK/Δ IacZ 的總 cDNA ；lane 2，4，6，利用引物對(duì) kan45/kan741 分 別擴(kuò)增野生型MG 1655，重組菌K/ Δ IacZ和CK/ Δ IacZ的總cDNA.圖10為本發(fā)明重組菌CK/ Δ IacZ和K/ Δ IacZ在30mM NaHCO3高堿脅迫環(huán)境中的 生長(zhǎng)曲線。圖11為本發(fā)明重組菌CK/ Δ IacZ和K/ Δ IacZ經(jīng)52°C熱擊30min處理后的生長(zhǎng)曲線。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的原理和特征進(jìn)行描述，所舉實(shí)例只用于解釋本發(fā)明，并 非用于限定本發(fā)明的范圍。實(shí)施例一一種茶樹BURP-domain類蛋白抗逆基因(CsBDP)。采用SV Total RNA Isolation System(P romega)提取茶葉總 RNA(圖 1)。提取 的總 RNA利用 PrimeScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit(TaKaRa)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，合成 cDNA第一鏈(圖2)。依據(jù)BURP-domain的高度保守性，設(shè)計(jì)一對(duì)簡(jiǎn)并引物RDOl (5-GGA GAG GAR AAR TAT TGTGC-3)和 RD02 (5-TGT GGC ANA CNG CAN CTG CT-3)進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增。PCR 反應(yīng)循環(huán)參數(shù)為94°C預(yù)變性:3min ；95°C變性30s，55°C退火45s，72°C延伸20s，;35個(gè)循環(huán)； 72°C終止延伸IOmin0 1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物(圖3)。使用DNA Gel Extraction Kit(Axygen)回收PCR產(chǎn)物。將該DNA片段連接到pMD19_T載體(TaKaRa)，陽(yáng)性克隆送到 上海生工生物工程公司進(jìn)行測(cè)序，得到長(zhǎng)度為304bp的CsBDP基因的保守序列片段。使用GeneRacer Kit (Invitrogen)進(jìn)行 CsBDP 的 5 ‘ RACE 和 3 ‘ RACE 操作。根 據(jù)已經(jīng)獲得的CsBDP的保守片段設(shè)計(jì)兩個(gè)基因特異性引物，分別為5' -GSP(5‘ -GCATCG CTT GCC ATC TTC TTC ACT CCT T—3 ‘)禾口 3 ‘ -GSP (5 ‘ -AGC CGT AGT GTG CCA TAA GCA AAA C-3‘)。5' RACE PCR反應(yīng)循環(huán)參數(shù)為94°C預(yù)變性^iiin ；95°C變性30s，64°C退火45s， 72°C延伸lmin，;35個(gè)循環(huán)；72°C終止延伸lOmin。3' RACEPCR反應(yīng)循環(huán)參數(shù)為94°C預(yù)變 性2min ；95°C變性30s，64°C退火45s，72°C延伸30s，35個(gè)循環(huán)；72°C終止延伸IOmin0瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物。切膠回收PC R產(chǎn)物。使用Τ0Ρ0 TACloning Kit(Invitrogen)克隆RACE PCR產(chǎn)物，操作按說(shuō)明書進(jìn)行。將陽(yáng)性克隆送至上海生工生物 工程有限公司測(cè)序。通過(guò)5' RACE和3' RACE，分別獲得了長(zhǎng)度為918bp和659bp的CsBDP 的5'端和3'端序列(圖4)。將三段基因片段拼接后獲得了 CsBDP的全長(zhǎng)cDNA序列，如 序列表 SEQ IDNO 1 所示。CsBDP 全長(zhǎng) 1333bp。實(shí)施例二 抗逆基因(CsBDP)編碼的蛋白質(zhì)CsBDP。通過(guò)ORFinder軟件預(yù)測(cè)，CsBDP基因編碼一個(gè)337個(gè)氨基酸的多肽，如序列表SEQ ID NO 2所示。利用DNAMAN軟件對(duì)CsBDP以及其它28種不同的BU RP-domain蛋白進(jìn)行 系統(tǒng)進(jìn)化分析。結(jié)果如圖5所示，30種BURP-domain蛋白在系統(tǒng)發(fā)生樹上非常清晰地聚集 為7個(gè)進(jìn)化枝。