專利名稱：一種抗白粉病近等基因系Brock/京411⁷的遺傳檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于農(nóng)業(yè)生物技術(shù)工程，涉及抗白粉病近等基因系配制，更具體的說是涉 及小麥Brock抗白粉病近等基因系遺傳背景的分子檢測與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
近等基因系(Near-isogenic Lines, NIL)是由Yong等提出的，指的是遺傳背景 相近，目標(biāo)基因不同的一組品系(Young N D, Zamir D G, Tanksley S D. Use of isogenic lines andsimultaneoue probing to identify DNA markers tightly linked to the TM-Za gene in tomato. Genetics. 1988，120 :579_585)，它可以用于基因多效性分析、目 標(biāo)基因分離、基因精細(xì)定位和克隆等研究(田清震，周榮華，賈繼增.小麥抗白粉病近等 基因系遺傳背景的分子檢測.作物學(xué)報，2004，30 (3) :205-209;張毅，李云峰，謝戎，楊正 林，鐘秉強，沈福成，譚自俊，何光華.水稻小穗簇生性近等基因系的構(gòu)建及其近等性評 價.作物學(xué)報，2006，32 (3) :397-401)，因此，是遺傳學(xué)及育種研究的珍貴材料。通過雜交 和多代回交已培育了包括抗病性在內(nèi)的許多目標(biāo)性狀的NIL，并應(yīng)用于各自的相關(guān)領(lǐng)域研 究中([BorbalaD, Harrach J F，Miklos P，et al. Antioxidant ethylene and membrane leakage responses topowdery mildew infection of near-isogenic barley lines with various types of resistance. European Journal of Plant Pathology.2008， 121 :21_33 ；Mumtaz S，Khan I A，Ali S，et al. Development of RAPD based markers for wheat rust resistance gene cluster(Lr37_Sr38_Yrl7)derived from Triticum ventricosum L.African Journal of Biotechnology. 2009，8(7) : 1188-1192 ；Zhu S， Walker D R，Boerma H R，et al. Effects of defoliating insectresistance QTLs and a crylAc transgene in soybean near-isogenic lines. Theoretical andApplied Genetics. 2008，116 :455_463 ；Brevis J C，Chicaiza 0，Khan I A，et al. Agronomicand quality evaluation of common wheat near-isogenic lines carrying the Leaf Rust ResistanceGene Lr47. Crop Science.2008,48,1411-1451. Zhou R H, Zhu Z D， Kong X Y，Huo N X，Tian Q Z，Li P，Jin C Y，Dong Y C，Jia J Z. Development of wheat near-isogenic lines forpowdery mildew resistance.Theoretical and Applied Genetics. 2005，110 :640_648)。但NIL的培育與選擇需7_8年時間，周期長，而選擇效率 的評價指標(biāo)是回交代數(shù)和外觀形態(tài)，這種方法容易受發(fā)育和環(huán)境條件影響，選擇效率低。 分子水平上跟蹤和評價NIL遺傳背景，可靠性高，不受發(fā)育和環(huán)境條件制約，因此，可以提 高NIL的培育進程和選擇效率。栽培小麥Brock中含有一個抗白粉病新基因(Wang Z Y， Zheng Q，Peng Y K，et al.Identification of random amplified polymorphic DNA and simple sequence repeat markerslinked to powdery mildew resistance in common wheat cultivar Brock. Plant ProductionScience，2004，7(3) 318-322 ；Wang Z Y，Zhao P，Chen H，et al. Identification of RAPDmarkers and development of SCAR markers linked to a powdery mildew resistance gene， andtheir location on chromosome inwheat cultivar Brock. Plant Production Science, 2005,8 (5) :578_585)。