專利名稱：一株植物內(nèi)生枯草芽胞桿菌tr21及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一株對(duì)植物病原真菌具有廣譜拮抗能力的枯草芽胞桿菌TR21(后續(xù)簡(jiǎn)稱TR21)，具體地說(shuō)是提供枯草芽胞桿菌TR21 (Bacillus subtilis str. TR21)菌株 (CCTCC No :M 2010019)及其對(duì)植物病原真菌的生長(zhǎng)抑制作用，尤其在香蕉枯萎病和西芹黃萎病生物防治方面的能力，它屬于生物農(nóng)藥、抗病微生物肥料的范疇。
背景技術(shù)：
我國(guó)水果、蔬菜等園藝作物因病害引起的損失非常嚴(yán)重，根據(jù)1984-1986全國(guó)園林植物病蟲害普查的結(jié)果，在1256種園林植物上發(fā)現(xiàn)植物病害5508種，平均每種植物上 4. 4種，蔬菜、花卉、果樹(shù)等園藝作物的病害發(fā)生遠(yuǎn)比大宗禾谷類農(nóng)作物嚴(yán)重。據(jù)我國(guó)農(nóng)業(yè)部全國(guó)農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心統(tǒng)計(jì)，我國(guó)農(nóng)作物每年因病蟲草鼠造成大量損失，其中水果、蔬菜損失達(dá)25%以上，遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于糧食(10%)和棉花(15%-20%)。尤其是近年來(lái)，隨著農(nóng)村經(jīng)濟(jì)的發(fā)展和農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)的調(diào)整，越來(lái)越多的農(nóng)民從事園藝作物的生產(chǎn)和栽培，由于在有限的土地上長(zhǎng)期輪作，土傳病害、維管束病害嚴(yán)重影響了農(nóng)業(yè)的健康發(fā)展。
隨著農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展戰(zhàn)略的實(shí)施，人們逐漸重視化學(xué)農(nóng)藥的危險(xiǎn)和危害，因此，符合環(huán)保、健康、高效、安全、環(huán)境友好的生物農(nóng)藥成為當(dāng)前生態(tài)農(nóng)業(yè)研究的主題。目前國(guó)際上生物農(nóng)藥產(chǎn)品已超過(guò)100多種，但90%以上是微生物殺蟲劑。有專家預(yù)測(cè)第二個(gè)重要的商業(yè)化生物農(nóng)藥將是微生物殺菌劑。
枯草芽胞桿菌是一種廣泛分布于各種不同生活環(huán)境中的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌，可以產(chǎn)生內(nèi)生芽胞，在土壤和植物的表面普遍存在，同時(shí)還是植物體內(nèi)常見(jiàn)的一種內(nèi)生菌，對(duì)人畜無(wú)害，不污染環(huán)境。它生長(zhǎng)速度快、營(yíng)養(yǎng)需求簡(jiǎn)單，在植物的表面易于存活、定殖和與繁殖， 而且生產(chǎn)枯草芽胞桿菌制劑的工藝簡(jiǎn)單，制劑穩(wěn)定，施用方面，存儲(chǔ)期長(zhǎng)，是一種理想的生防微生物。
枯草芽胞桿菌主要通過(guò)五種不同途徑發(fā)揮效果。首先，枯草芽胞桿菌能夠在寄主植物上定殖，易有金研究了枯草芽胞桿菌B-001菌株通過(guò)自然孔口和傷口入侵寄主植物定殖的問(wèn)題，穆常青等研究了枯草芽胞桿菌B-332在水稻上的定殖與防治稻瘟病的關(guān)系。其次，枯草芽胞桿菌可以通過(guò)非核糖體途徑產(chǎn)生抗菌物質(zhì)，如脂肽類抗生素、多肽類抗生素等，如伊枯草菌素家族、表面活性素、芬枯草菌素等以及一些結(jié)果未知的環(huán)肽抗生素。再次， 枯草芽胞桿菌還能夠吸附在病原菌的菌絲上，并隨著菌絲的生長(zhǎng)而生長(zhǎng)，產(chǎn)生溶菌物質(zhì)，造成真菌原生質(zhì)泄露后，使真菌的細(xì)胞壁或細(xì)胞膜破裂，致使細(xì)胞出現(xiàn)穿孔、畸形等現(xiàn)象。林福呈從甘蔗根圍分離的枯草芽孢桿菌S9對(duì)立枯絲核菌產(chǎn)生溶菌作用，高學(xué)文等對(duì)枯草芽孢桿菌B2菌株產(chǎn)生的胞外物質(zhì)進(jìn)行了分離純化，獲得的抗菌物質(zhì)可以使小麥赤霉病菌的分生孢子發(fā)生畸變從而抑制其萌發(fā)。再次，枯草芽胞桿菌可以通過(guò)誘導(dǎo)植物產(chǎn)生系統(tǒng)抗性來(lái)發(fā)揮作用，李德全等對(duì)枯草芽胞桿菌Bs-916進(jìn)行誘變，并發(fā)現(xiàn)Bs-916及其突變株分泌的活性物質(zhì)對(duì)水稻具有誘導(dǎo)抗性作用，使得水稻體內(nèi)過(guò)氧化物酶等抗病酶活增強(qiáng)。再次，枯草芽胞桿菌可以通過(guò)促進(jìn)植物生長(zhǎng)來(lái)達(dá)到抗病的作用，如蔡學(xué)清等發(fā)現(xiàn)植物內(nèi)生枯草芽胞桿菌BS-2對(duì)小白菜具有促生作用，并表現(xiàn)出抗病能力。
根據(jù)姜莉莉等的綜述，美國(guó)已有4株枯草芽胞桿菌生防菌株(QST713、MB1600、 GB03和FZB24)得到EPA商品化或有限商品化生產(chǎn)應(yīng)用許可。其中QST713商品名Serenade 得到食用作物病害應(yīng)用的審批和認(rèn)可，通過(guò)葉面施用能夠防治蔬菜、櫻桃、番茄、葡萄和胡桃多種作物的白粉病、爛根病、霜霉病、疫病、灰霉病等細(xì)菌和真菌引起的病害。GB03商品名Kodiak，可直接施用于土壤或者拌種用于預(yù)防棉花、豆類和花生等由鐮刀菌、曲霉菌、 鏈格孢屬和絲核菌屬所引起的根部和種子的真菌病害。MB1600商品名Subtilex，用于防治灰霉病、白粉病及由絲核菌屬、鐮刀菌屬、曲霉屬引起的葉部和根部病害，F(xiàn)ZB24商品名 TaegroTM，施用于溫室或室內(nèi)栽培樹(shù)苗、灌木和裝飾植物根部可防治鐮刀菌和絲核菌引起的根腐病和枯萎病，也可以用于防治番茄晚疫病、灰霉病、小麥白粉病和植物輪枝菌，還可以作為增產(chǎn)促生劑。我國(guó)現(xiàn)已開(kāi)發(fā)成功并投入使用的枯草芽胞桿菌商品制劑有百抗、麥豐寧、紋曲寧、亞寶等。百抗的有效成分是枯草芽孢桿菌B908，作用機(jī)制是營(yíng)養(yǎng)競(jìng)爭(zhēng)、位點(diǎn)占領(lǐng)，對(duì)煙草、三七、花卉、小麥、白菜等易患土壤病害的作物具有很好的防治效果，對(duì)水稻紋枯病的防治效果達(dá)70%以上。麥豐寧是利用枯草芽胞桿菌B3菌株制成的活體生物殺菌劑， 其防病機(jī)制主要產(chǎn)生抗菌物質(zhì)。
在利用枯草芽胞桿菌防治香蕉枯萎病方面也有相關(guān)的工作開(kāi)展，但仍然處于菌株篩選、鑒定和室內(nèi)平板拮抗活性測(cè)定，少數(shù)開(kāi)展了盆栽實(shí)驗(yàn)，還沒(méi)有大田試驗(yàn)的報(bào)道。孫正祥和王振中從香蕉根際土壤中分離篩選出一株對(duì)香蕉枯萎病有防治效果的地衣芽孢桿菌 C4，在溫室中表現(xiàn)出良好的防效。殷曉敏等從香蕉假莖內(nèi)分離獲得一株編號(hào)為B215的枯草芽胞桿菌，在平板上對(duì)香蕉枯萎病和其它的幾種香蕉病原菌菌絲生長(zhǎng)和孢子萌發(fā)具有抑制效果。付業(yè)勤等對(duì)香蕉內(nèi)生枯草芽胞桿菌BEB2在不同溫度、pH值和培養(yǎng)基下發(fā)酵液對(duì)香蕉枯萎病生長(zhǎng)的抑制能力，并在人工接種的條件下，研究了 2個(gè)月內(nèi)BEB2對(duì)香蕉枯萎病4 號(hào)生理小種的盆栽防效，先接種BEB2的防效達(dá)到98%。孫正祥等從香蕉根際土壤中分離獲得一株枯草芽胞桿菌S-1，對(duì)包括香蕉枯萎病、番茄枯萎病等一批病原真菌具有廣譜拮抗活性，并且測(cè)定該菌株最適的PH值為7. 0 8. 0，最適的培養(yǎng)溫度26 30°C，最適的培養(yǎng)基為PYTG或PDA。黃小光等測(cè)定了枯草芽胞桿菌、熒光假單胞菌等生防菌對(duì)香蕉枯萎病菌菌絲的抑制效果。楊秀娟等利用利福平抗性芽胞桿菌T2WF和W10菌株開(kāi)展了芽胞桿菌在香蕉體內(nèi)和根際定殖的研究。在上述所有涉及香蕉枯萎病生物防治的枯草芽胞桿菌菌株中， 尚無(wú)菌株開(kāi)展了大田防治試驗(yàn)，并缺乏大田防治試驗(yàn)的防效。
