專利名稱：一種檢測(cè)人6種免疫相關(guān)基因的標(biāo)簽單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種檢測(cè)人6種免疫相關(guān)基因的標(biāo)簽單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)方法， 這些基因是人補(bǔ)體受體1型(CR1)、達(dá)菲抗原/趨化因子受體(DARC)、白細(xì)胞分化抗原 59 (⑶59)、白細(xì)胞分化抗原4 (⑶4)、白細(xì)胞分化抗原8A (⑶8A)和白細(xì)胞分化抗原8B (⑶8B) 等6個(gè)基因，屬于醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
研究表明，紅細(xì)胞具有免疫黏附、直接殺滅抗原異物、調(diào)節(jié)補(bǔ)體活性、增強(qiáng)NK細(xì)胞 功能、結(jié)合趨化因子、參與B細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)等多種免疫功能，在天然免疫和獲得性免疫中發(fā) 揮重要作用。在紅細(xì)胞表面或胞漿內(nèi)存在多種免疫相關(guān)物質(zhì)，其中以補(bǔ)體受體1型的免疫 黏附功能和達(dá)菲抗原/趨化因子受體的趨化因子受體功能最受關(guān)注，白細(xì)胞分化抗原59則 具有限制人補(bǔ)體系統(tǒng)溶細(xì)胞活性、介導(dǎo)紅細(xì)胞-T細(xì)胞信號(hào)傳遞的作用。T細(xì)胞則是實(shí)現(xiàn)獲 得性免疫功能的主要細(xì)胞，其表面的白細(xì)胞分化抗原4和白細(xì)胞分化抗原8分別與主要組 織相容性復(fù)合體II類和I類抗原結(jié)合，可增強(qiáng)T細(xì)胞與抗原遞呈細(xì)胞或靶細(xì)胞結(jié)合的程 度，在T細(xì)胞增殖和分化的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中起重要作用，白細(xì)胞分化抗原4陽性的T細(xì)胞和白細(xì) 胞分化抗原8陽性的T細(xì)胞分別具有免疫輔助和免疫抑制及直接殺傷功能。上述免疫分子 的水平在多種疾病發(fā)生了改變，與疾病發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后密切有關(guān)，但目前對(duì)這些分子的基 因與疾病遺傳易感性的關(guān)聯(lián)研究未見報(bào)道。單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism, SNP)是指染色體上單個(gè)核 苷酸變異而引起的DNA序列多態(tài)性，它具有密度高、遺傳穩(wěn)定、易于自動(dòng)化分析等特點(diǎn)，被 認(rèn)為是繼限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性、微衛(wèi)星多態(tài)性之后的第三代遺傳標(biāo)記，可用于基因定位、 多態(tài)性分析等方面，是研究疾病遺傳易感性、疾病診斷、藥物篩選等的常用指標(biāo)。目前已發(fā) 展了 20余種單核苷酸多態(tài)性檢測(cè)方法，如DNA測(cè)序、限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析、等位基因 特異的寡核苷酸雜交等，但這些方法不適合大規(guī)模、自動(dòng)化檢測(cè)；后來發(fā)展的DNA芯片技術(shù) 滿足了高通量、自動(dòng)化檢測(cè)的需要，以DNA芯片為檢測(cè)平臺(tái)，結(jié)合上述反應(yīng)原理，發(fā)展了多 種單核苷酸多態(tài)性檢測(cè)方法，但一般的單核苷酸多態(tài)性芯片存在假陽性率高、通量不靈活 等缺點(diǎn) ° Hirschhorn 等(Hirschhorn JN, et al. SBE-TAGS :an array-based method for eff icientsingle-nucleotide polymorphism genotyping. Proc Natl Acad Sci USA, 2000,97(22) 12164-12169)在單堿基延伸反應(yīng)單核苷酸多態(tài)性芯片的基礎(chǔ)上，建立了基 于單堿基延伸反應(yīng)_標(biāo)簽微陣列雜交相結(jié)合的DNA芯片技術(shù)，巧妙地將等位基因特異性引 物序列和能與芯片上序列特異結(jié)合的標(biāo)簽序列集成于單堿基延伸引物上，將單堿基延伸反 應(yīng)的高敏感度和高分辨率與標(biāo)簽微陣列的多重反應(yīng)等優(yōu)點(diǎn)融合在一起，克服了其他DNA芯 片技術(shù)的缺點(diǎn)，達(dá)到了高通量、高精確度、高通用性、簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)的效果。單堿基延伸法(single base primer extension)又稱微測(cè)序法、模 板介導(dǎo)染料終止劑摻入分析或單核苷酸多態(tài)性鑒定技術(shù)(single-nucleotidepolymorphism-identification technology, SNP-IT)，是在雙脫氧測(cè)序法的基礎(chǔ)上發(fā)展出 來的單核苷酸多態(tài)性檢測(cè)方法。其原理是首先設(shè)計(jì)1對(duì)PCR引物用于從基因組DNA中擴(kuò) 增出含有目的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)的片段，再設(shè)計(jì)1條與待測(cè)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)上游序 列互補(bǔ)的延伸引物，該引物的3'端最后一個(gè)堿基與單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)上游相鄰的1個(gè) 堿基互補(bǔ)；將延伸引物與PCR產(chǎn)物混合，摻入標(biāo)記不同熒光染料的ddNTPs進(jìn)行延伸反應(yīng)，由 于ddNTP的特性，當(dāng)延伸1個(gè)堿基，即加入的ddNTP與單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)堿基互補(bǔ)時(shí)，反 應(yīng)即終止；通過檢測(cè)延伸堿基所發(fā)出的熒光類型來判斷單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)的堿基類型。 該方法基于測(cè)序原理，但由于只需測(cè)1個(gè)堿基，其準(zhǔn)確性大大超過了一般測(cè)序反應(yīng)，堪稱單 核苷酸多態(tài)性檢測(cè)的黃金標(biāo)準(zhǔn)。標(biāo)簽微陣列是在玻璃芯片板的板底預(yù)先合成寡核苷酸單鏈(標(biāo)簽)，與這些標(biāo)簽 互補(bǔ)的帶有熒光標(biāo)記的寡核苷酸鏈能通過雜交結(jié)合上去，然后掃描檢測(cè)其熒光標(biāo)記。引入 芯片技術(shù)有助于實(shí)現(xiàn)高通量、自動(dòng)化檢測(cè)，而采用標(biāo)簽微陣列使多重檢測(cè)成為可能，可以利 用固定在芯片上的標(biāo)簽容易地將多種寡核苷酸鏈準(zhǔn)確地區(qū)分開來。2005年，美國(guó)貝克曼公司基于這一原理開發(fā)了 GenomeLab SNPstream 12-重 /48-重基因分型系統(tǒng)，該系統(tǒng)采用的微陣列芯片是特殊的384孔板，孔底是平底的玻璃芯 片，從廣泛應(yīng)用于DNA芯片的幾千條寡核苷酸鏈中選取了幾十條交叉雜交率最低、與數(shù)據(jù) 庫(kù)中各種基因組同源性極小、并能提供很強(qiáng)信號(hào)的標(biāo)簽，預(yù)先合成到微陣列芯片板上。384 孔板的每個(gè)孔板底有16個(gè)或者52個(gè)“點(diǎn)”，包括12個(gè)或48個(gè)序列不同的標(biāo)簽和4個(gè)質(zhì)控， 分別可供最多12重或48重延伸反應(yīng)。利用在線引物設(shè)計(jì)工具Autoprimer設(shè)計(jì)擴(kuò)增含候 選單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)目的片段的多重PCR引物和相應(yīng)的多重延伸引物，在每條延伸引物 的5'端加有與芯片上標(biāo)簽序列互補(bǔ)的序列，用于延伸產(chǎn)物與標(biāo)簽微陣列的結(jié)合，結(jié)果可由 成像儀上的雙色熒光讀出。