專利名稱：一種嗜鹽纖維素酶及其編碼基因與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種嗜鹽纖維素酶及其編碼基因與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
纖維素是通過3_1，4葡萄糖苷鍵連接葡萄糖苷形成的線形聚合體，是植物細(xì)胞 壁的主要成分，占植物干重的35% -50%。作為地球上最豐富的可再生資源，通過纖維素酶 系將其水解成可利用的葡萄糖具有重要的應(yīng)用價值。多種微生物都能夠產(chǎn)生纖維素酶，如細(xì)菌、酵母、真菌、放線菌。微生物產(chǎn)生的纖維 素酶系是一個多組分酶系，主要包括內(nèi)切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和葡萄糖苷酶。先由 內(nèi)切葡聚糖酶作用于纖維素分子內(nèi)部隨機(jī)水解0-1，4_糖苷鍵，將長鏈纖維分子截?cái)?，產(chǎn) 生大量小分子纖維素。再由外切葡聚糖酶，作用于纖維素線狀分子末端，水解0-1，4_糖苷 鍵，每次從纖維素鏈的非還原端切下一個纖維二糖分子。最后由葡萄糖苷酶將纖維二 糖分子水解成可利用的葡萄糖。微生物產(chǎn)生的纖維素酶在工農(nóng)業(yè)上有著廣泛的應(yīng)用。應(yīng)用于提取果蔬汁，提高浸 出率，縮短浸出時間，提高營養(yǎng)價值，同時還可以降低萃取之后的混合物黏度。在釀造過程 中加入纖維素酶可以彌補(bǔ)麥芽汁中酶活力的不足，并且可以減少發(fā)酵中的結(jié)塊現(xiàn)象，提高 過濾效率，增加啤酒產(chǎn)量。在動物飼養(yǎng)行業(yè)中，纖維素酶的應(yīng)用可以提高飼料的利用率，平 衡飼養(yǎng)動物間的個體差異，提高體重或者出奶率。在紡織業(yè)中，應(yīng)用纖維素酶進(jìn)行生物打磨 可以降低手工打磨的破損率，縮短處理時間，減小工作強(qiáng)度，并有利于工作環(huán)境的安全。纖 維素酶還可以提高洗滌衣物的效果，降低洗滌成本。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個目的是提供一種嗜鹽纖維素酶及其編碼基因。本發(fā)明所提供的嗜鹽纖維素酶屬于糖基水解酶5家族，是如下(a)、(b)或(c)所 示的蛋白質(zhì)(a)由序列表中序列1中自N端起第34-569位氨基酸殘基所示的氨基酸序列組成 的蛋白質(zhì)；(b)由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(c)將(a)或(b)所示的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺 失和/或添加且具有纖維素酶活性的由(a)或(b)衍生的蛋白質(zhì)。序列1所示的CelB蛋白由569個氨基酸殘基組成。所述編碼基因是如下1)或2)或3)或4)的DNA分子1)核苷酸序列是序列表中序列2自5'末端起第100至1710位核苷酸所示的DNA 分子；2)核苷酸序列是序列表中序列2所示的DNA分子；3)在嚴(yán)格條件下與1)或2)限定的DNA序列雜交且編碼具有嗜鹽纖維素酶活性的蛋白的DNA分子；4)與1)或2)或3)限定的DNA序列具有90%以上同源性，且編碼具有嗜鹽纖維 素酶活性的蛋白的DNA分子。序列2所示編碼基因由1710個核苷酸組成。上述嚴(yán)格條件可為在6 X SSC，0. 5% SDS的溶液中，在65°C下雜交，然后用2 X SSC， 0. 1 % SDS 和 1 X SSC, 0. 1 % SDS 各洗膜一次。為了使(a)中的蛋白便于純化，可在由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的 蛋白質(zhì)的氨基末端或羧基末端連接上如表1所示的標(biāo)簽。表1標(biāo)簽的序列 上述(a)或(b)中的蛋白可人工合成，也可先合成其編碼基因，再進(jìn)行生物表達(dá)得 到。上述(b)中的蛋白的編碼基因可通過將序列表中序列2自5'端第1至1710位核苷酸 所示的DNA序列中缺失一個或幾個氨基酸殘基的密碼子，和/或進(jìn)行一個或幾個堿基對的 錯義突變，和/或在其5'端和/或3'端連上表1所示的標(biāo)簽的編碼序列得到。含有上述任一所述編碼基因的重組載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌也屬于 本發(fā)明的保護(hù)范圍。所述重組載體為將上述任一所述編碼基因插入出發(fā)載體pET28a的多克隆位點(diǎn)得 到的重組表達(dá)載體；所述重組菌是將上述任一所述編碼基因插入出發(fā)載體pET28a的多克 隆位點(diǎn)得到的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌RoSetta(DE3)得到的?？捎矛F(xiàn)有的表達(dá)載體構(gòu)建含有所述基因的重組表達(dá)載體。