專利名稱：在大腸桿菌中高效表達(dá)可溶性細(xì)菌漆酶的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及的是生物工程技術(shù)，特別是在大腸桿菌中高效表達(dá)可溶性細(xì)菌漆酶的
方法。
背景技術(shù)：
由于漆酶能夠氧化芳香類化合物和其它一些非芳香類有機物，具有廣泛的底物特 異性，因此在紙漿漂白、紡織品染料脫色、有毒廢棄物的去除、生物修復(fù)、醫(yī)療診斷或作偽抗 癌藥物制備的催化劑以及生物傳感器等方面具有巨大的應(yīng)用潛力。但是缺少大量廉價酶源 的供應(yīng)阻礙了漆酶商業(yè)化的應(yīng)用。解決這個問題的一個主要方法是通過漆酶的異源表達(dá)來 獲得大量的漆酶。由于需要糖基化修飾才具有活性，真菌漆酶不適合在原核生物表達(dá)系統(tǒng) 中表達(dá)，目前主要在酵母和絲狀真菌表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)，其活性酶表達(dá)量仍然較低，需要進(jìn)一 步提高才能滿足工業(yè)上的需要。細(xì)菌漆酶具有與真菌漆酶相似的生物學(xué)功能，不需要糖基 化修飾，能在原核生物細(xì)菌表達(dá)系統(tǒng)中實現(xiàn)高效表達(dá)。但由于高效表達(dá)的酶蛋白絕大部分 在細(xì)菌胞內(nèi)形成不溶且無活性的包涵體，有活性的可溶性酶蛋白通常不到10%。較低比例 的可溶性酶蛋白嚴(yán)重影響了細(xì)菌漆酶的開發(fā)與應(yīng)用。 介于上述現(xiàn)狀，本研究發(fā)明提出利用融合酶的技術(shù)思路，在低溫條件下進(jìn)行表達(dá)， 提高大腸桿菌胞內(nèi)可溶性細(xì)菌漆酶的含量，實現(xiàn)功能性細(xì)菌漆酶的高效表達(dá)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提出了一種在大腸桿菌中高效表達(dá)可溶性細(xì)菌漆酶的方法。利用麥芽糖結(jié)
合蛋白與細(xì)菌漆酶融合形成麥芽糖結(jié)合蛋白-細(xì)菌漆酶融合蛋白并在18-23C°低溫下表
達(dá)的技術(shù)思路，在大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)實現(xiàn)了高效表達(dá)麥芽糖結(jié)合蛋白-細(xì)菌漆酶融合蛋白，
克服了細(xì)菌漆酶高效表達(dá)時形成大量的不溶性包涵體的問題。麥芽糖結(jié)合蛋白與細(xì)菌漆酶
融合后不影響細(xì)菌漆酶的酶活性，可直接利用融合蛋白進(jìn)行漆酶催化反應(yīng)，不需要先切除
融合蛋白中的麥芽糖結(jié)合蛋白后再分離純化出細(xì)菌漆酶的操作步驟。 本發(fā)明是這樣實現(xiàn)的。具體操作步驟為 A、麥芽糖結(jié)合蛋白_細(xì)菌漆酶基因的構(gòu)建 (1)在50 iU的體系中，加入5 iU 10X限制性內(nèi)切酶反應(yīng)緩沖液，并按 1 ii gDNA : 3-5U限制性內(nèi)切酶的比例加入DNA和限制性內(nèi)切酶，混勻后37。C保溫2-12小 時。使用該方法分別用相同的限制性內(nèi)切酶消化切割pMAL-c2x質(zhì)粒DNA和細(xì)菌漆酶基因 DNA ; (2)用1%瓊脂糖凝膠電泳分離限制性內(nèi)切酶消化樣品，在紫外燈下用刀片切出 目的DNA片段，然后按DNA片段回收試劑盒的方法回收目的DNA片段；
(3)在25iU的體系中，加入2. 5iU 10 X T4DNA連接酶反應(yīng)緩沖液，并按1 : 5的 比例加入限制性內(nèi)切酶消化過的pMAL-c2x質(zhì)粒DNA和細(xì)菌漆酶基因DNA，再加入1 y 1T4DNA 連接酶。16t:水浴4-12小時將細(xì)菌漆酶基因插入pMAL-c2x質(zhì)粒上的多克隆位點，使細(xì)菌