其分型成功率達(dá)到96. 5 %，準(zhǔn)確率達(dá)到99 %，只需要2ng的DNA 就足夠進(jìn)行12重及48重的檢測(cè)，通量靈活，操作簡(jiǎn)便，自動(dòng)化程度高。本發(fā)明建立并優(yōu)化了多重PCR-熒光標(biāo)記單堿基延伸_標(biāo)簽微陣列雜交基因分型 技術(shù)檢測(cè)人補(bǔ)體受體1型等6個(gè)基因標(biāo)簽單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)的方法，以便對(duì)其在健康人 的遺傳特點(diǎn)及與疾病易感性的關(guān)聯(lián)進(jìn)行研究。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是建立采用多重PCR-熒光標(biāo)記單堿基延伸_標(biāo)簽微陣列雜交基因 分型技術(shù)結(jié)合GenomeLab SNPstream 基因分型系統(tǒng)同時(shí)檢測(cè)人補(bǔ)體受體1型(CR1)、達(dá)菲 抗原/趨化因子受體(DARC)、白細(xì)胞分化抗原59(CD59)、白細(xì)胞分化抗原4(CD4)、白細(xì)胞 分化抗原8A(CD8A)和白細(xì)胞分化抗原8B(CD8B)等6個(gè)基因標(biāo)簽單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)的方法。本發(fā)明所述方法包括以下步驟1.候選基因標(biāo)簽單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)的篩選利用HapMap網(wǎng)站的Tagger程序挑選各基因的標(biāo)簽單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn) (http://www. hapmap. org/cgi-perl/gbrowse/hapmap_B36/)① @ 人基因名；②設(shè)置 條件Population (人群)CHB (中國(guó)漢族)；Pairwise Methods (配對(duì)方法)Tagger pairwise (Tagger 配對(duì)標(biāo)志法)；RSquare cut off (復(fù)相關(guān)系數(shù)臨界值)0. 8 ;MAF cut
4off (最小等位基因頻率臨界值):0. 05 ；③執(zhí)行搜索，即可顯示該基因標(biāo)簽單核苷酸多態(tài)性 位點(diǎn)及與其密切關(guān)聯(lián)的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)的登錄號(hào)。Pubmed 網(wǎng)立占(http //www. ncbi. nlm. nih. gov/pubmed/) g才戈示亥 苷酸多態(tài)性位點(diǎn)的信息。根據(jù)各單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)等位基因的類型，確定擬采用的延伸 試劑的類型，并據(jù)此調(diào)整不符合設(shè)計(jì)要求的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)，主要包括單核苷酸多態(tài) 性位點(diǎn)前后含大量重復(fù)序列、相鄰單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)在染色體上位置太近、等位基因類 型不在延伸試劑檢測(cè)范圍內(nèi)。最終確定檢測(cè)的27個(gè)標(biāo)簽單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)見表1。表1 27個(gè)標(biāo)簽單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)信息 2.單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)擴(kuò)增引物及延伸引物設(shè)計(jì)與合成利用貝克曼公司編寫的AP Editor軟件編輯模板序列在指定頁面輸入選定標(biāo)簽 單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)的登錄號(hào)，設(shè)置建立通用類模板(即所有單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)的等位 基因類型以T/A代替)，執(zhí)行操作，即可自動(dòng)搜索含該位點(diǎn)的序列信息；同時(shí)軟件自動(dòng)將重 復(fù)序列用字母“N”屏蔽；導(dǎo)出的序列文件為.txt格式。禾丨J用貝克曼公司在線工具Autoprimer (http //www. autopr imer. com/)設(shè)計(jì)單 核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)擴(kuò)增引物及延伸引物，選擇設(shè)計(jì)引物為48-重，導(dǎo)入AP Editor軟件導(dǎo) 出的序列文件，執(zhí)行設(shè)計(jì)步驟，即可得到各單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)的1對(duì)PCR引物及1條延 伸引物，延伸引物的5'端包含有與微陣列芯片雜交板上固定序列互補(bǔ)的堿基序列。采 M BLAST(http://blast, ncbi. nlm. nih. gov/Blast. cgi)及 UCSC In-Silico PCR 工具 (http://genome, ucsc. edu/cgi-bin/hgPcr ？ command = start) X^ti^if W PCR 弓L的牛寺胃 性進(jìn)行評(píng)價(jià)。設(shè)計(jì)好的引物委托上海生工生物工程有限公司合成，采用聚丙烯酰胺凝膠電 泳法純化。表2設(shè)計(jì)的27個(gè)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)擴(kuò)增引物及延伸引物 3.基因組DNA樣本的制備(1)人全血基因組DNA提取采集受試者清晨空腹靜脈血2mL，入乙二胺四乙酸二鉀抗凝管，混勻。采用 Promega公司W(wǎng)izard 基因組DNA純化試劑盒(貨號(hào)A1125)提取人外周血基因組DNA，按 說明書操作，具體步驟如下①吸取900PL細(xì)胞裂解液加至1.5mL環(huán)氧樹脂管中，輕搖血標(biāo) 本管充分混勻，取全血300 u L加至含有細(xì)胞裂解液的環(huán)氧樹脂管中，顛倒混和5 6次；② 室溫孵育lOmin，其間顛倒2 3次使紅細(xì)胞裂解，13000 16000r/min離心40秒，盡可能 移棄上清，留下白色沉淀物及約10yL殘留液；劇烈震蕩環(huán)氧樹脂管約10 15秒，使白細(xì) 胞重懸；③加入300 iiL細(xì)胞核裂解液至上述重懸細(xì)胞中，抽吸溶液5 6次使白細(xì)胞溶解； ④加入1. 5 ii LRNA酶，顛倒混和2 5次，37°C孵育15min，冷卻至室溫；⑤加入100 y L蛋白 沉淀液，劇烈震蕩10 20秒，靜置lOmin，其間劇烈震蕩2 3次，使蛋白充分沉淀；⑥置室 溫中13000 16000r/min離心5min，可見褐色蛋白沉淀，將上清移至事先加好400 u L異丙 醇的1. 5ml環(huán)氧樹脂管中；⑦輕輕顛倒混和溶液直至白色絲狀DNA成團(tuán)狀；⑧室溫13000 16000r/min離心lmin后輕輕倒出上清，加入500 y L 70%乙醇，輕輕顛倒幾次以洗滌DNA 及環(huán)氧樹脂管管壁，13000 16000r/min離心lmin ；⑨輕輕倒出上清，環(huán)氧樹脂管倒置于吸 水紙上，室溫風(fēng)干10 15min ；⑩加100 u L DNA水化液4°C過夜后，將DNA溶液置超低溫冰 箱保存。(2) DNA純度及濃度測(cè)定①將DU800紫外/可見光分光光度計(jì)調(diào)至DNA測(cè)試狀態(tài)，儀器穩(wěn)定15min ；②先用 空氣調(diào)零，然后吸取100 yL滅菌雙蒸餾水至微量比色杯中，作為空白對(duì)照，再次調(diào)零；③在 0. 5mL環(huán)氧樹脂管中加入96 ii L滅菌雙蒸餾水，吸取DNA溶液4 y L加入其中，混勻后加至微 量比色杯，上機(jī)測(cè)試，記錄260nm吸光度/280nm吸光度比值以及濃度值。4.單重PCR驗(yàn)證單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)擴(kuò)增引物質(zhì)量(1)按下列反應(yīng)體系分別配制各單重PCR混合物，加入96孔板中。引物對(duì)(每種引物濃度為10 u mol/L)0. 5 u LdNTPs (每種成分濃度為 2. 5mmol/L)2. 0 u L10XPCR 緩沖液 II2. 5 ii LMgCl2 (25mmol/L)5. 0 u LAmplitaq Gold DNA 聚合酶(5 單位 / ii L)0. 2 u L基因組DNA0. 5u L雙蒸餾水14. 3 ii L_
