專利名稱：具有高產(chǎn)d-塔格糖能力的l-阿拉伯糖異構(gòu)酶的突變體酶l20a及其突變方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種具有高產(chǎn)D-塔格糖能力的L-阿拉伯糖異構(gòu)酶的突變體酶及其突 變方法，以及利用該突變體酶生產(chǎn)D-塔格糖的技術(shù)，屬于生物工程、基因工程和酶工程技 術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
D-塔格糖是近年發(fā)現(xiàn)的一種具有特殊保健功能的功能性甜味劑。D-塔格糖屬于
天然稀有糖的一種，在許多食品中都發(fā)現(xiàn)少量存在，如高溫滅菌牛奶、奶酪、酸奶及其它奶 制品等。2000年美國(guó)食品與藥物管理局(FDA)確定D-塔格糖為普遍公認(rèn)安全食品(GRAS)， 并正式批準(zhǔn)作為甜味劑用于食品飲料業(yè)以及醫(yī)藥制劑中；隨后聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織和世界衛(wèi)生 組織的聯(lián)合食品添加劑委員會(huì)第57次會(huì)議批準(zhǔn)D-塔格糖作為食品添加劑；歐盟也于2003 年批準(zhǔn)D-塔格糖在歐洲上市。 目前，國(guó)內(nèi)對(duì)于D-塔格糖生產(chǎn)的研究還處于起步階段，國(guó)外對(duì)其研究已較為深 入，方法主要有兩種化學(xué)法和生物法。但目前市售的D-塔格糖都是由化學(xué)法生產(chǎn)的。由于 一方面化學(xué)法生產(chǎn)存在許多不利因素，如化學(xué)污染物多，堿性條件下異構(gòu)化反應(yīng)副產(chǎn)物多， 分離困難等；另一方面由于消費(fèi)者消費(fèi)觀念的轉(zhuǎn)變，天然食品的需求日益增長(zhǎng)，因此近年來(lái) 對(duì)D-塔格糖生產(chǎn)的研究集中在生物法上。 研究發(fā)現(xiàn)L-阿拉伯糖異構(gòu)酶(EC 5.3. 1.4，縮寫(xiě)為L(zhǎng)-AI)可以催化D-半乳糖 轉(zhuǎn)化為D-塔格糖，是目前生物法生產(chǎn)D-塔格糖最為有效的途徑。但是L-AI是一種非專 一性酶，它可以分別催化L-阿拉伯糖和D-半乳糖為L(zhǎng)-核酮糖和D-塔格糖。研究表明 L-AI催化L-阿拉伯糖的效率明顯高于D-半乳糖。本發(fā)明所使用的來(lái)源于(Acidothermus cellulolytics)ATCC 43068的L_AI酶是一種高耐熱性酶，具有工業(yè)應(yīng)用前景。因此，進(jìn)一 步提高該酶催化D-半乳糖轉(zhuǎn)化生產(chǎn)D-塔格糖的能力將賦予其更好的應(yīng)用潛能。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的 一 個(gè)目的是提供提高來(lái)源于解纖維熱酸菌
(Acidothermuscellipolytics) ATCC 43068的L-AI酶產(chǎn)D_塔格糖能力的方案。 本發(fā)明的另一個(gè)目的是提出具有更高生產(chǎn)D-塔格糖能力的單突變體酶L20A，及
其構(gòu)建方法。 同時(shí)本發(fā)明還提供了一種利用該單突變體酶L20A生產(chǎn)D-塔格糖的方法。
本發(fā)明的技術(shù)方案一種L-可拉伯糖異構(gòu)酶的單突變體酶L20A，將來(lái)源于解纖維 熱酸菌(Acidothe麗s eel lipolytics) ATCC 43068的L_阿拉伯糖異構(gòu)酶L-AI酶(其基 因序列詳見(jiàn)Appl Microbiol Biotechnol D0I10. 1007/s00253-009-2322-z)，進(jìn)行突變所 得的單突變體酶L20A ;其為L(zhǎng)-AI酶基因中第20位的亮氨酸Leu突變成了丙氨酸Ala，命名 為L(zhǎng)20A ;它相比于野生型L-AI酶具有更高的產(chǎn)D-塔格糖的能力。
下游外側(cè)引物
正向突變引物
反向突變引物 所述的L-阿拉伯糖異構(gòu)酶的單突變體酶L20A的制備方法，根據(jù)ATCC43068的 L-AI酶基因序列，設(shè)計(jì)突變引物，對(duì)L-AI酶進(jìn)行定點(diǎn)突變，測(cè)定DNA序列，鑒定出第20位 Leu密碼子突變成Ala密碼子，并將其表達(dá)于大腸桿菌中，經(jīng)誘導(dǎo)即得L-阿拉伯糖異構(gòu)酶的 單突變體酶L20A;步驟為
(1)定點(diǎn)突變利用重疊延伸PCR技術(shù)，以表達(dá)載體pET-22b(+)-araA為原始模版，經(jīng)PCR1，PCR2 及PCR3，引入L20A突變點(diǎn)，定點(diǎn)突變的引物為