另外，枯草芽胞桿菌能夠產(chǎn)生各種酶類、抗生素、表面活性劑，被廣泛應(yīng)用與商業(yè)、工業(yè)生產(chǎn)和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中(Fritze，2004)，在植物病害生物防治中也應(yīng)用廣泛(趙達(dá)等，2007 ；姜莉莉等，2009)?？莶菅堪麠U菌組的種類包括Bacillus subtilis subsp. subtilis(Smithet al. , 1964 ；Nakamura et al. ,1999), B. lichenifromis(Skerman et al.，1980)，B. atrophaeus(Nakamura,1989)，B. mojavensis(Robert et al.，1994)， B.vallismortis(Roberts et al.,1996), B.subtilis subsp. spizizenii(Nakamura et al. ,1999), B. sonorensis(Palmisano et al. ,2001), B. subtilis subsp. inaquosorum(Rooney et al.，2009)，這些種類的親緣關(guān)系很近，可以通過(guò)脂肪酸組成分析、DNA-DNA雜交分析以及限制性酶切分析區(qū)分開(kāi)來(lái)，但很難通過(guò)表型特征分析區(qū)分開(kāi)來(lái) (Fritze, 2004, Wang, et al.，2007)，雖然16S rDNA/RNA基因序列廣泛應(yīng)用于細(xì)菌鑒定或構(gòu)建細(xì)菌的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系，但在親緣關(guān)系很近的分類類群間，由于序列間的相似度太高而失效(Christensen et al.，1998)，16S rDNA序列不能有效區(qū)分枯草芽孢桿菌組的菌種。
Chun and Bae (2000)用編碼DNA促旋酶(gyrase) A亞基的基因gyrA分析了枯草芽胞桿菌和相近種類的進(jìn)化關(guān)系，發(fā)現(xiàn)基于gyrA基因部分序列的系統(tǒng)進(jìn)化分析，可以區(qū)分枯草芽胞桿菌組中的近緣種。Rooney等(2009)測(cè)定了大量枯草芽孢桿菌菌株的gyrA基因序列，并利用gyrA基因細(xì)致的研究了枯草芽孢桿菌種間的復(fù)雜性，發(fā)現(xiàn)枯草芽胞桿菌的不同菌株存在很大的差異，可以基于gyrA分成不同的群，并根據(jù)gyrA基因開(kāi)展的系統(tǒng)進(jìn)化分析，發(fā)現(xiàn)和描述了枯草芽孢桿菌的一個(gè)新的亞種B. subtilis subsp. inaquosorum,到2009 年為止，枯草芽胞桿菌以確定了 3個(gè)亞種。
gyrB基因的分子進(jìn)化速率大于16S rRNA基因，因而gyrB基因也非常適合近緣種的鑒定，目前已經(jīng)在假單胞菌屬Pseudomonas (Yamamoto&Harayama, 1998)、不動(dòng)桿菌屬 Acinetobacter(Yamomoto&Harayama, 1996 ；Yamamoto et al.，1999)、分枝桿菌屬 Mycobacterium(Kasai et al. , 2000 ；Niemann et al. , 2000)、沙門氏菌屬 Salmonella、志賀氏菌屬 Shigella、大腸桿菌 Escherichia coli (Fukushima et al.，2002)、氣單胞菌屬 Aeromonas (Yafiezet al.，2003 ；侯曉麗等，2006)、擬諾卡氏菌屬 Nocardiopsis (楊玲玲等， 2007)、炭疽桿菌-蠟狀芽胞桿菌_蘇云金芽胞桿菌組B. anthracis-cereus-thuringiensi sgroup (La Due et al.，2004)、枯草芽胞桿菌組 B. subtilis group (Wang et al. ,2007), B. amyloliquefaciens 近緣種 B. velezensis(wang et al. ,2008)的鑒定上使用了 gyrB 基因。國(guó)內(nèi)已有研究者就gyrB基因在鑒別細(xì)菌近緣種的應(yīng)用方面開(kāi)展了綜述研究(李獻(xiàn)梅等，2008 ；郝云婕和韓素貞，2008)。為了準(zhǔn)確鑒定本專利菌株，并獲得更為豐富的信息用于保護(hù)本菌株，本專利還對(duì)TR21的16S rDNA、gyrA、gyrB基因序列進(jìn)行了測(cè)定和分析，并利用 Biolog和API微生物鑒定系統(tǒng)進(jìn)行了鑒定，獲得了豐富的菌株生理生化和分子標(biāo)簽。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一株植物內(nèi)生枯草芽胞桿菌。
本發(fā)明提供的枯草芽胞桿菌TR21菌株(Bacillis subtilis str.TR21)，已于 2010年1月20日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，地址中國(guó)湖北省武昌珞珈山武漢大學(xué)校內(nèi)中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心；保藏號(hào)為CCTCC No =M 2010019。
該菌株分離自珠海市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究中心種植的雙色石斛蘭葉片 (Dendrobiumchrysopterum)，為革蘭氏陽(yáng)性菌，菌體桿狀，產(chǎn)生芽胞，生長(zhǎng)需要氧氣，接觸酶、氧化酶試驗(yàn)陽(yáng)性，能在0. 001%的溶菌酶存在下生長(zhǎng)，具有水解淀粉、酪蛋白、尿素、吐溫 80的能力，能夠利用檸檬酸鹽，具有糖酵解能力、硝酸鹽還原能力，具有產(chǎn)硫化氫能力，不產(chǎn)生苯丙氨酸脫氨酶，V. P反應(yīng)陰性，不能利用蘋果酸和甘氨酸，不能利用阿拉伯糖產(chǎn)酸，不能利用酪氨酸，不能產(chǎn)生二羥基丙酮，不能在50°c生長(zhǎng)，10°C不能生長(zhǎng)。在3%到10%的NaCl 存在時(shí)均能生長(zhǎng)，生長(zhǎng)PH范圍較廣，pH5. O pH9. O均能生長(zhǎng)，最佳生長(zhǎng)pH值為6. 0，最佳氮源為酵母浸提物，最佳碳源為葡萄糖，在NA培養(yǎng)基上，老齡菌落顏色金黃色、表面光滑較粘稠、有時(shí)會(huì)出現(xiàn)褶皺，在PDA上，菌落初期表現(xiàn)出濃狀，后期變成干燥皺縮，菌落呈現(xiàn)出明顯的擴(kuò)展能力。TR21可以分泌抗菌蛋白和脂肽以抑制植物病原菌的生長(zhǎng)，并能夠通過(guò)根系的傷口入侵到香蕉體內(nèi)，定殖到香蕉的球莖和根系，并在香蕉根際的土壤中形成一定的種群。
本發(fā)明的另一目的在于提供該菌株在用于抑制植物病原菌方面的用途，特別是防治由尖孢鐮刀菌引起香蕉和西芹病害方面的用途。
本發(fā)明提供的上述菌株通過(guò)獲得的16S rDNA、gyrA和gyrB基因片段，并在NCBI上通過(guò)BLAST搜索和比對(duì)后被證明是一種新的枯草芽胞桿菌菌株，能夠?qū)Χ喾N植物病原真菌具有較好的平板拮抗活性，尤其對(duì)各種尖孢鐮刀菌、立枯絲核菌、交鏈孢霉等土傳維管束病害具有很好的拮抗能力，并在田間表現(xiàn)出良好的防治效果；在珠海斗門小赤坎村和井岸雞嘴村開(kāi)展防治巴西蕉枯萎病、皇帝蕉枯萎病和農(nóng)科1號(hào)抗性香蕉枯萎病的大田試驗(yàn)，對(duì)巴西蕉枯萎病2年綜合防效達(dá)到64. 57%，噴施葉腋對(duì)農(nóng)科1號(hào)抗性蕉的防效達(dá)到85%，對(duì)皇帝蕉的防效達(dá)到82. 09%。發(fā)酵液稀釋100倍潑灑對(duì)西芹黃萎病的防治效果達(dá)到60. 45%。


圖1TR21生長(zhǎng)曲線； 圖2不同氮源對(duì)TR21生長(zhǎng)的影響； 圖3不同碳源對(duì)TR21生長(zhǎng)的影響； 圖4不同pH對(duì)TR21生長(zhǎng)的影響； 圖5菌株TR21的基因組DNA ； 圖6菌株TR21的16S rDNA、gyrA和gyrB基因PCR擴(kuò)增結(jié)果； 圖7基于gyrA基因序列的菌株TR21與相關(guān)菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)； 圖8基于gyrB基因序列的菌株TR21與相關(guān)菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)； 圖9TR21發(fā)酵上清不同飽和度硫酸銨沉淀蛋白對(duì)香蕉枯萎病病原菌F0C_zh (雞) 菌株菌絲生長(zhǎng)的抑制作用； 圖10TR21發(fā)酵上清不同飽和度硫酸銨沉淀蛋白對(duì)香蕉枯萎病病原菌F0C_zh(廖) 菌株菌絲生長(zhǎng)的抑制作用； 圖11TR21產(chǎn)生抗菌脂肽粗提物對(duì)香蕉枯萎病病原菌F0C_zh (雞)菌株菌絲生長(zhǎng)的抑制作用； 圖12TR21產(chǎn)生抗菌脂肽粗提物對(duì)香蕉枯萎病病原菌F0C_zh (廖)菌株菌絲生長(zhǎng)的抑制作用； 圖13TR21產(chǎn)生抗生素標(biāo)記TR21在香蕉體內(nèi)的定殖情況； 圖14TR21產(chǎn)生抗生素標(biāo)記TR21在香蕉根際的定殖情況。