專利名稱：：一種通用可靠的土壤總dna的提取方法及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種土壤總DNA提取方法，尤其涉及一種通用可靠的土壤總DNA提取方法及其在各類土壤樣品中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：土壤中含有非常豐富的微生物資源，但由于受到研究方法和研究手段的限制，土壤中絕大多數(shù)微生物還不為人所知。分子微生物生態(tài)學(xué)研究表明，利用傳統(tǒng)的純培養(yǎng)技術(shù)，僅有1%的微生物可被培養(yǎng)，而未能培養(yǎng)的微生物才是土壤微生物多樣性的主體(AmannRI.etal，1995)，這給微生物的多樣性資源開發(fā)和利用帶來很大的局限。在分子水平上研究土壤中未可培養(yǎng)微生物的技術(shù)關(guān)鍵之一是從各種土壤樣品中獲得可進行分子操作的宏基因組DNA。獲得高純度、大片段、完整性好的土壤微生物總DNA是土壤微生物分子生態(tài)學(xué)研究和宏基因組文庫構(gòu)建的基礎(chǔ)。由于土壤樣品種類繁多、成分復(fù)雜、物化性質(zhì)多變，含有大量的無機及有機化合物，存在著對某些酶反應(yīng)的抑制劑，如腐植酸、腐植酸類似物、重金屬離子等都會干擾提取反應(yīng)的進行。加之，微生物細胞通常緊密吸附于土壤顆粒表面。因此，從土壤樣品中提取出高質(zhì)量的、具有代表性的微生物總基因組DNA具有相當難度。因此，建立土壤樣品DNA的提取純化方法對于在分子水平上研究未培養(yǎng)微生物具有重要意義。雖然目前對土壤DNA提取方法的研究報道已有很多，但沒有一種方法能適用于所有的土壤樣品，而且大部分方法都需要再純化過程，也沒有一種方法能滿足不同的實驗條件和實驗?zāi)康摹?br/>發(fā)明內(nèi)容為了解決上述現(xiàn)有技術(shù)中存在的不足，本發(fā)明首要目的在于提供一種能夠提取各種類型土壤總DNA的方法。本發(fā)明所涉及的土壤樣品類型包括大田作物土壤、保護地土壤、淺海污泥、深海污泥、用于污水處理的活性污泥、高鹽堿土壤、酸性土壤等類型。本發(fā)明的目的通過下述方案實現(xiàn)—種通用可靠的土壤總DNA的提取方法，其特征是包括以下步驟[ooog](1)土壤樣品預(yù)處理用10mLpH8.0的0.12mol/L的磷酸鈉緩沖液洗滌土壤樣品5g，8000r/min離心10min，沉淀再洗滌一次；(2)裂解細胞將步驟(1)中的沉淀中加入5mL溶液I，37t:水浴10min，然后加入5mL溶液I1，65。C水浴lh，每隔15分鐘搖晃，離心10min(6000r/min)棄沉淀；上清中加入2.7mL5mo1/LNaCl，混勻，在65t:水浴中放置5min;[OO13](3)除去蛋白并沉淀DNA:3用氯仿異戊醇(24:1)抽提兩次，8000r/min離心；得到的上層水相與等體積的溶液III(13%聚乙二醇8，000，1.6mol/LNaCl)混合，冰上靜置20min;離心10min(10000r/min)棄上清，沉淀用70%乙醇洗滌一遍，室溫干燥；(4)除去腐殖酸等雜質(zhì)干燥后溶于3mlTE(10mmol/LTris—HCl，lmmol/LEDTA，pH8.0)中；力口入707ii1(7.5mol/L)醋酸鉀溶液，混合物在室溫條件下放置30min，離心10min(8000r/min)，棄沉淀；上清中加入0.6倍體積的冰異丙醇，混勻后靜置10min;沉淀用70%乙醇洗滌后干燥，用90ii1TE溶解DNA，加入等體積2mol/L氯化鎂溶液，混勻，室溫靜置30min，離心10min(8000r/min)，棄沉淀；上清中加入0.6倍體積的異丙醇沉淀，于70%乙醇洗滌沉淀后干燥，TE溶解；所述的溶液I各成分含量為0.15mol/LNaCl，O.lmol/LEDTA，15mg/mllysozym，pH8.0;所述的溶液II各成分含量為0.lmol/LNaCl，O.5mol/LTris-HCl，10%SDS，pH8.0。