專利名稱：一種棒狀桿菌啟動(dòng)子探測(cè)載體及其構(gòu)建方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種啟動(dòng)子探測(cè)載體及其構(gòu)建方法和應(yīng)用，特別是一種棒狀桿菌啟動(dòng) 子探測(cè)載體以及應(yīng)用該載體篩選到的強(qiáng)啟動(dòng)子，屬于微生物基因工程領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
棒狀桿菌是一類革蘭氏陽性菌，屬于具有中度到高GC含量的放線菌。自人們首次 分離谷氨酸棒狀桿菌生產(chǎn)L-谷氨酸以來(Kinoshita等，1957年)，棒狀桿菌的三個(gè)主要代 表谷氨酸棒狀桿菌，黃色短桿菌，和乳糖發(fā)酵短桿菌，已經(jīng)被廣泛用于生產(chǎn)氨基酸。這里 特別指出，通過DNA-DNA雜交實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，這三個(gè)不同物種之間只有很小的差別(Liebl等， 1991)。由于已累計(jì)了大量的關(guān)于谷氨酸棒狀桿菌生理學(xué)，生物化學(xué)和遺傳學(xué)知識(shí) (Eggeling andBott,2005 ；Burkovski，2008)，代謝工程已經(jīng)取代經(jīng)典的隨機(jī)突變，成為棒 狀桿菌菌種改良的主要策略。應(yīng)用表達(dá)載體對(duì)氨基酸生物合成途徑中的限速酶編碼基因的 過表達(dá)，是代謝工程最常用的策略之一。目前幾乎所有的現(xiàn)存棒狀桿菌表達(dá)載體都使用大 腸桿菌啟動(dòng)子如lacUV5、trp、tac、λ PkP1和araBAD啟動(dòng)子來表達(dá)外源基因(Srivastava and Deb, 2005)；然而，在棒狀桿菌中，這些啟動(dòng)子的活性較弱，外源基因在他們的控制下的 表達(dá)水平通常不高，這會(huì)限制氨基酸的產(chǎn)量。因此，應(yīng)用探測(cè)載體尋找用于棒狀桿菌代謝工 程改造的強(qiáng)啟動(dòng)子，具有重要的意義。在本發(fā)明中，我們首先構(gòu)建了一個(gè)新的棒狀桿菌啟動(dòng)子探測(cè)載體pDXW-11，應(yīng)用該 載體探測(cè)了四種已知的啟動(dòng)子PilvA，Pkan, PF104, tac以及兩種我們?cè)O(shè)計(jì)tac衍生物，即 tac-Ml, tac-M啟動(dòng)子在黃色短桿菌中的活性。我們發(fā)現(xiàn)tac_M啟動(dòng)子在黃色短桿菌中能 高水平表達(dá)報(bào)告基因cat編碼的氯霉素酰基轉(zhuǎn)移酶CAT。tac-M啟動(dòng)子是一個(gè)適用于棒狀 桿菌代謝工程研究的強(qiáng)啟動(dòng)子，它的發(fā)現(xiàn)具有如下的重要意義目前棒狀桿菌中存在的使 用tac啟動(dòng)子控制外源基因表達(dá)的弱表達(dá)載體，可以通過定點(diǎn)突變技術(shù)，轉(zhuǎn)變成使用tac-M 啟動(dòng)子的強(qiáng)表達(dá)載體。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種棒狀桿菌啟動(dòng)子探測(cè)載體及其構(gòu)建方案，通過此探測(cè)載體篩選 到一個(gè)強(qiáng)啟動(dòng)子。一種本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種棒狀桿菌啟動(dòng)子探測(cè)載體pDXW-11。本發(fā)明所述的探測(cè)載體包括篩選標(biāo)記、復(fù)制子片段及多克隆位點(diǎn)，其特征在于含 有用于檢測(cè)外源DNA片段啟動(dòng)子活性的氯霉素?；D(zhuǎn)移酶基因(cat)；用于控制報(bào)告基因 上游啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄通讀的rrnBTlT2終止子序列。