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1 :TR21的分離純化、理化性質(zhì)研究和鑒定 (一)TR21的分離、純化和保藏 在珠海市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究中心蘭花生產(chǎn)基地的溫室中，采集健康的雙色石斛葉片， 自來(lái)水沖洗干凈，晾干后75%酒精處理lmin，再用5 %的NaOCl處理5min，無(wú)菌水漂洗4 次；晾干后，用無(wú)菌剪刀和鑷子將葉片剪成0. 2cmX0. 5cm左右的組織塊，鋪于含放線菌酮50 μ g/ml的NA(牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基)平板上；28°C恒溫培養(yǎng)，每天觀察，一旦發(fā)現(xiàn)有菌從切口長(zhǎng)出即挑出，于新的NA平板純化培養(yǎng)，并以菌液形式用20%甘油保存于-20°C 及_80°C。再取第4次漂洗的無(wú)菌水200 μ 1涂于NA平板，做3個(gè)重復(fù)，同等條件培養(yǎng)，觀察是否長(zhǎng)菌。一旦發(fā)現(xiàn)無(wú)菌水涂的平板長(zhǎng)菌，則分離平板上分離到的相應(yīng)菌株視為非內(nèi)生菌而放棄。
(二)TR21的理化性質(zhì)測(cè)定 試驗(yàn)方法及所需培養(yǎng)基 (I)NA培養(yǎng)基(用于培養(yǎng)細(xì)菌)牛肉膏3g，蛋白胨5g，葡萄糖2. 5g，瓊脂粉15g， 蒸餾水 1000ml, pH 7. O0 (2)需氧性試驗(yàn)(用于細(xì)菌鑒定)在厭氧罐中進(jìn)行，培養(yǎng)基為NA平板；在無(wú)氧的情況下，挑取新鮮培養(yǎng)的待測(cè)菌在NA平板中劃線，37°C培養(yǎng)；不生長(zhǎng)則為陰性，反之為陽(yáng)性。測(cè)試結(jié)果見(jiàn)表1，下同。
(3)氧化酶試驗(yàn)(用于細(xì)菌鑒定)購(gòu)買氧化酶試紙，挑取新鮮培養(yǎng)的待測(cè)菌菌苔， 涂抹在試紙上；在IOs內(nèi)涂抹的菌苔出現(xiàn)紅色者為陽(yáng)性，IOs 60s出現(xiàn)紅色者為延遲反應(yīng)，不出現(xiàn)紅色或者60s以上出現(xiàn)紅色者均為陰性。
(4)接觸酶試驗(yàn)(用于細(xì)菌鑒定)配制3% 10%過(guò)氧化氫，挑取新鮮培養(yǎng)的待測(cè)菌一小環(huán)涂抹于已滴有過(guò)氧化氫溶液的玻璃片上；如有氣泡產(chǎn)生則為陽(yáng)性，反之為陰性。
(5)V. P試驗(yàn)(用于細(xì)菌鑒定)培養(yǎng)基配方為蛋白胨5g、葡萄糖5g、磷酸氫二鉀 5g、水1000ml, pH7. 0 7. 2，每管分裝4ml 5ml, 115°C滅菌30min ；接種待測(cè)菌于該培養(yǎng)液中37°C振蕩培養(yǎng)24h后，取培養(yǎng)液和40%氫氧化鈉等量相混，加少許肌酸，IOmin后如培養(yǎng)液出現(xiàn)紅色則為陽(yáng)性(有時(shí)需要放置更長(zhǎng)時(shí)間才出現(xiàn)紅色反應(yīng))，反之為陰性。
(6)最高和最低生長(zhǎng)溫度試驗(yàn)(用于細(xì)菌鑒定)最高生長(zhǎng)溫度(設(shè)置55°C、50°C) 試驗(yàn)采用NA液體培養(yǎng)，挑取待測(cè)菌的新鮮液體培養(yǎng)物一小環(huán)轉(zhuǎn)入NA培養(yǎng)液中，分別置于 55°C、50°C水浴搖床振蕩培養(yǎng)，觀察生長(zhǎng)情況，另設(shè)置37°C培養(yǎng)為對(duì)照；如果在該溫度中連續(xù)3次移種生長(zhǎng)，則認(rèn)為在此溫度中能夠生長(zhǎng)，為陽(yáng)性，反之為陰性。最低生長(zhǎng)溫度(設(shè)置 10°C、15°C )試驗(yàn)采用NA固體平板培養(yǎng)，挑取待測(cè)菌的新鮮液體培養(yǎng)物一小環(huán)在NA平板中劃線，然后分別置于10°C、15°C培養(yǎng)箱中，觀察生長(zhǎng)情況，另設(shè)置37°C培養(yǎng)為對(duì)照；能生長(zhǎng)則為陽(yáng)性，反之為陰性。
(7)對(duì)溶菌酶抗性試驗(yàn)(用于細(xì)菌鑒定)在IOOml的三角瓶中，放入60ml 65ml 無(wú)菌的O.Olmol/L HCL，加入0. Ig溶菌酶，瓶上塞無(wú)菌棉花，在小火上煮沸20min，冷卻至室溫后，用無(wú)菌的0. 01mol/L HCL補(bǔ)足液體體積至100ml即為溶菌酶液；取Iml溶菌酶液與 99ml無(wú)菌的NA培養(yǎng)液混合，分裝于無(wú)菌試管，每管2. 5ml，在含有0. 001 %溶菌酶NA培養(yǎng)液試管及無(wú)溶菌酶的NA培養(yǎng)液試管對(duì)照管中，各接種1環(huán)菌液，37°C培養(yǎng)5d 7 d ；能生長(zhǎng)則為陽(yáng)性，反之為陰性。
(8)能否在pH5. 7的培養(yǎng)液中生長(zhǎng)試驗(yàn)(用于細(xì)菌鑒定)取待測(cè)菌液一環(huán)，接種于pH5. 7的NA培養(yǎng)液中，同時(shí)接種普通NA培養(yǎng)液(pH7. 2)作對(duì)照，37°C培養(yǎng)Id 3d后觀察生長(zhǎng)情況；能生長(zhǎng)則為陽(yáng)性，反之為陰性。
(9)耐鹽和需鹽試驗(yàn)(用于細(xì)菌鑒定)在NA培養(yǎng)液中加入妝(1，使NaCl終濃度分別為3%、5%、7%和10%，取待測(cè)菌液一環(huán)，接種于上述培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)，觀察生長(zhǎng)情況；能生長(zhǎng)則為陽(yáng)性，反之為陰性。
(10)產(chǎn)酸試驗(yàn)(用于細(xì)菌鑒定)需要測(cè)試的糖和醇包括葡萄糖、阿拉伯糖、木糖、 甘露醇和半乳糖；培養(yǎng)基配方為磷酸氫二銨1. 0g、氯化鉀0. 2g、硫酸鎂0. 2g、酵母膏0. 2g、糖或醇類10. 0g、溴百里酚藍(lán)水溶液3ml、蒸餾水1000ml，pH7. 0 7. 2，試管分裝，112°C 滅菌30min ；挑取新鮮培養(yǎng)的待測(cè)菌，穿刺接種4支試管，其中2支用滅菌的凡士林石蠟油封蓋，約0. 5cm 1. Ocm厚，以隔絕空氣為閉管；另2支不封凡士林石蠟油為開(kāi)管；同時(shí)以不接種的閉管和開(kāi)管做對(duì)照；37°C培養(yǎng)ld、2d、3d、7d、14d后觀察結(jié)果；培養(yǎng)基顏色變?yōu)辄S色者為陽(yáng)性，反之為陰性，其中只有開(kāi)管產(chǎn)酸變黃者為氧化型產(chǎn)酸，開(kāi)管和閉管均產(chǎn)酸變黃者為發(fā)酵型產(chǎn)酸。
(11)淀粉水解試驗(yàn)(用于細(xì)菌鑒定)在配制NA固體培養(yǎng)基的同時(shí)，加入可溶性淀粉，使其終濃度為0. 2%，121°C滅菌20min，倒平板備用；挑取新鮮培養(yǎng)的待測(cè)菌點(diǎn)接于上述平板中，37°C培養(yǎng)2d 5d，形成明顯菌落后，在平板上滴加碘液，平板即呈藍(lán)黑色，菌落周圍如有不變色透明圈，則表示淀粉水解，為陽(yáng)性，仍為藍(lán)黑色則為陰性。
(12)檸檬酸鹽利用實(shí)驗(yàn)(用于細(xì)菌鑒定)培養(yǎng)基配方為氯化鈉lg、7水合硫酸鎂 0. 2g、磷酸二氫銨0. 5g、檸檬酸鈉2g、蒸餾水IOOOml,0. 04%酚紅液20ml，121°C滅菌20min， 倒平板備用；挑取新鮮培養(yǎng)的待測(cè)菌于上述平板中劃線，37°C培養(yǎng)3d 7d，如果培養(yǎng)基為堿性(指示劑變藍(lán)色或桃紅色)則為陽(yáng)性，反之為陰性。
(13)丙酸鹽利用實(shí)驗(yàn)(用于細(xì)菌鑒定)培養(yǎng)基配方為氯化鈉lg、7水合硫酸鎂 0. 2g、磷酸二氫銨0. 5g、丙酸鈉2g、蒸餾水1000ml、0. 04%酚紅液20ml，121°C滅菌20min，倒平板備用；挑取新鮮培養(yǎng)的待測(cè)菌于上述平板中劃線，37°C培養(yǎng)3d 7d，如果培養(yǎng)基為堿性(指示劑變藍(lán)色或桃紅色)則為陽(yáng)性，反之為陰性。