從圖中可以看出，CsBDP與其它RD22-like亞族蛋白聚在同一進(jìn)化枝上， 提示CsBDP與這個(gè)亞族中的其它成員可能具有相似的功能，即參與茶樹相關(guān)的脅迫應(yīng)答反 應(yīng)，CsBDP是茶樹的一個(gè)抗逆基因。實(shí)施例三含有茶樹CsBDP基因的重組大腸桿菌。構(gòu)建兩種線性DNA同源打靶片段(kan cassette和CsBDP-kancassette)。首先將 融合PC R所需的7個(gè)DNA片段進(jìn)行獨(dú)立擴(kuò)增。這些片段分別為lac0/Pl、lac0/P2、lacYl、 lacY2、kanU kan2 禾口 CsBDP。 lac0/Pl，kanl 禾口 IacYl 用于構(gòu)建 kan cassette, Iac0/P2, CsBDP, kan2 和 lacY2 用于構(gòu)建 CsBDP-kan cassette。其中，lac0/Pl 和 Iac0/P2 是大腸桿 菌MG1655 IacZ基因起始密碼子上游的300bp序列，IacYl和lacY2是IacZ基因終止密碼
6子下游的300bp序列，它們分別是兩個(gè)同源打靶片段兩端的同源臂。kan，kan2以及CsBDP 代表kan基因和CsBDP基因的ORF。采用“兩步法”融合PCR構(gòu)建線性DNA打靶片段kan cassette和CsBDP-kan cassette。kan cassette 長(zhǎng) 1395bp(圖 6), CsBDP-kancassette 長(zhǎng) 2435bp (圖 7)。經(jīng)測(cè) 序，兩個(gè)片段結(jié)構(gòu)和序列正確。將大腸桿菌MG1655/pKD46接種于5ml新鮮SOB培養(yǎng)基30°C培養(yǎng)過(guò)夜，按1 50 比例轉(zhuǎn)接于50ml新鮮SOB培養(yǎng)基，阿拉伯糖誘導(dǎo)細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)中期(0D· = 0. 2 0. 3)， 制備感受態(tài)細(xì)胞。將兩端帶有300bp同源臂的片段CsBDP-kan cassette和kan cassette 分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌MG 1655/pKD46感受態(tài)細(xì)胞。經(jīng)過(guò)同源臂的雙交換，CsBDP-kan cassette 和kan cassette分別替換了基因組上的IacZ基因，得到重組菌CK/Δ IacZ和對(duì)照菌K/ ΔlacZ。采用PCR方法驗(yàn)證重組菌基因組結(jié)構(gòu)上的變化。本研究共設(shè)計(jì)了三對(duì)鑒定引 物CsBDP 基因內(nèi)部引物(CsBDP 146,5 ‘ -AAT GGA TGG AAG ATAAGA GCA CCG C-3 ‘ 和 CsBDP884，5' -GCA ACT GCT TCT GCC TTCGTT CCA T_3 ‘ ) ；kan 內(nèi)部引物(Kan45， 5' -GGT GGA GAG GCT ATT CGGCTA TGA C-3'和 Kan741，5' -GGC GAT ACC GTA AAG CA CGA GGAAG-3‘ ) ；IacZ 基因外部引物(lacl_out，5' -AGG AGA AGA TCG CCT CTATCG CCG T-3'和 lacY-out，5' -TGC GGC CTA TAT GGA TGT TGG AACC-3‘)。以重組大腸桿菌基因 組DNA為模板，使用不同的引物組合進(jìn)行PCR，并對(duì)PCR產(chǎn)物測(cè)序，結(jié)果顯示兩個(gè)重組菌已被 成功構(gòu)建(圖8)。實(shí)施例四=CsBDP和kan基因在重組大腸桿菌中表達(dá)的鑒定將兩個(gè)重組大腸桿菌CK/ Δ IacZ和K/ Δ IacZ以及野生型大腸桿菌MG1655 在含有0. ImM IPTG的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，使用SVTotal RNA Isolation System(Promega)提取三個(gè)菌的總 RNA，然后使用 PrimeScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit (TaKaRa)將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。以三個(gè)菌的總cDNA為模板，分別使用引物 對(duì)CsBDP146/CsBDP884和Kan45/Kan741進(jìn)行擴(kuò)增，以檢測(cè)CsBDP和kan在IacZ位置上能 否順利表達(dá)。RT-PCR的結(jié)果證明CsBDP和kan基因在重組菌中都可以被0. ImM IPTG誘導(dǎo) 表達(dá)(圖9)。