探測(cè)載體pDXW-11含有使質(zhì)粒能在棒狀桿菌宿主中復(fù)制并穩(wěn)定存在的rep片段， 從4786位到2010位。探測(cè)載體pDXW-11含有用于棒狀桿菌轉(zhuǎn)化子選擇的抗性標(biāo)記卡那霉素標(biāo)記抗性基因kan，從5789位到6604位。探測(cè)載體PDXW-Il含有用于檢測(cè)外源DNA片段啟動(dòng)子活性報(bào)告基因cat，從823位 到164位。探測(cè)載體PDXW-Il含有用于控制報(bào)告基因上游啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄通讀的rrnBTlT2終止 子序列，其中rrnBTl從1121位到1080位，rrnBT2從947位到940位。本發(fā)明提供的表達(dá)載體pDXW-11，{Escherichia coli DH5 α (pDXff-11)}已保 藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，簡(jiǎn)稱CCTCC，保藏編號(hào)CCTCC NO =M 2010006保藏日期 2010-1-13。本發(fā)明所要解決的另一個(gè)技術(shù)問題是提供表達(dá)載體pDXW-11的構(gòu)建方法。為解決上述問題，所采用的技術(shù)方案是第一步用限制酶XbaI和BglI雙酶切載體pET28a，去除含IacI基因及T7啟動(dòng) 子的DNA片段，將大片段自身環(huán)化，構(gòu)建成的重組質(zhì)粒命名為pDXW-Ι ；第二步以質(zhì)粒大腸桿菌-棒狀桿菌穿梭質(zhì)粒pC2為模板，rep-F和r印-R為引 物，通過PCR擴(kuò)增2686bp的棒狀桿菌復(fù)制子片段r印，PCR產(chǎn)物用SmaI酶切，并連接到用 BstZ17I酶切，且用CIAP去磷酸化后的pDXW-Ι上，構(gòu)建的穿梭載體命名為為pDXW_2 ；第三步以含有cat基因的載體為模板，cat-F和cat-R為引物，通過PCR擴(kuò)增 686bp報(bào)告基因cat的開放閱讀框，在擴(kuò)增產(chǎn)物的5'和3'末端分別引入限制酶內(nèi)切酶 酶切位點(diǎn)，PCR產(chǎn)物用引入的限制性內(nèi)切酶雙切，并連接到用同樣限制性內(nèi)切酶雙切后的 pDXff-2上，構(gòu)建的重組質(zhì)粒命名為pDXW-2-cat ；第四步以含有終止子rrnBTlT2的載體為模板，rrnBTlT2_F和rrnBTlT2_R為引 物，通過PCR擴(kuò)增294bp的終止子π·ηΒΤ1Τ2，在擴(kuò)增產(chǎn)物的5'和3'末端分別引入限制酶 內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)，PCR產(chǎn)物用引入的限制性內(nèi)切酶雙切，并連接到同樣用同樣限制性內(nèi)切酶 雙切后的pDXW-2-cat上，構(gòu)建的重組質(zhì)粒命名為pDXW-11。本發(fā)明所要解決的另一個(gè)技術(shù)問題是提供一個(gè)應(yīng)用棒狀桿菌啟動(dòng)子探測(cè)載體篩 選得到的強(qiáng)啟動(dòng)子tac-M，該啟動(dòng)子根據(jù)雜合性啟動(dòng)子tac進(jìn)行人工改造后得到，其核苷酸 序列為 SEQ ID NO :2ο所述啟動(dòng)子通過寡核苷酸鏈退火法獲得。本發(fā)明的有益效果本發(fā)明的探測(cè)載體pDXW-11在大腸桿菌及棒狀桿菌中皆能穩(wěn)定存在，可用于檢測(cè) DNA片段在棒狀桿菌中有無啟動(dòng)子活性及活性的相對(duì)大?。粦?yīng)用本發(fā)明構(gòu)建的探測(cè)載體， 篩選到一種在棒狀桿菌中能高效表達(dá)外源基因的強(qiáng)啟動(dòng)子tac-M，解決了目前棒狀桿菌啟 動(dòng)子普遍較弱的問題，尤其適用于棒狀桿菌生產(chǎn)次生代謝產(chǎn)物的研究和生產(chǎn)。