(14)硝酸鹽被還原為亞硝酸鹽試驗(yàn)(用于細(xì)菌鑒定)NA培養(yǎng)液中加入硝酸鉀Ig 即為硝酸鹽液體培養(yǎng)基，pH7. 0 7. 6，每管分裝4ml 5ml，121°C滅菌20min備用；另外配制格里斯氏試劑A液和B液，A液為對(duì)氨基苯磺酸0. 5g、稀醋酸(10%左右)150ml，B液為 a_萘胺0. lg、蒸餾水20ml、稀醋酸(10%左右)150ml ；二苯胺試劑為二苯胺0. 5g溶于IOOml 濃硫酸中，用20ml蒸餾水稀釋；將待測(cè)菌接種于硝酸鹽液體培養(yǎng)基中，37°C振蕩培養(yǎng)Id、 3d、5d，另留兩管不接種作對(duì)照；取2支干凈的空試管，分別倒入少許培養(yǎng)ld、3d、5d的培養(yǎng)液，再各加一滴A液和B液，對(duì)照管也作同樣處理；如果溶液變?yōu)榉奂t色、玫瑰紅色、橙色、棕色等則表示亞硝酸鹽存在，為硝酸鹽還原陽(yáng)性，如無(wú)紅色出現(xiàn)，則可加1、2滴二苯胺試劑， 如溶液呈藍(lán)色，則表示培養(yǎng)液中仍有硝酸鹽，且又無(wú)亞硝酸鹽反應(yīng)，則表示無(wú)硝酸鹽還原作用，為陰性；如不呈藍(lán)色反應(yīng)，表示硝酸鹽和形成的亞硝酸鹽已還原為其它物質(zhì)，故仍應(yīng)判斷為硝酸鹽還原陽(yáng)性。
(15)產(chǎn)吲哚試驗(yàn)(用于細(xì)菌鑒定)配制胰胨水溶液，pH7. 2 7. 6，試管分裝，115°C滅菌30min ；另配制如下試劑——對(duì)二甲基氨基苯甲醛8g、95%乙醇760ml、濃鹽酸160ml ；挑取待測(cè)菌于上述培養(yǎng)液中振蕩培養(yǎng)ld、2d、4d、7d后，沿試管壁緩緩加入3ml 5ml上述試劑于培養(yǎng)液表面，在液層界面出現(xiàn)紅色，即為陽(yáng)性，反之為陰性。
(16)產(chǎn)硫化氫試驗(yàn)(用于細(xì)菌鑒定)培養(yǎng)基配方為蛋白胨10g、氯化鈉5g、牛肉膏l(xiāng)og、半胱氨酸0. 5g、蒸餾水1000ml，pH7. 0 7. 4，試管分裝，112°C滅菌30min。另將普通濾紙剪成0. 5cm Icm寬，長(zhǎng)度根據(jù)試管與培養(yǎng)液高度而定；用5% 10%的醋酸鉛將紙條浸透，然后用烘箱烘干，放于培養(yǎng)皿中滅菌備用。挑去新鮮培養(yǎng)的待測(cè)菌接種于上述培養(yǎng)液中，然后用無(wú)菌鑷子夾取1條醋酸鉛紙條并用棉塞塞緊，使其懸掛于管中，37°C靜置培養(yǎng)，分別在3d、7d、14d后觀察。紙條變黑色則為陽(yáng)性，不變色則為陰性。
(17)產(chǎn)二羥基丙酮試驗(yàn)(用于細(xì)菌鑒定)培養(yǎng)基配方為甘油10.0ml、酵母膏 1. 0g、蛋白胨0. 5g、碳酸鈣0. 3g、磷酸二氫鉀0. 3g、瓊脂粉1. 8g，pH5. 5 6. 0，121°C滅菌 15min，倒平板備用；另配制顯色液——二苯胺2g、乙酸200ml、濃硫酸20ml。挑去新鮮培養(yǎng)的待測(cè)菌，在上述平板中劃線，37°C培養(yǎng)IOd后，倒入顯色液，以覆蓋菌落為宜，2h內(nèi)檢查， 如在菌落周圍出現(xiàn)紅色暈圈則為陽(yáng)性，反之為陰性。
(18)苯丙氨酸脫氨酶試驗(yàn)(用于細(xì)菌鑒定)培養(yǎng)基配方為酵母膏3g、氯化鈉5g、 磷酸氫二鈉lg、DL-苯丙氨酸2g、瓊脂12g、蒸餾水1000ml，pH7. 0,試管分裝，121°C滅菌 IOmin后擺成斜面；另配制10% (W/V)的三氯化鐵溶液。挑取新鮮培養(yǎng)的待測(cè)菌在上述培養(yǎng)基斜面中劃線，37°C培養(yǎng)4h或8h 24h，然后將4 5滴三氯化鐵溶液到生長(zhǎng)菌的斜面上，當(dāng)斜面上冷凝水中產(chǎn)生綠色時(shí)即表明形成苯丙酮酸，為陽(yáng)性，反之為陰性。
(19)酪蛋白水解試驗(yàn)(用于細(xì)菌鑒定)取5g脫脂奶粉、1. 5g瓊脂分別溶于50ml 蒸餾水中，121°C滅菌20min ；待兩種液體冷卻至45°C 50°C后，互相混均勻并倒平板；平板倒置過(guò)夜以使平板表面水分干燥，然后點(diǎn)接新鮮培養(yǎng)的待測(cè)菌，37°C培養(yǎng)ld、3d、5d后，觀察菌落周圍是否出現(xiàn)透明圈，如出現(xiàn)透明圈則為陽(yáng)性，反之為陰性。
(20)酪氨酸水解試驗(yàn)(用于細(xì)菌鑒定)將L-酪氨酸0. 5g懸浮于IOml蒸餾水中， 112. 6°C滅菌20min，然后與IOOml無(wú)菌的NA固體培養(yǎng)基混合，倒平板，待凝固后，將測(cè)試菌接種于平皿上，37°C培養(yǎng)7d 14d，記錄酪氨酸結(jié)晶是否被水解而變透明，如變透明則為陽(yáng)性，反之為陰性。
(21)尿素分解試驗(yàn)(用于細(xì)菌鑒定)培養(yǎng)基配方為蛋白胨lg、氯化鈉5g、葡萄糖lg、磷酸二氫鉀2g、0. 2%酚紅水溶液6ml、瓊脂20g、蒸餾水1000ml, ρΗ6· 8 6. 9，試管分裝，115°C滅菌30min，此時(shí)培養(yǎng)基呈橘黃色或微帶粉紅色；冷卻至50°C左右，加入過(guò)濾除菌的20%尿素溶液，使其終濃度為2%，擺成斜面。挑取新鮮培養(yǎng)的待測(cè)菌在斜面上劃線， 37°C培養(yǎng)，培養(yǎng)基呈桃紅色者為陽(yáng)性，培養(yǎng)基顏色不變者為陰性(陰性結(jié)果要觀察4d)。
(22) 土溫80降解試驗(yàn)(用于細(xì)菌鑒定)培養(yǎng)基配方為蛋白胨10g、氯化鈉5g、7 水合氯化鈣0. lg、瓊脂9g、蒸餾水1000ml，pH7. 4，121°C滅菌20min ；待培養(yǎng)基溫度冷卻至 45°C左右，加入土溫80至其終濃度為1%，然后倒平板；挑取新鮮培養(yǎng)的待測(cè)菌，在上述平板中劃線，37°C培養(yǎng)7d，每天觀察，如菌落周圍有模糊暈圈則為陽(yáng)性，反之為陰性。
(23)TR21生長(zhǎng)曲線的測(cè)定將NA培養(yǎng)液裝于三角瓶中，裝載量為40%，滅菌后， 接種0. 1 %的TR21新鮮種子液，37 0C、180r/m振蕩培養(yǎng)12h、24h、36h、48h、72h后采集TR21 培養(yǎng)液，蒸餾水稀釋10倍后測(cè)0D·，設(shè)置五個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)每個(gè)時(shí)間段測(cè)三次，計(jì)算平均 0D_，已培養(yǎng)時(shí)間(h)為橫坐標(biāo)，0D_為縱坐標(biāo)繪制生長(zhǎng)曲線。參見(jiàn)附圖1。
(24)TR21對(duì)不同氮源的利用基礎(chǔ)培養(yǎng)基配方為磷酸二氫鉀1. 36g、二水氯化鈣0. 005g、磷酸氫二鈉2. 13g、葡萄糖10g、七水硫酸鎂0. 2g、七水硫酸亞鐵0. 0005g、水 1000ml，分別加入各種氮源，116°C滅菌30min (等滅菌完后，二水氯化鈣單獨(dú)溶解并無(wú)菌過(guò)濾后再加入)，牛肉膏、蛋白胨、酵母浸提粉、酪蛋白、硝酸鉀、氯化銨，加入量為2% ；滅菌后接種0. 1 %的TR21新鮮種子液，370C、180r/m振蕩培養(yǎng)24h后，蒸餾水稀釋培養(yǎng)液5倍后測(cè) 0D_，每種碳源設(shè)置3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)測(cè)三次，計(jì)算平均0D·。結(jié)果參見(jiàn)附圖2，其中圖上不同的大寫字母表示方差分析和多重比較差異極顯著，P < 0. 01，下同。
(25)TR21對(duì)不同碳源的利用基礎(chǔ)培養(yǎng)基配方為硫酸銨2. 0g、七水硫酸鎂0. 2g、磷酸二氫鈉O. 5g、二水氯化鈣0. lg、磷酸氫二鉀0. 5g，水1000ml，分別加入各種碳源，116°C 滅菌30min(等滅菌完后，二水氯化鈣單獨(dú)溶解并無(wú)菌過(guò)濾后再加入)，供試碳源果糖、葡萄糖、蔗糖、甘氨酸、甘露醇、精氨酸、蘋果酸，加入量為2% ；滅菌后接種0. 的TR21新鮮種子液，370C、180r/m振蕩培養(yǎng)24h后，測(cè)培養(yǎng)液OD_，每種碳源設(shè)置3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)測(cè)三次，計(jì)算平均OD·。結(jié)果參見(jiàn)附圖3。
(26) pH對(duì)TR21生長(zhǎng)的影響用鹽酸和氫氧化鈉將NA培養(yǎng)液pH值分別調(diào)為4. 0、 5. 0,6. 0,7. 0,8. 0,8. 5,9. 0,9. 5,10. 0,10. 5,11. 0，常規(guī)滅菌后，上述 NA 培養(yǎng)液的 pH 值分別變?yōu)?4. 15,5. 13,6. 11,7. 23,7. 83,8. 30,8. 65,8. 99,9. 29,9. 56,9. 78，接種 0. 的 TR21 新鮮種子液，370C、180r/m振蕩培養(yǎng)24h后，蒸餾水稀釋培養(yǎng)液5倍后測(cè)0D·，每種pH設(shè)置3 個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)測(cè)三次，計(jì)算平均0D_。結(jié)果參見(jiàn)附圖4。
表1TR21生理生化特征
注“ _ ”表示陰性，“ + ”表示陽(yáng)性。