使用所述基因構(gòu)建重組 表達(dá)載體時，在其轉(zhuǎn)錄起始核苷酸前可加上任何一種增強(qiáng)型啟動子或組成型啟動子，它們 可單獨(dú)使用或與其它的啟動子結(jié)合使用；此外，使用本發(fā)明的基因構(gòu)建重組表達(dá)載體時，還 可使用增強(qiáng)子，包括翻譯增強(qiáng)子或轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子，這些增強(qiáng)子區(qū)域可以是ATG起始密碼子或 鄰接區(qū)域起始密碼子等，但必需與編碼序列的閱讀框相同，以保證整個序列的正確翻譯。所 述翻譯控制信號和起始密碼子的來源是廣泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻譯起始 區(qū)域可以來自轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域或結(jié)構(gòu)基因。本發(fā)明的另一個目的是提供一種制備嗜鹽纖維素酶的方法。本發(fā)明所提供的制備嗜鹽纖維素酶的方法，是培養(yǎng)上述任一所述的重組菌，得到所述蛋白質(zhì)。本發(fā)明所提供的制備嗜鹽纖維素酶的方法，具體可為將所述重組菌37°C培養(yǎng) 3h，OD600 = 0. 7-1. 0 時，加入 IPTG 至終濃度 0. 1-0. 8mM，轉(zhuǎn)至 18°C繼續(xù)培養(yǎng) 4_20h。擴(kuò)增上述任一所述編碼基因的全長及其任意片段的引物對也屬于本發(fā)明的保護(hù) 范圍。所述引物對中的一條引物序列如序列表中序列3所示，另一條引物序列如序列表 中序列4所示。上述任一所述蛋白質(zhì)、上述任一所述編碼基因、上述任一所述重組表達(dá)載體、所述 表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌中的任意一種在降解纖維素中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù) 范圍。其中，所述纖維素具體可為羧甲基纖維素。上述應(yīng)用中，所述羧甲基纖維素可為羧甲基纖維素的可溶性鹽，具體可為羧甲基 纖維素鈉；所述蛋白在高鹽條件下(0.5-4M)降解羧甲基纖維素鈉時，反應(yīng)體系的溫度為 20-70°C，優(yōu)選為55°C，反應(yīng)體系的pH值為4_10，優(yōu)選為5. 5 ；反應(yīng)體系中鹽濃度為如下1) 或2)所示1)所述鹽為NaCl，反應(yīng)體系中鹽濃度為0. 25-4M，優(yōu)選為2. 5M ；2)所述鹽為 KC1，反應(yīng)體系中鹽濃度為0. 25-3. 5M，優(yōu)選3M。本發(fā)明的CelB蛋白具有嗜鹽纖維素酶活性，屬于嗜鹽纖維素酶。CelB蛋白與其它 已表征的纖維素酶的氨基酸序列相比，相似性小于55%，屬于纖維素酶家族中的一員。本 發(fā)明纖維素酶在高鹽(2. 5M氯化鈉)的條件下，仍具有較高的酶活性，為33U/mg蛋白干粉， 而一般的纖維素酶在2. 5M氯化鈉的條件下已完全或部分變性，完全或部分失去酶活性。在 2. 5M氯化鈉的條件下，在40°C -70°C的溫度范圍內(nèi)，本發(fā)明酶均具有較高活性，最適溫度為 55°C ；在2. 5M氯化鈉的條件下，在pH4-pH10的pH值范圍內(nèi)，本發(fā)明酶均具有較高活性，最 適pH值為5. 5。因此，本發(fā)明酶具有廣泛的pH耐受性、適用溫度范圍廣和耐鹽的特性，本發(fā) 明酶具有寬廣的使用范圍，特別適合于高鹽環(huán)境中應(yīng)用，在高滲和高鹽條件下纖維素的降 解領(lǐng)域具有很好的應(yīng)用前景。


圖1為CelB蛋白的SDS-PAGE電泳圖。圖2為CelB蛋白活性隨鹽濃度的變化圖3為嗜鹽纖維素酶活性隨溫度的變化。圖4為嗜鹽纖維素酶活性隨pH的變化。
具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。遺傳資源名稱芽孢桿菌Bacillus sp. BG-CS10。直接來源獲取時間2004年；采 集方式采集地(國家、省(市))內(nèi)蒙古巴爾堿湖，采集者名稱(姓名)薛燕芬，采集者聯(lián) 系方式 e-mail :xueyf@im. ac. en。實(shí)施例1、嗜鹽纖維素酶的發(fā)現(xiàn)一、芽孢桿菌 Bacillus sp. BG-CS10 總 DNA 的提取
采用芽孢桿菌Bacillus sp. BG-CS10，取其新鮮濕菌體20克，懸于10毫升 50mMTris緩沖液中(pH8. 0)，加入少量溶菌酶和8毫升0. 25mM EDTA (pH8. 0)，混勻后37°C 放置20min ；之后加入2毫升10% SDS，55°C放置5min，分別用等體積酚、氯仿各抽提一次； 取最后一次的上清溶液，加入2倍體積乙醇，回收DNA，分別用70%和無水乙醇洗；沉淀溶于 0. 5 毫升 TE 緩沖液(pH8. 0，10mM Tris, ImMEDTA)，加入 10mg/ml RNase 3 u 1，37°C保溫 1 小 時，分別用等體積酚、氯仿各抽提一次；上清溶液加入2倍體積乙醇，回收DNA，分別用70% 和無水乙醇洗，真空干燥，用去離子水溶解。二、嗜鹽纖維素酶的發(fā)現(xiàn)1、取總DNA溶液lOiU (約50iig DNA)，用限制性內(nèi)切酶Sau3AI部分酶切，經(jīng)瓊脂 糖凝膠電泳，回收3-9kb DNA片段。