圖1表達(dá)載體pDXW-11的構(gòu)建。圖2表達(dá)載體pDXW-11的構(gòu)建。圖3不同黃色短桿菌菌株全蛋白SDS-PAGE圖。圖4不同黃色短桿菌菌株CAT活性圖。圖5啟動(dòng)子探測(cè)載體pDXW-11的物理圖譜。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1表達(dá)載體pDXW-11的構(gòu)建表達(dá)載體pDXW-10的構(gòu)建過程如圖1，2所示。第一步，以表達(dá)載體pET28a(NOVagen，USA)為基礎(chǔ)，去除IacI基因及T7啟動(dòng)子， 構(gòu)建質(zhì)粒PDXW-I (圖1)。用限制酶XbaI和BglI雙酶切載體pET28a，將獲得的大片段純化， 用T4連接酶將大片段自身環(huán)化，構(gòu)建成的重組質(zhì)粒大小為3524bp，命名為pDXW-Ι (圖1)；第二步，構(gòu)建穿梭載體pDXW_2(圖1).以質(zhì)粒大腸桿菌-棒狀桿菌穿梭質(zhì)粒 pC2 (Goyal etal.，1996Plasmid. 36 :62_66)為模板，r印-F 和 r印-R 為引物，通過 PCR 擴(kuò)增 2686bp的棒狀桿菌復(fù)制子片段r印，在擴(kuò)增產(chǎn)物的5’和3’末端引入限制酶SmaI酶切位點(diǎn)。 PCR 擴(kuò)增反應(yīng)體系為 50 μ 1，包括 10 μ 15 X PrimerSTAR buffer (Mg2+plus)，4 μ 1 dNTP 混合 物(各2. 5mM)，ly 1質(zhì)粒模板pC2(100ng/y 1)，1μ 1正向引物r印-F (20 μ Μ)，1 μ 1反向引 物 r印-R (20 μ Μ), 0. 5 μ 1 PrimeSTAR HS DNA Polymerase ；反應(yīng)程序94°C預(yù)變性分鐘； 94°C變性30秒，60°C退火15秒，72°C延伸2分45秒，35個(gè)循環(huán)；72°C再延伸10分鐘；10°C 保存。PCR產(chǎn)物用SmaI酶切，并連接到用BstZ17I酶切，且用CIAP去磷酸化后的pDXW_l， 由此產(chǎn)生的穿梭載體大小為6216bp，命名為為pDXW-2。第三步，向質(zhì)粒pDXW-2引入將報(bào)告基因cat，cat編碼氯霉素酰基轉(zhuǎn)移酶(CAT) (圖 2)。以質(zhì)粒 pDXW-10-cat (Xu et al. ,2010FEMS Microbiology letters. In review) 為模板，帶有三個(gè)串聯(lián)終止密碼子和SD序列的引物cat-F和cat-R為引物，通過PCR擴(kuò)增 686bp報(bào)告基因cat的開放閱讀框，在擴(kuò)增產(chǎn)物的5'和3'末端分別引入限制酶NotI和 XhoI 酶切位點(diǎn)。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為 50 μ 1，包括 10 μ 1 5 X PrimerSTAR buffer (Mg2+plus)， 4 μ 1 dNTP 混合物(各 2. 5mM)，1 μ 1 質(zhì)粒模板 pDXff-10-cat (IOOng/ μ 1)，1 μ 1 正向引物 cat-F(20yM)，ly 1 反向引物 cat-R(20yM)，0. 5μ 1 PrimeSTAR HS DNA Polymerase ；反 應(yīng)程序94°C預(yù)變性分鐘；94°C變性30秒，54°C退火15秒，72°C延伸45秒，35個(gè)循環(huán)；72°C 再延伸10分鐘；10°C保存。PCR產(chǎn)物用NotI和XhoI雙切，并連接到同樣用NotI和XhoI雙 切后的pDXW-2，構(gòu)建的重組質(zhì)粒大小為6901bp，命名為pDXW-2-cat (圖2)。第四步，為了消除報(bào)告基因上游pDXW-2自身序列對(duì)報(bào)告基因轉(zhuǎn)錄的干擾，在cat 上游的多克隆位點(diǎn)前面引入轉(zhuǎn)錄終止子rrnBTlT2(圖2)。以質(zhì)粒pKK223_3 (Pharmacia， Sweden)為模板，rrnBTlT2_F和rrnBTlT2_R為引物，通過PCR擴(kuò)增294bp的終止子 rrnBTlT2，在擴(kuò)增產(chǎn)物的5'和3'末端分別引入限制酶NheI和BamHI酶切位點(diǎn)。