專利名稱：阿薩希毛孢子菌2-1及其在制備丙烯酸中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及 一 株丙烯酰胺酶的菌株——阿薩希毛孢子菌(Trichosporonasahii) 2-1 ，及其在制備丙烯酸中的應(yīng)用。
(二)
背景技術(shù)：
阿薩希毛孢子菌(Trichosporon asahii)為半知菌門，芽孢綱，隱球酵母目，隱球酵母科，絲胞酵母菌屬。 酰胺酶(amidase， EC 3. 5. 1. 4)能將酰胺水解成相對應(yīng)的羧酸和氨。丙烯酰胺酶催化丙烯酰胺水解為丙烯酸和氨。丙烯酸(C3H402)是無色，帶有剌激性氣味的液體，其具有高聚合性能，既可以自身均聚，又可以與其它乙烯基單體如苯乙酸、乙酸乙烯酯、甲基丙烯酸甲酯、丙烯睛、丙烯酰胺、氯乙烯等共聚，可以制成各種不同性能的丙烯酸類樹脂或聚丙烯酸鹽類等系列產(chǎn)品，這些產(chǎn)品廣泛應(yīng)用于涂料、塑料、紡織、皮革、造紙、建材等工業(yè)，因此是重要的化工產(chǎn)品之一。 丙烯酸歷史上曾經(jīng)用氯乙醇法、氰乙醇法、高壓R印pe法、烯酮法等，現(xiàn)今主要采用丙烯腈水解法和丙烯直接氧化法兩種方法，其中丙烯直接氧化法產(chǎn)能占總產(chǎn)量的85%以上。 丙烯腈水解法制備丙烯酸是法國Ugine Kuhlamnn公司開發(fā)，工藝的反應(yīng)過程是丙烯腈先經(jīng)硫酸水解生成丙烯酰胺，再在酸性條件下生成相應(yīng)的丙烯酸，該生產(chǎn)工藝過程簡單，反應(yīng)條件溫和，設(shè)備投資少，同時該流程具有污染嚴重、副產(chǎn)品含有大量低值的硫酸銨等缺點。丙烯直接氧化法生產(chǎn)丙烯酸由公司率先建成，該生產(chǎn)工藝在合成中分兩步進行第一步，丙烯被氧化成丙烯醛；第二步，丙烯醛被進一步氧化成丙烯酸。該反應(yīng)工藝丙烯酸的收率較高，單程收率能達到85 % ，但該反應(yīng)能耗高、設(shè)備要求高、易污染。
目前報道的生物法生產(chǎn)主要有乳酸水解、丙烯腈水解法，但所采用的菌株主要為細菌，以酵母的酰胺酶來生產(chǎn)丙烯酸的研究未見報道。
(三)

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供可將丙烯酰胺水解為丙烯酸的阿薩希毛孢子菌新菌株及
其在制備丙烯酸中的應(yīng)用。 本發(fā)明采用的技術(shù)方案是 —種丙烯酰胺酶的菌株——阿薩希毛孢子菌(Trichosporon asahii) 2_1，保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，地址湖北省武漢市珞珈山武漢大學，430072，保藏日期2010年01月19日，保藏編號CCTCC No :M2010017。 阿薩希毛孢子菌2-l菌落形態(tài)為橢圓，乳白色半透明，表明光滑，周邊有散射線狀，中間有隆起。單個細胞橢圓至柱狀，細胞大小為4. 5 15X2 5um。
阿薩希毛孢子菌2-1由以下途經(jīng)篩選得到 所采用的富集培養(yǎng)基，其配方如下丙烯酸20.0g，蔗糖20.0g，酵母膏10g， NaCl
35g， KH2P04 1. 0， MgS04. 7H20 0. 2， FeS04 0 . 01， pH 7. 0。 用于篩選微生物的土樣來自浙江省內(nèi)各種可分離到微生物的樣品，如果園、樹林、農(nóng)田、污水處理站等。 稱取5g土樣于50mL生理鹽水中，用玻璃珠振蕩打碎，取懸濁液5mL于裝有30mL富集培養(yǎng)基的三角瓶中，置于搖床30°C 、 150r/min培養(yǎng)2天，1000rpm離心5分鐘，取上清液稀釋成10—^lO—2、10—3三個梯度進行涂布，吸取各梯度稀釋液涂平板(0. lmL/平板)。涂布完畢后置于生化培養(yǎng)箱中3(TC培養(yǎng)，培養(yǎng)2-3后，待長出合適大小的單菌落后，根據(jù)形態(tài)上的差異隨機挑取單菌落接種試管斜面并分別編號，置生化培養(yǎng)箱中3(TC培養(yǎng)至長滿整個斜面。 