2、連接反應(yīng)16小時連接體系(20ill) :2u l(5u g) Sau3AI 酶解 DNA 片段；lu l(lu g)經(jīng) Earl 酶解的質(zhì)粒 pHBM803DNA ；2iU10X連接緩沖液；1 u 1 T4DNA 連接酶；14iil7jC°3、用連接反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌XL-Gold，然后涂于含50iig/ml Amp (氨 芐青霉素)的固體培養(yǎng)基上，37 °C培養(yǎng)16-18小時，將所得菌落影印到含有50 yg/ mlAmp (氨芐青霉素)、0. 5mM IPTG、0. 025%曲利本藍(lán)和1 %魔芋粉的固體培養(yǎng)基上，菌落周 圍有透明圈的即為陽性克隆。4、陽性克隆在Amp-LB培養(yǎng)基中37°C培養(yǎng)16-18小時，經(jīng)活性測試具有纖維素酶活 性。對陽性克隆中的重組質(zhì)粒進(jìn)行了測序。測序結(jié)果顯示，重組質(zhì)粒中，在PHBM803DNA 骨架中插入了一個DNA片段，該DNA片段含有一個長1710bp的開放閱讀框架(0RF)，0RF核 苷酸序列如序列表的序列2所示，其中自5’端第1至99位核苷酸為信號肽。質(zhì)粒pHBM803
(Cloning and enzymatic characterizationof a xylanase gene from a soil-derived metagenomic library with an efficient approach. Applied Microbial Biotechnology,2008,80(5) :823_30)。序列2所示核苷酸編碼的蛋白如序列表中序列1所示(記作CelB蛋白)，該蛋白 由569個氨基酸殘基組成。CelB蛋白屬纖維素酶超家族，與來源于Bacillusagaradhaerens 的纖維素酶一致性為80%，和全基因組測序的Bacillus haloduransC-125菌株的纖維素 酶B—致性為68%;和Geobacillu sp. Y412MC10的纖維素酶一致性55%，但是這些蛋白均 沒有進(jìn)行酶學(xué)性質(zhì)的分析；將CelB蛋白的編碼基因命名為celB基因。實(shí)施例2、嗜鹽纖維素酶的表達(dá)一、celB基因的制備可采用如下方法制備celB基因；也可以采用人工合成的方法得到序列表中序列2 自5’端起第100至1710位核苷酸所示的celB基因，并使其兩端分別帶有BamHI的酶切位 點(diǎn)和Sail酶切位點(diǎn)。根據(jù)celB基因的核苷酸序列(如序列表的序列2所示)，設(shè)計(jì)引物對如下
XEt^l弓L 5‘ -cgcggatccgatgaaggtgctaagcaaacagatattc-3‘；反向弓I物5‘ -agcgtcgacttatcgtctaccttgaacatggtttcc-3‘；正向引物的下劃線部分為BamHI的酶切位點(diǎn)，反向引物的下劃線部分為Sail酶切 位點(diǎn)。以芽孢桿菌Bacillus sp. BG-CS10的總DNA為模板，用設(shè)計(jì)的引物對進(jìn)行PCR擴(kuò)
+飽
+曰oPCR反應(yīng)體系10 X 緩沖液5 illdNTP4U 1exTaq DNA 聚合酶0. 5 ii 1正向引物liU反向引物liil模板0. 5u 1水38 ii 1。PCR反應(yīng)條件94°C預(yù)變性5min，然后94°C變性30秒_58°C退火30秒_72°C延伸 2min，30個循環(huán)，最后72°C延伸lOmin。PCR產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳檢測產(chǎn)量和特異性，并用DNA純化試劑盒(超薄離 心柱型，天根公司生產(chǎn))純化。將純化的PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序，結(jié)果表明PCR產(chǎn)物的序列如序 列表中序列2自5’端起第100至1710位核苷酸所示。二、重組表達(dá)載體的構(gòu)建1、將測序正確的PCR產(chǎn)物或人工合成的片段用BamHI和Sail雙酶切，瓊脂糖電泳 回收酶切產(chǎn)物。2、將質(zhì)粒 pET28a(Cat. NO 69864-3，Novogen)用 BamHI 和 Sail 雙酶切，瓊脂糖電 泳回收酶切產(chǎn)物。3、將步驟1的酶切產(chǎn)物和步驟2的酶切產(chǎn)物進(jìn)行連接，連接產(chǎn)物電擊轉(zhuǎn)化大腸桿 菌DH5ci后涂布于含有50P g/ml卡那霉素的LB平板，37 °C過夜培養(yǎng)，將得到的轉(zhuǎn)化子用 正向引物和反向引物進(jìn)行菌落PCR，篩選到含有celB基因的重組菌，提取重組菌的質(zhì)粒， 進(jìn)行測序驗(yàn)證，結(jié)果表明，在pET28a的BamHI和Sail酶切位點(diǎn)之間插入了序列表中序列2 自5’端起第100至1710位核苷酸所示的celB基因，插入方向正確，將該重組質(zhì)粒命名為 pET28a_celB。三、工程菌的制備將質(zhì)粒pET28a-celB 電擊轉(zhuǎn)化大腸桿菌 Rosetta (DE3) (Cat. N0CD801,全式 金公司)后涂布于含有50i!g/ml卡那霉素的LB平板，37 °C過夜培養(yǎng)，得到含有質(zhì)粒 pET28a-celB 的工程菌，記作 Rosetta/pET28a_celB。