上游外側(cè)引物5' -TATATAAGCTTTCACCACGGCCGCGATGC-3'，
:5， -TTATCCATATGACCGACCTGCCCTATCCG-3，， :5' -CAGCATGCGTACGGCGAGGACGT-3，,下劃線為突變堿基， :5' -CGCCGTACGCATGCTGACTGC-3，,下劃線為突變堿基，
PCR1反應(yīng)體系為10XPCR buffer 5iiL，2mM dNTP 4 ii L， 10 ii M上游外側(cè)引物 liiL，10iiM反向突變引物liiL，模版DNA liiL，5U/mL taq plus 0. 5 y L，加入雙蒸水至 50ii L。 PCR2反應(yīng)體系為IOXPCR buffer 5iiL，2mM dNTP 4 ii L， 10 ii M下游外側(cè)引物 lyL，lOiiM正向突變引物liiL，模版DNA liiL，5U/mL taq plus 0. 5 y L，加入雙蒸水至 50ii L。PCR1、 PCR2擴(kuò)增條件為94t:預(yù)變性4min ;隨后進(jìn)行94。C變性lmin，56t:退火
lmin，72。C延伸lmin的35個(gè)循環(huán)；最后72。C保溫10min ;PCR1、 PCR2擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖電泳檢測(cè)，割膠回收純化； PCR3反應(yīng)體系為10XPCR buffer 10iiL，2mM dNTP 8 ii L， 10 ii M上游外側(cè)引物 1 ii L， 10 ii L下游外側(cè)引物1 y L， PCR1純化產(chǎn)物10 ii L， PCR2純化產(chǎn)物10 ii L， 5U/mL taq plus lyL，加入雙蒸水至100iiL;PCR3擴(kuò)增條件為94t:變性lmin，56t:退火lmin，72t:延伸5min ;隨后進(jìn)行94°C 變性lmin，56。C退火lmin，72。C延伸lmin的35個(gè)循環(huán)；最后72。C保溫10min。
(2)突變體載體質(zhì)粒的構(gòu)建 經(jīng)瓊脂糖電泳膠回收純化后的PCR3擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)限制性內(nèi)切酶Ndel和HindIII消 化后連接至載體pET-22b (+)，并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5 a感受態(tài)細(xì)胞中，在含50 y g/mL氨芐 青霉素的LB固體培養(yǎng)基培養(yǎng)過(guò)夜后，挑單克隆于含50 ii g/mL氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基 培養(yǎng)，后提取突變質(zhì)粒，將突變質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至表達(dá)宿主大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中，突 變質(zhì)粒經(jīng)測(cè)序鑒定為正確的突變；
(3)突變體的表達(dá) 挑取轉(zhuǎn)入表達(dá)宿主大腸桿菌BL21 (DE3)的單克隆于含50 y g/mL氨芐青霉素的LB 液體培養(yǎng)基中，37t:振蕩培養(yǎng)過(guò)夜，按2%接種量接種至含50 ii g/mL氨芐青霉素的LB液體 培養(yǎng)基中；37t:振蕩培養(yǎng)至0D6。。為0. 6-0. 8時(shí)，加入0. 4mM終濃度的異丙基_ P _D_硫代半 乳糖苷(IPTG)進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，并在3(TC繼續(xù)振蕩培養(yǎng)12h后，將發(fā)酵液于4t:、1000rpm離 心10min收集菌體；
(4)單突變體酶的純化 將步驟(3)收集的突變體菌體重懸于Tris-HCl緩沖液中，經(jīng)超聲波破碎后，于4t:、1000rpm離心20min去除細(xì)胞碎片，收集上清，經(jīng)強(qiáng)陰離子交換柱Q-S印harose進(jìn)行初 步純化，隨后收集活性部分再經(jīng)分子篩S印hodex S200純化，得到單突變體酶L20A的純酶 制品。 本發(fā)明的有益效果本發(fā)明構(gòu)建了一個(gè)有工業(yè)經(jīng)濟(jì)價(jià)值的單突變體酶L20A，實(shí)現(xiàn) 了 L-AI酶活力的提高，比野生型L-AI酶更有利于D-塔格糖的工業(yè)化生產(chǎn)。