從已長好的試管斜面上挑取一環(huán)菌體至裝有30mL發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，搖瓶培養(yǎng)均在3(TC，搖床轉(zhuǎn)速150r/min。培養(yǎng)20h后吸取3mL菌體加入誘導培養(yǎng)基中培養(yǎng)24h，誘導培養(yǎng)基成份為丙烯酸3. 0 10. 0g，蔗糖10. 0 20. 0g，酵母膏0. 0 15. Og，尿素0. 0 5. 0g， NaCll. 0 5. Og， KH2P04 0 . 0 1. Og， MgS04. 7H20 0. 0 2. Og，F(xiàn)eS04 0 . 0 1. Og，用去離子水配制，pH 6. 5 8. 5。培養(yǎng)完成后在6000r/min下離心5分鐘收集菌體，并用生理鹽水洗滌菌體2次，用滅菌蒸餾水制成1. Og/mL的菌懸液。
用終濃度為0. 1M、 pH 7. 0的磷酸緩沖液20mL的反應(yīng)終體系含有0. 1M丙烯酰胺、0. 8g的菌體(濕重)，反應(yīng)在150mL的三角瓶中，150r/min、3(TC條件下進行，5h后取樣，離心取上清液進行微孔過濾(水性濾膜)，然后高效液相色譜檢測是否有丙烯酸生成，有丙烯酸生成的菌株即為所要的菌株。液相檢測條件為Aglient 1100， C18反向柱(ZORBAXSB-AQ，5咖，4.6X250mm)，流動相乙腈水=35 : 65，檢測波長210nm。
所篩選得到具有很強水解丙烯酰胺能力的菌株阿薩希毛孢子菌ZZB-1菌落形態(tài)為橢圓，乳白色半透明，表明光滑，周邊有散射線狀，中間有隆起。單個細胞橢圓至柱狀，細胞大小為4. 5 15X2 5um。菌株2-1為阿薩希毛孢子菌ZZB-1的NTG誘變菌株，其酰胺酶酶活力提高了 70%。
菌株2-1的18S rDNA序列分析 以提取到的細胞總DNA為模板，利用引物Upper primer(5' -AGCCAT GCA TGT CTAAGT ATA AGC-3' )， Lower primer (5' _ACA AAG GGCAGG GAC GTAATC AAC-3')擴增菌株的18S rDNA基因；反應(yīng)條件為95°C 5min，35循環(huán)95°C 40s，55。C 60s，72。C 2min，72。C8min ;將PCR產(chǎn)物進行1 %的瓊脂糖凝膠電泳，經(jīng)過PCR擴增成功獲得了一條約1. 6kb的片段，經(jīng)過測序確認該片段實際長度為1591bp，其堿基序列如下 att acaaagggca gggacgtaat caacgcgagc tggtgactca cgcttactag gtattcctcgttg^gagca ataattgcaa tgctctatcc ccagcacgac tgagtttcac aagattaccc aaacttctcagttaaggtta taaactcgct ggctcagtca gtgtagcgcg cgtgcggccc agaacatcta agggcatcac agacctgttattgcctcaaa cttccaacag ctaaacgctg ttagtccctc taagaagtcg acgaccagcc aaagccggcc tgactatttagcaggttaag gtctcgttcg ttatcggaat taaccagaca aatcactcca ccaactaaga acggccatgc accaccaccc
4ateg^tc^ g^agagcte tcaatctgtc aatcctcact atgtctggac ctggtgagtt tccccgtgtt gagtcaaattaagccgcagg ctccacacct ggtggtgccc ttccgtcaat tcctttaagt ttcagccttg cgaccatact ccccccagaacccaaagact ttgatttctc gtaaggtgcc gatccagtca aaaaataacg tggaccgatc cctagtcggc atagtttactgtteagacte c^cggtetc taatcgtttt tgatccccta accttcgttc ttgatcaatg aaaacgtcct tggcaaatgctttcgcagtt gttagtcttc cgtaaatcta agaatttcac ctctagcaac