用pET28a代替pET28a_celB，轉(zhuǎn)化大腸桿菌Rosetta (DE3)，步驟同上，得到含有 pET28a的重組菌，作為對照菌。將轉(zhuǎn)入pET28a的陽性重組菌記作Rosetta/pET28a。四、嗜鹽纖維素酶的制備和純化Ni-NTA His Bind Superflow 純化柱購自 Novagen 公司，產(chǎn)品目錄號為 70971-3。將步驟三制備的陽性重組菌ROSetta/pET28a-CelB培養(yǎng)于含有50 y g/ml卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)3h ；0D_ = 0. 7時，加入IPTG至其在LB培養(yǎng)基中的終濃度 0. 8mM，轉(zhuǎn)至18 °C繼續(xù)培養(yǎng)16h。5000rpm、10min 離心收集菌體，懸浮于溶液 A(20mM Tris-HCl, pH7. 9,0. 5MNaCl, lOmM咪唑)中，于冰浴中超聲破碎(60w，10min ；超聲2s，停止2s)，之后15000rpm離心 lOmin除去細(xì)胞碎片，取上清液；將上清液過Ni-IDA His BindSuperf low純化柱，用5ml 溶液A沖洗，再用10ml溶液B(20mM Tris-HCl，pH7. 9,0. 5M NaCl，60m M咪唑)漂洗，最后 用5ml溶液C(20mM Tris-HCl，pH7. 9，0. 5MNaCl，500mM咪唑)洗脫，收集洗脫液。然后將洗 脫液用FPLC (快速蛋白液相層析)脫鹽，獲得純化的CelB蛋白的溶液，真空冷凍干燥，得到 CelB蛋白干粉。將步驟三制備的對照菌采用相同的步驟進(jìn)行培養(yǎng)和純化，得到的溶液作為對照酶 液。SDS-PAGE電泳顯示純化的CelB蛋白的分子量約為62kDa，符合理論推斷的62kDa。 結(jié)果如圖1所示，圖1中，泳道1表示Ni-NTA柱純化后的CelB蛋白，泳道2表示大腸桿 菌Rosetta/pET28a-celB破菌后的上清液，泳道3表示蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)(100，75，50，35， 25kDa)。對照菌沒有得到目的蛋白。實(shí)施例3、蛋白的功能驗(yàn)證酶活單位定義為lmin內(nèi)催化產(chǎn)生1 y mol葡萄糖所需的酶量。(一)鹽對酶活性的影響實(shí)驗(yàn)組1 活性測定反應(yīng)體系為0. 5ml,由0. 48ml溶液A和0. 02ml實(shí)施例2得到 的CelB蛋白干粉的稀釋液組成；活性測定反應(yīng)體系的pH值為8. 8 (該pH緩沖體系受NaCl 濃度的影響小)。將反應(yīng)體系在40°C溫育30min后，加入0. 5ml 二硝基水楊酸溶液(DNS) 終止反應(yīng)，然后沸水浴5min后測定520nm的吸光值。用pH值8. 8的Tris-HCl緩沖液代替 CelB蛋白稀釋液進(jìn)行同樣的操作，作為對照1。溶液A的組成由50mM的pH8. 8的Tris-HCl緩沖液、NaCl和羧甲基纖維素鈉 (CMC)組成；NaCl在溶液A中的濃度為0. 05-4M,羧甲基纖維素鈉在溶液A中的濃度為 0.5g/100ml。實(shí)驗(yàn)組2 活性測定反應(yīng)體系為0. 5ml,由0. 48ml溶液A和0. 02ml實(shí)施例2得到 的CelB蛋白干粉的稀釋液組成；活性測定反應(yīng)體系的pH值為8. 8 (該pH緩沖體系受KC1 濃度的影響小)。將反應(yīng)體系在40°C溫育30min后，加入0. 5ml 二硝基水楊酸溶液(DNS) 終止反應(yīng)，然后沸水浴5min后測定520nm的吸光值。用pH值8. 8的Tris-HCl緩沖液代替 Ce 1B蛋白稀釋液進(jìn)行同樣的操作，作為對照2。溶液A的組成由50mM的pH8. 8的Tris-HCl緩沖液、KC1和羧甲基纖維素鈉 (CMC)組成；KC1在溶液A中的濃度為0. 5-3. 5M，羧甲基纖維素鈉在溶液A中的濃度為 0.5g/100ml。對照3 活性測定反應(yīng)體系為0. 5ml,由0. 48ml溶液A和0. 02ml實(shí)施例2得到的 CelB蛋白干粉的稀釋液組成；活性測定反應(yīng)體系的pH值為8. 8。將反應(yīng)體系在40°C溫育 30min后，加入0. 5ml 二硝基水楊酸溶液(DNS)終止反應(yīng)，然后沸水浴5min后測定520nm的 吸光值。
溶液A的組成由50mM的pH8. 8的Tris_HCl緩沖液和羧甲基纖維素鈉(CMC)組 成；羧甲基纖維素鈉在溶液A中的濃度為0. 5g/100ml。該溶液中不含有NaCl或KC1。將不含NaCl或KC1時測的吸光值(即對照3)作為相對活性100%，其它組的吸光 值與該吸光值的比值作為各自的相對活性。實(shí)驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)。CelB蛋白溶液活性隨鹽濃度的變化見圖2。在pH值為8. 8的 環(huán)境中，在含有2. 5M NaCl或3M KC1時CelB蛋白溶液具有最高的酶活性，比不含鹽時的酶 活高出十倍以上。在鹽濃度為0. 5-4M的條件下，該蛋白均具有較高活性，說明該蛋白具有 嗜鹽特性。