中國農(nóng)業(yè)大學(xué) 以Brock為供體，和農(nóng)業(yè)性狀優(yōu)良的小麥品系015雜交后，后代與優(yōu)良品 種京411雜交，獲 得抗白粉病的F1，與京411為輪回親本再次雜交，后代用京411回交，并在白粉菌脅迫下選 擇，配制了近等基因系Brock/015//京4117。本發(fā)明以Brock為抗白粉病基因供體親本，直接和優(yōu)良品種京411，通過雜交、回 交和白粉菌脅迫下的個體選擇，配制了抗白粉病近等基因系Brock/京4117。并利用AFLP方 法，對本發(fā)明配制的近等基因系Brock/京4117的遺傳背景進行了檢測，該檢測在抗白粉病 基因供體親本Brock、輪回親本京411和近等基因系Brock/015/京4117和Brock/京4117 之間進行。結(jié)果發(fā)現(xiàn)有4種AFLP譜型“親二型”、“偏抗病供體Brock型”、“偏輪回親本京 411型”和“交換型”被檢測到，它們能反映出近等基因系中雙親遺傳背景。同時，對2對近 等基因系中與抗病基因相連鎖分子標(biāo)記進行了篩選，獲得緊密連鎖分子標(biāo)記P15/M14-160。 上述對近等基因系遺傳背景的檢測，會使其能在抗病遺傳機理研究和農(nóng)業(yè)上應(yīng)用發(fā)揮更好 作用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于用對白粉菌免疫的小麥品種Brock為抗白粉病基因供體親本， 以農(nóng)藝性狀優(yōu)良的品種京411為輪回親本，配制抗白粉病近等基因系，通過AFLP檢測技術(shù)， 檢測近等基因系與雙親間的遺傳背景，從而獲得可靠的抗白粉病近等基因系，用于小麥的 抗白粉病育種、抗病基因因克隆及抗病分子機理研究。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供如下的 技術(shù)方案一種抗白粉病近等基因系Brock/京4117遺傳檢測方法，其特征在于包括如下步 驟DAFLP分析參照所用接頭和引物見表1 ；表1 AFLP分析所用接頭和引物
接頭與引物 序列
Pst I 接頭 5’ CTCGTAGACTGCGTACATGCA3’
3' CATCTGACGCATGT 5' Mse I 接頭 5' GACGATGAGTCCTGAG3' 3' TACTCAGGACTCAT5' 5， GACTGCGTACATGCAG3， 預(yù)擴增引物 5’ GATGAGTCCTGAGTAA3，
5’ -GACTGCGTACATGCAG ANN 或 GNN_3;~ 5’ -GATGAGTCCTGAGTAACNN-3’
選擇性擴增引物注下畫線部分為選擇堿基，N為任意堿基A、G、T、C
2)基因組 DNA 雙酶切及接頭連接100XBSA 0. 2μ 1, NEB buffer 4. 0μ 1, Pst I(20U/y 1)0. 25 μ 1, Mse I(10U/μ 1)0. 5 μ 1, Pst I 接頭(5ρΜ) 1· 0 μ 1，Mse I 接頭 (50ρΜ) 1· 0μ 1，Τ4 DNAligase 0. 4μ 1,10ΧΤ4 buffer 2· O μ 1，DNA(100ng/μ 1) 5· O μ 1， ddH20補齊40 μ 1。37 °C條件下保溫8個小時；3)預(yù)擴增反應(yīng)體系為25 μ L，內(nèi)含IyL連接產(chǎn)物，0.6pmol/L引物，IOXPCR緩沖 液 2. 5μ L，0. 2mmol/L 的 dNTPs，IU Taq 聚合酶。PCR 擴增程序為 94°C 2min ；94°C 35S,56°C 35S，72°C 60S, 30個循環(huán)；72°C 5min。預(yù)擴增產(chǎn)物用瓊脂糖電泳檢測，稀釋20倍保存
備用；
4)選擇性擴增選擇性擴增體積為20 μ L，AFLP選擴體系Pst I接頭引物(50ng/ μ L) 0· 8 μ L，Mse I 接頭引物(50ng/μ L) 0. 8 μ L, IOXBuffer 2. 0 μ LjMgCl2 (25mM) L 2 μ L， dNTP (IOmM) 0. 45 μ L, TaqE (5U/ μ L) 0· 2 μ L，模板 DNA 2. 0 μ L, ddH20 補齊 20 μ L ；PCR 擴增采 用遞降式方法，其程序為94°C 2min -MV 35S，65°C 35S，72°C 30S,以后每個循環(huán)退火溫度 降低 0. 7°C，共 12 個循環(huán)；然后 94°C 35S，56°C 35S, 72°C, 60S, 30 個循環(huán)；最后 72°C 5min。 擴增在MJ Research PTC-200型PCR儀上進行。5)擴增產(chǎn)物的檢測擴增產(chǎn)物加等量loading Buffer (98 %甲酰胺；IOmM EDTA(pH8. 0) ；0.25%溴酚蘭；0. 25%二甲苯青)，95°C變性5min，立即于冰浴待用；用6% 的變性聚丙烯酰胺凝膠(含6mol/L尿素)電泳分離，銀染法顯示電泳圖譜。6)遺傳背景分析以兩個近等基因系(Brock/015//京4117 ；Brock/京4117)和供 體親本Brock及輪回親本京411為材料，用表2中隨機選取225對AFLP引物組合，用上述 酶切連接、預(yù)擴增、選擇擴增及擴增產(chǎn)物檢測體系進行AFLP分子檢測，結(jié)果有4種親二型、 偏抗病供體Brock型、偏輪回親本京411型和交換型被檢測到。表2 AFLP標(biāo)記的弓丨物組合