ggaatactaa tgcccccgac cgtccctattaatcattacg gcgatcctag aaaccaacaa aatagaaccg cacgtcctat tctattattc catgctaatg tattcgggcgattgcctgct ttgaacactc taattttctc aaggtaaaat tcctggttcc actgcacact cagtaaagag catacagcctcacc^gagg teag3ctcag acaaacagtg cgtaccgtaa ggcagaccgt tcctccaagt ccgaagttcg actacgagctttttaactgc aacaacttta atatacgcta ctggagctgg aattaccgcg gctgctggca ccagacttgc cctccagttgttcctcgtta agggatttaa attgtactca ttccaattat aagacccaat agagccctat attgttattt attgtcactacctccccgtg tcgggattgg gtaatttgcg cgcctgctgc cttccttgga tgtggtagcc gtttctcagg ctccctctccggaatcgaac cctaattccc cgttacccgt tgataccatg gtaggcctct atcctaccat cgaaagttga tagggcagat3tttg33tg3 3gcatcgccg gcgc肌ggcc atgcgattcg ag肌gttatt atg肌tcacc 肌g肌gaccg 肌gtcattggttttttatct aataaataca ccccttccag aagtcggggc ttttcagcat gtattagctc tagaattacc acagttaccc
ataaactata actgatttaa tgagccattc gcagtttcac agtatgaatt tgcttatact
菌株2-1的ITS DNA序列分析 以提取到的細胞總DNA為模板，利用引物S1(5' -TCC GTA GGT GAACCT GCGG-3' )，S2(5' -TCC TCC GCT T A T TGC TAT GC-3')擴增菌株的ITS DNA基因，反應(yīng)條件為95。C 5min，35循環(huán)95。C 40s，55。C 60s，72。C 2min，72。C 8min ;將PCR產(chǎn)物進行1 %的瓊脂糖凝膠電泳，經(jīng)過PCR擴增成功獲得了一條約O. 5kb的片段，經(jīng)過測序確認該片段實際長度為512bp，其堿基序列如下<formula>formula see original document page 6</formula> 將18srDNA序列與GenBank中相關(guān)數(shù)據(jù)進行相似性分析發(fā)現(xiàn)，與阿薩希毛孢子菌屬的同源性最高(homology,99%，based on 18srDNA)。同已知的真菌的18s rDNA序列進行對比，利用MegAlign software軟件構(gòu)建進化樹(見圖1)，確定菌株2-1的進化地位。將2-1菌株的ITS序列與將18srDNA序列與GenBank中相關(guān)數(shù)據(jù)進行相似性分析發(fā)現(xiàn)，與阿薩希毛孢子菌PUMCHBY12、PUMCH8R5548、PUMCHBY26同源性最高(homology, 99%， based onITS sequence)。同已知的真菌的ITS序列進行對比，利用MegAlign software軟件構(gòu)建進化樹(見圖2)，確定菌株2-1種的名稱為阿薩希毛孢子菌2-1。 本發(fā)明還涉及所述的阿薩希毛孢子菌2-l在制備丙烯酰胺酶中的應(yīng)用。所述的阿薩希毛孢子菌2-1可進一步應(yīng)用于制備丙烯酸。 具體的，所述應(yīng)用為以丙烯酰胺為底物，以阿薩希毛孢子菌2-1經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)獲得的丙烯酰胺酶為催化劑，進行水解反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后，反應(yīng)液經(jīng)分離純化得到所述丙烯酸。