4漆酶基因連接在pMAL-c2x質(zhì)粒上攜帶的麥芽糖結(jié)合蛋白基因malE的后面，形成一個重組 表達(dá)質(zhì)粒。 B、陽性轉(zhuǎn)化子的篩選利用常規(guī)的CaCl2法制備E.coli DH10B感受態(tài)細(xì)胞，然后 將5-10 ii 1連接反應(yīng)混合物與100 ii 1 E. coli DH10B感受態(tài)細(xì)胞混合，冰浴30分鐘。42°C 熱休克1. 5分鐘后立即置冰上5分鐘。加入900 ii 1新鮮LB培養(yǎng)基(蛋白胨10g、酵母粉 5g、NaC110g、加水至1L(pH7. O))后在37。C搖床上培養(yǎng)45分鐘，搖床轉(zhuǎn)速為150rpm。然后將 細(xì)菌涂布在含100 ii g/ml氨芐青霉素(Amp)的LB平板(蛋白胨10g、酵母粉5g、 NaC110g、 瓊脂1.5g、加水至lL(pH7. O))上，37t:培養(yǎng)12小時。平板上長出的單個菌落即為陽性轉(zhuǎn)化 子。 C、融合蛋白的表達(dá)；將單個的陽性轉(zhuǎn)化子接種到5ml含50ii g/ml氨芐青霉素 (Amp)的LB培養(yǎng)基中37t:培養(yǎng)12小時，活化后菌液按1 : 100接入在含有50 y g/ml氨芐 青霉素的LB培養(yǎng)基的搖瓶中2(TC搖動培養(yǎng)，搖床轉(zhuǎn)速為250rpm。當(dāng)0D6。。值達(dá)到0. 6-0. 8 時加入終濃度為0.5mM的IPTG(異丙基-e-D-硫代半乳糖苷)誘導(dǎo)6_8小時。細(xì)胞經(jīng) 4500rpm離心15分鐘后收集并懸浮在含有200mM NaCl的20mM TrisHCl緩沖液中(pH7. 4)， 超聲波破碎，12000rpm離心收集上清液。 D、可溶性融合蛋白的鑒定取10-15 yl上清液上樣，經(jīng)10 % SDS-PAGE電泳 (120V，1.5小時)后，考馬斯亮藍(lán)染色l小時。與單一細(xì)菌漆酶基因表達(dá)的可溶性漆酶蛋白 (< 10%)相比，可溶性融合酶蛋白的比例提高到65%以上。 E、融合蛋白的純化將50ml上清粗酶液與10ml麥芽糖親和層析樹脂混合，4°C 緩慢搖動4-12小時。然后將混合物裝柱(柱直徑2mM、柱高10mM)并用緩沖液A(20mM TrisHCl(pH7. 4)、200mM NaCl)平衡，流速為lml/min。用緩沖液A洗柱10-15個床體積后， 再用緩沖液B(20mM TrisHCl(pH7. 4)、200mM NaCl、 10mM麥芽糖)洗脫，流速為lml/min。收 集洗脫峰，目的蛋白經(jīng)10% SDS-PAGE電泳鑒定。純化后的蛋白經(jīng)65%硫酸銨沉淀濃縮后 再用50mM磷酸緩沖液(pH7. 2)透析去除殘余的硫酸銨。在實驗室搖瓶發(fā)酵條件下，從1L 培養(yǎng)物中可獲得50-80mg純蛋白。 F、酶動力學(xué)參數(shù)測定使用漆酶底物ABTS(2，2'-聯(lián)氮基-雙(3-乙基苯丙 噻唑啉-6-磺酸))和DMP(2，6-二甲基苯)檢測，麥芽糖結(jié)合蛋白-細(xì)菌漆酶融合蛋 白具有與未融合的細(xì)菌漆酶相似的酶動力學(xué)參數(shù)。以DMP為底物時，反應(yīng)體系為50mM TrisHCl (pH8. 0) 、0. 2mM CuS04和不同濃度的DMP(O. 2、0. 3、0. 4、0. 6禾卩l(xiāng)mM)。以ABTS為底 物時，反應(yīng)體系為50mM醋酸緩沖液(pH3. 0) 、0. 2mMCuS04和不同濃度的ABTS (0. 2、0. 4、0. 6、 0. 8、1. 0和2mM)。在反應(yīng)體系中加入1-5 iil適量稀釋的純酶后啟動反應(yīng)，用MV-2550型紫 外分光光度計在37t:條件下測定477nm(用于DMP)或420nm(用于ABTS)的吸收值1_3分 鐘。再根據(jù)吸收值的改變(AA)值和消光系數(shù)(O計算出單位時間內(nèi)產(chǎn)物的生成量即酶 反應(yīng)速度(u ) 。 DMP在477nm處的消光系數(shù)為14. 8mM—^m—、 ABTS在420nm處的消光系數(shù)為 36mM—^m—、酶活力定義為在37。C條件下每分鐘氧化1 y g底物為1個酶活力單位。然后再 根據(jù)Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖法1/v = (Km/Vmax)*1/[S]+1/Vmax求出酶動力學(xué)參數(shù) Km、 Vmax禾口 Km/Vmax值。