實(shí)施例五CsBDP基因重組大腸桿菌抗逆性本研究通過(guò)在LB培養(yǎng)基中加入終濃度為0. ImM的IPTG來(lái)誘導(dǎo)IacZ位置上的 CsBDP和kan進(jìn)行表達(dá)。為了驗(yàn)證CsBDP的功能，測(cè)定重組菌在以下兩種脅迫條件中的生 長(zhǎng)1)在LB培養(yǎng)基中加入NaHCO3至終濃度30mM ；2)將重組菌在52°C熱擊30min。當(dāng)兩個(gè) 重組菌生長(zhǎng)在由30mM高濃度NaHCO3所引起的高堿性環(huán)境中時(shí)，重組菌CK/Δ IacZ表現(xiàn)出 了更好的生長(zhǎng)狀況(表1，圖10)，其生長(zhǎng)速率是K/Δ IacZ的1. 15倍。通過(guò)兩樣本t檢驗(yàn) 發(fā)現(xiàn)，二者的生長(zhǎng)速率差異顯著(P<0. 05)。經(jīng)熱擊處理后，重組菌CK/Δ IacZ同樣表現(xiàn)出 了更好的生長(zhǎng)狀況(表1，圖11)，其生長(zhǎng)速率是K/ Δ IacZ的1. 11倍。通過(guò)兩樣本t檢驗(yàn) 發(fā)現(xiàn)，二者的生長(zhǎng)速率差異同樣顯著(P <0.05)。表1 CK/ Δ IacZ和K/ Δ IacZ在兩種脅迫環(huán)境中的生長(zhǎng)速率Growth rates ( hStressedculture K/AiacZCKj Alocl medium
LB/NaHC〇30.334±0.019〇.385±〇.011HeatShock_0.871 ±0.016Q.964±0.050由于重組菌CK/ Δ IacZ和K/ Δ IacZ的染色體背景僅相差一個(gè)拷貝的CsBDP基因， 所以二者在相同脅迫環(huán)境下生長(zhǎng)的差異就應(yīng)該與CsBDP的表達(dá)有關(guān)。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，CK/AlacZ 在高堿環(huán)境和熱擊處理后的生長(zhǎng)都要好于對(duì)照菌K/ Δ IacZ,并且二者生長(zhǎng)速率的差異具有 顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。由此可以看出，CsBDP在CK/Δ IacZ中的表達(dá)提高了重組菌對(duì)于這兩 種脅迫環(huán)境的耐受能力，說(shuō)明CsBDP具有抗堿功能，并在宿主受到熱擊后，對(duì)宿主細(xì)胞具有 保護(hù)作用。CsBDP基因的這種性質(zhì)決定了其在植物基因中具有重要的應(yīng)用價(jià)值。以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和 原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。序列表
SEQUENCE LIST
<110>安徽師范大學(xué)
<120>茶樹CsBDP基因
<140>
<141>
<160>1
<170>PatentIn version3. 3
<210>1
<211>1333
<212>DNA
<213> 茶樹(Camellia sinensis)
<400>1
aagtgtaagc tagctatactaataagctttctttctctttcatatcatagttttctgttc
60
tgcagctttc catggagttccacttcctacccatccttgcatttctttct
ttgacattgg120
tagcaagtca tgcaactctatctcctgaagcgtactggaactcggttctg
ccaaactctc180
ctatgcctac ggctgtcaaggatcttttacaccctgaatggatggaagat
aagagcaccg240
cagtcggggt aggaaagggcggcgtaggcgtcgatgcagg
gcaaggaaag cccggtggca300
80094]ctagtgttggtgtcgggaaaggaggtgtctctgtgaacaccggaaaaaaa0095]ggaaagcccg3600096]tctctgtcggagtatcaaagggaccgaatccattcctttacaagtacgct0097]gccactgcgg4200098]atcaactccatgataatcccaacatcgctcttttcttcttggaaaatgac0099]ttgaaaaaat4800100]￡lC￡lC￡l￡l￡l￡l￡ltgacattgcacttcactaaaaccaccacaccgactaccttc0101]ttgcctcgcc5400102]aggttgctgagaaaatacccttttcatccaagaaaattccacaaattctt0103]gactacttct6000104]cggtgaaacccaactccatggaagccaagacaatcaagca0105]￡l￡lC￡l￡ltC￡l￡l￡lgaatgcgaag6600106]agcctggaatcaaaggagaa gagaaatatt gcgcgacttc actagagtcc0107]atggtcgatt7200108]tctgcagtaccaggcttgggaaaagtatccaagcaatctccacagaagtc0109]SLSLSLSLSLSL^SLSLSL7800110]cccctttgca3.3. C 3. 