丙烯酰胺英文名為acrylamide，結(jié)構(gòu)式為CH2 = CHC0NH2，分子量71. 08，為無色片狀晶體，沸點為125°C (3325Pa)，溶于水、丙酮、乙醇，不溶于苯。在熔點或紫外光照射下易聚合，受高熱分解放出腐蝕性氣味，對中樞神經(jīng)有危害。 丙烯酸英文名為acrylic acid，結(jié)構(gòu)式為CH2 = CHC0H，分子量為72. 06，為無色液體，有剌激性氣味，熔點13. 5t:，沸點141°C (101.3kPa)。能溶于水、乙醇、乙醚等。有較強腐蝕性。 所述的應(yīng)用是將阿薩希毛孢子菌2-1菌株接種到合適的培養(yǎng)基中進行發(fā)酵培養(yǎng)獲得高產(chǎn)丙烯酰胺酶的微生物細胞，然后對發(fā)酵液進行離心或過濾，得到菌體，將菌體細胞或處理過的菌體細胞添加到含有丙烯酰胺的溶液中進行催化反應(yīng)，最后對轉(zhuǎn)化液進行分離，即得到所述丙烯酸的水溶液。所述處理過的菌體細胞是指經(jīng)過處理后得到的粗酶、固定化細胞。 用于本發(fā)明的阿薩希毛孢子菌2-1菌種的培養(yǎng)基是一些含有可以被上述菌體利用營養(yǎng)物質(zhì)，培養(yǎng)基中合理配入上述微生物能利用的碳源、氮源、無機鹽等。作為碳源的有葡萄糖、乳糖、麥芽糖、糊精、淀粉、甘油、甘露醇、山梨醇等。作為氮源的有酵母膏、酵母粉、大豆粉、玉米漿、蛋白胨、尿素、氨鹽(硫酸銨、氯化銨、硝酸銨、醋酸銨等)。無機鹽類有Na、K、Ca、Mg、Fe、Mn、Zn、Co、Ni等金屬鹽類和磷酸鹽、醋酸鹽、檸檬酸鹽等有機酸鹽類；另可加有氨基酸類(如谷氨酸、天冬氨酸、賴氨酸、甘氨酸、甲硫氨酸等)、維生素(VB1、VB2、VB12、VC、Ve、煙酸等)、核酸笑(如嘌呤、嘧啶及其衍生物等)。用無機酸或有機酸、堿類調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH值。 所述發(fā)酵培養(yǎng)的發(fā)酵培養(yǎng)基終濃度組成如下丙烯酸3.0 10.0g/L，蔗糖10. 0 20. 0g/L，酵母膏0. 01 15. Og/L，尿素0. 01 5. Og/L，NaC11. 0 5. Og/L， KH2P04 0. 01 1. 0g/L，MgS04. 7H20 0. 01 2. 0g/L，F(xiàn)eS040. 01 1. Og/L，溶劑為水，pH 6. 5 8. 5。
所述水解反應(yīng)條件如下反應(yīng)溫度5 45°C ，反應(yīng)pH 5. 0 10. 0，反應(yīng)時間2 20h。最適反應(yīng)溫度為32 35t:、pH 9.0 9. 5，底物的轉(zhuǎn)化率可達到98%。加入底物丙烯 酰胺的方式有多種，可以一次性加入，也可以逐漸地，以可控制的方式連續(xù)加入丙烯酰胺， 底物的濃度最大可達到50g/L。丙烯酰胺在細胞或處理過的細胞催化作用下轉(zhuǎn)化為丙烯酸， 轉(zhuǎn)化體系中大約含有0.02 0. 1% (重量比，以濕重計)的鮮細胞和大約O. 5% 4.0%的 丙烯酰胺。 本發(fā)明中作為生物催化劑的微生物細胞或處理過的細胞(粗酶、固定化細胞、固 定化酶等)可以重復利用。
所述分離純化方法如下反應(yīng)結(jié)束后，離心回收反應(yīng)液中的菌體細胞，剩余清夜用 乙酸異丁酯萃取，萃取液經(jīng)過精餾塔精餾回收乙酸異丁酯，即得所述的丙烯酸。
具體的，應(yīng)用方法如下 (1)種子培養(yǎng)取種子培養(yǎng)基，接種阿薩希毛孢子菌2-l，搖床轉(zhuǎn)速150r/min，28°C 培養(yǎng)20h作為種子液；所述種子培養(yǎng)基終濃度組成如下丙烯酸1. Og/L，蔗糖15. Og/L，葡 萄糖5. Og/L，酵母膏10g/L， NaCl 5g/L， KH2P04 1. Og/L， MgS04. 7H20 0. 2g/L， FeS04 0. Olg/ L，用去離子水配制，pH用氨水調(diào)至7.0 ;培養(yǎng)方式可以為搖動培養(yǎng)、或通風攪拌培養(yǎng)等。大 量生產(chǎn)菌體時宜采用深層通風攪拌培養(yǎng)。 (2)發(fā)酵培養(yǎng)取發(fā)酵培養(yǎng)基，按照2 8%體積比接種種子液，25 45。C下培 養(yǎng)18 48h，得到發(fā)酵液；所述發(fā)酵培養(yǎng)基終濃度組成如下丙烯酸3. 0 10. Og/L，蔗糖 10. 0 20. Og/L，酵母膏0. 01 15. Og/L，尿素0. 01 5. Og/L， NaCl 1. 0 5. Og/L， KH2P04 0. 01 1. Og/L， MgS04. 7H20 0. 01 2. Og/L， FeS04 0 . 01 1. Og/L，溶劑為水，pH 6. 5 8. 5 ; (3)催化水解發(fā)酵液離心收集菌體，用pH 7. 0 8. 0磷酸鹽緩沖液配制成菌懸 液，加入丙烯酰胺，反應(yīng)體系中丙烯酰胺初始濃度為1 50g/L，菌體濃度以濕重計為1 20g/L，20 40。C水浴中轉(zhuǎn)化5 10h ; (4)產(chǎn)物分離轉(zhuǎn)化液離心回收菌體，離心上清液經(jīng)乙酸異丁酯萃取，萃取液經(jīng)過 精餾塔精餾去除溶劑，剩余液即為所述的丙烯酸。 可以用高效液相色譜(HPLC)等的分析方法對轉(zhuǎn)化液中的丙烯酰胺和丙烯酸進行 分析。高效液相色譜(HPLC)分析方法如下HPLCllOO， C18反向柱(ZORBAX SB-AQ，5咖， 4. 6X250mm)，流動相為乙腈:水=35 : 65，檢測波長為210nm。 本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在通過篩選得到一株產(chǎn)酰胺酶的新菌株，經(jīng)過誘變 改良得到酰胺酶酶活明顯提高的誘變菌株，并以此突變菌株來生物法制備丙烯酸，代替化 學合成的方法。具有轉(zhuǎn)化率高，環(huán)境友好，過程綠色等優(yōu)點。同時該菌株可以利用高毒的脂 肪氰類化合物、丙烯酰胺水解成毒性較小酸類物質(zhì)，為處理工業(yè)廢水中脂肪睛、酰胺類化合 物一種最經(jīng)濟、最有效的方法，因此本發(fā)明在環(huán)境治理上也具有重要的現(xiàn)實意義。


圖1為基于18S rDNA序列的進化樹；
圖2為基于ITS序列的進化樹。 具體實施例方式
下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明進行進一步描述，但本發(fā)明的保護范圍并不僅限于 此 實施例1 : 種子培養(yǎng)基配方丙烯酸l.Og，蔗糖15.0g，葡萄糖5.0g，酵母膏10g， NaCl 5g， KH2P04 1. Og， MgS04. 7H20 0. 2g， FeS04 0. Olg，用去離子水配制，pH用氨水調(diào)至7. O，總量為 1L。 發(fā)酵培養(yǎng)基丙烯酸10. Og，蔗糖20. Og，酵母膏5. Og， NaCl 1. Og， KH2P04 1. Og， MgS04. 7H20 0. 2g， FeS04 0. lg，用去離子水配制，pH用氨水調(diào)至7. O，總量為1L。
取120mL上述種子培養(yǎng)基，平均分裝在4個250mL三角瓶中，滅菌。接入斜面菌種 阿薩希毛孢子菌2-l，搖床轉(zhuǎn)速150r/min，3(TC搖床培養(yǎng)20h作為種子液，備用。
取1L上述發(fā)酵培養(yǎng)基，平均分配裝入10個500mL搖瓶中，滅菌。接入種子液，接 種量為2% (V/V)，進行培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為3(TC，培養(yǎng)時間為20h，搖床轉(zhuǎn)速為150r/min。
培養(yǎng)完成后，將發(fā)酵液在5000r/min， 15。C離心5min收集菌體，并將菌體懸浮于磷 酸緩沖液中，進行轉(zhuǎn)化反應(yīng)。反應(yīng)體系為100mL，包含有底物終濃度為0. 1M(7. lg/L) 、 pH 為7. 0磷酸緩沖液(終濃度為50mM) 、4. 3g菌體細胞(濕重)，30°C 、搖床培養(yǎng)5h后，離心除 去轉(zhuǎn)化液中的細胞，用高效液相色譜檢測。得到丙烯酰胺的轉(zhuǎn)化率為95% ，將轉(zhuǎn)化液離心除 去細胞，上清液采用150ML的乙酸異丁酯(3 : l發(fā)酵液)萃取發(fā)酵液2次，萃取液混合于 精餾塔中精餾，除去乙酸異丁酯，剩余液即是丙烯酸。丙烯酰胺轉(zhuǎn)化的最終產(chǎn)率在89.5%。