PCR擴(kuò) 增反應(yīng)體系為 50μ 1，包括 10μ 1 5 X PrimerSTAR buffer (Mg2+plus), 4 μ 1 dNTP 混合物 (各 2. 5mM), 1 μ 1 質(zhì)粒模板 pKK223-3(100ng/y 1)，1 μ 1 正向引物 rrnBTlT2_F(20 μ Μ)， 1 μ 1 反向引物 rrnBTlT2-R(20 μ Μ)，0· 5 μ 1 PrimeSTAR HS DNA Polymerase ；反應(yīng)程序 94°C預(yù)變性分鐘；94°C變性30秒，44°C退火15秒，72°C延伸20秒，35個(gè)循環(huán)；72°C再延伸 10分鐘；10°C保存。PCR產(chǎn)物用NheI和BamHI雙切，并連接到同樣用NheI和BamHI雙切 后的pDXW-2-cat，構(gòu)建的重組質(zhì)粒即為最終的啟動(dòng)子探測(cè)載體，其大小為7163bp，命名為 pDXW-11，物理圖譜見圖5，構(gòu)建過程中使用的引物序列如下rep-F agtacccgggcattgtcaacaacaag acccatcarep-R agtacccggggtctacgtctgatgct ttgaatcg
cat-F aactagcggccgctaactaactaagaaaggacatgaacgatggagacat-R actactcgagttacgccccgccctgccactrrnBTlT2-F :atctagctagccgatggtagtgtggggtctcrrnBTlT2-R :agttggatccagaaaaataaacaaaagagt實(shí)施例2應(yīng)用探測(cè)載體pDXW-11探測(cè)啟動(dòng)子為了證明pDXW-11的可用性并且尋找能在棒狀桿菌中高效表達(dá)的啟動(dòng)子，在黃色 短桿菌中，我們對(duì)六個(gè)不同類型的異源啟動(dòng)子PilvA，Pkan, PF104, tac,, tac-Ml和tac_M進(jìn) 行了活性檢測(cè)。？…八是谷氨酸棒桿菌染色體上蘇氨酸脫氫酶基因ilvA的啟動(dòng)子序列；Pkan 是來自轉(zhuǎn)座子Tn5的啟動(dòng)子序列；PF104是來自谷氨酸棒桿菌噬菌體Φ GAl的啟動(dòng)子序列； tac是雜合性啟動(dòng)子；tac-Ml和tac_M是我們自己設(shè)計(jì)的tac啟動(dòng)子的衍生物。首先，設(shè)計(jì)合成啟動(dòng)子寡核苷酸單鏈序列，并且在序列中引入限制性酶切位點(diǎn)，應(yīng) 用寡核苷酸鏈退火法獲得啟動(dòng)子雙鏈DNA序列。寡核苷酸單鏈序列包括PilvA_F、PilvA_R，用 于通過寡核苷酸鏈退火法獲得PilvA啟動(dòng)子雙鏈DNA序列；PF104-F、PF104-R，用于通過寡核 苷酸鏈退火法獲得PF104啟動(dòng)子雙鏈DNA序列；Pkan-F、Pkan-R,用于通過寡核苷酸鏈退火法 獲得Pkan啟動(dòng)子雙鏈DNA序列；tac-F、tac_R，用于通過寡核苷酸鏈退火法獲得tac啟動(dòng)子 雙鏈DNA序列。為了能夠克隆到啟動(dòng)子探測(cè)載體的多克隆位點(diǎn)，所有啟動(dòng)子序列的5'和 3'末端都分別引入了限制性切點(diǎn)BamHI和HindIII0將PilvA，Pkan, PF104, tac啟動(dòng)子雙鏈 DNA序列用BamHI和HindIII雙切，并連接到同樣用BamHI和HindIII雙切后的啟動(dòng)子探測(cè) 載體 pDXW-11，獲得的重組質(zhì)粒分別命名為 pDXW-1 l-PilvA，pDXff-Il-Pkan, pDXW-ll_PF104 和 pDXW-11-tac。將 pDXW-1 l-PilvA，pDXff-11-Pkan, pDXff-11-PF104 和 pDXW-ll-tac 轉(zhuǎn)化黃色短 桿菌 B. flavumATCC14067,分別形成菌株 14067/pDXff-ll-PilvA, 14067/pDXff-lI-Pkan, 14067/ pDXW-11-PF104和14067/pDXW-ll_tac。