取利用本發(fā)明方法分別以白菜地、玉米地、蔥地、森林地、保護地、松樹、槐樹地、柞樹地、柏樹、溫室沙地、近海污泥、深海污泥樣品提取的土壤總DNA，經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳后用0.5%EB染色結(jié)果。結(jié)果顯示各種樣品中的DNA條帶清晰且單一，無拖尾，無雜帶，與A-HindIIIMaker對比均能保證在23kb以上，說明具有較好的完整性。詳見實施例1-實施例12;以利用本發(fā)明方法分別以白菜地、玉米地、蔥地、森林地、保護地、松樹、槐樹地、柞樹地、柏樹、溫室沙地、近海污泥、深海污泥樣品提取的土壤總DNA為模板，PCR擴增16SrDNA的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果。結(jié)果顯示各種樣品中的總DNA都能有效擴增出目標基因，不受腐植酸等其他PCR抑制劑的影響，說明采用本發(fā)明方法提取的各種樣品中的總DNA其濃度和質(zhì)量可以保證后續(xù)試驗的進行。詳見實施例1-實施例12。經(jīng)步驟(4)得到的白菜地、玉米地、蔥地、森林地、保護地、松樹、槐樹地、柞樹地、柏樹、溫室沙地、近海污泥、深海污泥樣品DNA溶液分別在230nm、260nm、280nm紫外測定腐植酸含量、核酸含量和蛋白質(zhì)含量。通過測定0D260/0D230和0D260/0D280比值檢測提取的DNA純度，二者比值在1.8-2.2之間為最佳。本方法測定的0D260/0D230和0D260/0D280比值比文獻中報道的其他方法提取的土壤中總DNA的純度要高，文獻中報道的其他方法提取的土壤中總DNA樣品，其0D260/0D230比值均小于1，0D260/0D280比值也明顯低于本方法，且其他方法提取DNA后還需要繁雜的純化過程，本方法提取的DNA樣品中A260/A230及A260/A280比值結(jié)果見表1。表1本發(fā)明方法提取不同樣品DNA中A260/A230及A260/A280比值<table>tableseeoriginaldocumentpage4</column></row><table>綜上所述，本發(fā)明的有益效果包括本發(fā)明所提供的土壤樣品總DNA提取方法綜合使用適當濃度的醋酸鉀和氯化鎂溶液去除樣品中的各類腐植酸等雜質(zhì)和PCR擴增抑制因子，并能得到較高濃度的大片段DNA，且適合于PCR擴增試驗，能夠保證后續(xù)試驗的順利進行。能滿足不同的實驗條件和實驗?zāi)康?。提取過程無需再純化，縮減了提取步驟，降低了提取成本。本發(fā)明能適用于所有的土壤樣品，具有通用可靠、提取成本低廉的突出優(yōu)點。圖1為利用本發(fā)明方法分別提取白菜地、玉米地、蔥地、森林地、保護地、松樹、槐樹地、柞樹地、柏樹、溫室沙地、近海污泥、深海污泥樣品的總DNA經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳后用0.5%EB染色結(jié)果。在圖中，1-白菜地，2-玉米地，3-蔥地，4-森林地，5-保護地，6_松樹，7_槐樹地，8-柞樹地，9-柏樹，10-溫室沙地，11-近海污泥，12-深海污泥.M-HindIIImarker(Taka:ra)。圖2為以本發(fā)明方法提取的白菜地、玉米地、蔥地、森林地、保護地、松樹、槐樹地、柞樹地、柏樹、溫室沙地、近海污泥、深海污泥樣品的總DNA為模板，PCR擴增16SrDNA的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果。