實施例2 : 種子培養(yǎng)基組成及種子培養(yǎng)同實施例1。 發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基配方丙烯酸5. Og，蔗糖15. Og，酵母膏5. Og，尿素1. Og， NaCl 1. Og， KH2P04 0. 5g， MgS04. 7H20 0. 5g， FeS04 0. lg，用去離子水配制，pH用氨水調(diào)至7. 0，總 量為1L ; 取1L上述發(fā)酵培養(yǎng)基，平均分配裝入10個500mL搖瓶中，滅菌。接入種子液，接 種量為2% (V/V)，進行培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為3(TC，培養(yǎng)時間為20h，搖床轉(zhuǎn)速為150r/min。
培養(yǎng)完成后，將發(fā)酵液在5000r/min， 15。C離心5min收集菌體，并將菌體懸浮于磷 酸緩沖液中，進行轉(zhuǎn)化反應(yīng)。反應(yīng)體系為100mL，包含有底物終濃度為0. 1M(7. lg/L) 、 pH 為8. 0磷酸緩沖液、4. 3g菌體細胞(濕重)、3(TC、搖床培養(yǎng)5h后，離心除去轉(zhuǎn)化液中的細 胞，用高效液相色譜檢測。得到丙烯酰胺的轉(zhuǎn)化率為96%，將轉(zhuǎn)化液離心除去細胞，上清液 采用150ML的乙酸異丁酯(3 : 1發(fā)酵液)萃取發(fā)酵液2次，萃取液混合于精餾塔中精餾， 除去乙酸異丁酯，剩余液即是丙烯酸。丙烯酰胺轉(zhuǎn)化的最終產(chǎn)率在89. 9%。
實施例3 : 種子培養(yǎng)基組成及種子培養(yǎng)同實施例1。 發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基配方丙烯酸3. Og，蔗糖15g，酵母膏5. Og，尿素2. Og， NaCl 1. Og， KH2P04 0. 5g， MgS04. 7H20 0. 5g， FeS04 0. 2g，用去離子水配制，pH用氨水調(diào)至8. 0，總量為 1L。
取1L上述發(fā)酵培養(yǎng)基，平均分配裝入10個500mL搖瓶中，滅菌。接入種子液，接 種量為2% (V/V)，進行培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為3(TC，培養(yǎng)時間為20h，搖床轉(zhuǎn)速為150r/min。
培養(yǎng)完成后，將發(fā)酵液在5000r/min， 15。C離心5min收集菌體，并將菌體懸浮于緩 沖液中，進行轉(zhuǎn)化反應(yīng)。反應(yīng)體系為100mL，包含有底物終濃度為0. 1M(7. lg/L) 、pH為9. 0 甘氨酸-NaOH(50mM)緩沖液、4. 3g菌體細胞(濕重)、30°C 、搖床培養(yǎng)5h后，離心除去轉(zhuǎn)化 液中的細胞，用高效液相色譜檢測。得到丙烯酰胺的轉(zhuǎn)化率為99%，將轉(zhuǎn)化液離心除去細 胞，上清液采用150ML的乙酸異丁酯(3 : 1發(fā)酵液)萃取發(fā)酵液2次，萃取液混合于精餾 塔中精餾，除去乙酸異丁酯，剩余液即是丙烯酸。丙烯酰胺轉(zhuǎn)化的最終產(chǎn)率在92.0%。
實施例4 : 種子培養(yǎng)基組成及種子培養(yǎng)同實施例1。 發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基配方丙烯酸5. Og，蔗糖10. Og，酵母膏2. Og，尿素4. Og， NaCl 1. Og， KH2P04 0. 5g， MgS04. 7H20 0. 5g， FeS04 0. 2g，用去離子水配制，pH用氨水調(diào)至8. 0，總 量為1L。 取1L上述發(fā)酵培養(yǎng)基，平均分配裝入10個500mL搖瓶中，滅菌。接入種子液，接 種量為2% (V/V)，進行培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為3(TC，培養(yǎng)時間為20h，搖床轉(zhuǎn)速為150r/min。