將ImL過夜培養(yǎng)的上述黃色短桿菌菌株分別接種 到30mL含卡那霉素的LBG培養(yǎng)基中，培養(yǎng)物生長(zhǎng)到在600nm光密度為1. 5時(shí)，離心收獲 細(xì)胞并懸浮在 5mL Tris-HCl 緩沖液(lOOmM，ρΗ7· 8)中。用 Constant Cell Disruption Systems (Constant Systems, Daventry, UK)，在20KPSI條件下，破碎細(xì)胞，離心除去細(xì)胞碎 片，粗提物用于SDS-PAGE和CAT蛋白的生物活性分析。SDS-PAGE結(jié)果顯示所有樣品都沒 有出現(xiàn)與預(yù)測(cè)的分子量約為25kD特異性CAT蛋白條帶(報(bào)告基因cat的編碼產(chǎn)物)(圖3)， 這意味著檢測(cè)的啟動(dòng)子在黃色短桿菌中活性不是很強(qiáng)。為了進(jìn)一步證明上述檢測(cè)的啟動(dòng) 子是否具有活性以及活性相對(duì)大小，我們應(yīng)用Shaw(1975)等的方法，分別對(duì)上述4個(gè)菌株 粗提物進(jìn)行了 CAT的生物活性檢測(cè)。結(jié)果顯示14067/pDXW-ll-PilvA，14067/pDXW-lI-Pkan, 14067/pDXff-ll-PF104 和 14067/pDXW-ll-tac 樣品的 CAT 的相對(duì)活性分別為 0. 086,0. 785、 0. 128,0. 467U(mg protein—1) (Fig. 4)。結(jié)合SDS-PAGE圖譜及CAT活性測(cè)定數(shù)值進(jìn)行分析 可得出結(jié)論P(yáng)ilvA，Pkan, PF104, tac啟動(dòng)子在黃色短桿菌中都具有活性，但活性水平不高。然后，為了發(fā)現(xiàn)適用于棒狀桿菌代謝工程研究的強(qiáng)啟動(dòng)子，我們?cè)O(shè)計(jì)了兩個(gè)tac 啟動(dòng)子的衍生物tac-Ml和tac-M。tac、tac-Ml和tac_M啟動(dòng)子的差別僅在于其延伸 的"10區(qū)序列，他們的延伸的-10區(qū)序列分別為gctcgtataa tgt、tgtgctataa tgg禾口 tgtggtacca tgt。我們應(yīng)用寡核苷酸鏈退火法獲得tac-Ml和tac_M啟動(dòng)子雙鏈DNA序 列，序列的5'和3'末端都分別引入了限制性切點(diǎn)BamHI和Hindlll。寡核苷酸單鏈 序列包括tac-Ml-F、tac-Ml-R,用于通過寡核苷酸鏈退火法獲得tac_Ml啟動(dòng)子雙鏈DNA序列；tac-M-F、tac-M-R，用于通過寡核苷酸鏈退火法獲得tac_M啟動(dòng)子雙鏈DNA序 列。將tac-Ml和tac-M啟動(dòng)子雙鏈DNA序列用BamHI和HindIII雙切，并連接到同樣 用BamHI和HindIII雙切后的啟動(dòng)子探測(cè)載體pDXW_ll，獲得的重組質(zhì)粒分別命名為 pDXff-11-tac-Ml 和 pDXW-ll-tac_M2。將 pDXW-11-tac-Ml 和 pDXW-ll-tac_M2 轉(zhuǎn)化黃色短 桿菌 B. flavumATCC14067，分別形成菌株 14067/pDXff-ll-tac-Ml 和 14067/pDXW-ll-tac-M。 將ImL過夜培養(yǎng)的黃色短桿菌菌株14067/pDXff-ll-tac-Ml和14067/pDXW-ll-tac-M分別 接種到30mL含卡那霉素的LBG培養(yǎng)基中，培養(yǎng)物生長(zhǎng)到在600nm光密度為1. 5時(shí)，離心收 獲細(xì)胞并懸浮在 5mL Tris-HCl 緩沖液(lOOmM，pH7. 8)中。用 Constant Cell Disruption systems (Constant Systems, Daventry, UK)，在 20KPSI 條件下，破碎細(xì)胞，離心除去細(xì)胞 碎片，粗提物用于SDS-PAGE和CAT蛋白的生物活性分析。