3. C 3. C atcgaaggagtgaagaagatggcaagcgat0111]gcagccgtag8400112]tgtgccataagcaaaactacgcgtacacagtgttttattgccacaagaca0113]cagaccacaa9000114]aggcatactcagtttcaatggtacgcctcgatggaacgaaggcagaagca0115]gttgcagtgt9600116]gccataccgacacatcgggttggaatccgaaacacttggcctttcaactg0117]ctcaaggtca10200118]agccagggactgttccaatttgccatttccttcctgaggatcatatagtt0119]tgggttcata10800120]actgatattgatctttgcaaaaaagagtcatcactacttgtttaattagt0121]tttttatatg11400122]ttcgtttagcttggtttggcatgtcatcataatctgaaaaactctacttatgttgtcttt0123]12000124]acatatatgtgtgtactataacaactctcccacccacatatgcatatgca0125]tatgagctcg12600126]acatagaggtggcttgtttttagatatgttgtccctggta0127]SLSLSLSLSLSLSLSLSLSL13200128]slslslslslslslslslsl0129]13330130]<210>10131]<211>3370132]<212>PRT
權(quán)利要求
1.一種茶樹CsBDP抗逆基因，其特征在于，包括長(zhǎng)度為1014bp的開(kāi)放閱讀框(ORF)以 及71bp的5'端非翻譯區(qū)和MSbp的3'端非翻譯區(qū)。
2.一種由權(quán)利要求1所述的茶樹CsBDP抗逆基因所編碼的蛋白質(zhì)，其特征在于，該蛋白 質(zhì)為CsBDP基因編碼的含有337個(gè)氨基酸的多肽。
3.一種含有如權(quán)利要求1所述的茶樹CsBDP抗逆基因的重組大腸桿菌CK/Δ IacZ及 相應(yīng)的對(duì)照菌K/ Δ lacZ。與野生型大腸桿菌MG1655相比，所述重組大腸桿菌CK/ Δ IacZ 及相應(yīng)的對(duì)照菌K/ Δ IacZ的IacZ基因位置分別被兩種線性DNA同源打靶片段CsBDP-kan cassette和kan cassette所替換并經(jīng)過(guò)PCR方法驗(yàn)證重組菌構(gòu)建成功。所述線性DNA同 源打靶片段CsBDP-kan caSSette由DNA片段lac0/P2、CsBDP、kan2和lacY2經(jīng)過(guò)獨(dú)立擴(kuò)增 和“兩步法”融合PCR構(gòu)建而成，全長(zhǎng)M35bp ；所述線性DNA同源打靶片段kan cassette由 DNA片段Iac0/Pl、kanl和IacYl經(jīng)過(guò)獨(dú)立擴(kuò)增和“兩步法”融合PCR構(gòu)建而成，全長(zhǎng)1395bp。
4.一種如權(quán)利要求1所述茶樹抗逆基因CsBDP在植物基因工程中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種茶樹CsBDP抗逆基因。所述茶樹CsBDP抗逆基因cDNA全長(zhǎng)1333bp，其包括長(zhǎng)度為1014bp的開(kāi)放閱讀框(ORF)以及71bp的5′端非翻譯區(qū)和248bp的3′端非翻譯區(qū)。本發(fā)明所涉及的茶樹CsBDP抗逆基因能夠提高重組大腸桿菌對(duì)于高堿環(huán)境和熱擊的耐受能力，說(shuō)明茶樹CsBDP抗逆基因具有抗堿功能，并且當(dāng)宿主菌受到熱擊后，茶樹CsBDP抗逆基因?qū)τ谒拗骷?xì)胞具有保護(hù)作用。因此，本發(fā)明的茶樹CsBDP抗逆基因在植物基因工程中具有重要的應(yīng)用價(jià)值。
文檔編號(hào)C12R1/19GK102121015SQ20101004652
公開(kāi)日2011年7月13日 申請(qǐng)日期2010年1月8日 優(yōu)先權(quán)日2010年1月8日
發(fā)明者宋平, 曹正宇, 朱友明, 朱國(guó)萍, 王鵬, 趙旵軍 申請(qǐng)人:安徽師范大學(xué)