培養(yǎng)完成后，將發(fā)酵液在5000r/min， 15。C離心5min收集菌體，并將菌體懸浮于緩 沖液中，進行轉(zhuǎn)化反應(yīng)。反應(yīng)體系為100mL，包含有底物終濃度為0. 1M(7. lg/L) 、pH為9. 5 的甘氨酸-NaOH緩沖液(50mM) 、4. 3g菌體細胞(濕重)、30°C 、搖床培養(yǎng)5h后，離心除去轉(zhuǎn) 化液中的細胞，用高效液相色譜檢測。得到丙烯酰胺的轉(zhuǎn)化率為99% ，將轉(zhuǎn)化液離心除去細 胞，上清液采用150ML的乙酸異丁酯(3 : 1發(fā)酵液)萃取發(fā)酵液2次，萃取液混合于精餾 塔中精餾，除去乙酸異丁酯，剩余液即是丙烯酸。丙烯酰胺轉(zhuǎn)化的最終產(chǎn)率在91.5%。
實施例5 : 種子培養(yǎng)基組成及種子培養(yǎng)同實施例1。 發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基配方丙烯酸10. Og，蔗糖20. Og，酵母膏1. Og，尿素5. Og， NaCl 1. Og， KH2P04 0. 5g， MgS04. 7H20 0. 5g， FeS04 0. 2g，用去離子水配制，pH用氨水調(diào)至8. 0，總 量為1L。 取1L上述發(fā)酵培養(yǎng)基，平均分配裝入10個500mL搖瓶中，滅菌。接入種子液，接 種量為2% (V/V)，進行培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為3(TC，培養(yǎng)時間為20h，搖床轉(zhuǎn)速為150r/min。
培養(yǎng)完成后，將發(fā)酵液在5000r/min， 15。C離心5min收集菌體，并將菌體懸浮于磷 酸緩沖液中，進行轉(zhuǎn)化反應(yīng)。反應(yīng)體系為100mL，包含有底物終濃度為0. 1M(7. lg/L) 、 pH 為9. 5甘氨酸-NaOH(50mM) 、4. 3g菌體細胞(濕重)、30°C 、搖床培養(yǎng)5h后，離心除去轉(zhuǎn)化液 中的細胞，用高效液相色譜檢測。得到丙烯酰胺的轉(zhuǎn)化率為99%，將轉(zhuǎn)化液離心除去細胞， 上清液采用150ML的乙酸異丁酯(3 : l發(fā)酵液)萃取發(fā)酵液2次，萃取液混合于精餾塔中 精餾，除去乙酸異丁酯，剩余液即是丙烯酸。丙烯酰胺轉(zhuǎn)化的最終產(chǎn)率在91.6%。
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權(quán)利要求
一種丙烯酰胺酶的菌株——阿薩希毛孢子菌(Trichosporon asahii)2-1，保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，地址湖北省武漢市珞珈山武漢大學，430072，保藏日期2010年01月19日，保藏編號CCTCC NoM2010017。
2. 如權(quán)利要求1所述的阿薩希毛孢子菌2-1在制備丙烯酰胺酶中的應(yīng)用。
3. 如權(quán)利要求1所述的阿薩希毛孢子菌2-1在制備丙烯酸中的應(yīng)用。
4. 如權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于所述應(yīng)用為以丙烯酰胺為底物，以阿薩希毛 孢子菌2-l經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)獲得的丙烯酰胺酶為催化劑，進行水解反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后，反應(yīng)液經(jīng) 分離純化得到所述丙烯酸。