在圖中，1-白菜地，2-玉米地，3-蔥地，4-森林地，5-保護地，6_松樹，7_槐樹地，8-柞樹地，9-柏樹，10-溫室沙地，11-近海污泥，12-深海污泥.M-DL2000(Takara)。具體實施例方式下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步詳細的描述，但本發(fā)明的實施方式不限于此。實施例1利用本發(fā)明所述方法提取大連董家溝保護地土壤總DNA:(1)土壤采集及預(yù)處理大連董家溝黃瓜保護地采用五點法采樣，去除表面土，取10-20cm的土樣，裝入滅菌紙袋帶回實驗室，研缽研細土樣，過200目標準篩。用10mLpH8.0的0.12mol/L的磷酸鈉緩沖液洗滌土壤樣品5g，8000r/min離心10min，沉淀再洗滌一次。(2)裂解細胞將步驟(1)中的沉淀中加入5mL溶液1(0.15mol/LNaCl，0.lmol/LEDTA，15mg/mllysozym，pH8.0)，37°C7JC》谷10min，然后加入5mL溶夜II(0.lmol/LNaCl，0.5mol/LTris-HCl，10%SDS，pH8.0)，65。C水浴lh，每隔15分鐘搖晃，離心10min(6000r/min)棄沉淀。上清中加入2.7mL5mol/LNaCl，混勻，在65。C水浴中放置5min。(3)除去蛋白并沉淀DNA:用氯仿異戊醇(24:1)抽提兩次，8000r/min離心。得到的上層水相與等體積的溶液III(13%PEG8，000，1.6mol/LNaCl)混合，冰上靜置20min。離心10min(10000r/min)棄上清，沉淀用70%乙醇洗滌一遍，室溫干燥。(4)除去腐殖酸等雜質(zhì)干燥后溶于3mlTE(10mmol/LTris—HCl，lmmol/LEDTA，pH8.0)中。力口入707ii1(7.5mol/L)醋酸鉀溶液，混合物在室溫條件下放置30min，離心10min(8000r/min)，5棄沉淀。上清中加入0.6倍體積的冰異丙醇，混勻后靜置10min。沉淀用70%乙醇洗滌后干燥，用90ii1TE溶解DNA，加入等體積2mol/L氯化鎂溶液，混勻，室溫靜置30min，離心10min(8000r/min)，棄沉淀。上清中加入0.6倍體積的異丙醇沉淀，于70%乙醇洗滌沉淀后干燥，TE溶解，電泳結(jié)果如圖1-5，PCR擴增電泳結(jié)果如圖2-5;樣品DNA中A260/A230及A260/A280比值見表1。實施例2利用本發(fā)明所述方法提取大連開發(fā)區(qū)童牛嶺森林土壤總DNA:(1)土壤采集及預(yù)處理大連開發(fā)區(qū)童牛嶺森林中去除表層落葉及腐殖質(zhì)層，取10-20cm的土樣，裝入滅菌紙袋帶回實驗室，除去較大石塊，研缽研細土樣，過200目標準篩。用10mLpH8.0的0.12mol/L的磷酸鈉緩沖液洗滌土壤樣品5g，8000r/min離心10min，沉淀再洗滌一次。(2)裂解細胞將步驟(1)中的沉淀中加入5mL溶液I(O.15mol/LNaCl，0.lmol/LEDTA，15mg/mllysozym，pH8.0)，37°C7JC》谷10min，然后加入5mL溶夜II(0.lmol/LNaCl，0.5mol/LTris-HCl，10%SDS，pH8.0)，65。C水浴lh，每隔15分鐘搖晃，離心10min(6000r/min)棄沉淀。上清中加入2.7mL5mol/LNaCl，混勻，在65。C水浴中放置5min。(3)除去蛋白并沉淀DNA:用氯仿異戊醇(24:1)抽提兩次，8000r/min離心。得到的上層水相與等體積的溶液111(13%聚乙二醇8，000，1.6mol/LNaCl)混合，冰上靜置20min。離心10min(10000r/min)棄上清，沉淀用70%乙醇洗滌一遍，室溫干燥。