專(zhuān)利名稱(chēng)：利用微生物碳酸酐酶催化制備碳酸鈣的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種碳酸鈣的制備方法，特別是一種利用微生物碳酸酐酶催化制備碳 酸鈣的方法。
背景技術(shù)：
碳酸鈣是一種重要的無(wú)機(jī)礦物，是地球中最豐富的礦產(chǎn)資源。碳酸鈣不僅廣泛應(yīng) 用于橡膠、塑料、涂料行業(yè)，還可應(yīng)用于油墨、造紙、電纜、醫(yī)藥、日用化工等行業(yè)，并且在除 硫和污水處理等環(huán)保領(lǐng)域也得到廣泛應(yīng)用。此外，有研究表明，碳酸鈣在石質(zhì)景觀和石刻文 物的保護(hù)與修復(fù)以及重大建筑工程和重要?dú)v史建筑物裂縫的修補(bǔ)方面能發(fā)揮重要作用。目前，碳酸鈣的制備主要有兩種方法，即化學(xué)加工法和機(jī)械方法?；瘜W(xué)加工法主要 生產(chǎn)輕質(zhì)碳酸鈣，包括碳化法、純堿氯化鈣法、苛化堿法、聯(lián)鈣法和蘇爾維(Solvay)法等， 這些方法的主要缺點(diǎn)是能耗大，容易引起環(huán)境污染，造成生態(tài)環(huán)境破壞。機(jī)械方法主要生產(chǎn) 重質(zhì)碳酸鈣，生產(chǎn)工藝有干法和濕法兩種，主要缺點(diǎn)是能耗大、粉塵多、質(zhì)量低。有研究和專(zhuān)利表明，利用微生物沉積制備碳酸鈣也是一種有效的方法，如錢(qián)春香 等在中國(guó)專(zhuān)利(申請(qǐng)?zhí)?00510094744. 5)中提出利用巴氏芽孢桿菌(Bacillus pasteurii) 產(chǎn)生脲酶，分解培養(yǎng)基中的尿素致使溶液中PH升高、CO/—濃度增加，從而誘導(dǎo)碳酸鈣的沉 積。Mocks-Fischer等利用巴氏芽孢桿菌在沙中誘導(dǎo)出碳酸鈣的沉積。！^erris等在不同 溫度的人工地下水中利用巴氏芽孢桿菌的尿素水解作用誘導(dǎo)了碳酸鈣的沉積。利用微生物 沉積制備碳酸鈣的方法，具有資源豐富、工藝簡(jiǎn)單、環(huán)境清潔、成本低廉等優(yōu)點(diǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種利用微生物碳酸酐酶的催化作用加速沉積制備碳酸鈣的方法。本發(fā)明利用微生物產(chǎn)生的碳酸酐酶的催化作用沉積制備碳酸鈣，不僅具有前述微 生物制備碳酸鈣方法的諸多優(yōu)點(diǎn)，而且由于碳酸酐酶能催化CO2和HCO3_的相#轉(zhuǎn)化反應(yīng)， 從而能加速碳酸鈣的沉積。當(dāng)HC03_是可溶性無(wú)機(jī)碳(DIC)的來(lái)源時(shí)，整個(gè)反應(yīng)如式(1) 式(2)所示HCCV+H+ — H20+C02 (1)Ca2++2HC(V — CaC03+H++HC03_ — CaCO3 丨 +Η20+ω2 (2)當(dāng)CO2是^^的來(lái)源時(shí)，整個(gè)反應(yīng)如式(3) 式(4)所示C02+H20 — HCO3^H+ (3)Ca2++HC(V — CaCO3 I +H+(4)本發(fā)明利用微生物產(chǎn)生的碳酸酐酶，分別通過(guò)兩種含有鈣離子溶液的反應(yīng)體系來(lái) 實(shí)現(xiàn)加速沉積制備碳酸鈣的目的。