對照1和對照2中均沒有檢測到酶活性。以實(shí)施例2中的對照菌ROSetta/pET28a獲得的蛋白(記作對照酶液)進(jìn)行上述 實(shí)驗(yàn)，結(jié)果不管在哪個鹽濃度條件下，對照酶液均沒有活性。以上實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明的CelB蛋白具有纖維素酶活性，是一種纖維素酶，且其具 有嗜鹽特性，是一種嗜鹽纖維素酶。(二)最適溫度實(shí)驗(yàn)組活性測定反應(yīng)體系為0. 5ml,由0. 48ml溶液A和0. 02ml實(shí)施例2得到的 CelB蛋白干粉的稀釋液組成；反應(yīng)體系的pH值為8. 8 ；將反應(yīng)體系在特定溫度溫育30min 后，加入0. 5ml 二硝基水楊酸溶液(DNS)終止反應(yīng)，然后沸水浴5min后測定520nm的吸光值。溶液A的組成由50mM的pH8. 8的Tris_HCl緩沖液、NaCl和羧甲基纖維素 鈉(CMC)組成；NaCl在溶液A中的濃度為2. 5M，羧甲基纖維素鈉在溶液A中的濃度為 0.5g/100ml。對照組活性測定反應(yīng)體系為0. 5ml,由0. 48ml溶液A和0. 02ml實(shí)施例2得到的 CelB蛋白干粉的稀釋液組成；反應(yīng)體系的pH值為8. 8 ；將反應(yīng)體系在特定溫度溫育30min 后，加入0. 5ml 二硝基水楊酸溶液(DNS)終止反應(yīng)，然后沸水浴5min后測定520nm的吸光值。溶液A的組成由50mM的pH8. 8的Tris_HCl緩沖液和羧甲基纖維素鈉(CMC)組 成；羧甲基纖維素鈉在溶液A中的濃度為0. 5g/100ml。該溶液中不含有氯化鈉。實(shí)驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)。在含有2. 5M NaCl時，55°C時，嗜鹽纖維素酶液具有最高的酶活性，為20U/mg蛋白 干粉。以此最高酶活性體系的吸光值作為相對活性100%，其它反應(yīng)體系的吸光值與此最高 酶活性體系的吸光值的比值作為各自的相對活性。嗜鹽纖維素酶活性隨溫度的變化見圖3。在pH值為8. 8的環(huán)境中，在無鹽條件下， 35°C時，纖維素酶液具有最高的酶活性；在2. 5M NaCl的條件下，40°C _70°C時，CelB蛋白 (嗜鹽纖維素酶液)均具有較高的活性，55°C時，CelB蛋白(嗜鹽纖維素酶液)具有最佳酶 活性。以實(shí)施例2中的對照菌ROSetta/pET28a獲得的蛋白(記作對照酶液)進(jìn)行上述 實(shí)驗(yàn)，結(jié)果不管在哪個溫度條件下，對照酶液均沒有活性。(三)最適pH實(shí)驗(yàn)組活性測定體系為0. 5ml,由0. 48ml溶液B(B1、B2、B3、B4、B5、B6或B7)和0. 02ml實(shí)施例2得到的CelB蛋白干粉的稀釋液組成；溶液B1的組成由50mM的Na2HP04_檸檬酸緩沖液、NaCl和羧甲基纖維素鈉(CMC) 組成；NaCl在溶液B1中的濃度為2. 5M，羧甲基纖維素鈉在溶液B1中的濃度為0. 5g/100ml ； 溶液B1的pH值為4.0。溶液B2的組成與溶液B1的組成相同，不同的是溶液B2的pH值為5.0。溶液B3的組成與溶液B1的組成相同，不同的是溶液B2的pH值為6. 0，將50mM 的Na2HP04-檸檬酸緩沖液替換為50mM的NaH2P04-Na2HP04緩沖液。溶液B4的組成與溶液B1的組成相同，不同的是溶液B4的pH值為7. 0，將50mM 的Na2HP04-檸檬酸緩沖液替換為50mM的NaH2P04-Na2HP04緩沖液。溶液B5的組成與溶液B1的組成相同，不同的是溶液B5的pH值為8. 0，將50mM 的Na2HP04-檸檬酸緩沖液替換為50mM的Tris_HCl緩沖液。溶液B6的組成與溶液B1的組成相同，不同的是溶液B6的pH值為9. 0，將50mM 的Na2HP04-檸檬酸緩沖液替換為50mM的Glycine-NaOH緩沖液。溶液B7的組成與溶液B1的組成相同，不同的是溶液B7的pH值為10.0，將50mM 的Na2HP04-檸檬酸緩沖液替換為50mM的Glycine-NaOH緩沖液。將反應(yīng)體系在55°C，溫育30min后，加入0. 5ml 二硝基水楊酸溶液(DNS)終止反 應(yīng)，然后沸水浴5min后測定520nm的吸光值。對照組反應(yīng)體系與實(shí)驗(yàn)組不同的是對照組均不含有NaCl，在35°C進(jìn)行反應(yīng)。實(shí)驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)。實(shí)驗(yàn)組，在反應(yīng)體系的pH值為5. 5時，嗜鹽纖維素酶液具有最高的酶活性，為33U/ mg蛋白干粉。以此最高酶活性體系的吸光值作為相對活性100%，其它反應(yīng)體系的吸光值 與此最高酶活性體系的吸光值的比值作為各自的相對活性。對照組，在反應(yīng)體系的pH值為5. 5時，嗜鹽纖維素酶液具有最高的酶活性，為3U/ mg蛋白干粉。以此最高酶活性體系的吸光值作為相對活性100%，其它反應(yīng)體系的吸光值 與此最高酶活性體系的吸光值的比值作為各自的相對活性。嗜鹽纖維素酶活性隨pH的變化見圖4(A表示實(shí)驗(yàn)組，B表示對照組)。結(jié)果在高 鹽(2. 