SDS-PAGE結(jié)果顯示14067/ pDXW-11-tac-M樣品顯示了分子量約為25kD的CAT蛋白條帶(圖3)，說明tac_M啟動(dòng)子在 黃色短桿菌中能高效表達(dá)活性很強(qiáng)。為了進(jìn)一步證明tac-Ml和tac-M啟動(dòng)子活性相對(duì)大 小，我們應(yīng)用Shaw(1975)等的方法，分別對(duì)上述2個(gè)菌株粗提物進(jìn)行了 CAT的生物活性檢 測(cè)。結(jié)果顯示14067/pDXW-ll-tac-Ml和14067/pDXW-ll-tac-M樣品的CAT的相對(duì)活性分 別為0. 602,5. 526U(mg protein—1)(圖4)。結(jié)合SDS-PAGE圖譜及CAT活性測(cè)定數(shù)值進(jìn)行 分析可得出結(jié)論tac-M啟動(dòng)子在黃色短桿菌中是一個(gè)強(qiáng)啟動(dòng)子。用于獲得啟動(dòng)子雙鏈DNA的寡核苷酸單鏈序列如下PiivA-F :agcggatcccaaagtaggtgcaattctaggagaagattacactagtcaaccatgagtgaaaa gcttagcPiivA-R :gctaagcttttcactcatggttgactagtgtaatcttctcctagaattgcacctactttggg atccgctPF104-F :aataggatcccagcgtatttgaccgatccggacacctgggataatgtgtggattttgtcgg aagctttaatPF104-R :attaaagcttccgacaaaatccacacattatcccaggtgtccggatcggtcaaatacgctg ggatcctattPkan-F acttggatccccggaattgccagctggggcgccctctggtaaggttgggaagccctgcaaaa gcttaatgPkan-R cattaagcttttgcagggcttcccaaccttaccagagggcgccccagctggcaattccgggg atccaagt tac-F atatggatcctgagetgttgacaattaatcatcggctcgtataatgtgtggaattgtgage ggataacaattaagctttaaatac-R tttaaagcttaattgttatccgctcacaattccacacattatacgagccgatgattaattg tcaacagctcaggatccatattac-Ml-F agetggatcctgagetgttgacaattaatcatcgtgtgctataatgggtggaattgtgag cggataacaattaagcttagcttac-Ml-R :agctaagcttaattgttatccgctcacaattccacccattatagcacacgatgattaatt gtcaacagctcaggatccagcttac-M-F agetggatcctgagetgttgacaattaatcatcgtgtggtaccatgtgtggaattgtgag cggataacaattaagcttagct
7
catccataccgccagttgtttaccctcacaacgttccagtaaccgggcatgttcatcatc1680
agtaacccgtatcgtgagcatcctctctcgtttcatcggtatcattacccccatgaacag1740
aaatcccccttacacggaggcatcagtgaccaaacaggaaaaaaccgcccttaacatggc1800
ccgctttatcagaagccagacattaacgcttctggagaaactcaacgagctggacgcgga1860
tgaacaggcagacatctgtgaatcgcttcacgaccacgctgatgagctttaccgcagctg1920
cctcgcgcgtttcggtgatgacggtgaaaacctctgacacatgcagctcccggagacggt1980
cacagcttgtctgtaagcggatgccgggagcagacaagcccgtcagggcgcgtcagcggg2040