合計(jì)25. 0 ii L(2)用封板膜密封96孔板，lOOOr/min離心10秒。(3)在基因擴(kuò)增儀上運(yùn)行如下程序保持(HOLD) :94°C lmin — 40個(gè)循環(huán)94°C 30 秒，55°C 30 秒，72°C lmin — HOLD -A°C lOmin。(4) 1.8%瓊脂糖凝膠電泳稱取0.9g瓊脂糖加入錐形瓶，量取50mL lXTris 堿-乙酸-乙二胺四乙酸緩沖液，搖勻，放入微波爐中加熱至瓊脂糖完全溶解；取出后冷卻 至約70°C，加入2 y L濃度為10 y g/ y L的溴化乙錠溶液，混勻，將瓊脂糖緩緩倒入制膠模 具中，插入梳子，待膠凝固；在對(duì)應(yīng)孔中加入樣本和DL2000 DNA分子標(biāo)準(zhǔn)，將膠置于加有 lXTris堿-乙酸-乙二胺四乙酸緩沖液的電泳槽中，以80伏電壓進(jìn)行電泳；電泳結(jié)束后， 采用SX-300凝膠圖像分析系統(tǒng)掃描凝膠，根據(jù)DNA分子標(biāo)準(zhǔn)判斷擴(kuò)增產(chǎn)物中是否含有與目 標(biāo)片段大小一致的片段。5.單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)的檢測(cè)(1)基因組DNA樣品的稀釋根據(jù)測(cè)定的DNA濃度，在96孔板中加入適量滅菌雙蒸餾水，將待測(cè)DNA樣品全部 稀釋到10ng/ii L。(2)引物稀釋①PCR引物稀釋(共27X2個(gè))將合成好的引物稀釋到240 u mol/L ；從54管稀釋好的PCR引物中各取5 y L加入 到一個(gè)新的環(huán)氧樹脂管中，并補(bǔ)加210 y L滅菌雙蒸餾水，作為新的多重PCR引物池；PCR引 物池中共有480 u L試劑，各引物終濃度為2. 5 u mol/L。②延伸弓丨物稀釋(共27個(gè))將合成好的引物稀釋到240 u mol/L ；從27管稀釋好的延伸引物中各取5 y L力口入 到一個(gè)新的環(huán)氧樹脂管中，并補(bǔ)加105 yL滅菌雙蒸餾水作為新的延伸引物池；延伸引物池 中共有240 u L試劑，各引物終濃度為5 u mol/L。(3) 27-重 PCR
①配制多重反應(yīng)混合物，每個(gè)96孔板(96個(gè)樣品)所需試劑組成如下 引物池(各引物濃度為2. 5 u mol/L) dNTPs (各成分濃度為2. 5mmol/L) 10XPCR緩沖液II MgCl2(25mmol/L)
Amplitaq Gold DNA 聚合酶(5 單位 / ii L) 雙蒸餾水
10. 56u L 18. 77 u L 52. 8u L 105. 6 u L
10.56u L 118.51u L_合計(jì)316.8iiL②向96孔板每孔內(nèi)加入3 u L配好的PCR混合物，再將稀釋好的基因組DNA加入 到對(duì)應(yīng)的孔內(nèi)，每孔加2 iiL。③用封板膜密封96孔板，1000r/min離心10秒。④在基因擴(kuò)增儀上運(yùn)行如下程序HOLD :94°C lmin — 40個(gè)循環(huán)94°C 30秒， 55°C 30 秒，72°C lmin — HOLD :4°C lOmin。
(4)PCR產(chǎn)物純化
①按照下表中的體系，配制純化試劑
核酸外切酶工(20單位／u L)lo．56 u L
堿性磷酸酶(1單位／u L)105．13 u L
10X堿性磷酸酶緩沖液31．68 u L
雙蒸餾水169．43 u L
合計(jì)316．8 u L
②PCR結(jié)束后，取出96孔板，1000r．／’min離心lo秒，每孔加入3 u L新配制的純化試劑。
⑧取新的封板膜密封96孔板，1000r．／’min離心lo秒。
④在基因擴(kuò)增儀上運(yùn)行如下程序37℃30m~n一96℃10m~n一4℃10m~n。純化好的PCR產(chǎn)物可以在一20℃條件下存放幾天。
(5)引物延伸反應(yīng)
①提前將微陣列芯片延伸稀釋緩沖液和純化好的PCR產(chǎn)物解凍。
②按下表所示體系配制微陣列芯片引物延伸反應(yīng)混合物
延伸稀釋緩沖液397．17 u L
延伸引物混合物3．17 1~1+
20 X延伸試劑混合物(T／C，A／G)各lo．56 1~I+
雙蒸餾水315．53 u L
DNA聚合酶2．21 1~I+
合計(jì)739．2 u L
⑧將PCR板t000r．／’m~n離心lo秒，向每個(gè)孔中加入7 u L配制好的引物延伸反應(yīng)混合物。
④重新用封板膜封上PCR板，1000r．／’min離心lo秒。
⑤在基因擴(kuò)增儀上，運(yùn)行如下程序HOLD96℃3min一46個(gè)循環(huán)94~一C20秒，40℃11秒一HOLD4℃10min。
(6)準(zhǔn)備微陣列芯片雜交板并進(jìn)行雜交反應(yīng)
①按照下表所示體系配制微陣列芯片雜交板洗滌液
20~洗滌緩沖液[300~I+
雙蒸餾水5．700 u L
合計(jì)6000 u L
②取一七．384孔微陣列芯片雜交板，用封板膜將本次不使用的孔封閉。向雜交板的每個(gè)反應(yīng)孔中加18~L 1 X微陣列芯片板洗滌緩沖液工。
⑧將微陣列芯片雜交板翻過來放在無生紙上，一起放在離心機(jī)的托盤內(nèi)2000r／min離心2min，使雜交板上每個(gè)孔中的清洗液全部脫離。
④重復(fù)步驟②和⑧，共清洗3次。
⑤根據(jù)下表所示體系配制雜交溶液雜交緩沖液850 U L雜交試劑50 ii L_合計(jì)900 iiL⑥向96孔板每孔中加入8 PL上述雜交溶液，在離心機(jī)上稍稍離心使其混合均勻。 吸取18 ii L加入到微陣列芯片雜交板上對(duì)應(yīng)的孔內(nèi)。⑦將加入混合液的微陣列芯片雜交板放入一個(gè)密封的濕盒中，置于培養(yǎng)箱中， 42°C孵育2 2. 5小時(shí)。(7)雜交反應(yīng)后清洗雜交板①按照下表所示體系配制雜交板清洗液64X 洗滌緩沖液 II100 u L雙蒸餾水6300 iiL_合計(jì)6400 iiL②雜交反應(yīng)完成后，將雜交板扣于無塵吸水紙上，2000r/min離心10秒，甩掉反應(yīng)液。③每個(gè)反應(yīng)孔加入ISiiL IX洗滌緩沖液II，再次清洗微陣列芯片雜交板，共清 洗3次。④清洗完畢后，用無塵紙蘸取少量無水乙醇輕輕擦拭雜交板背面玻片，使其清晰 無痕跡。(8)掃描雜交板清洗好的雜交板馬上放到GenomeLab SNPstream 基因分型系統(tǒng)掃描儀上，運(yùn)行 RunManager程序，進(jìn)行掃描。掃描后雜交板避光保存。6.數(shù)據(jù)分析(1)編輯樣本及信息運(yùn)行PlateExplorer程序，編輯樣本信息并生成.txt文件。導(dǎo)入從Autoprimer軟 件中導(dǎo)出的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)引物文件，上傳樣本信息文件，所有數(shù)據(jù)保存至數(shù)據(jù)庫(kù)中。(2)讀取掃描信息運(yùn)行SNPAdmin程序，將掃描的雜交板信息轉(zhuǎn)化為圖像信息，并上傳數(shù)據(jù)，獲取基 因型。(3)分型結(jié)果調(diào)整與分析運(yùn)行GetGenos程序，通過QC Review判斷是否存在偏移點(diǎn)，如存在則需調(diào)整，并保 存至數(shù)據(jù)庫(kù)，然后重新獲取基因分型信息。在QC Review模式下分析數(shù)據(jù)，在質(zhì)控點(diǎn)分型結(jié) 果合格的情況下，去除分型成功率<90%的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)，通過R印ort程序?qū)С龇?型成功率> 90%的各單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)基因分型報(bào)告。7.單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)檢測(cè)穩(wěn)定性評(píng)價(jià)按上述方法對(duì)部分DNA樣本單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)重復(fù)測(cè)定2次，計(jì)算單一單核苷 酸多態(tài)性位點(diǎn)基因分型結(jié)果符合率。