5M NaCl)或無鹽條件下，55°C時，pH4_pH10時，CelB蛋白(嗜鹽纖維素酶液)均具有 活性，PH5. 5時，CelB蛋白(嗜鹽纖維素酶液)具有最佳酶活性。這說明鹽對酶的最適pH 基本沒有影響。以實(shí)施例2中的對照菌ROSetta/pET28a獲得的蛋白(記作對照酶液)進(jìn)行上述 實(shí)驗(yàn)，結(jié)果不管在哪個pH條件下，對照酶液均沒有活性。(四)酶熱穩(wěn)定性將酶分別用含有2. 5MNaCl和不含NaCl的緩沖液稀釋后，分別在30、40、50、60°C水 浴放置15和30分鐘，測定酶的殘余活性。結(jié)果顯示，酶在有2. 5MNaCl時有很好的熱穩(wěn)定 性，60°C處理30分鐘未見酶活下降；酶在沒有NaCl時，在30°C和40°C穩(wěn)定，但在50°C處理 15分鐘完全喪失了活性。這說明鹽可以增加酶的熱穩(wěn)定性。序列表<110>中國科學(xué)院微生物研究所<120> 一種嗜鹽纖維素酶及其編碼基因與應(yīng)用0131]<160>40132]<210>10133]<211>5690134]<212>PRT0135]<213> 芽孢桿菌(Bacillussp.)0136]<400>10137]MetValHislieGinArgLysPhelieLeuThrLysSerLeulieVal0138]1510150139]ValPheThrMetLeuLeuCysLeuSerLeuMetThrProProLeuLeu0140]2025300141]AlaAspGluGlyAlaLysGinThrAsplieGinSerTyrValAlaAsp0142]3540450143]MetGinProGlyTrpAsnLeuGlyAsnThrPheAspAlaValGlyAsp0144]5055600145]AspGluThrAlaTrpGlyAsnProArgValThrArgGluLeulle Lys0146]657075800147]ThrlieAlaAspGluGlyTyrLysSerlieArglieProValThrTrp0148]8590950149]GluAsnGinMetGlyAsnAlaProAspTyrThrlieAsnGluAspPhe0150]1001051100151]PheSerArgValGluGinVallieAspTrpAlaLeuGluGluAspLeu0152]1151201250153]TyrValMetLeuAsnLeuHisHisAspSerTrpLeuTrplieTyrAsn0154]1301351400155]MetGluHisAsnTyrAspGluValMetAlaLysTyrThrAlaLeuTrp0156]1451501551600157]GluGinLeuSerGluArgPheGinGlyHisSerHisLysLeuMetPhe0158]1651701750159]GluSerValAsnGluProArgPheThrArgAspTrpGlyGlulieGin0160]1801851900161]GluAsnHisHisAlaPheLeuGluGluLeuAsnThrAlaPheTyrHis0162]1952002050163]lieValArgGluSerGlyGlySerAsnThrGluArgProLeuValLeu0164]2102152200165]ProThrLeuGluThrAlaThrSerGinAspLeuLeuAsnArgLeuHis0166]2252302352400167]GinThrMetLysAspLeuAsnAspProAsnLeulieAlaThrValHis0168]2452502550169]TyrTyrGlyPheTrpProPheSerValAsnValAlaGlyTyrThrArg
260265270
PheGluGluGluThrGinGinAsplielieAspThrPheAsnArgVal
275280285
HisAsnThrPheThrAlaAsnGlylieProValValLeuGlyGluPhe
290295300
GlyLeuLeuGlyPheAspThrSerThrAspVallieGinGinGlyGlu
305310315320
LysLeuLysPhePheGluPheLeulieHisHisLeuAsnGluArgAsp
325330335
ValThrHisMetLeuTrpAspAsnGlyGinHisLeuAsnArgGluThr
340345350
TyrSerTrpTyrAspGinGluPheHisAsnMetLeuLysAlaSerTrp
355360365
GluGlyArgSerAlaThrAlaGluSerAsnLeulieHisValArgAsp
370375380
GlyGluProlieArgAspGinAsplieGinLeuHisLeuHisGlyAsn
385390395400
GluLeuThrGlyLeuGinValAspGlyAspSerLeuAlaLeuGlyGlu
405410415
AspTyrGluLeuAlaGlyAspValLeuThrMetLysAlaAspAlaLeu
420425430
ThrAlaLeuMetThrProGlyGluLeuGlyThrAsnAlaVallieThr
435440445
AlaGinPheAsnSerGlyAlaAspTrpHisPheGinLeuGinAsnVal
450455460