(4)除去腐殖酸等雜質(zhì)干燥后溶于3mlTE(10mmol/LTris—HCl，lmmol/LEDTA，pH8.0)中。力口入707ii1(7.5mol/L)醋酸鉀溶液，混合物在室溫條件下放置30min，離心10min(8000r/min)，棄沉淀。上清中加入0.6倍體積的冰異丙醇，混勻后靜置10min。沉淀用70%乙醇洗滌后干燥，用90ii1TE溶解DNA，加入等體積2mol/L氯化鎂溶液，混勻，室溫靜置30min，離心10min(8000r/min)，棄沉淀。上清中加入0.6倍體積的異丙醇沉淀，于70%乙醇洗滌沉淀后干燥，TE溶解，電泳結(jié)果如圖1-4，PCR擴增電泳結(jié)果如圖2-4;樣品DNA中A260/A230及A260/A280比值見表1。實施例3利用本發(fā)明所述方法提取大連近海污泥土壤總DNA:(1)污泥采集及預(yù)處理大連開發(fā)區(qū)泊石灣乘船入近海，收集10m左右海泥裝入無菌塑料袋帶回實驗室，除去較大沙粒，用10mLpH8.0的0.12mol/L的磷酸鈉緩沖液洗滌污泥樣品5g，8000r/min離心10min，沉淀再洗滌一次。(2)裂解細胞將步驟(1)中的沉淀中加入5mL溶液1(0.15mol/LNaCl，0.lmol/LEDTA，15mg/mllysozym，pH8.0)，37°C7JC》谷10min，然后加入5mL溶夜II(0.lmol/LNaCl，0.5mol/LTris-HCl，10%SDS，pH8.0)，65。C水浴lh，每隔15分鐘搖晃，離心10min(6000r/min)棄沉淀。上清中加入2.7mL5mol/LNaCl，混勻，在65。C水浴中放置5min。(3)除去蛋白并沉淀DNA:用氯仿異戊醇(24:1)抽提兩次，8000r/min離心。得到的上層水相與等體積的溶液III(13%PEG8，000，1.6mol/LNaCl)混合，冰上靜置20min。離心lOmin(lOOOOr/min)棄上清，沉淀用70%乙醇洗滌一遍，室溫干燥。(4)除去腐殖酸等雜質(zhì)干燥后溶于3mlTE(10mmol/LTris—HCl，lmmol/LEDTA，pH8.0)中。力口入707ii1(7.5mol/L)醋酸鉀溶液，混合物在室溫條件下放置30min，離心lOmin(8000r/min)，棄沉淀。上清中加入0.6倍體積的冰異丙醇，混勻后靜置10min。沉淀用70%乙醇洗滌后干燥，用90ITE溶解DNA，加入等體積2mol/L氯化鎂溶液，混勻，室溫靜置30min，離心lOmin(8000r/min)，棄沉淀。上清中加入0.6倍體積的異丙醇沉淀，于70%乙醇洗滌沉淀后干燥，TE溶解，電泳結(jié)果如圖l-ll，PCR擴增電泳結(jié)果如圖2-11;樣品DNA中A260/A230及A260/A280比值見表1。實施例4土壤采集地為白菜地，其它同實施例1。電泳結(jié)果如圖1-1，PCR擴增電泳結(jié)果如圖2-1;樣品DNA中A260/A230及A260/A280比值見表1。實施例5土壤采集地為玉米地，其它同實施例1。電泳結(jié)果如圖1-2，PCR擴增電泳結(jié)果如圖2-2;樣品DNA中A260/A230及A260/A280比值見表1。實施例6土壤采集地為蔥地，其它同實施例1。電泳結(jié)果如圖1-3，PCR擴增電泳結(jié)果如圖2-3;樣品DNA中A260/A230及A260/A280比值見表1。實施例7土壤采集地為松樹地，其它同實施例2。電泳結(jié)果如圖1-6，PCR擴增電泳結(jié)果如圖2-6;樣品DNA中A260/A230及A260/A280比值見表1。實施例8土壤采集地為槐樹地，其它同實施例2。電泳結(jié)果如圖1-7，PCR擴增電泳結(jié)果如圖2-7;樣品DNA中A260/A230及A260/A280比值見表1。實施例9土壤采集地為柞樹地，其它同實施例2。電泳結(jié)果如圖1-8，PCR擴增電泳結(jié)果如圖2-8;樣品DNA中A260/A230及A260/A280比值見表1。