(三)利用Biolog微生物鑒定系統(tǒng)鑒定的結(jié)果 本申請(qǐng)對(duì)TR21菌株進(jìn)行了 Biolog鑒定，樣品送往廣東省微生物分析檢測(cè)中心鑒定。Biolog未能給出準(zhǔn)確的鑒定結(jié)果，但提供了詳細(xì)的有關(guān)菌株碳源利用的資料，結(jié)果參見(jiàn)表2。
表2、Biolog鑒定系統(tǒng)提供的TR21菌株代謝能力

注“ + ”表示具有代謝能力，“_”表示不具代謝能力，下同。
(四)利用API微生物鑒定系統(tǒng)鑒定的結(jié)果 法國(guó)API鑒定系統(tǒng)是世界范圍內(nèi)應(yīng)用最廣，已被微生物學(xué)家所公認(rèn)，本申請(qǐng)還對(duì) TR21菌株進(jìn)行了 API生化鑒定，樣品送往廣東省微生物分析檢測(cè)中心鑒定。API鑒定給出的結(jié)果為TR21菌株對(duì)48種碳源利用情況與枯草芽胞桿菌的符合率達(dá)到90. 3 %。菌株碳源利用的結(jié)果參見(jiàn)表3。
表3、API鑒定系統(tǒng)鑒定的TR21代謝能力

(五)利用16SrDNA、gyrA基因和gyrB基因開(kāi)展的菌株鑒定 本申請(qǐng)對(duì)TR21開(kāi)展了 16S rDNA基因序列、gyrA基因序列和gyrB基因序列克隆分析和系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)構(gòu)建，通過(guò)系統(tǒng)進(jìn)化分析。TR21的分離、純化和保藏同本實(shí)施例第(一)節(jié)。
1菌株DNA的提取 基因組DNA 使用 TaKaRa 公司的 MiNiBEST Bacterial Genomic DNA Extraction KitVer. 2. 0細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取，可以獲得理想的基因組DNA。
216S rDNA基因序列PCR擴(kuò)增 采用細(xì)菌通用引物27F(27F:5，-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3，)和 1513R 5，-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3，)進(jìn)行 16S rDNA 的 PCR 擴(kuò)增。PCR 條件95 "C 5min, 94°C lmin，56°C 2min，72°C 2min，30 個(gè)循環(huán)，72°C IOmin0 用OMEGA公司凝膠回收試劑盒(Gel Extraction Kit)對(duì)擴(kuò)增片段進(jìn)行回收，將回收產(chǎn)物連接到PMD19-T載體上，轉(zhuǎn)化E. coli DH5 α，挑轉(zhuǎn)化子經(jīng)菌落PCR檢驗(yàn)確定有目的基因插入后，搖菌，保甘油種，送Irwitrogen生物工程技術(shù)有限公司廣州分公司測(cè)定目的基因的堿基序列。
3gyrA基因序列PCR擴(kuò)增 按照Chun and Bae 在《Antonie van Leeuwenhoek》雜志第 78 卷 I23-I27 頁(yè)的報(bào)道設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物 f (5 ‘ -CAGTCAGGAAATGCGTACGTCCTT-3，)和 r (5，-CAAGGTAATGCTCCA GGCATTGCT-3，), 95 °C 5min，94°C lmin，62. 3士 1 °C (優(yōu)化后)lmin，72 °C 2min，30 個(gè)循環(huán)， 72°C IOmin。
擴(kuò)增產(chǎn)物的克隆和測(cè)序方法同16S rDNA的克隆和測(cè)序。4gyrB基因序列PCR擴(kuò)增 根據(jù) Yamamoto 禾口 Harayamal995 在《Applied Environmental Microbiology》雜志61卷1104-1109頁(yè)的報(bào)道設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物UP-IS和UP_2Sr。
UP-IS :5， -GAAGTCATCATGACCGTTCTGCA(TC)GC(TCAG)GG(TCAG)GG(TCAG)AA(AG) TT (TC)GA-3'； UP-2Sr 5，-AGCAGGGTACGGATGTGCGAGCC(AG)TC(TCAG) AC(AG)TC(TCAG)GC(AG) TC (TCAG) GTCAT-3，用于擴(kuò)增 gyrB 基因，95°C預(yù)變性 5min，94°C lmin，55°C _62°C退火(優(yōu)化后)lmin, 72°C延伸 2min, 30 個(gè)循環(huán)，72°C IOmin0 擴(kuò)增產(chǎn)物的克隆和測(cè)序同16S rDNA的克隆和測(cè)序。
5序列的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化分析 去掉獲得基因序列中引物片段，將剩余序列登錄NCBI (www. ncbi. nlm. nih. gov)進(jìn)行在線 BLAST同源性搜索，選取在《International Journal of Systematic and EvolutionaryMicrobiology》雜志上公開(kāi)發(fā)表的相似度超過(guò)90 %的序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析。其中利用gyrA基因構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)時(shí)，以相似性較低的Bacillus vallismortis NRRL B-14890菌株的gyrA基因序列作為外群。利用gyrB基因構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)時(shí)，以Blast結(jié)果中相似性較低的相近種gyrB基因序列作為外群。序列先采用ClustralX 2. 0進(jìn)行多重序列比對(duì)，然后用 MEGA4. 0 軟件包采用 Neighbour-joining 法(Kimura，s 2-parameter 模型，bootstrap 1000)法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。
616S rDNA、gyrA和gyrB基因序列的克隆結(jié)果 利用基因組提取試劑盒獲得TR21的基因組DNA，電泳檢測(cè)基因組DNA分子量大于 IOOOObp (基因組DNA電泳圖如圖5所示)，利用提取的基因組DNA PCR擴(kuò)增TR21的16S rDNA, gyrA和gyrB基因(PCR擴(kuò)增結(jié)果如圖6所示)，其中g(shù)yrA基因IOOObp左右，gyrB基因1200bp左右。測(cè)序后獲得的16S rDNA基因片段長(zhǎng)度1544bp，gyrA基因片段長(zhǎng)度1025bp， gyrB基因片段長(zhǎng)度1259bp。
7基于gyrA基因Blast結(jié)果的系統(tǒng)進(jìn)化分析 如圖7所示為基于gyrA基因序列的菌株TR21與相關(guān)菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。根據(jù)發(fā)育樹(shù)的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)利用gyrA基因可以準(zhǔn)確鑒定TR21為枯草芽胞桿菌，并能夠獲得TR21與已知種的親緣關(guān)系。以gyrA基因序列比對(duì)結(jié)果構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，其中B. subtilissubsp. inaquosorum 2個(gè)菌株gyrA基因片段序列與TR21相似性較低(94% )，但為了完整顯示枯草芽胞桿菌各亞種間的進(jìn)化關(guān)系，仍然選擇了這2個(gè)公開(kāi)發(fā)表的序列進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)利用 gyrA基因系列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，能夠很好的反應(yīng)不同枯草芽胞桿菌菌株間的親緣關(guān)系。
8基于gyrB基因Blast結(jié)果的系統(tǒng)進(jìn)化分析 如圖8所示為基于gyrB基因序列的菌株TR21與相關(guān)菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。根據(jù)發(fā)育樹(shù)的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)利用gyrB基因也可以準(zhǔn)確鑒定TR21為枯草芽胞桿菌，以gyrB基因序列比對(duì)結(jié)果構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)時(shí)，選擇了多個(gè)基因系列相似性達(dá)到90%的不同菌株用作外群。 由于枯草芽胞桿菌組中枯草芽胞桿菌已測(cè)定gyrB基因的菌株較多，因而gyrB基因能很好的顯示TR21和其它菌株間的親緣關(guān)系遠(yuǎn)近。