1

圖1為91例樣本檢測(cè)后質(zhì)控點(diǎn)分型結(jié)果，其中a、b、c、d圖分別為基因型XX、YY、 XY和陰性質(zhì)控點(diǎn)；圖2為91例樣品檢測(cè)后3個(gè)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)的分型結(jié)果，其中a、b、c圖分別 為單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)rs3213427、rs863002、rs3020729，可見91例樣本根據(jù)3個(gè)單核苷 酸多態(tài)性位點(diǎn)分別被清晰地歸類到XX、XY，YY、XY，XX、XY、YY基因型。本發(fā)明的有益效果(1)本發(fā)明采用的單堿基延伸法使檢測(cè)的敏感度和準(zhǔn)確性大大超過了一般測(cè)序反 應(yīng)；(2)本發(fā)明采用的標(biāo)簽微陣列雜交技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)高通量、自動(dòng)化和多重檢測(cè)；(3)本發(fā)明所述方法操作簡(jiǎn)單、結(jié)果判斷快速準(zhǔn)確、檢測(cè)結(jié)果穩(wěn)定性高、單次檢測(cè) 平均成本低廉。本發(fā)明所應(yīng)用的試劑如下Wizard 基因組DNA純化試劑盒、瓊脂糖、堿性磷酸 酶(1單位/PL)、10X堿性磷酸酶緩沖液為美國(guó)Promega公司產(chǎn)品，dNTPs(每種成分 濃度為2. 5mmol/L)、DL2000DNA分子標(biāo)準(zhǔn)為日本Takara公司產(chǎn)品，10XPCR緩沖液II、 MgCl2(25mmol/L)、Amplitaq Gold DNA 聚合酶(5 單位 / ii L)為瑞士 Roche 公司產(chǎn)品，Tris 堿-乙酸-乙二胺四乙酸緩沖液、溴化乙錠溶液(lOyg/yL)為北京天根公司產(chǎn)品，核酸外 切酶I (20單位/ y L)為美國(guó)Biolabs公司產(chǎn)品，延伸稀釋緩沖液、20 X延伸試劑混合物(T/ C，A/G)、DNA聚合酶、20X洗滌緩沖液I、雜交緩沖液、雜交試劑、64X洗滌緩沖液II、微陣 列芯片雜交板為美國(guó)Beckman Coulter公司產(chǎn)品(除已標(biāo)明來源外)。本發(fā)明所應(yīng)用的主要儀器如下DU800紫外/可見光分光光度計(jì)、GenomeLab SNPstream 基因分型系統(tǒng)為美國(guó) BeckmanCoulter公司產(chǎn)品，基因擴(kuò)增儀為德國(guó)Eppendorf公司產(chǎn)品，EPS-4105數(shù)字式雙恒 電泳儀為北京軍科院儀器廠產(chǎn)品，SX-300凝膠圖像分析系統(tǒng)為上海小源科技公司產(chǎn)品(除 已標(biāo)明來源外)。序列表<110>中國(guó)人民解放軍總醫(yī)院<120> 一種檢測(cè)人6種免疫相關(guān)基因的標(biāo)簽單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)方法<160>81<210>1<211>18<212>DNA<213>人工序列<223>對(duì)人工序列的描述本發(fā)明設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增rs4844600-R-TC-U41的上游擴(kuò)增 引物。<400>1AATAACCAGG GCGGCATT 18<210>2
<211>18<212>DNA<213>人工序列<223>對(duì)人工序列的描述本發(fā)明設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增rs4844600-R-TC-U41的下游擴(kuò)增 引物。<400>2AATGCCCCAG AATGGCTT 18<210>3<211>45<212>DNA<213>人工序列<223>對(duì)人工序列的描述本發(fā)明設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增rs4844600-R-TC-U41的上游延伸 引物。<400>3TACCTATGAC CAGCAAGCAC GATATGTCCC AATGGGAAAC TCAAA<210>4<211>18<212>DNA<213>人工序列<223>對(duì)人工序列的描述本發(fā)明設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增rs2255301-TC-U39的上游擴(kuò)增引 物。<400>4GAAAGGCAAA GGTGGAGG 18<210>5<211>18<212>DNA<213>人工序列<223>對(duì)人工序列的描述本發(fā)明設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增rs2255301-TC-U39的下游擴(kuò)增引 物。<400>5TGCTGGGAGG AGCGCTAA 18<210>6<211>45<212>DNA<213>人工序列<223>對(duì)人工序列的描述本發(fā)明設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增rs2255301-TC-U39的上游延伸引 物。<400>6CACGACAAGA CAACAGATAC GGGGTAGAGG GGGACAGCGG CGACA 45
1
<210>7<211>23<212>DNA<213>人工序列<223>對(duì)人工序列的描述本發(fā)明設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增rsll585-TC_U40的上游擴(kuò)增引 物。<400>7TACCTTAATT TCTAGGTGGG TGC 23<210>8<211>18<212>DNA<213>人工序列<223>對(duì)人工序列的描述本發(fā)明設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增rsll585-TC_U40的下游擴(kuò)增引 物。<400>8CCTCCTCTCC CAGAGGCT 18<210>9<211>45<212>DNA<213>人工序列<223>對(duì)人工序列的描述本發(fā)明設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增rsll585-TC_U40的上游延伸引 物。<400>9AAGTACCACG TCAACGTCAC TTCATTGTAG GTAAGGACAT TTTCT 45<210>10<211>24<212>DNA<213>人工序列<223>對(duì)人工序列的描述本發(fā)明設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增rs831629-TC_U34的上游擴(kuò)增引 物。<400>10ATTTCTTAGT TCTGCTATGG ATGC 24<210>11<211>24<212>DNA<213>人工序列<223>對(duì)人工序列的描述本發(fā)明設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增rs831629-TC-U34的下游擴(kuò)增引 物。<400>11
TAGTGATAGC ATCAGGTGAG AAGA 24<210>12<211>45<212>DNA<213>人工序列<223>對(duì)人工序列的描述本發(fā)明設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增rs831629-TC-U34的上游延伸引 物。<400>12CACTAGTCAT AACGCAGCCT TACTTAGGCA AGTTCAAAAC CTCCC 45<210>13<211>24<212>DNA<213>人工序列<223>對(duì)人工序列的描述本發(fā)明設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增rs3020729-TC_U38的上游擴(kuò)增引 物。<400>13TAAAATGAAG TGGTGAGCTT AACC 24<210>14<211>18<212>DNA<213>人工序列<223>對(duì)人工序列的描述本發(fā)明設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增rs3020729-TC-U38的下游擴(kuò)增引 物。<400>14GGCCCCTCTG CAATGCAA 18<210>15<211>45<212>DNA<213>人工序列<223>對(duì)人工序列的描述本發(fā)明設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增rs3020729-TC_U38的上游延伸引 物。<400>15ACGTAAGACC ACTCAAGACC AAAGAAAATC TCTGTGAAAC CCCTA 45<210>16<211>24<212>DNA<213>人工序列<223>對(duì)人工序列的描述本發(fā)明設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增rsl075835-TC_U37的上游擴(kuò)增引 物。