AspGluProThrLeuGluAsnThrGluGlySerThrSerAsnPheAla
465470475480
lieProAlaHisPheAsnGlyAspSerValAlaThrMetGluAlaVal
485490495
TyrAlaAsnGlyGluPheAlaGlyProGinAsnTrpThrSerPheLys
500505510
GluPheGlyTyrThrPheSerProValTyrAspLysGlyGlulieVal
515520525
lieThrAspAlaPhePheAsnGluValArgAspAspAsplieHisLeu
530535540
ThrPheHisPheTrpSerGlyGluMetValGluTyrThrLeuSerLys
545550555560
AsnGlyAsnHisValGinGlyArgArg
565
<210>2<211>1710<212>DNA<213> 芽孢桿菌(Bacillus sp.)<400>2atggtacaca tccaaagaaa gttcatactg acaaaatctc taatagtcgt gttcacaatg 60cttttgtgtt tgtcattaat gactccccca ttgttagctg atgaaggtgc taagcaaaca 120gatattcaat cttatgtagc tgacatgcag cctggttgga atttaggaaa cacgtttgac 180gctgttggcg atgatgaaac agcttggggg aatcctcgtg tgacgagaga gttaataaaa 240acgattgctg atgaagggta taaaagtatt cgtatcccag tgacatggga aaatcagatg 300gggaatgcgc cagattatac gataaatgaa gattttttta gccgtgtgga gcaagtgatc 360gattgggcgt tggaagaaga cttatatgtc atgttaaatc tgcatcatga ttcatggctg 420tggatatata atatggaaca caattacgat gaagtgatgg ctaaatatac agctctttgg 480gagcagttat cagagcgttt tcaaggccat tctcataaat taatgtttga gagtgtcaat 540gagcctcggt ttacgcgaga ttggggagag attcaagaaa atcaccatgc tttcttagaa 600gagttaaata cggcatttta tcatattgtc agagagtcgg gaggaagtaa tacagaacgg 660cctctagttt taccaacatt agaaacagca acgtcacagg atttactcaa tcggttgcat 720caaacgatga aagacttaaa tgatccaaac ttgatagcca cagttcatta ttatggcttc 780tggccattta gtgtaaatgt agcaggttac acccgttttg aggaggagac acaacaggat 840atcatagaca cgtttaatcg tgttcataac acatttacag cgaatggcat tcctgtcgta 900ttgggtgaat ttggcttgtt aggctttgat acaagtacag acgtcattca gcaaggtgag 960aaattaaaat tttttgagtt tctcatccat catctcaatg aacgtgatgt aacccatatg 1020
ttatgggaca acggtcagca tttaaatcga gaaacttatt catggtatga tcaagaattt 1080cataacatgc taaaagcgag ctgggaagga cgttctgcta cagcagagtc taatttaatt 1140catgtgaggg acggggagcc aattagagac caagatatac agcttcattt acac ggaaat 1200gagctaacag gtttacaggt agatggagat tcgcttgctc taggggagga ttatgagcta 1260gcgggagatg tgctaacgat gaaagcggac gccctaacag cactaatgac acctggagag 1320ttagggacca atgccgtcat aacagctcaa tttaattctg gagctgactg gcattttcaa 1380ctacagaatg tagacgaacc aactttagaa aatacggaag gctcaacttc gaatttcgca 1440atacctgctc attttaatgg ggatagtgtt gcgacgatgg aagctgttta tgcgaatggg 1500gaatttgccg gaccacaaaa ttggacatcg tttaaagaat tcggttatac cttttcacct 1560gtttacgaca agggagaaat tgtcataaca gacgcattct ttaacgaggt acgcgatgat 1620gacattcatt taacctttca tttttggagc ggggagatgg tggaatatac attaagtaaa 1680aatggaaacc atgttcaagg tagacgataa 1710<210>3<211>37<212>DNA<213>人工序列<220><223><400>3cgcggatccg atgaaggtgc taagcaaaca gatattc 37<210>4<211>36<212>DNA<213>人工序列<220><223><400>4