本發(fā)明具有的優(yōu)點 1、充分利用了麥芽糖結(jié)合蛋白和低溫有助于過量表達(dá)蛋白質(zhì)折迭的特點，實現(xiàn)了
5細(xì)菌漆酶的可溶性表達(dá)。使用該法表達(dá)不同來源的細(xì)菌漆酶以及突變酶，都使可溶性酶蛋 白的比例從《10%提高到65%以上。該法簡單、發(fā)酵時間短。 2、使用該技術(shù)不僅可實現(xiàn)細(xì)菌漆酶的可溶性表達(dá)而且不需要在純化后切除融合 蛋白中的麥芽糖結(jié)合蛋白，麥芽糖結(jié)合蛋白-細(xì)菌漆酶融合蛋白具有與未融合細(xì)菌漆酶相 似的酶動力學(xué)參數(shù)?？梢灾苯邮褂萌诤系鞍走M(jìn)行酶反應(yīng)。 3、本發(fā)明還有利于后續(xù)的酶純化工作。麥芽糖結(jié)合蛋白-細(xì)菌漆酶融合蛋白可經(jīng) 麥芽糖親和層析柱一步純化即可，程序簡單快速。 4、本發(fā)明還有利于將來細(xì)菌漆酶的固定化。麥芽糖結(jié)合蛋白-細(xì)菌漆酶可通過麥 芽糖結(jié)合蛋白與麥芽糖親和層析樹脂的結(jié)合，直接將細(xì)菌漆酶固定在麥芽糖親和層析樹脂 上進(jìn)行各種酶催化反應(yīng)。
具體實施例方式
實施例1 :土壤克萊伯氏菌601細(xì)菌漆酶MC0在大腸桿菌中的表達(dá)
首先用限制性內(nèi)切酶BamHI和Sail分別酶切編碼土壤克萊伯氏菌601細(xì)菌漆酶 基因DNA和pMAL-c2x質(zhì)粒DNA，酶切緩沖液為10XT反應(yīng)緩沖液。37。C酶切4小時。酶切 混合物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后回收1. 6kb的編碼土壤克萊伯氏菌601細(xì)菌漆酶基因DNA 片段和6. 67kb的線性pMAL-c2x質(zhì)粒DNA。然后將兩種回收的DNA片段按5倍漆酶基因DNA 片段l倍線性pMAL-c2x質(zhì)粒DNA的比例混合，并用iy)NA連接酶在16t:條件下連接過夜。 然后將連接反應(yīng)混合物直接轉(zhuǎn)化E. coli DH10B，并用含100 ii g/ml氨芐青霉素的LB平板篩 選陽性轉(zhuǎn)化子。陽性轉(zhuǎn)化子中含有的重組質(zhì)粒大小為8.3kb。按上述步驟C-E表達(dá)目的蛋 白，上清液中可溶性融合蛋白為70%左右，沉淀中占30%。而利用限制性內(nèi)切酶BamHI和 Sail酶切位點將編碼土壤克萊伯氏菌601細(xì)菌漆酶基因DNA連接到ptac85表達(dá)載體上并 在E.coli ToplO細(xì)菌中表達(dá)，上清液中可溶性融合蛋白僅占8X左右，沉淀中為92X。動 力學(xué)分析表明麥芽糖結(jié)合蛋白_細(xì)菌漆酶融合蛋白具有與未融合的細(xì)菌漆酶相似的酶動 力學(xué)參數(shù)。 實施例2 :土壤克萊伯氏菌601細(xì)菌漆酶MCO突變體在大腸桿菌中的表達(dá)
采用相同的方法在大腸桿菌DH10B中的表達(dá)編碼土壤克萊伯氏菌601細(xì)菌漆酶 MCO突變體a 351-378/|3 351-378，上清液中可溶性融合蛋白為60%，沉淀中占40%。而利 用限制性內(nèi)切酶BamHI和Sail酶切位點將編碼土壤克萊伯氏菌601細(xì)菌漆酶基因DNA連 接到ptac85表達(dá)載體上并在E. coli ToplO細(xì)菌中表達(dá)，上清液中可溶性融合蛋白為O，沉 淀中為100%。 實施例3 :土壤赫氏菌531細(xì)菌漆酶MCO在大腸桿菌中的表達(dá)