微生物碳酸酐酶的制備方法如下(1)胞外碳酸酐酶采用如下制備方法在添加 10 μ M硫酸鋅的培養(yǎng)基中接種微生物，30°C下振蕩培養(yǎng)18 M小時(shí)，培養(yǎng)液冷凍離心，收集上清液，菌體冷藏備用。上清液用飽和硫酸銨鹽析后離心取蛋白沉淀，將蛋白沉淀溶解于 磷酸鹽緩沖液中過(guò)GlOO凝膠柱，收集酶活性高的部分，透析，再過(guò)DEAE-纖維素離子交換 柱，收集酶活性高的部分，透析，獲得胞外碳酸酐酶溶液。( 胞內(nèi)碳酸酐酶采用如下制備 方法取前述的菌體，加入磷酸鹽緩沖液，在冰浴條件下研磨后冷凍離心，取上清液，隨后步 驟同前面所述的胞外碳酸酐酶的制備方法，從而獲得胞內(nèi)碳酸酐酶溶液。( 混合碳酸酐 酶采用如下制備方法在添加10 μ M硫酸鋅的培養(yǎng)基中接種微生物，30°C下振蕩培養(yǎng)18 24小時(shí)，培養(yǎng)液在0 4°C用閃式提取器或球磨機(jī)進(jìn)行菌體破碎后冷凍離心，取上清液，將 上清液用飽和硫酸銨鹽析，隨后步驟同前面所述的胞外碳酸酐酶的制備方法。反應(yīng)體系(1)是含有鈣離子和碳酸氫根離子溶液的液體體系，向該液體體系中加 入微生物碳酸酐酶，酶濃度大于1. 5U/ml，初始PH控制在5 10，在室溫下振蕩反應(yīng)，將產(chǎn) 生的沉淀取出，過(guò)濾、洗滌、烘干，得到碳酸鈣。反應(yīng)體系( 是含有鈣離子溶液且利用碳酸 氫銨溶液釋放(X)2的氣體擴(kuò)散體系，即采用密閉反應(yīng)裝置，該裝置分為上下兩層，中間有可 透氣的隔板為界，下層裝有碳酸氫銨溶液；上層放置裝有鈣離子溶液的容器，向鈣離子溶液 中加入微生物碳酸酐酶，酶濃度大于1. 5U/ml。整個(gè)密閉反應(yīng)裝置放置于振蕩器上振蕩反 應(yīng)，將產(chǎn)生的沉淀取出，過(guò)濾、洗滌、烘干，得到碳酸鈣。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明不僅充分利用了微生物資源，而且利用了酶催化反應(yīng)的 專(zhuān)一性、高效性特點(diǎn)，加速沉積制備碳酸鈣，具有資源豐富、工藝簡(jiǎn)單、環(huán)境清潔、成本低廉、 高效快速等優(yōu)點(diǎn)。所沉積制備的碳酸鈣純度高，為方解石晶型碳酸鈣，不僅可以作為工業(yè)上 的填料，還可用于建筑工程和建筑物以及石質(zhì)景觀和石刻文物裂縫的修補(bǔ)。


圖1是在含有氯化鈣和碳酸氫鈉溶液的液體體系中微生物胞外碳酸酐酶催化制 備碳酸鈣的X射線(xiàn)衍射分析圖譜。圖2是在含有氯化鈣和碳酸氫鈉溶液的液體體系中微生物胞外碳酸酐酶催化制 備碳酸鈣在掃描電子顯微鏡下的顆粒形貌。其中，(a)碳酸鈣顆粒總體分布；(b)碳酸鈣顆 粒微觀形貌。圖3是在含有氯化鈣和碳酸氫鈉溶液的液體體系中微生物胞內(nèi)碳酸酐酶催化制 備碳酸鈣的X射線(xiàn)衍射分析圖譜圖4是在含有氯化鈣和碳酸氫鈉溶液的液體體系中微生物胞內(nèi)碳酸酐酶催化制 備碳酸鈣在掃描電子顯微鏡下的顆粒形貌。其中，(a)碳酸鈣顆?？傮w分布；(b)碳酸鈣顆 粒微觀形貌。圖5是在氣體擴(kuò)散體系中微生物胞外碳酸酐酶催化制備碳酸鈣的X射線(xiàn)衍射分析 圖譜。圖6是在氣體擴(kuò)散體系中微生物胞外碳酸酐酶沉積碳酸鈣在掃描電子顯微鏡下 的顆粒形貌。其中，(a)碳酸鈣顆粒總體分布；(b)碳酸鈣顆粒微觀形貌。圖7是在氣體擴(kuò)散體系中微生物胞內(nèi)碳酸酐酶催化制備碳酸鈣的X射線(xiàn)衍射分析 圖譜。圖8是在氣體擴(kuò)散體系中微生物胞內(nèi)碳酸酐酶催化制備碳酸鈣在掃描電子顯微 鏡下的顆粒形貌。其中，(a)碳酸鈣顆?？傮w分布；(b)碳酸鈣顆粒微觀形貌。