圖1野生型L-AI酶和單突變體酶L20A的D-塔格糖轉(zhuǎn)化圖。A表示野生型L-AI 酶；B表示單突變體酶L20A。 下游外側(cè)引物
正向突變引物
反向突變引物
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1 :本例說(shuō)明單突變體酶L20A的制備。
(1)定點(diǎn)突變 利用重疊延伸PCR技術(shù)，以表達(dá)載體pET-22b(+)-araA為原始模版，經(jīng)PCR1，PCR2 及PCR3，引入L20A突變點(diǎn)，定點(diǎn)突變的引物為
上游外側(cè)引物5' -TATATAAGCTTTCACCACGGCCGCGATGC-3'，
:5， -TTATCCATATGACCGACCTGCCCTATCCG-3，， :5' -CAGCATGCGTACGGCGAGGACGT-3，(下劃線為突變堿基) :5' -CGCCGTACGCATGCTGACTGC-3，(下劃線為突變堿基)
PCR1反應(yīng)體系為10XPCR buffer 5iiL，2mM dNTP 4 ii L， 10 ii M上游外側(cè)引物 liiL，10iiM反向突變引物liiL，模版DNA liiL，5U/mL taq plus 0. 5 y L，加入雙蒸水至 50ii L。 PCR2反應(yīng)體系為10XPCR buffer 5iiL，2mM dNTP 4 ii L， 10 ii M下游外側(cè)引物 lyL，lOiiM正向突變引物liiL，模版DNA liiL，5U/mL taq plus 0. 5 y L，加入雙蒸水至 50ii L。PCR1、 PCR2擴(kuò)增條件為:94"C預(yù)變性4min ;隨后進(jìn)行94。C變性lmin，56。C退火
lmin，72。C延伸lmin的35個(gè)循環(huán)；最后72。C保溫10min。 PCR1、 PCR2擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖電泳檢測(cè)，并通過(guò)膠回收純化。PCR3反應(yīng)體系為10XPCR buffer 10iiL，2mM dNTP 8 ii L， 10 ii M上游外側(cè)引物
1 ii L， 10 ii L下游外側(cè)引物1 y L， PCR1純化產(chǎn)物10 ii L， PCR2純化產(chǎn)物10 ii L， 5U/mL taq
plus lyL，加入雙蒸水至100iiL。PCR3擴(kuò)增條件為94t:變性lmin，56t:退火lmin，72t:延伸5min ;隨后進(jìn)行94°C 變性lmin，56。C退火lmin，72。C延伸lmin的35個(gè)循環(huán)；最后72。C保溫10min。
(2)突變體載體質(zhì)粒的構(gòu)建 經(jīng)瓊脂糖電泳膠回收純化后的PCR3擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)限制性內(nèi)切酶Ndel和HindIII消 化后連接至載體pET-22b (+)，并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5 a感受態(tài)細(xì)胞中，在含50 y g/mL氨芐 青霉素的LB固體培養(yǎng)基培養(yǎng)過(guò)夜后，挑單克隆于含50 ii g/mL氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基 培養(yǎng)，后提取突變質(zhì)粒，將突變質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至表達(dá)宿主大腸桿菌BL21 (DE3)感受態(tài)細(xì)胞中，突 變質(zhì)粒經(jīng)測(cè)序鑒定為正確的突變。
(3)突變體的表達(dá) 挑取轉(zhuǎn)入表達(dá)宿主大腸桿菌BL21 (DE3)的單克隆于含50 y g/mL氨芐青霉素的LB 液體培養(yǎng)基中，37t:振蕩培養(yǎng)過(guò)夜，按2%接種量接種至含50 ii g/mL氨芐青霉素的LB液體 培養(yǎng)基中；37t:振蕩培養(yǎng)至0D6。。為0. 6-0. 8時(shí)，加入0. 4mM終濃度的IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)， 并在3(TC繼續(xù)振蕩培養(yǎng)12小時(shí)后，將發(fā)酵液于4t:、1000rpm離心10min收集菌體。
(4)突變體酶的純化 將表達(dá)的突變體菌體重懸于Tris-HCl緩沖液中，經(jīng)超聲波破碎后，于4 °C 、 1000rpm離心20min去除細(xì)胞碎片，收集上清，經(jīng)強(qiáng)陰離子交換柱Q-S印harose進(jìn)行初步純 化，隨后收集并濃縮活性部分再經(jīng)分子篩S印hodex S200純化，得到單突變體酶L20A的純 酶制品，經(jīng)SDS-PAGE檢測(cè)為單一條帶。