實(shí)施例2 :TR21對(duì)不同鐮刀菌病原菌的拮抗試驗(yàn) (一 )不同鐮刀菌病原菌的分離與純化 分離來(lái)源在珠海市及周邊城市采集典型的香蕉枯萎病、西芹黃萎病、石斛蘭葉斑病病組織，進(jìn)行病原菌分離，用于測(cè)試TR21對(duì)不同鐮刀菌病原菌的拮抗活性。
分離與純化方法用清水將病組織清洗干凈，吹干，用無(wú)菌刀片切取病健交界處的病組織并切成適宜大小，無(wú)菌情況下用70%酒精表面消毒30s，再用有效氯為5%的NaOCl 處理5min，無(wú)菌水漂洗4次，將表面消毒后的病組織用無(wú)菌剪刀和鑷子剪成0. 2cm X0. 5cm 左右的組織塊，吹干病組織塊表面水分后置于無(wú)菌培養(yǎng)皿中，然后加入少量的PDA(馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，含300 μ g/ml的硫酸鏈霉素)培養(yǎng)基，使培養(yǎng)基與病組織塊混合；待培養(yǎng)基凝固后，再加一層上述PDA培養(yǎng)基，培養(yǎng)基凝固后再加一層，形成三層培養(yǎng)基平板。最后將平板置于27°C培養(yǎng)箱中，每天觀察，待有菌絲從病組織中長(zhǎng)出并穿過(guò)三層培養(yǎng)基長(zhǎng)至最外層培養(yǎng)基表面時(shí)，挑取菌絲于SNA (SpezielIerNahrstoffarmer Agar，鐮刀菌保存專用培養(yǎng)基)培養(yǎng)基中擴(kuò)繁后，再挑取菌絲于SNA斜面培養(yǎng)基，待菌絲長(zhǎng)滿斜面后置于4°C冰箱中保存。另用PDA平板培養(yǎng)經(jīng)SNA培養(yǎng)基擴(kuò)繁后的菌絲，待菌絲長(zhǎng)滿整個(gè)平皿后，加入適量的無(wú)菌水，用無(wú)菌接種針輕輕刮動(dòng)菌絲，使菌絲中的孢子脫落，形成孢子懸浮液，吸取該懸浮液與40%甘油按照1 1的比例混合，保存于-20°C及-80°C。
從香蕉枯萎病組織(分屬珠海市及周邊城市香蕉種植區(qū)的不同香蕉品種)共分離出16株目標(biāo)鐮刀菌、從西芹黃萎病組織分離出1株目標(biāo)鐮刀菌、從石斛蘭葉斑病組織分離出1株目標(biāo)鐮刀菌。
回接測(cè)定分離菌致病性嚴(yán)格按照柯赫氏法則(Koch’ s Postulate)對(duì)上述分離的菌株進(jìn)行致病性測(cè)定。香蕉枯萎病及西芹黃萎病組織分離菌分別以健康無(wú)病的香蕉苗 (15cm高，4 5片葉)、西芹穴盤苗(5cm IOcm高)作為回接對(duì)象；制備分離菌的孢子懸浮液，濃度為IO6個(gè)/ml，然后人工機(jī)械損傷香蕉苗和西芹苗根部組織，將傷根處理的香蕉苗和西芹苗分別置于對(duì)應(yīng)分離菌的孢子懸浮液中浸泡30min ；最后將接種后的香蕉苗和西芹苗移栽至裝有無(wú)菌土的花盆中；待植株出現(xiàn)典型發(fā)病癥狀后采集病組織并分離，將分離獲得的菌株與出發(fā)接種菌株進(jìn)行比對(duì)，從而確定出發(fā)菌株是否為病原菌。石斛蘭葉斑病組織分離菌以石斛蘭(苗齡為1 2個(gè)月)健康無(wú)病葉片作為回接對(duì)象；接種前，葉片均用75% 酒精做表面消毒，待酒精揮發(fā)完全后再接種；先用無(wú)菌軟毛刷在葉子表面造成輕微的傷口， 再用接種針挑取一小塊已在PDA上培養(yǎng)7天的分離菌菌塊，反扣于傷口上，套袋保濕24h ； 供試石斛蘭苗置于溫室中培養(yǎng)，白天26°C 29°C，相對(duì)濕度80 90%左右；待植株出現(xiàn)典型發(fā)病癥狀后采集病組織并分離，將分離獲得的菌株與出發(fā)接種菌株進(jìn)行比對(duì)，從而確定出發(fā)菌株是否為病原菌。
通過(guò)上述分離與致病性測(cè)定，從不同地區(qū)的香蕉枯萎病組織中分離獲得16株病原菌(大部分為尖孢鐮刀菌古巴?；?，F(xiàn)usarium oxysporum Schl. f. cubense (Ε. F. Smith) Snyder et Hansen, FOC)，編號(hào)分別為:F0C_zh (連灣)、F0C_zh(鶴州北 2 號(hào))、 FOC-z j (易)、F0C-zh (賀)、F0C-zh (皇)，F(xiàn)OC-zh (新鄉(xiāng))，F(xiàn)OC-zh (廖)，F(xiàn)OC-zh (八一)， F0C-zh (九圍 1)，F(xiàn)OC-zh (九圍 2)，F(xiàn)OC-zh (平塘)，F(xiàn)0C-zh (鶴州北 1 號(hào))，F(xiàn)0C-zh (雞)， FOC-zh (東)白，香枯4，F(xiàn)0C-ts ；從西芹黃萎病組織中分離獲得1株病原菌(尖孢鐮刀菌西芹?；?，F(xiàn)usarium oxysproum f. sp. Apii, F0A)；從石斛蘭葉斑病組織中分離獲得1株病原真菌(Fusarium moniliforme Sheld),編號(hào)為 BlOb0 (二)TR21對(duì)上述真菌的拮抗活性 在PDA平板中央接種直徑為5mm的病原菌菌塊，距離菌塊3cm處點(diǎn)接TR21，28°C恒溫培養(yǎng)5d，觀察抑菌帶有無(wú)，并測(cè)定大小，設(shè)置不接TR21的處理為對(duì)照。結(jié)果參見(jiàn)表4，抑菌帶越大，表示抑菌效果越強(qiáng)。表中抑菌帶數(shù)據(jù)為平均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差。
表4、TR21對(duì)不同寄主來(lái)源病原真菌鐮刀菌(Fusarium spp.)的拮抗活性
實(shí)施例3 :TR21對(duì)其它植物病原真菌的拮抗活性，結(jié)果見(jiàn)表5所示。
生測(cè)拮抗活性時(shí)的方法同實(shí)施例2，其中交鏈孢霉、新月彎孢霉、芒果蒂腐病、西瓜枯萎病等分別為珠海市真綠色技術(shù)有限公司贈(zèng)送的植物病原真菌，立枯絲核菌由廣東海洋大學(xué)易潤(rùn)華博士贈(zèng)送的植物病原真菌。抑菌帶越大，表示抑菌效果越強(qiáng)。
表5TR21對(duì)幾種植物病原真菌的平板拮抗活性(單位mm)
實(shí)施例4 :TR21對(duì)香蕉枯萎病的生物防治研究 (一 )對(duì)不同香蕉枯萎病菌菌株的拮抗機(jī)理 TR21對(duì)香蕉枯萎病菌的不同致病菌株具有良好的拮抗效果(見(jiàn)實(shí)施例2)，通過(guò)顯微鏡觀察，經(jīng)TR21處理后，不同致病菌株與對(duì)照相比，菌絲和分生孢子均發(fā)生明顯變化，主要變現(xiàn)為菌絲粗糙、畸形腫脹；孢子畸形，中間膨脹、兩端縊縮等。
( 二)TR21的拮抗物質(zhì)提取和對(duì)香蕉病原菌的抑制效果測(cè)定 用接種環(huán)從平板上挑取完整單菌落，接入盛有100ml NB培養(yǎng)基的三角瓶中，180rpm，37°C搖床中培養(yǎng)過(guò)夜，即得到種子液，然后按6%接種量加入到300ml新鮮的NB培養(yǎng)基中，180rpm，37°C搖床中培養(yǎng)3d。
抗菌蛋白粗品的制備將上述發(fā)酵液按IOOml的量分裝到果醬瓶中，并向每瓶中分別加入20 % ,30 % ,40 % ,50 % ,60 % ,70 % ,80 % ,90 %, 100 %飽和度的硫酸銨，置于 4°C 冰箱中靜置過(guò)夜，10000rpm，4°C離心20min分離得沉淀，然后分別用IOml無(wú)菌水溶解，即得到不同飽和度硫酸銨鹽析粗制品。
抗菌脂肽粗品的制備將上述發(fā)酵液6000rpm，4°C離心20min除去菌體，將上清按IOOml的量分裝到果醬瓶中，然后向上清中加入濃鹽酸調(diào)節(jié)到pH = 2. 0，4°C冰箱中靜置過(guò)夜，10000rpm，4°C離心20min分離得沉淀，并用甲醇抽提，真空干燥，用IOml 0. 05M的 NaHC03溶解，即得到粗制品。
參照程亮等(注程亮，肖愛(ài)萍，游春平.拮抗細(xì)菌對(duì)香蕉枯萎病菌的抑菌作用初步研究[J].仲愷農(nóng)業(yè)技術(shù)學(xué)院學(xué)報(bào)，2005，18(1) 9-13.)的方法，取制備好的蛋白粗制品、 脂肽類粗制品各Iml分別加入冷卻至40°C左右的15ml PDA培養(yǎng)基中輕輕搖動(dòng)，充分混勻后倒入直徑為9cm的培養(yǎng)皿中，冷卻后于平板中央接種直徑為5mm的香蕉枯萎病菌塊，置于 28°C下培養(yǎng)5d，分別以添加無(wú)菌水和0. 05M的NaHC03溶液為對(duì)照，每處理4次重復(fù)，測(cè)量菌落直徑，觀察抑菌效果并計(jì)算抑制率。