圖9是在含有氯化鈣和碳酸氫鈉溶液的液體體系中混合微生物碳酸酐酶催化制 備碳酸鈣在掃描電子顯微鏡下的顆粒形貌。其中，(a)碳酸鈣顆?？傮w分布；(b)碳酸鈣顆 粒微觀形貌。圖10是在氣體擴(kuò)散體系中混合微生物碳酸酐酶催化制備碳酸鈣在掃描電子顯微 鏡下的顆粒形貌。其中，(a)碳酸鈣顆?？傮w分布；(b)碳酸鈣顆粒微觀形貌。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1微生物胞外碳酸酐酶的制備及其在含有氯化鈣和碳酸氫鈉溶液的液體體系中 催化制備碳酸鈣。在添加ΙΟμΜ硫酸鋅的細(xì)菌培養(yǎng)基中接種蠟樣芽孢桿菌(Bacillus pasteurii)，在30°C、120r/min下培養(yǎng)M小時(shí)，培養(yǎng)液5000r/min冷凍離心15分鐘后收集 上清液，菌體冷藏備用，上清液用70%飽和度的硫酸銨鹽析12小時(shí)，離心取蛋白沉淀，蛋白 沉淀溶解于0. 2mol/L pH8. 0的磷酸鹽緩沖液中，通過(guò)GlOO凝膠柱，用0. 2mol/L pH8. 0的磷 酸鹽緩沖液洗脫，收集酶活性高的部分，置于透析袋透析M小時(shí)后將透析液通過(guò)DEAE-纖 維素離子交換柱，先用0. 2mol/L pH8. 0的磷酸鹽緩沖液平衡，再用0. 2mol/L pH6. 0的磷酸 鹽緩沖液洗脫，收集酶活性高的部分，置于透析袋透析M小時(shí)后獲得胞外碳酸酐酶溶液， 檢測(cè)其酶活性為8. OU/mL。配制碳酸氫鈉和氯化鈣溶液置于三角瓶中，碳酸氫鈉和氯化鈣的 濃度均為25. 2mmol/L,加入制備的胞外碳酸酐酶溶液，使酶濃度達(dá)到4. OU/mL,初始pH控制 在6. 5，在20°C下振蕩反應(yīng)M小時(shí)后將產(chǎn)生的沉淀取出，過(guò)濾、洗滌、烘干，得到碳酸鈣。實(shí)施例2微生物胞內(nèi)碳酸酐酶的制備及其在含有氯化鈣和碳酸氫鈉溶液的液體體系中催 化制備碳酸鈣。將實(shí)施例1得到的菌體，加入0.2mol/L pH8. O的磷酸鹽緩沖液，使菌體濃 度為10%，在冰浴條件下研磨30分鐘，5000rpm下冷凍離心15分鐘，取上清液，將上清液用 70%飽和度的硫酸銨鹽析12小時(shí)，隨后步驟同實(shí)施例1中所述的胞外碳酸酐酶的制備方 法，獲得胞內(nèi)碳酸酐酶溶液，檢測(cè)其酶活性為8. 2U/mL。配制碳酸氫鈉和氯化鈣溶液置于三 角瓶中，碳酸氫鈉和氯化鈣的濃度均為25. 2mmol/L，加入制備的胞內(nèi)碳酸酐酶溶液，使酶濃 度達(dá)到2. OU/mL,初始pH控制在6. 5，在20°C下振蕩反應(yīng)M小時(shí)后將產(chǎn)生的沉淀取出，過(guò) 濾、洗滌、烘干，得到碳酸鈣。實(shí)施例3微生物胞外碳酸酐酶在氣體擴(kuò)散體系中催化制備碳酸鈣。胞外碳酸酐酶的制備方 法同實(shí)施例1，檢測(cè)其酶活性為8. OU/mL。在密閉的玻璃干燥器中，上層放置50mL小燒杯， 里面裝有25. Ommol/L氯化鈣溶液，其中添加胞外碳酸酐酶，酶濃度為1. 8U/mL，初始pH控制 在6. 