實施例10土壤采集地為柏樹地，其它同實施例2。電泳結(jié)果如圖1-9，PCR擴增電泳結(jié)果如圖2-9;樣品DNA中A260/A230及A260/A280比值見表1。實施例11土壤采集地為溫室沙地，其它同實施例3。電泳結(jié)果如圖l-10，PCR擴增電泳結(jié)果如圖2-10;樣品DNA中A260/A230及A260/A280比值見表1。實施例12土壤采集地為深海污泥，其它同實施例3。電泳結(jié)果如圖l-12，PCR擴增電泳結(jié)果如圖2-12;樣品DNA中A260/A230及A260/A280比值見表1。權(quán)利要求一種通用可靠的土壤總DNA的提取方法，其特征是包括以下步驟(1)土壤樣品預(yù)處理用10mLpH8.0的0.12mol/L的磷酸鈉緩沖液洗滌土壤樣品5g，8000r/min離心10min，沉淀再洗滌一次；(2)裂解細胞將步驟(1)中的沉淀中加入5mL溶液I，37℃水浴10min，然后加入5mL溶液II，65℃水浴1h，每隔15分鐘搖晃，離心10min(6000r/min)棄沉淀；上清中加入2.7mL5mol/LNaCl，混勻，在65℃水浴中放置5min；(3)除去蛋白并沉淀DNA用氯仿∶異戊醇(24∶1)抽提兩次，8000r/min離心；得到的上層水相與等體積的溶液III(13％聚乙二醇8,000，1.6mol/LNaCl)；混合，冰上靜置20min；離心10min(10000r/min)棄上清，沉淀用70％乙醇洗滌一遍，室溫干燥；(4)除去腐殖酸等雜質(zhì)干燥后溶于3mlTE(10mmol/LTris-HCl，1mmol/LEDTA，pH8.0)中；加入707μl(7.5mol/L)醋酸鉀溶液，混合物在室溫條件下放置30min，離心10min(8000r/min)，棄沉淀；上清中加入0.6倍體積的冰異丙醇，混勻后靜置10min；沉淀用70％乙醇洗滌后干燥，用90μlTE溶解DNA，加入等體積2mol/L氯化鎂溶液，混勻，室溫靜置30min，離心10min(8000r/min)，棄沉淀；上清中加入0.6倍體積的異丙醇沉淀，于70％乙醇洗滌沉淀后干燥，TE溶解；所述的溶液I各成分含量為0.15mol/LNaCl，0.1mol/LEDTA，15mg/mllysozym，pH8.0；所述的溶液II各成分含量為0.1mol/LNaCl，0.5mol/LTris-HCl，10％SDS，pH8.0。2.如權(quán)利要求1所述的通用可靠的土壤總DNA的提取方法在各種類型土壤總DNA的制備中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明涉及一種通用可靠的土壤總DNA的提取方法及其應(yīng)用，屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域。土壤中含有非常豐富的微生物資源，但利用傳統(tǒng)的純培養(yǎng)技術(shù)，僅有1％的微生物可被培養(yǎng)，而未能培養(yǎng)的微生物才是土壤微生物多樣性的主體，這給微生物的多樣性資源開發(fā)和利用帶來很大的局限。本研究所提供的提取方法使用溶液I、溶液II、醋酸鉀和氯化鎂移除腐植酸等雜質(zhì)，能滿足不同類型土壤樣品的需要，且能得到高質(zhì)量、大片段并且適合后續(xù)克隆實驗的DNA，為研究各種環(huán)境中土壤(污泥)樣品微生物多樣性奠定了基礎(chǔ)。提取過程無需再純化，縮減了提取步驟，降低了提取成本。文檔編號C12N15/10GK101775388SQ20101010329公開日2010年7月14日申請日期2010年1月29日優(yōu)先權(quán)日2010年1月29日發(fā)明者于基成,劉秋,胡英暢,閆建芳申請人:大連民族學(xué)院