物。物。

增引物。
增引物。
<400>16
TAGACTGTCA TCTCTGTCCT CAAG 24
<210>17
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<223>對(duì)人工序列的描述本發(fā)明設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增 -TC-U37的下游擴(kuò)增引 <400>17
TACTCTGAAG TCCCACAGCA C 21 <210>18 <211>45 <212>DNA <213>人工序列
<223>對(duì)人工序列的描述本發(fā)明設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增rsl075835-TC-U37的上游延伸引 <400>18
ACCGCACTAA GCAATGTATC GGAGAGTTGA GAAACCAAAT CACTA 45
<210>19
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<223>對(duì)人工序列的描述本發(fā)明設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增rsl3024609-R-TC-U35的上游擴(kuò) <400>19
TGGTTCTGAG GCTACAGCA 19 <210>20 <211>23 <212>DNA <213>人工序列
<223>對(duì)人工序列的描述本發(fā)明設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增rsl3024609-R-TC-U35的下游擴(kuò) <400>20
ACTTGAGTTA AGATCACACT GGG 23 <210>21 <211>45 <212>DNA <213>人工序列
<223>對(duì)人工序列的描述本發(fā)明設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增rsl3024609-R-TC-U35的上游延伸引物。

物。物。物。引物。
<400>21
CAGAATAGCC ACGCCTAGAT ACCGAACTCG GCCTGTGCCC CAACT 45 <210>22 <211>28 <212>DNA <213>人工序列
<223>對(duì)人工序列的描述本發(fā)明設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增rs863002-TC-U36的上游擴(kuò)增引 <400>22
CTCAGTCTTT ATATCTCTT CCTTTTCC 28
<210>23
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<223>對(duì)人工序列的描述本發(fā)明設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增rs863002-TC-U36的下游擴(kuò)增引 <400>23
ATGGAACTGA CTCAAAGGCA 20
<210>24
<211>45
<212>DNA
<213>人工序列
<223>對(duì)人工序列的描述本發(fā)明設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增rs863002-TC-U36的下游延伸引 <400>24
CACCGCTATC AACAGACTTG CTAGGAGGCT AGCATAGGAA GGAGA 45
<210>25
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<223>對(duì)人工序列的描述本發(fā)明設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增rs3213426-R-TC-U33的上游擴(kuò)增 <400>25
AACTTGTAGA ATTACAACT GGCAG 25 <210>26 <211>18 <212>DNA <213>人工序列
引物。引物。物。物。物。
<223>對(duì)人工序列的描述本發(fā)明設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增rs3213426-R-TC-U33的下游擴(kuò)增 <400>26
TCCTCTGTGG TCCCAGGG 18
<210>27
<211>45
<212>DNA
<213>人工序列
<223>對(duì)人工序列的描述本發(fā)明設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增rs3213426-R-TC-U33的上游延伸 <400>27
CGCAGAAGCA ACTCACTTCT GCCCAGGACC ACAACCCACC TCACT 45 <210>28 <211>23 <212>DNA <213>人工序列
<223>對(duì)人工序列的描述本發(fā)明設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增rs3213427-TC-U31的上游擴(kuò)增引 <400>28
TTGAGTGTTG CTCTCTAGTT TCC 23
<210>29
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<223>對(duì)人工序列的描述本發(fā)明設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增rs3213427-TC-U31的下游擴(kuò)增引 <400>29
CCTGGGATCC AAATGAGC 18
<210>30
<211>45
<212>DNA
<213>人工序列
<223>對(duì)人工序列的描述本發(fā)明設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增rs3213427-TC-U31的上游延伸引 <400>30
CAGAACATCC TCAGAAGCAA CCTTCAAGCC TAGCCCTTCT CTCAT 45
<210>31
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列<223>對(duì)人工序列的描述本發(fā)明設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增rsl055141-TC_U32的上游擴(kuò)增引 物。<400>31CAGAAAAATT TGACCTGTGA GG 22<210>32<211>18<212>DNA<213>人工序列<223>對(duì)人工序列的描述本發(fā)明設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增rsl055141-TC_U32的下游擴(kuò)增引 物。<400>32TTCTCCCGCT TCGAGACC 18<210>33<211>45<212>DNA<213>人工序列<223>對(duì)人工序列的描述本發(fā)明設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增rsl055141-TC_U32的上游延伸引 物。<400>33CAAGCAACGA CCTACTACAA CCACCTCCCC TAAGCTGATG CTGAG 45<210>34<211>22<212>DNA<213>人工序列<223>對(duì)人工序列的描述本發(fā)明設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增rsl075838-TC-U29的上游擴(kuò)增引 物。<400>34CCACTTTATA TCCTAGGCCT GG 22<210>35<211>20<212>DNA<213>人工序列<223>對(duì)人工序列的描述本發(fā)明設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增rsl075838-TC_U29的下游擴(kuò)增引 物。<400>35TAACTGGGGA CCAGATGACA 20<210>36<211>45