權(quán)利要求
一種抗白粉病近等基因系Brock/京4117遺傳檢測方法，其特征在于包括如下步驟1)AFLP分析參照所用接頭和引物見表1；2)基因組DNA雙酶切及接頭連接100×BSA 0.2μl，NEB buffer 4.0μl，Pst I(20U/μl)0.25μl，Mse I(10U/μl)0.5μl，Pst I接頭(5pM)1.0μl，Mse I接頭(50pM)1.0μl，T4DNAligase 0.4μl，10×T4buffer 2.0μl，DNA(100ng/μl)5.0μl，ddH2O補齊40μl。37℃條件下保溫8個小時；3)預(yù)擴增反應(yīng)體系為25μL，內(nèi)含1μL連接產(chǎn)物，0.6pmol/L引物，10×PCR緩沖液2.5μL，0.2mmol/L的dNTPs，1U Taq聚合酶。PCR擴增程序為94℃2min；94℃35S，56℃35S，72℃60S，30個循環(huán)；72℃5min。預(yù)擴增產(chǎn)物用1％瓊脂糖電泳檢測，稀釋20倍保存?zhèn)溆茫?)選擇性擴增選擇性擴增體積為20μL，AFLP選擴體系PstI接頭引物(50ng/μL)0.8μL，Mse I接頭引物(50ng/μL)0.8μL，10×Buffer 2.0μL，MgCl2(25mM)1.2μL，dNTP(10mM)0.45μL，TaqE(5U/μL)0.2μL，模板DNA 2.0μL，ddH2O補齊20μL；PCR擴增采用遞降式方法，其程序為94℃2min94℃35S，65℃35S，72℃30S，以后每個循環(huán)退火溫度降低0.7℃，共12個循環(huán)；然后94℃35S，56℃35S，72℃，60S，30個循環(huán)；最后72℃5min。擴增在MJ Research PTC 200型PCR儀上進行。5)擴增產(chǎn)物的檢測擴增產(chǎn)物加等量loading Buffer(98％甲酰胺；10mM EDTA(pH8.0)；0.25％溴酚蘭；0.25％二甲苯青)，95℃變性5min，立即于冰浴待用；用6％的變性聚丙烯酰胺凝膠(含6mol/L尿素)電泳分離，銀染法顯示電泳圖譜。6)遺傳背景分析以兩個近等基因系(Brock/015//京4117；Brock/京4117)和供體親本Brock及輪回親本京411為材料，用表2中隨機選取225對AFLP引物組合，用上述酶切連接、預(yù)擴增、選擇擴增及擴增產(chǎn)物檢測體系進行AFLP分子檢測，結(jié)果有4種親二型、偏抗病供體Brock型、偏輪回親本京411型和交換型被檢測到。
2.權(quán)利要求1所述的遺傳檢測方法，其中抗白粉病近等基因系Brock/京4117的配制 在于以抗白粉病普通小麥Brock為抗病基因供體親本，以農(nóng)藝性狀優(yōu)良但不抗白粉病的 栽培小麥京411為輪回親本，BrockX京411雜交，雜交組合為Brock/京411”，所得F1均 抗白粉病，用京411回交7代，自交1代育成抗白粉病近等基因系Brock/京4117;每一次的 雜交和回交，均在白粉菌脅迫下選擇抗病單株。
3.一種采用AFLP方法與抗白粉病基因緊密連鎖的分子標(biāo)記P15/M14-160，其堿基序列為GCAGAAGTCGTTTACAATCAGGTCATAGTAGAAACTGTTGAAATCAAAAGGAAATGGGTGCGTGTTTTGAATTGAGACGTGTTAGTCGCTAAATCGAGGTGTCAAAGCGTCGTTCTGTTCTTATGATCGCTCGTTATGTGTTGCTGAAGAAAATGTGGTC。
全文摘要
本發(fā)明公開了抗白粉病近等基因系Brock/京4117配制、遺傳背景的分子檢測方法和與抗白粉病基因緊密連鎖的分子標(biāo)記P15/M14-160的核苷酸序列，屬于農(nóng)業(yè)生物基因工程領(lǐng)域。該近等基因系的獲得是以抗白粉病普通小麥Brock為抗病基因供體親本，以農(nóng)藝性狀優(yōu)良但不抗白粉病的栽培小麥京411為輪回親本，Brock×京411雜交后，F(xiàn)1再與京411連續(xù)回交7代，自交1代育成近等基因系Brock/京4117。每一次的雜交和回交，均在白粉菌脅迫下選擇抗病單株。本發(fā)明用AFLP檢測技術(shù)，發(fā)現(xiàn)有4種AFLP譜型親二型、偏抗病供體Brock型、偏輪回親本京411型和交換型被檢測到，它們能反映出近等基因系中雙親遺傳背景。
文檔編號C12Q1/68GK101955988SQ20101010192
公開日2011年1月26日 申請日期2010年1月28日 優(yōu)先權(quán)日2010年1月28日
發(fā)明者劉曉穎, 彭永康, 王振英, 陳宏 , 陳歐 申請人:天津師范大學(xué)