結(jié)果發(fā)現(xiàn)(參見(jiàn)圖9和圖10)，20%、30%和40%飽和度硫酸銨沉淀的蛋白質(zhì)具有較好的拮抗活性，但以40%的效果最好。TR21除了產(chǎn)生蛋白類拮抗物質(zhì)外，其產(chǎn)生的脂肽類物質(zhì)對(duì)香蕉枯萎病病原菌也具有抑制作用，結(jié)果參見(jiàn)圖U和12。
(三)TR21的抗生素標(biāo)記篩選和在香蕉苗中的定殖能力測(cè)定 1、利福平和硫酸鏈霉素標(biāo)記TR21 將配好的NB培養(yǎng)基分裝到250ml培養(yǎng)瓶中，滅菌后冷卻到50°C左右，分別加入一定量的利福平、氨芐青霉素、硫酸鏈霉素、氯霉素、四環(huán)素、紅霉素、潮霉素、新霉素、卡那霉素貯存液至終濃度為5μ g/ml，搖勻后，迅速制成抗性平板。取ΙΟΟμ 1的TR21菌液涂布在不同的抗性平板上，28°C培養(yǎng)3-4d觀察結(jié)果。每個(gè)處理重復(fù)三次，以不加抗生素的平板為對(duì)照。結(jié)果發(fā)現(xiàn)TR21菌株對(duì)5 μ g/ml的利福平具天然抗性。
選用利福平、氨芐青霉素、鏈霉素、氯霉素、新霉素五種抗生素作為下一步抗性篩選試劑。按6%接種量加入TR21種子液到含有5 μ g/ml上述抗生素的NB培養(yǎng)基中，28°C振蕩培養(yǎng)4d。取200 μ 1涂含相應(yīng)量的抗生素的NA平板，28°C培養(yǎng)4d。挑取可以生長(zhǎng)的突變體菌株，再接入同濃度的培養(yǎng)基中，繼代一次后轉(zhuǎn)入10 μ g/ml利福平的NB培養(yǎng)基中，28°C 振蕩培養(yǎng)4天。取200 μ 1涂含10 μ g/ml利福平的NA平板，每處理3個(gè)重復(fù)。按以上的方法，依次接種在含50、100、150、200、250、3001^/1111上述抗生素的NB培養(yǎng)基中培養(yǎng)。篩選到在含鏈霉素最高濃度下生長(zhǎng)良好的突變菌株，即獲得抗300 μ g/ml硫酸鏈霉素，且具5 μ g/ ml利福平天然抗性的突變株TR21*。
2、標(biāo)記菌株的穩(wěn)定性測(cè)定 將耐藥菌株在不含抗生素的NA培養(yǎng)基上連續(xù)傳代20次后，接種到NB培養(yǎng)基中培養(yǎng)24h，然后涂布NA平板，37°C培養(yǎng)過(guò)夜，待長(zhǎng)出小菌落后，用滅菌牙簽隨機(jī)挑取100個(gè)菌落點(diǎn)接到含300 μ g/ml鏈霉素和5 μ g/ml利福平的NA培養(yǎng)基上，37°C培養(yǎng)2 3d，統(tǒng)計(jì)出現(xiàn)的菌落數(shù)量，以抗性菌株所占百分比計(jì)算標(biāo)記菌的穩(wěn)定性。100個(gè)點(diǎn)接處都有菌落長(zhǎng)出，即標(biāo)記菌株的穩(wěn)定性100%。
3、標(biāo)記菌株的拮抗能力測(cè)定 參照程亮等(注程亮，肖愛(ài)萍，游春平.拮抗細(xì)菌對(duì)香蕉枯萎病菌的抑菌作用初步研究[J].仲愷農(nóng)業(yè)技術(shù)學(xué)院學(xué)報(bào)，2005，18(1) 9-13.)的方法，挑取TR21*在PDA平板一側(cè)沿一直線接種，而在別一側(cè)接入直徑為5mm的FOC-zh (廖)菌株菌碟，兩者相距3cm，置 280C下培養(yǎng)6d，觀察FOC-zh (廖)菌落生長(zhǎng)情況，以未標(biāo)記生防菌TR21為對(duì)照，每處理4次重復(fù)，結(jié)果參見(jiàn)表6。
表6抗性標(biāo)記與非標(biāo)記菌株的拮抗能力比較
4、標(biāo)記菌株在香蕉體內(nèi)、根表和根和的定殖規(guī)律 選擇對(duì)5 μ g/ml利福平具有天然抗性且抗300 μ g/ml鏈霉素的枯草芽胞桿菌TR21 突變菌株TR21*用于測(cè)定。香蕉組培苗購(gòu)自廣東省農(nóng)科院，培育至6 7葉，株高30 35cm 時(shí)待用。供試抗生素則皆購(gòu)自上海生工。
采用傷根法/灌根法，每株接種濃度為2X108cfu/ml TR21*菌的NB培養(yǎng)液 20ml于香蕉根部(種植在非滅菌的腐殖土中)，共處理30株，設(shè)無(wú)菌水為對(duì)照，實(shí)驗(yàn)溫度 22士3°C。分別于接菌后l、3、5、7、9、12、15d隨機(jī)取5株香蕉苗進(jìn)行根際土樣、根表、根、球莖、假莖和葉片中標(biāo)記菌的分離。
標(biāo)記菌在香蕉根際土中的定殖與消長(zhǎng)動(dòng)態(tài)取5株香蕉苗的根際土(緊附在根系的土)各Ig充分混勻，再?gòu)闹腥g放人9ml無(wú)菌水中渦旋振蕩15min，然后加無(wú)菌水進(jìn)行系列稀釋，用含有利福平5 μ g/ml，鏈霉素300 μ g/ml，制霉菌素50 μ g/ml的NA培養(yǎng)基按 MPN法測(cè)定細(xì)菌數(shù)量(南京土壤所微生物研究室.土壤微生物研究法[M].北京科學(xué)出版社，1985,54-58.)，每濃度均5個(gè)重復(fù)，以空白處理(接無(wú)菌水)為對(duì)照。將平板置37°C下培養(yǎng)3天，統(tǒng)計(jì)每皿菌落數(shù)，最后計(jì)算平均每克根際土(干重)的含菌量，同時(shí)檢查對(duì)照上是否有菌落長(zhǎng)出。
標(biāo)記菌在香蕉根表的定殖與消長(zhǎng)動(dòng)態(tài)將香蕉苗根表的土剝除，每株各取Ig根混合，然后從中隨機(jī)取Ig根，并放人IOml無(wú)菌水中渦旋振蕩15min，所得的水溶液即為母液， 然后加無(wú)菌水進(jìn)行系列稀釋。其余同上，計(jì)算平均每克根(鮮重)的根表含菌量。
標(biāo)記菌在香蕉體內(nèi)的定殖與消長(zhǎng)動(dòng)態(tài)分別取香蕉根、球莖、假莖(離球莖上部 Icm處)和葉片用清水沖洗后，各取Ig先在75%酒精中浸泡lmin，根再用5% NaClO表面消毒6min，而球莖、假莖和葉片經(jīng)5% NaClO表面消毒4min，然后無(wú)菌水漂洗4次，濾紙吸干水分后，進(jìn)行根、球莖、假莖和葉片內(nèi)標(biāo)記菌的分離，取消毒后最后一次漂洗液0. Iml涂布NA 平板。其余同上，計(jì)算平均每克根、球莖、假莖和葉片(鮮重)內(nèi)標(biāo)記菌的數(shù)量，同時(shí)檢查最后一次漂洗水和對(duì)照上是否有菌落長(zhǎng)出。
研究顯示，通過(guò)傷根或灌根接種，TR21都能夠在香蕉根系和假莖中定殖，也能夠在香蕉根際土壤中定殖，定殖的能力隨時(shí)間延長(zhǎng)而下降，定殖能力測(cè)定結(jié)果參見(jiàn)圖13和圖 14。
(四)對(duì)香蕉枯萎病的田間防治試驗(yàn) 利用TR21對(duì)香蕉枯萎病進(jìn)行田間生物防治試驗(yàn)，試驗(yàn)地點(diǎn)為珠海市斗門小赤坎村和井岸雞嘴村香蕉種植地，供試香蕉品種為巴西蕉(香蕉，感病品種)、農(nóng)科1號(hào)(香蕉， 抗病品種)、皇帝蕉(香蕉，感病品種)，均為新植苗。TR21使用方式均為NA發(fā)酵液40倍稀釋液灌根，每株灌4斤稀釋液，每月灌一次，葉腋噴施時(shí)，采用40倍稀釋后，每月噴3次，每次噴50ml左右。
UTR21灌根處理對(duì)巴西蕉香蕉枯萎病的防治試驗(yàn) 試驗(yàn)在小赤坎進(jìn)行，從2008年3月到2009年9月，跨越2茬，其中第一茬從2008 年3月到2008年10月，處理區(qū)面積507. 7m2，初始蕉苗86株，2008年4月試驗(yàn)開(kāi)始時(shí)因枯萎病發(fā)病和冷害導(dǎo)致8. 14%的植株死亡，試驗(yàn)實(shí)際有效株79株。對(duì)照區(qū)面積880. lm2，初始蕉苗144株，2008年4月統(tǒng)計(jì)的總死亡率為21. 53%，試驗(yàn)開(kāi)始時(shí)實(shí)際有效處理巴西蕉113 株。第一茬的數(shù)據(jù)表明，至2008年9月收蕉止，對(duì)照的發(fā)病率為17.22%，TR21灌根處理的發(fā)病率為6. 33%，防治效果為63. 23%。在防治香蕉枯萎病的同時(shí)，TR21灌根處理對(duì)巴西蕉產(chǎn)量沒(méi)有影響，對(duì)照及TR21灌根處理的植株的香蕉產(chǎn)量均為50斤/株左右。
第一輪試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，到2008年12月調(diào)查時(shí)，對(duì)照在第一輪生長(zhǎng)周期的總死亡率超過(guò)50%，被農(nóng)戶放棄，因而2009年進(jìn)行第二輪實(shí)驗(yàn)時(shí)，處理區(qū)以第一輪試驗(yàn)存活的吸芽為對(duì)象繼續(xù)開(kāi)展灌根，有效株69株，對(duì)照區(qū)則重新選擇，并采用藥劑處理。對(duì)照區(qū)面積 1163. 9m2，第一年種植巴西蕉212株，因枯萎病和臺(tái)風(fēng)等因素導(dǎo)致的死亡率達(dá)到56. 13%, 第二年存活吸芽93株，用70 %多菌靈600倍灌根(青島海澳生化有限公司生產(chǎn))，每株 2000ml，每月一次。數(shù)據(jù)分析時(shí)，以藥劑處理的發(fā)病率為對(duì)照計(jì)算防效。至2009年9月開(kāi)始收蕉止，對(duì)照的發(fā)病率為38. 85%, TR21灌根處理的發(fā)病率為10. 14%，防治效果為 73.90%。在防治香蕉枯萎病的同時(shí)，TR21的灌根處理對(duì)巴西蕉的產(chǎn)量沒(méi)有影響，對(duì)照及 TR21灌根處理的植株的香蕉產(chǎn)量均為64斤/株左右。2輪綜合防效估算結(jié)果如表7。