20
<212>DNA<213>人工序列<223>對(duì)人工序列的描述本發(fā)明設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增rsl075838-TC_U29的上游延伸引 物。<400>36AATAAGCTCA CCACCGTCAA TCCTTTGAGG TGCTATCTTG GTGCC 45<210>37<211>23<212>DNA<213>人工序列<223>對(duì)人工序列的描述本發(fā)明設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增rsl546727-R-TC_U23的上游擴(kuò)增 引物。<400>37CTCTAGAGCT GGCCTGT°C TA TTT 23<210>38<211>23<212>DNA<213>人工序列<223>對(duì)人工序列的描述本發(fā)明設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增rsl546727-R-TC_U23的下游擴(kuò)增 引物。<400>38TAAACCTAGG GTTCTCATTT TCC 23<210>39<211 >45<212>DNA<213>人工序列<223>對(duì)人工序列的描述本發(fā)明設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增rsl546727-R-TC-U23的下游延伸 引物。<400>39AGTAGCCTAA CAGCACTCGA AGGTTAAGTA ACTTGCCTGA GGGTC 45<210>40<211>26<212>DNA<213>人工序列<223>對(duì)人工序列的描述本發(fā)明設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增rsl3400210-TC-U25的上游擴(kuò)增 引物。<400>40ATAAATAAAA AAGAGAAGCA CAATGC 26<210>41
21
<211>19<212>DNA<213>人工序列<223>對(duì)人工序列的描述本發(fā)明設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增rsl3400210-TC-U25的下游擴(kuò)增 引物。<400>41AACCACCCTG GAAGGTAGG 19<210>42<211 >45<212>DNA<213>人工序列<223>對(duì)人工序列的描述本發(fā)明設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增rsl3400210-TC-U25的上游延伸 引物。<400>42CCATAACAAC TTACCAGCCA ATCTCTGACT CTGGCCCGTC TCTTC 45<210>43<211>21<212>DNA<213>人工序列<223>對(duì)人工序列的描述本發(fā)明設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增rsll064410-R-TC-U21的上游擴(kuò) 增引物。<400>43TCTCCTCAGT TCTAGGCACA C 21<210>44<211>23<212>DNA<213>人工序列<223>對(duì)人工序列的描述本發(fā)明設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增rsll064410-R-TC-U21的下游擴(kuò) 增引物。<400>44TTTTCTTTTG AAGAGAAGCA AGG 23<210>45<211 >45<212>DNA<213>人工序列<223>對(duì)人工序列的描述本發(fā)明設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增rsll064410-R-TC-U21的上游延 伸引物。<400>45GATCCATCAA CAGACATCAC TATCCTGCCA TCACCCCAAA CGCAA 45<210>46 <211>24 <212>DNA <213>人工序列
<223>對(duì)人工序列的描述本發(fā)明設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增rsl7048010-TC-U19的上游擴(kuò)增 <400>46
AAATTTCTGC CGTAATTCTC TACC 24
<210>47
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<223>對(duì)人工序列的描述本發(fā)明設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增rsl7048010-TC-U19的下游擴(kuò)增 <400>47
TATGGAGTTT CTGTTATAAC TGCC 24
<210>48
<211>45
<212>DNA
<213>人工序列
<223>對(duì)人工序列的描述本發(fā)明設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增rsl7048010-TC-U19的上游延伸 <400>48
CCACTCAACT CCACGAATAC TTCAAGGCTG CTCCTTGTTC TAATA 45
<210>49
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<223>對(duì)人工序列的描述本發(fā)明設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增rs4832054-R-TC-U20的上游擴(kuò)增 <400>49
AAAAGAAGTT TCTCTCTCCT CATG 24
<210>50
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<223>對(duì)人工序列的描述本發(fā)明設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增rs4832054-R-TC-U20的下游擴(kuò)增 <400>50
ATTTGTCATG TAATCCACAT GTTC 24<210>51<211>45<212>DNA<213>人工序列<223>對(duì)人工序列的描述本發(fā)明設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增rs4832054-R-TC-U20的下游延伸 引物。<400>51ACAACTACCG ACGACAAGAC TGGAGTCTAT TCATGCATCA CTTCA 45<210>52<211>21<212>DNA<213>人工序列<223>對(duì)人工序列的描述本發(fā)明設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增rs3818361-TC_U18的上游擴(kuò)增引 物。<400>52AAAGGACAGT TCCAGAGCAC T 21<210>53<211>26<212>DNA<213>人工序列<223>對(duì)人工序列的描述本發(fā)明設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增rs3818361-TC-U18的下游擴(kuò)增引 物。<400>53TTAGTGAGAT GTGGCTACTG AACTAC 26<210>54<211>45<212>DNA<213>人工序列<223>對(duì)人工序列的描述本發(fā)明設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增rs3818361-TC-U18的上游延伸引 物。<400>54AACATCCACG CAACTCATAC GTTAGATATG GGGCAATTTC CTTTG 45<210>55<211>20<212>DNA<213>人工序列<223>對(duì)人工序列的描述本發(fā)明設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增rsll064404-TC-U14的上游擴(kuò)增 引物。