用限制性內(nèi)切酶EcoRI和Sail分別酶切編碼土壤赫氏菌531細(xì)菌漆酶MCO的基 因DNA和pMAL-c2x質(zhì)粒DNA，酶切緩沖液為10XT反應(yīng)緩沖液。37"酶切4小時。酶切混 合物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后回收1. 6kb的編碼土壤赫氏菌531細(xì)菌漆酶基因DNA片段和 6. 67kb的線性pMAL-c2x質(zhì)粒DNA。然后將兩種回收的DNA片段按5漆酶基因DNA片段1 線性pMAL-c2x質(zhì)粒DNA的比例混合，并用T4DNA連接酶在16。C條件下連接過夜。然后將 連接反應(yīng)混合物直接轉(zhuǎn)化E. coliDH10B，并用含100 ii g/ml氨芐青霉素的LB平板篩選陽性 轉(zhuǎn)化子。按上述步驟C-E表達(dá)目的蛋白，上清液中可溶性融合蛋白為60X左右，沉淀中占40%。而利用限制性內(nèi)切酶Sail酶切位點將編碼土壤赫氏菌531細(xì)菌漆酶基因DNA連接 到ptac85表達(dá)載體上并在E.coli ToplO細(xì)菌中表達(dá)，上清液中可溶性融合蛋白僅占2%左 右，沉淀中為98%。動力學(xué)分析表明麥芽糖結(jié)合蛋白-細(xì)菌漆酶融合蛋白具有與未融合的 細(xì)菌漆酶相似的酶動力學(xué)參數(shù)。
權(quán)利要求
在大腸桿菌中高效表達(dá)可溶性細(xì)菌漆酶的方法，其特征在于包括以下步驟A、麥芽糖結(jié)合蛋白-細(xì)菌漆酶基因的構(gòu)建(1)在50μl的體系中，加入5μl 10×限制性內(nèi)切酶反應(yīng)緩沖液，并按1μgDNA3-5U限制性內(nèi)切酶的比例加入DNA和限制性內(nèi)切酶，混勻后37℃保溫2-12小時，使用該方法分別用相同的限制性內(nèi)切酶消化切割pMAL-c2x質(zhì)粒DNA和細(xì)菌漆酶基因DNA；(2)用1％瓊脂糖凝膠電泳分離限制性內(nèi)切酶消化樣品，在紫外燈下用刀片切出目的DNA片段，然后按DNA片段回收試劑盒的方法回收目的DNA片段；(3)在25μl的體系中，加入2.5μl 10×T4DNA連接酶反應(yīng)緩沖液，并按1∶5的比例加入限制性內(nèi)切酶消化過的pMAL-c2x質(zhì)粒DNA和細(xì)菌漆酶基因DNA，再加入1μlT4DNA連接酶，16℃水浴4-12小時將細(xì)菌漆酶基因插入pMAL-c2x質(zhì)粒上的多克隆位點，使細(xì)菌漆酶基因連接在pMAL-c2x質(zhì)粒上攜帶的麥芽糖結(jié)合蛋白基因malE的后面，形成一個重組表達(dá)質(zhì)粒；B、陽性轉(zhuǎn)化子的篩選利用常規(guī)的CaCl2法制備E.coli DH10B感受態(tài)細(xì)胞，然后將5-10μl連接反應(yīng)混合物與100μl E.coli DH10B感受態(tài)細(xì)胞混合，冰浴30分鐘，42℃熱休克1.5分鐘后立即置冰上5分鐘，加入900μl新鮮LB培養(yǎng)基后在37℃搖床上培養(yǎng)45分鐘，搖床轉(zhuǎn)速為150rpm，然后將細(xì)菌涂布在含100μg/ml氨芐青霉素(Amp)的LB平板上，37℃培養(yǎng)12小時，平板上長出的單個菌落即為陽性轉(zhuǎn)化子；新鮮LB培養(yǎng)基組成為蛋白胨10g、酵母粉5g、NaC110g、加水至1L(pH7.0；LB平板組成為蛋白胨10g、酵母粉5g、NaC110g、瓊脂1.5g、加水至1L(pH7.0))；C、融合蛋白的表達(dá)將單個的陽性轉(zhuǎn)化子接種到5ml含50μg/ml氨芐青霉素(Amp)的LB培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)12小時，活化后菌液按1∶100接入在含有50μg/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基的搖瓶中20℃搖動培養(yǎng)，搖床轉(zhuǎn)速為250rpm，當(dāng)OD600值達(dá)到0.6-0.8時加入終濃度為0.5mM的IPTG(異丙基-β-D-硫代半乳糖苷)誘導(dǎo)6-8小時，細(xì)胞經(jīng)4500rpm離心15分鐘后收集并懸浮在含有200mM