agcgtcgact tatcgtctac cttgaacatg gtttcc 3權(quán)利要求
一種蛋白質(zhì)，是如下(a)、(b)或(c)所示的蛋白質(zhì)(a)由序列表中序列1中自N端起第34-569位氨基酸殘基所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(b)由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(c)將(a)或(b)所示的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有纖維素酶活性的由(a)或(b)衍生的蛋白質(zhì)。
2.權(quán)利要求1所述蛋白質(zhì)的編碼基因。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的編碼基因，其特征在于所述編碼基因是如下1)或2)或3) 或4)的DNA分子1)核苷酸序列是序列表中序列2自5'末端起第100至1710位核苷酸所示的DNA分子；2)核苷酸序列是序列表中序列2所示的DNA分子；3)在嚴(yán)格條件下與1)或2)限定的DNA序列雜交且編碼具有纖維素酶活性的蛋白的 DNA分子；4)與1)或2)或3)限定的DNA序列具有90%以上同源性，且編碼具有纖維素酶活性 的蛋白的DNA分子。
4.含有權(quán)利要求2或3所述編碼基因的重組載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的重組載體，其特征在于所述重組載體為將權(quán)利要求2或3所 述編碼基因插入出發(fā)載體pET28a的多克隆位點(diǎn)得到的重組表達(dá)載體；所述重組菌是將權(quán) 利要求2或3所述編碼基因插入出發(fā)載體pET28a的多克隆位點(diǎn)得到的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化 大腸桿菌Rosetta(DE3)得到的。
6.一種制備權(quán)利要求1所述蛋白的方法，是培養(yǎng)權(quán)利要求5所述的重組菌，得到所述蛋 白質(zhì)。
7.擴(kuò)增權(quán)利要求2或3所述編碼基因的全長及其任意片段的引物對。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的引物對，其特征在于所述引物對中的一條引物序列如序列 表中序列3所示，另一條引物序列如序列表中序列4所示。
9.權(quán)利要求1所述蛋白質(zhì)在降解纖維素中的應(yīng)用；權(quán)利要求2或3所述編碼基因在降 解纖維素中的應(yīng)用；權(quán)利要求4或5所述重組載體在降解纖維素中的應(yīng)用；權(quán)利要求4或5 所述重組菌在降解纖維素中的應(yīng)用；權(quán)利要求4所述表達(dá)盒在降解纖維素中的應(yīng)用；或權(quán) 利要求4所述轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系在降解纖維素中的應(yīng)用。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其特征在于所述纖維素為羧甲基纖維素；所述降 解的條件包括反應(yīng)體系的溫度為20-70°C，優(yōu)選為55°C，反應(yīng)體系的pH值為4-10，優(yōu)選 為5. 5;反應(yīng)體系中鹽濃度為如下1)或2)所示1)所述鹽為NaCl，反應(yīng)體系中鹽濃度為 0. 25-4M，優(yōu)選為2. 5M ；2)所述鹽為KC1，反應(yīng)體系中鹽濃度為0. 25-3. 5M，優(yōu)選為3M。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種嗜鹽纖維素酶及其編碼基因與應(yīng)用。該酶是如下(a)或(b)所示的蛋白質(zhì)(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(b)將序列表中序列1所示的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有嗜鹽纖維素酶活性的由序列1衍生的蛋白質(zhì)。本發(fā)明酶具有廣泛的pH耐受性、適用溫度范圍廣和嗜鹽的特性，本發(fā)明酶具有寬廣的使用范圍，特別適合于高鹽環(huán)境中應(yīng)用，在高滲和高鹽條件下纖維素的降解領(lǐng)域具有很好的應(yīng)用前景。
文檔編號C12N15/56GK101845427SQ20101010006
公開日2010年9月29日 申請日期2010年1月22日 優(yōu)先權(quán)日2010年1月22日
發(fā)明者張桂敏, 毛良偉, 薛燕芬, 馬延和 申請人:中國科學(xué)院微生物研究所