引物。引物。物。物。
<400>55
TACAAAATTG GAACACCACC 20
<210>56
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<223>對(duì)人工序列的描述本發(fā)明設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增rsll064404-TC-U14的下游擴(kuò)增 <400>56
GCTTTGCCAT TTTAGCCTC 19
<210>57
<211>45
<212>DNA
<213>人工序列
<223>對(duì)人工序列的描述本發(fā)明設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增rsll064404-TC-U14的上游延伸 <400>57
AACATACAGA CGCACTCCTC AATGCTGATG AGGATGTGGA GAAAC 45
<210>58
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<223>對(duì)人工序列的描述本發(fā)明設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增rsl738548-TC-U12的上游擴(kuò)增引 <400>58
AATTACTTGT CTGAAATGGC AGG 23
<210>59
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<223>對(duì)人工序列的描述本發(fā)明設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增rsl738548-TC-U12的下游擴(kuò)增引 <400>59
AAGAAGCAGA AAAAAGTCAT GATG 24 <210>60 <211>45 <212>DNA <213>人工序列
<223>對(duì)人工序列的描述本發(fā)明設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增rsl738548-TC-U12的上游延伸引<400>60
CCAGATCCTC ACCATGTAAG ACCTCAATCT GTAGTACATA TCAAG 45 <210>61 <211>28 <212>DNA <213>人工序列
<223>對(duì)人工序列的描述本發(fā)明設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增rsllll8167-TC-U10的上游擴(kuò)增 <400>61
ATTTAATTGA GTCAATACTG GTTATGTG 28 <210>62 <211>24 <212>DNA <213>人工序列
<223>對(duì)人工序列的描述本發(fā)明設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增rsllll8167-TC-U10的下游擴(kuò)增 <400>62
AAAAGATAAG GCATGAGAAA TGAA 24
<210>63
<211>45
<212>DNA
<213>人工序列
<223>對(duì)人工序列的描述本發(fā)明設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增rsllll8167-TC-U10的上游延伸 <400>63
TCCAGAATAG ACAACAGACG CCAATATGTG AATATTATTA TCTTA 45
<210>64
<211>31
<212>DNA
<213>人工序列
<223>對(duì)人工序列的描述本發(fā)明設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增rs2231454-R-TC-U6的上游擴(kuò)增 <400>64
TATACTTACT ACTGTGAAGT AGGTCTCAAC T 31
<210>65
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
26<223>對(duì)人工序列的描述本發(fā)明設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增rs2231454-R-TC-U6的下游擴(kuò)增
<400>65
TCCCTAAAGT TTGAGAACCA CT 22 <210>66 <211>45 <212>DNA <213>人工序列
<223>對(duì)人工序列的描述本發(fā)明設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增rs2231454-R-TC-U6的上游延伸 <400>66
ACAACTCACG CAAGTACCAT CACCAACTGG TGCTAAAGAC TAGGA 45 <210>67 <211>32 <212>DNA <213>人工序列
<223>對(duì)人工序列的描述本發(fā)明設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增rsl2477946-R-TC-U7的上游擴(kuò)增 <400>67
ATATTTATTC TATCTGGAGT ATACATTTGT GA 32 <210>68 <211>22 <212>DNA <213>人工序列
<223>對(duì)人工序列的描述本發(fā)明設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增rsl2477946-R-TC-U7的下游擴(kuò)增 <400>68
AAGGATTCGA TCATTAGTGC TG 22 <210>69 <211>45 <212>DNA <213>人工序列
<223>對(duì)人工序列的描述本發(fā)明設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增rsl2477946-R-TC-U7的上游延伸 <400>69
TACAAGCACG CACTAGACAT GAGATAGAGT TCAAGTTTTA CGTTT 45 <210>70 <211>26 <212>DNA
<213>人工序列<223>對(duì)人工序列的描述本發(fā)明設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增rs6722860-TC_U5的上游擴(kuò)增引 物。<400>70TTTGTCTTAC ATCCAAGTAC TGAAGT 26<210>71<211>24<212>DNA<213>人工序列<223>對(duì)人工序列的描述本發(fā)明設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增rs6722860-TC_U5的下游擴(kuò)增引 物。<400>71ATCTGAGAAT TCAGAAAGCA GATC 24<210>72<211>45<212>DNA<213>人工序列<223>對(duì)人工序列的描述本發(fā)明設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增rs6722860-TC_U5的上游延伸引 物。<400>72CAACAAGTAA TCCGCAGACT CCAGGCTGCT ACAGGGCTTG AAGGT 45<210>73<211>27<212>DNA<213>人工序列<223>對(duì)人工序列的描述本發(fā)明設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增rsl2576440-R-TC_U4的上游擴(kuò)增 引物。<400>73TTTTAGTCTA GGGAGTAGTT TTACCAA 27<210>74<211>31<212>DNA<213>人工序列<223>對(duì)人工序列的描述本發(fā)明設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增rsl2576440-R-TC-U4的下游擴(kuò)增 引物。<400>74CCCAAATATT CTATAATTAA CCAAGTATTA C 31<210>75<211>45