5;中間有可透氣的隔板為界；下層裝有400mL 0. lmol/L的碳酸氫銨溶液。將整個(gè)干 燥器置于20°C、lOOr/min下振蕩反應(yīng)M小時(shí)，將產(chǎn)生的沉淀取出，過(guò)濾、洗滌、烘干，得到碳 酸鈣。實(shí)施例4微生物胞內(nèi)碳酸酐酶在氣體擴(kuò)散體系中催化制備碳酸鈣。胞內(nèi)碳酸酐酶的制備方 法同實(shí)施例2，檢測(cè)其酶活性為8. 2U/mL。在密閉的玻璃干燥器中，上層放置50mL小燒杯， 里面裝有25. Ommol/L氯化鈣溶液，其中添加胞內(nèi)碳酸酐酶，酶濃度為2. 2U/mL，初始pH控制在6.5 ；中間有可透氣的隔板為界；下層裝有400mL 0. lmol/L的碳酸氫銨溶液。將整個(gè)干 燥器置于20°C、lOOr/min下振蕩反應(yīng)M小時(shí)，將產(chǎn)生的沉淀取出，過(guò)濾、洗滌、烘干，得到碳酸鈣。實(shí)施例5混合微生物碳酸酐酶的制備及其在含有氯化鈣和碳酸氫鈉溶液的液體體系中催 化制備碳酸鈣。將實(shí)施例1中得到的含有菌體的培養(yǎng)液在閃式提取器中進(jìn)行菌體破碎， 5000rpm下冷凍離心15分鐘，取上清液，后續(xù)步驟同實(shí)施例1中所述的胞外碳酸酐酶的制備 方法，獲得混合碳酸酐酶溶液，檢測(cè)其酶活性為8. 5U/mL。配制碳酸氫鈉和氯化鈣溶液置于 三角瓶中，碳酸氫鈉和氯化鈣的濃度均為25. 2mmol/L，加入制備的混合微生物碳酸酐酶溶 液，使酶濃度達(dá)到3. OU/mL,初始pH控制在6. 5，20°C下振蕩反應(yīng)M小時(shí)后將產(chǎn)生的沉淀取 出，過(guò)濾、洗滌、烘干，得到碳酸鈣。實(shí)施例6混合微生物碳酸酐酶在氣體擴(kuò)散體系中催化制備碳酸鈣?；旌衔⑸锾妓狒傅?制備方法同實(shí)施例5，檢測(cè)其酶活性為8. 5U/mL。在密閉的玻璃干燥器中，上層放置50mL小 燒杯，里面裝有25mmol/L氯化鈣溶液，其中添加混合微生物碳酸酐酶，酶濃度為2. OU/mL, 初始pH控制在6. 5 ；中間有可透氣的隔板為界；下層裝有400mL 0. lmol/L的碳酸氫銨溶 液。整個(gè)干燥器置于20°C、100r/min下振蕩反應(yīng)M小時(shí)，將產(chǎn)生的沉淀取出，過(guò)濾、洗滌、 烘干，得到碳酸鈣。
權(quán)利要求
1.一種利用微生物碳酸酐酶催化制備碳酸鈣的方法，其特征在于將微生物碳酸酐酶加 入含有鈣離子溶液的反應(yīng)體系中，在室溫下進(jìn)行振蕩反應(yīng)，初始PH控制在5 10，將產(chǎn)生的 沉淀取出，過(guò)濾、洗滌、烘干，得到碳酸鈣。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用微生物碳酸酐酶催化制備碳酸鈣的方法，其特征在于所 述的碳酸酐酶可以是胞外碳酸酐酶、胞內(nèi)碳酸酐酶或胞內(nèi)胞外碳酸酐酶的混合物。