實(shí)施例2 :本例說(shuō)明酶活分析。 1)酶活的測(cè)定方法半胱氨酸-咔唑法測(cè)定L-AI的活力取適當(dāng)稀釋的酶液 20iiL，加入裝有980iiL預(yù)先用50mM Tris-HCL(p朋.0)配置的50mM D-半乳糖溶液中，在 75t:水浴中反應(yīng)10min后，于冰上終止反應(yīng)。取適當(dāng)稀釋的反應(yīng)液50 y L，加入950 y L去 離子水，加入200iiL 1.5X的鹽酸-半胱氨酸溶液，再加入6mL 75%的硫酸，混勻，然后加 入200 ii L 0. 12%的咔唑酒精溶液，立即混勻并于6(TC水浴保溫10min后冰浴終止反應(yīng)，在 560nm處測(cè)定吸光度。 一個(gè)酶活單位的定義為在該條件下每分鐘生成1 P mol D-塔格糖所 需的酶量。 2)酶活的比較將突變體酶L20A的純酶制品與野生型L-AI純酶制品相比，可以 發(fā)現(xiàn)突變體酶L20A的產(chǎn)D-塔格糖的能力明顯上升，其酶活為野生型的2. 2倍；而其產(chǎn) L-核酮糖的能力，與野生型相比基本保持不變，說(shuō)明該突變體酶L20A對(duì)催化生產(chǎn)D-塔格糖 的底物專一性有明顯改善作用。 實(shí)施例3 :利用突變體酶L20A轉(zhuǎn)化生產(chǎn)D-塔格糖。 在兩份50mM Tris-HCl配置的終濃度為50mM的D-半乳糖溶液中，每份中分別加 入一定量的野生型L-AI酶或突變體酶L20A，使反應(yīng)體系中酶活為0. 1U/mL，75t:水浴條件 下進(jìn)行轉(zhuǎn)化反應(yīng)，分別在1、2、4、6、8、10、12、24小時(shí)取樣，煮沸10min滅酶，1000rpm離心 10min，取上清后利用高效液相色譜(HPLC)測(cè)定生成的D-塔格糖含量。
HPLC進(jìn)行產(chǎn)物分析的色譜條件為Agilent 1200 HPLC色譜儀，色譜柱Shodex NH2P-504E，Shodex RI-101示差折光檢測(cè)器，流動(dòng)相為65% (V/V)乙腈水溶液，柱溫35°C ， 流速lmlVmin。 結(jié)果列于圖1 ，突變體酶L20A與野生型L-AI相比，其催化速度顯著提高，轉(zhuǎn)化率提 高了8%。突變體酶L20A反應(yīng)lh，其轉(zhuǎn)化率達(dá)50X ;反應(yīng)處，轉(zhuǎn)化率即達(dá)到最高61% ;而 野生型L-AI酶反應(yīng)lh，其轉(zhuǎn)化率只有20%;10h以后反應(yīng)才達(dá)到平衡，最高轉(zhuǎn)化率為53%。
權(quán)利要求
一種L-阿拉伯糖異構(gòu)酶的單突變體酶L20A，其特征在于將來(lái)源于解纖維熱酸菌(Acidothermus cellulolytics)ATCC 43068的L-阿拉伯糖異構(gòu)酶L-AI酶，進(jìn)行突變所得的單突變體酶L20A；其為L(zhǎng)-AI酶基因中第20位的亮氨酸Leu突變成了丙氨酸Ala，命名為L(zhǎng)20A；它相比于野生型L-AI酶具有更高的產(chǎn)D-塔格糖的能力。
2. 權(quán)利要求1所述的L-阿拉伯糖異構(gòu)酶的單突變體酶L20A的制備方法，其特征在于 根據(jù)ATCC 43068的L_AI酶基因序列，設(shè)計(jì)突變引物，對(duì)L_AI酶進(jìn)行定點(diǎn)突變，測(cè)定DNA序 列，鑒定出第20位Leu密碼子突變成Ala密碼子，并將其表達(dá)于大腸桿菌中，經(jīng)誘導(dǎo)即得 L-阿拉伯糖異構(gòu)酶的單突變體酶L20A ;步驟為(1) 定點(diǎn)突變利用重疊延伸PCR技術(shù)，以表達(dá)載體pET-22b(+)-araA為原始模版，經(jīng)PCR1， PCR2及PCR3，引入L20A突變點(diǎn)，定點(diǎn)突變的引物為上游外側(cè)引物5' -TATATAAGCTTTCACCACGGCCGCGATGC-3'，下游外側(cè)引物5' -TTATCCATATGACCGACCTGCCCTATCCG-3'，正向突變引物5' -CAGCATOeeTACGGCGAGGACGT-3'，下劃線為突變堿基，反向突變引物5' -CGCCGTAeeeATGCTGACTGC-3'，下劃線為突變堿基，PCR1反應(yīng)體系為10XPCR buffer 5iiL，2mM dNTP 4 ii L， 10 ii M上游外側(cè)引物1 ii L，10iiM反向突變引物liiL，模版DNA liiL，5U/mL taq plus 0. 