<212>DNA<213>人工序列<223>對(duì)人工序列的描述本發(fā)明設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增rsl2576440-R-TC-U4的上游延伸 引物。<400>75ATCTAACGCA CCTACGACCT GAACATTGTC ATGTGTGAAT TTTCC 45<210>76<211>28<212>DNA<213>人工序列<223>對(duì)人工序列的描述本發(fā)明設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增rsl0768024-TC_U3的上游擴(kuò)增引 物。<400>76AGATTAAGGA GATTATTTTG GATTATTC 28<210>77<211>20<212>DNA<213>人工序列<223>對(duì)人工序列的描述本發(fā)明設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增rsl0768024-TC_U3的下游擴(kuò)增引 物。<400>77TCGGTCATGA GTCTTTGACA 20<210>78<211>45<212>DNA<213>人工序列<223>對(duì)人工序列的描述本發(fā)明設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增rsl0768024-TC_U3的上游延伸引 物。<400>78CAGCCATCCA TTCACTATCT GGGCCCAATG TAATCCCAGG GGTCA 45<210>79<211>23<212>DNA<213>人工序列<223>對(duì)人工序列的描述本發(fā)明設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增rs9429945-TC_U2的上游擴(kuò)增引 物。<400>79AATTTCCACA AACTTAGTGG CTT 23<210>80
<211>19<212>DNA<213>人工序列<223>對(duì)人工序列的描述本發(fā)明設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增rs9429945-TC_U2的下游擴(kuò)增引 物。<400>80AGCCTCCACA AGGAACACA 19<210>81<211>45<212>DNA<213>人工序列<223>對(duì)人工序列的描述本發(fā)明設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增rs9429945-TC-U2的上游延伸引 物。<400>81CTCAGACTAC GAATCCACGT TGTATTCTCT TCCAGTTCTG GAGGC 4權(quán)利要求
一種檢測(cè)人6種免疫相關(guān)基因的標(biāo)簽單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)方法，這些基因及標(biāo)簽單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)為補(bǔ)體受體1型基因rs3818361、rs9429945、rs4844600、rs17048010、rs11118167；達(dá)菲抗原/趨化因子受體基因rs863002；白細(xì)胞分化抗原59基因rs1546727、rs831629、rs10768024、rs2231454、rs11585、rs1738548、rs12576440；白細(xì)胞分化抗原4基因rs11064410、rs2255301、rs1075835、rs1075838、rs11064404、rs3213427、rs1055141、rs3213426；白細(xì)胞分化抗原8A基因rs3020729；白細(xì)胞分化抗原8B基因rs4832054、rs12477946、rs13024609、rs6722860、rs13400210，其特征在于檢測(cè)方法包括如下步驟(1)挑選各基因的標(biāo)簽單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)，確定延伸試劑類型，并對(duì)初選單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)進(jìn)行評(píng)價(jià)、調(diào)整；(2)設(shè)計(jì)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)擴(kuò)增引物及延伸引物，委托公司合成；(3)制備人全血基因組DNA樣本；(4)單重PCR驗(yàn)證單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)擴(kuò)增引物質(zhì)量；(5)通過多重PCR-熒光標(biāo)記單堿基延伸-標(biāo)簽微陣列雜交反應(yīng)制備供基因分型系統(tǒng)檢測(cè)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)用的樣本；(6)采用基因分型系統(tǒng)檢測(cè)樣本單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)；(7)采用基因分型系統(tǒng)軟件分析單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)分型效果，去除分型成功率＜90％的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)，并利用分型成功率＞90％的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)確定個(gè)體基因型；(8)對(duì)多個(gè)DNA樣本單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)重復(fù)檢測(cè)，計(jì)算分型符合率，以評(píng)價(jià)方法的穩(wěn)定性。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種檢測(cè)人6種免疫相關(guān)基因的標(biāo)簽單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)方 法，其特征在于設(shè)計(jì)的27個(gè)標(biāo)簽單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)擴(kuò)增引物及延伸引物序列如序列1 81所述引物序列。
全文摘要
本發(fā)明提供一種檢測(cè)人6種免疫相關(guān)基因的標(biāo)簽單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)方法，它運(yùn)用多重PCR-熒光標(biāo)記單堿基延伸-標(biāo)簽微陣列雜交基因分型技術(shù)結(jié)合GenomeLabTMSNPstream基因分型系統(tǒng)同時(shí)檢測(cè)上述6個(gè)基因27個(gè)標(biāo)簽單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)，具體方法包括基因組DNA提取、候選基因標(biāo)簽單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)的篩選、單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)擴(kuò)增引物及延伸引物設(shè)計(jì)與合成、單重PCR驗(yàn)證單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)擴(kuò)增引物質(zhì)量、單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)檢測(cè)樣本的制備及檢測(cè)、數(shù)據(jù)分析、方法穩(wěn)定性評(píng)價(jià)。本發(fā)明具有高通量、高精確度、高通用性、簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)、可進(jìn)行自動(dòng)化檢測(cè)的優(yōu)點(diǎn)，可用于上述免疫相關(guān)基因在健康人的遺傳特點(diǎn)或其與各種疾病遺傳易感性的關(guān)聯(lián)研究。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK101851673SQ20101010075
公開日2010年10月6日 申請(qǐng)日期2010年1月26日 優(yōu)先權(quán)日2010年1月26日
發(fā)明者田亞平, 胡金川 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍總醫(yī)院