3.根據(jù)權(quán)利要求1和2所述的利用微生物碳酸酐酶催化制備碳酸鈣的方法，其特征在 于碳酸酐酶的制備方法如下(1)胞外碳酸酐酶采用如下制備方法在添加10 μ M硫酸鋅的 培養(yǎng)基中接種微生物，在30°c下振蕩培養(yǎng)18 M小時(shí)，培養(yǎng)液冷凍離心，收集上清液，菌體 冷藏備用，上清液用飽和硫酸銨鹽析后離心取蛋白沉淀，蛋白沉淀溶解于磷酸鹽緩沖液中， 過(guò)GlOO凝膠柱，收集酶活性高的部分，透析，透析液過(guò)DEAE-纖維素離子交換柱，收集酶活 性高的部分，再透析獲得胞外碳酸酐酶溶液；( 胞內(nèi)碳酸酐酶采用如下制備方法取前述 的菌體，加入磷酸鹽緩沖液，在冰浴條件下研磨后冷凍離心，取上清液，隨后步驟同前面所 述的胞外碳酸酐酶的制備方法，從而獲得胞內(nèi)碳酸酐酶溶液；C3)混合碳酸酐酶采用如下 制備方法在添加10 μ M硫酸鋅的培養(yǎng)基中接種微生物，在30°C下振蕩培養(yǎng)18 M小時(shí)， 培養(yǎng)液在0 4°C用閃式提取器或球磨機(jī)進(jìn)行菌體破碎，冷凍離心，取上清液，將上清液用 飽和硫酸銨鹽析，隨后步驟同前面所述的胞外碳酸酐酶的制備方法。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的利用微生物碳酸酐酶催化制備碳酸鈣的方法，其特征在于， 所述的微生物是蠟樣芽孢桿菌。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的利用微生物碳酸酐酶催化制備碳酸鈣的方法，其特征在 于所述的反應(yīng)體系可以為(1)含有鈣離子和碳酸氫根離子溶液的液體體系或(2)含有鈣離 子溶液且利用碳酸氫銨溶液釋放(X)2的氣體擴(kuò)散體系。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的利用微生物碳酸酐酶催化制備碳酸鈣的方法，其特征在于所 述的反應(yīng)體系可以為(1)含有鈣離子和碳酸氫根離子溶液的液體體系或(2)含有鈣離子溶 液且利用碳酸氫銨溶液釋放(X)2的氣體擴(kuò)散體系。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的利用微生物碳酸酐酶催化制備碳酸鈣的方法，其特征在于所 述的反應(yīng)體系可以為(1)含有鈣離子和碳酸氫根離子溶液的液體體系或(2)含有鈣離子溶 液且利用碳酸氫銨溶液釋放(X)2的氣體擴(kuò)散體系。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種利用微生物碳酸酐酶催化制備碳酸鈣的方法，在含有鈣離子和碳酸氫根離子溶液的液體體系或含有鈣離子溶液且利用碳酸氫銨溶液釋放CO2的氣體擴(kuò)散體系中，添加從微生物培養(yǎng)物中提取制備的碳酸酐酶，在室溫下進(jìn)行振蕩反應(yīng)，初始pH控制在5～10，將產(chǎn)生的沉淀取出，過(guò)濾、洗滌、烘干，得到碳酸鈣。本發(fā)明不僅充分利用了微生物資源，而且利用了酶催化反應(yīng)的專(zhuān)一性、高效性特點(diǎn)，加速沉積制備碳酸鈣，具有資源豐富、工藝簡(jiǎn)單、環(huán)境清潔、成本低廉、高效快速等優(yōu)點(diǎn)。所沉積制備的碳酸鈣純度高，為方解石晶型碳酸鈣，不僅可以作為工業(yè)上的填料，還可用于建筑工程和建筑物以及石質(zhì)景觀和石刻文物裂縫的修補(bǔ)。
文檔編號(hào)C12P3/00GK102121033SQ201010114139
公開(kāi)日2011年7月13日 申請(qǐng)日期2010年2月10日 優(yōu)先權(quán)日2010年2月10日
發(fā)明者余龍江, 劉麗萍, 敖明章, 曹龍, 李為, 栗茂騰, 陳薇珊 申請(qǐng)人:華中科技大學(xué)