5 y L，加入雙蒸水至50 y L ; PCR2反應(yīng)體系為10XPCR buffer 5iiL，2mM dNTP 4 ii L， 10 ii M下游外側(cè)引物1 ii L，10iiM正向突變引物liiL，模版DNA liiL，5U/mL taq plus 0. 5 y L，加入雙蒸水至50 y L ; PCR1、PCR2擴(kuò)增條件為94t:預(yù)變性4min ;隨后進(jìn)行94。C變性lmin， 56"退火lmin，72t:延伸lmin的35個(gè)循環(huán)；最后72"保溫10min ; PCR1、PCR2擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖電泳檢測(cè)，割膠回收純化；PCR3反應(yīng)體系為:10XPCR buffer 10iiL，2mM dNTP 8 ii L， 10 ii M上游外側(cè)引物1 ii L， 10 ii M下游外側(cè)引物1 y L， PCR1純化產(chǎn)物10 ii L， PCR2純化產(chǎn)物10 ii L， 5U/mL taq plus liiL，加入雙蒸水至100iiL ;PCR3擴(kuò)增條件為94t:變性lmin，56t:退火lmin，72t:延伸5min ;隨后進(jìn)行94"C變性 lmin，56t:退火lmin，72t:延伸lmin的35個(gè)循環(huán)；最后72"C保溫10min ;(2) 突變體載體質(zhì)粒的構(gòu)建經(jīng)瓊脂糖電泳膠回收純化后的PCR3擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)限制性內(nèi)切酶Ndel和HindiII消化 后連接至載體pET-22b (+)，并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5 a感受態(tài)細(xì)胞中，在含50 y g/mL氨芐青 霉素的LB固體培養(yǎng)基培養(yǎng)過(guò)夜后，挑單克隆于含50 ii g/mL氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基培 養(yǎng)，后提取突變質(zhì)粒，將突變質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至表達(dá)宿主大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中，突變 質(zhì)粒經(jīng)測(cè)序鑒定為正確的突變；(3) 突變體的表達(dá)挑取轉(zhuǎn)入表達(dá)宿主大腸桿菌BL21 (DE3)的單克隆于含50 y g/mL氨芐青霉素的LB液體 培養(yǎng)基中，37t:振蕩培養(yǎng)過(guò)夜，按2%接種量接種至含50 ii g/mL氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng) 基中；37t:振蕩培養(yǎng)至0D6。。為0. 6-0. 8時(shí)，加入0. 4mM終濃度的異丙基_ P _D_硫代半乳糖 苷IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，并在3(TC繼續(xù)振蕩培養(yǎng)12h后，將發(fā)酵液于4°C 、 1000rpm離心10min收集菌體；(4)單突變體酶的純化將步驟(3)收集的突變體菌體重懸于Tris-HCl緩沖液中，經(jīng)超聲波破碎后，于4t:、 lOOOrpm離心20min去除細(xì)胞碎片，收集上清，經(jīng)強(qiáng)陰離子交換柱Q-S印harose進(jìn)行初步純 化，隨后收集活性部分再經(jīng)分子篩S印hodex S200純化，得到單突變體酶L20A的純酶制品。
全文摘要
具有高產(chǎn)D-塔格糖能力的L-阿拉伯糖異構(gòu)酶的突變體酶L20A及其突變方法，屬于生物工程、基因工程和酶工程技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明通過(guò)基因突變，將來(lái)源于解纖維熱酸菌(Acidothermus cellulolytics)ATCC 43068的L-阿拉伯糖異構(gòu)酶(簡(jiǎn)稱L-AI酶)的20位氨基酸Leu替換為Ala，獲得單突變體酶L20A，它的D-塔格糖的生產(chǎn)能力較野生型L-AI酶有顯著提高。
文檔編號(hào)C12P19/02GK101768581SQ20101011233
公開(kāi)日2010年7月7日 申請(qǐng)日期2010年2月20日 優(yōu)先權(quán)日2010年2月20日
發(fā)明者江波, 沐萬(wàn)孟, 程麗芳 申請(qǐng)人:江南大學(xué)