tgttggcgggtgtcggggcgcagccatgacccagtcacgtagcgatagcggagtgtaggg2100
cattgtcaacaacaagacccatcatagtttgcccccgcgacattgaccataaattcatcg2160
cacaaaatatcgaacggggtttatgccgcttttagtgggtgcgaagaatagtctgctcat2220
tacccgcgaacaccgccgcattcagatcacgcttagtagcgtccccatgagtaggcagaa2280
ccgcgtccaagtccacatcatccataacgatcatgcacggggtggaatccacacccagac2340
ttgccagcacctcattagcgacacgttgcgcagcggccacgtccttagccttatccacgc2400
aatctagaacgtactgcctaac cgcgaaatcagactgaatcagtttccaatcatcgggct2460
tcaccaaagcaacagcaacgcgggttgattcgacccgttccggtgcttccagaccggcga2520
gcttgtacagttcttcttccatttcacgacgtacatcagcgtctatgtaatcaatgccca2580
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cacgccaccgagccaccaaaacagcgtccatatcctcgccggcgtcgctttgatcggcca2700
acatatccaacatctgaaacggcgtgtacgaccccttagacgcggttttagtagcggagc2760
cagtcagttcctgagacatgcccttagcgaggtaggttgccattttcgcagcgtctccac2820
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ccttaaccacaccagcagaccagcgggaaaacatggaatcctcaaacgccttgagttcat2940
cgtcagacagtggacgatccaagaacaacagcatgttgcggtgcaagtgccaaccgttcg3000
cccaagagtctgtgacctcatagtcactataggtgtgctccaccccgtaccgtgcacgtt3060
ctttcttccactgagatgttttcaccatcgaagagtacgcagtcttaatacccgcttcaa3120
cctgcgcaaatgactgtgagCggttgtgtCgaacagtgcccacaaacatcatgagcgcgc3180
cacccgccgccaagtgattcttagtagcaatagccagctcaatgcggcgttcgcccatga3240
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9
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<210>2
<211>62
<212>DNA
<213>人工序列
<400>2
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tt62
1權(quán)利要求
一種棒狀桿菌啟動(dòng)子探測(cè)載體，包括篩選標(biāo)記、復(fù)制子片段及多克隆位點(diǎn)，其特征在于含有用于檢測(cè)啟動(dòng)子活性的氯霉素酰基轉(zhuǎn)移酶報(bào)告基因(cat)；多克隆位點(diǎn)后為用于控制報(bào)告基因上游啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄通讀的rrnBT1T2終止子序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的探測(cè)載體，其特征在于其核苷酸序列為SEQID NO :1。