表7TR21連續(xù)灌根2年的綜合防效
2、TR21灌根處理對(duì)農(nóng)科1號(hào)香蕉枯萎病的防治測(cè)試 試驗(yàn)在小赤坎村進(jìn)行。試驗(yàn)時(shí)間從2008年3月到2008年9月，處理區(qū)面積 454.6m2，種植農(nóng)科1號(hào)89株，2008年4月15日實(shí)驗(yàn)開(kāi)始時(shí)調(diào)查，確定枯萎病發(fā)病率為 22. 47%，實(shí)際用于調(diào)查的有效株為69株；對(duì)照區(qū)面積568. Im2，種植農(nóng)科1號(hào)86株，初始發(fā)病率為25. 58%，試驗(yàn)時(shí)實(shí)際存活64株。
至2008年9月收蕉止，對(duì)照的發(fā)病率為21. 88%, TR21灌根處理的發(fā)病率為 8. 70%，防治效果為60. 25%。
3、TR21灌根處理對(duì)皇帝蕉Musaparadisiacal AA香蕉枯萎病的防治測(cè)試 試驗(yàn)在斗門小赤坎村進(jìn)行。試驗(yàn)時(shí)間從2009年2月到2009年9月，皇帝蕉新植蕉苗，套種于第一茬巴西蕉原來(lái)死亡的空缺。處理區(qū)面積1073. 4m2，種植皇帝蕉130株，初始發(fā)病率為0%。對(duì)照區(qū)共設(shè)置兩個(gè)，一個(gè)為陰性對(duì)照區(qū)(即該區(qū)不作任何防治措施)，面積42. 6m2，種植皇帝42株，初始發(fā)病率為0% ；另一個(gè)為陽(yáng)性對(duì)照區(qū)(即該區(qū)以進(jìn)口多菌靈 600倍液灌根作為防治措施)，面積982. 6m2，種植皇帝119株，初始發(fā)病率為0%。每月進(jìn)行一次數(shù)據(jù)調(diào)查，實(shí)行定點(diǎn)定株調(diào)查，并拍照記錄。
數(shù)據(jù)表明，至2009年9月開(kāi)始收蕉止，陰性對(duì)照區(qū)發(fā)病21株，發(fā)病率50. 00%，陽(yáng)性對(duì)照區(qū)發(fā)病26株，發(fā)病率為21.86%，TR21處理區(qū)發(fā)病12株，發(fā)病率為8.51% ；與陰性對(duì)照區(qū)相比，TR21防治效果為82. 09%，而藥劑的防效僅為56. 30%。
4、TR21葉腋噴施對(duì)農(nóng)科1號(hào)枯萎病的防治測(cè)試 試驗(yàn)在井岸雞嘴村進(jìn)行。從2008年5月開(kāi)始，開(kāi)展NA發(fā)酵液40倍稀釋噴施葉腋防治農(nóng)科1號(hào)枯萎病的研究，農(nóng)科1號(hào)種苗為新植苗。每月噴施3次，每隔10天1次。試驗(yàn)區(qū)面積10畝，調(diào)查時(shí)統(tǒng)計(jì)3個(gè)區(qū)，并設(shè)置2個(gè)對(duì)照區(qū)。試驗(yàn)采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，結(jié)果方差分析和F檢驗(yàn)。
從2008年5月開(kāi)始，到2009年9月結(jié)束，到2009年8月農(nóng)科1號(hào)處理的發(fā)病率為6. 74 %，對(duì)照發(fā)病率44. 93 %，差異極顯著，防效達(dá)到85 %。
實(shí)施例五對(duì)西芹黃萎病的田間防治試驗(yàn) 2007年12月到1月間在珠海白藤湖無(wú)公害蔬菜生產(chǎn)基地開(kāi)展了TR21發(fā)酵液100 倍稀釋潑灑對(duì)西芹黃萎病的防治效果評(píng)價(jià)，西芹品種為文圖拉。通過(guò)3次潑灑后，統(tǒng)計(jì)的發(fā)病率數(shù)據(jù)顯示，對(duì)照的總發(fā)病率達(dá)到10. 67%，處理的發(fā)病率4. 22%，防效達(dá)到60. 45%。由于發(fā)酵液的活菌濃度較低，稀釋倍數(shù)較大，因而防效偏低，如果提高發(fā)酵液活菌數(shù)，在相同的施用濃度下，可能會(huì)得到更好的防治效果。
權(quán)利要求
1.一株植物內(nèi)生枯草芽胞桿菌TR21 (Bacillus subtilis str. TR21)，于2010年1月 20日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心CCTCC，保藏號(hào)為CCTCC No :M2010019。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的植物內(nèi)生枯草芽胞桿菌TR21，其特征在于，該菌株為革蘭氏 陽(yáng)性菌，菌體桿狀，產(chǎn)生芽胞，接觸酶、氧化酶試驗(yàn)陽(yáng)性。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的植物內(nèi)生枯草芽胞桿菌TR21，其特征在于，該菌株能在 0. 001%的溶菌酶存在下生長(zhǎng)，具有水解淀粉、酪蛋白、尿素、吐溫80的能力，能夠利用檸檬 酸鹽，具有糖酵解能力、硝酸鹽還原能力，具有產(chǎn)硫化氫能力，在3%到10%的NaCl存在時(shí) 均能生長(zhǎng)，pH5. 0、H9. 0均能生長(zhǎng)，最佳生長(zhǎng)pH值為6. 0，最佳氮源為酵母浸提物，最佳碳源 為葡萄糖，V. P反應(yīng)陰性，不產(chǎn)生苯丙氨酸脫氨酶，不能利用蘋果酸和甘氨酸，不能利用阿拉 伯糖產(chǎn)酸，不能利用酪氨酸，不能產(chǎn)生二羥基丙酮，不能在50°C和10°C生長(zhǎng)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的植物內(nèi)生枯草芽胞桿菌TR21，其特征在于，該菌株在NA培養(yǎng) 基上，老齡菌落顏色金黃色、表面光滑較粘稠、有時(shí)會(huì)出現(xiàn)褶皺；在PDA上，菌落生長(zhǎng)初期出 現(xiàn)濃狀，隨后變成干燥粗糙的表面，菌落并呈現(xiàn)出明顯的擴(kuò)展能力。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的植物內(nèi)生枯草芽胞桿菌TR21在抑制植物病原真菌方面的應(yīng)用。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的植物內(nèi)生枯草芽胞桿菌TR21在防治由尖孢鐮刀菌引起香蕉 枯萎病和西芹黃萎病方面的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一株對(duì)植物病原真菌具有廣譜拮抗能力的枯草芽胞桿菌TR21(后續(xù)簡(jiǎn)稱TR21)，具體地說(shuō)是提供枯草芽胞桿菌TR21(Bacillus subtilisstr.TR21)菌株及其對(duì)植物病原真菌的生長(zhǎng)抑制作用。本發(fā)明提供的枯草芽胞桿菌TR21菌株(Bacillis subtilis str.TR21)，已于2010年1月20日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，地址中國(guó)湖北省武昌珞珈山武漢大學(xué)校內(nèi)中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心；保藏號(hào)為CCTCC NoM 2010019。本發(fā)明提供的上述菌株通過(guò)獲得的16S rDNA、gyrA和gyrB基因片段，并在NCBI上通過(guò)BLAST搜索和比對(duì)后被證明是一種新的枯草芽胞桿菌菌株，能夠?qū)Χ喾N植物病原真菌具有較好的平板拮抗活性，尤其對(duì)各種尖孢鐮刀菌、立枯絲核菌、交鏈孢霉等土傳維管束病害具有很好的拮抗能力，并在田間表現(xiàn)出良好的防治效果。
文檔編號(hào)C12N1/20GK101845410SQ20101011433
公開(kāi)日2010年9月29日 申請(qǐng)日期2010年2月11日 優(yōu)先權(quán)日2010年2月11日
發(fā)明者喻國(guó)輝, 陳燕紅, 黎永堅(jiān), 陳遠(yuǎn)鳳, 楊紫紅, 周林, 程萍 申請(qǐng)人:珠海市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究中心