5. 如權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于所述發(fā)酵培養(yǎng)的發(fā)酵培養(yǎng)基終濃度組成如 下丙烯酸3. 0 10. 0g/L，蔗糖10. 0 20. Og/L，酵母膏0. 01 15. Og/L，尿素0. 01 5. Og/L， NaCl 1. 0 5. Og/L， KH2P04 0 . 01 1. Og/L， MgS04. 7H20 0. 01 2. Og/L， FeS040. 01 1. Og/L，溶劑為水，pH 6. 5 8. 5。
6. 如權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于所述水解反應(yīng)條件如下反應(yīng)溫度5 45t:， 反應(yīng)pH 5. 0 10. 0，反應(yīng)時間2 20h。
7. 如權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于所述分離純化方法如下反應(yīng)結(jié)束后，離心回 收反應(yīng)液中的菌體細胞，剩余清夜用乙酸異丁酯溶劑萃取，萃取液經(jīng)過精餾塔回收乙酸異 丁酯，即得所述的丙烯酸。
8. 如權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于所述應(yīng)用方法如下(1) 種子培養(yǎng)取種子培養(yǎng)基，接種阿薩希毛孢子菌2-l，搖床轉(zhuǎn)速150r/min，28t:培養(yǎng) 20h作為種子液；所述種子培養(yǎng)基終濃度組成如下丙烯酸1.0g/L，蔗糖15. Og/L，葡萄糖 5. Og/L，酵母膏10g/L， NaCl 5g/L， KH2P04 1. Og/L， MgS04. 7H20 0. 2g/L， FeS040 . 01g/L，用去 離子水配制，pH用氨水調(diào)至7. 0 ;(2) 發(fā)酵培養(yǎng)取發(fā)酵培養(yǎng)基，按照2 8%體積比接種種子液，25 45t:下培養(yǎng)18 48h，得到發(fā)酵液；所述發(fā)酵培養(yǎng)基終濃度組成如下丙烯酸3. 0 10. Og/L，蔗糖10. 0 20. Og/L，酵母膏0. 01 15. Og/L，尿素0. 01 5. Og/L， NaCl 1. 0 5. Og/L， KH2P04 0 . 01. Og/L， MgS04. 7H20 0. 01 2. Og/L， FeS04 0 . 01 1. Og/L，溶劑為水，pH 6. 5 8. 5 ;(3) 催化水解發(fā)酵液離心收集菌體，用pH7. 0 8. 0磷酸鹽緩沖液配制成菌懸液，加 入丙烯酰胺，反應(yīng)體系中丙烯酰胺初始濃度為1 50g/L，菌體濃度以濕重計為1 20g/L， 20 40。C水浴中轉(zhuǎn)化5 10h ;(4) 產(chǎn)物分離轉(zhuǎn)化液離心回收菌體，離心上清液經(jīng)乙酸異丁酯溶劑萃取，萃取液經(jīng)過 精餾塔精餾去除溶劑，剩余液即為所述的丙烯酸。
全文摘要
本發(fā)明提供了一株丙烯酰胺酶的菌株——阿薩希毛孢子菌(Trichosporon asahii)2-1，及其在制備丙烯酸中的應(yīng)用。所述阿薩希毛孢子菌2-1保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，地址湖北省武漢市珞珈山武漢大學，430072，保藏日期2010年01月19日，保藏編號CCTCC NoM2010017。本發(fā)明通過篩選得到一株產(chǎn)酰胺酶的新菌株，經(jīng)過誘變改良得到酰胺酶酶活明顯提高的誘變菌株，并以此突變菌株來生物法制備丙烯酸，代替化學合成的方法。具有轉(zhuǎn)化率高，環(huán)境友好，過程綠色等優(yōu)點。同時該菌株可以利用高毒的脂肪氰類化合物、丙烯酰胺水解成毒性較小酸類物質(zhì)，為處理工業(yè)廢水中脂肪睛、酰胺類化合物一種最經(jīng)濟、最有效的方法，因此本發(fā)明在環(huán)境治理上也具有重要的現(xiàn)實意義。
文檔編號C12R1/645GK101768555SQ20101010749
公開日2010年7月7日 申請日期2010年1月30日 優(yōu)先權(quán)日2010年1月30日
發(fā)明者張正波, 裘娟萍, 趙春田, 高靚 申請人:浙江工業(yè)大學