3.權(quán)利要求1，2任一所述的探測(cè)載體的構(gòu)建方法，其特征在于包括如下步驟 第一步用限制酶XbaI和BglI雙酶切載體pET28a，去除含IacI基因及T7啟動(dòng)子的DNA片段，將大片段自身環(huán)化，構(gòu)建成的重組質(zhì)粒命名為pDXW-Ι ；第二步以質(zhì)粒大腸桿菌_棒狀桿菌穿梭質(zhì)粒PC2為模板，rep-F和rep-R為引物，通 過PCR擴(kuò)增2686bp的棒狀桿菌復(fù)制子片段r印，PCR產(chǎn)物用SmaI酶切，并連接到用BstZ17I 酶切，且用CIAP去磷酸化后的pDXW-Ι上，構(gòu)建的穿梭載體命名為為pDXW-2 ；第三步以含有氯霉素酰基轉(zhuǎn)移酶基因(cat)的載體為模板，cat-F和cat-R為引物， 通過PCR擴(kuò)增686bp報(bào)告基因cat的開放閱讀框，在擴(kuò)增產(chǎn)物的5'和3'末端分別引入限 制酶內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)，PCR產(chǎn)物用引入的限制性內(nèi)切酶雙切，并連接到用同樣限制性內(nèi)切酶 雙切后的PDXW-2上，構(gòu)建的重組質(zhì)粒命名為pDXW-2-cat ；第四步以含有終止子rrnBTlT2的載體為模板，rrnBTlT2_F和rrnBTlT2_R為引物，通 過PCR擴(kuò)增294bp的終止子π·ηΒΤ1Τ2，在擴(kuò)增產(chǎn)物的5'和3'末端分別引入限制酶內(nèi)切酶 酶切位點(diǎn)，PCR產(chǎn)物用引入的限制性內(nèi)切酶雙切，并連接到同樣用同樣限制性內(nèi)切酶雙切后 的pDXW-2-cat上，構(gòu)建的重組質(zhì)粒命名為pDXW-11。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于第一步中的2種限制性內(nèi)切酶為NotI和 Xhol，第二步中的2種限制性內(nèi)切酶為NheI和BamHI。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于使用下述引物對(duì) rep-F :agtacccgggcattgtcaacaacaag acccatcarep-R :agtacccggggtctacgtctgatgct ttgaatcg cat-F :aactagcggccgctaactaactaagaaaggacatgaacgatggaga cat-R :actactcgagttacgccccgccctgccact rrnBTlT2_F :atctagctagccgatggtagtgtggggtctc rrnBTlT2-R :agttggatccagaaaaataaacaaaagagt
6.一種應(yīng)用棒狀桿菌啟動(dòng)子探測(cè)載體篩選得到的強(qiáng)啟動(dòng)子tac-M，其特征在于該啟動(dòng) 子根據(jù)雜合性啟動(dòng)子tac進(jìn)行人工改造后得到，其核苷酸序列為SEQ ID NO :2。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的tac-M啟動(dòng)子，其特征在于采用寡核苷酸鏈退火法獲得。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種棒狀桿菌啟動(dòng)子探測(cè)載體及其構(gòu)建方法和應(yīng)用，屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明的棒狀桿菌啟動(dòng)子探測(cè)載體pDXW-11，可用于篩選能在棒狀桿菌中高效表達(dá)的啟動(dòng)子，通過質(zhì)粒的探測(cè)，篩選到一種棒狀桿菌強(qiáng)啟動(dòng)子tac-M，在棒狀桿菌中能高效表達(dá)，尤其適用于棒狀桿菌代謝產(chǎn)物的研究和生產(chǎn)。
文檔編號(hào)C12N15/77GK101985631SQ20101010846
公開日2011年3月16日 申請(qǐng)日期2010年2月10日 優(yōu)先權(quán)日2010年2月10日
發(fā)明者徐大慶, 李燁, 王小元, 譚延振 申請(qǐng)人:江南大學(xué)