NaCl的20mM TrisHCl緩沖液中(pH7.4)，超聲波破碎，12000rpm離心收集上清液；D、可溶性融合蛋白的鑒定取10-15μl上清液上樣，經(jīng)10％SDS-PAGE電泳120V、1.5小時后，考馬斯亮藍(lán)染色1小時，與單一細(xì)菌漆酶基因表達(dá)的可溶性漆酶蛋白(＜10％)相比，可溶性融合酶蛋白的比例提高到65％以上；E、融合蛋白的純化將50ml上清粗酶液與10ml麥芽糖親和層析樹脂混合，4℃緩慢搖動4-12小時，然后將混合物裝柱并用緩沖液A平衡，流速為1ml/min，用緩沖液A洗柱10-15個床體積后，再用緩沖液B洗脫，流速為1ml/min，收集洗脫液，目的蛋白經(jīng)10％SDS-PAGE電泳鑒定，純化后的蛋白經(jīng)65％硫酸銨沉淀濃縮后再用50mM磷酸緩沖液(pH7.2)透析去除殘余的硫酸銨，在實驗室搖瓶發(fā)酵條件下，從培養(yǎng)物中可獲得純蛋白；緩沖液A為20mM TrisHCl(pH7.4)、200mM NaCl，緩沖液B為20mM TrisHCl(pH7.4)、200mM NaCl、10mM麥芽糖；F、酶動力學(xué)參數(shù)測定使用漆酶底物ABTS(2，2’-聯(lián)氮基-雙(3-乙基苯丙噻唑啉-6-磺酸))和DMP(2，6-二甲基苯)檢測，麥芽糖結(jié)合蛋白-細(xì)菌漆酶融合蛋白具有與未融合的細(xì)菌漆酶相似的酶動力學(xué)參數(shù)，以DMP為底物時，反應(yīng)體系為50mM TrisHCl(pH8.0)、0.2mM CuSO4和濃度分別為0.2、0.3、0.4、0.6、1mM的DMP，以ABTS為底物時，反應(yīng)體系為50mM醋酸緩沖液(pH3.0)、0.2mMCuSO4和濃度分別為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、2mM的ABTS，在反應(yīng)體系中加入1-5μl適量稀釋的純酶后啟動反應(yīng)，用MV-2550型紫外分光光度計在37℃條件下測定酶動力學(xué)參數(shù)Km、Vmax和Km/Vmax值。
全文摘要
本發(fā)明提出了一種利用麥芽糖結(jié)合蛋白與細(xì)菌漆酶融合形成麥芽糖結(jié)合蛋白-細(xì)菌漆酶融合蛋白并在低溫下進(jìn)行表達(dá)的技術(shù)方法，其步驟為A、麥芽糖結(jié)合蛋白-細(xì)菌漆酶基因的構(gòu)建，B、陽性轉(zhuǎn)化子的篩選，C、融合蛋白的表達(dá)，D、可溶性融合蛋白的鑒定，E、融合蛋白的純化，F(xiàn)、漆酶酶動力學(xué)參數(shù)測定。本發(fā)明實現(xiàn)了在大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)高效表達(dá)麥芽糖結(jié)合蛋白-細(xì)菌漆酶融合蛋白?？扇苄约?xì)菌漆酶不僅可高效表達(dá)而且還保持與未融合細(xì)菌漆酶相同的酶活力?？朔思?xì)菌漆酶在大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)高效表達(dá)時形成大量的不溶性包涵體的問題。該方法操作簡單、發(fā)酵時間短、節(jié)約成本。還可以直接將細(xì)菌漆酶固定在麥芽糖親和層析樹脂上進(jìn)行各種酶催化反應(yīng)。
文檔編號C12R1/01GK101736026SQ20101010387
公開日2010年6月16日 申請日期2010年2月2日 優(yōu)先權(quán)日2010年2月2日
發(fā)明者左文峰, 李洋, 王行國, 龔子君 申請人:湖北大學(xué)