專利名稱：檢測(cè)皮膚老化相關(guān)基因突變的方法及其專用引物與TaqMan-MGB探針的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用分子生物學(xué)方法對(duì)突變堿基進(jìn)行定性、定量檢測(cè)的引物和探針。特別是涉及用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real-time fluorescent quantification PCR)技術(shù)對(duì)皮膚老化相關(guān)基因突變進(jìn)行定性、定量檢測(cè)的引物和TaqMan-MGB探針。
背景技術(shù)：
目前，在已知的人類2萬(wàn)至2. 5萬(wàn)個(gè)基因中，有1500個(gè)基因?qū)ζつw老化發(fā)揮關(guān)鍵作用。在人類衰老的過(guò)程中，有數(shù)百個(gè)基因會(huì)發(fā)生變異。人類皮膚老化有8種獨(dú)立的方式， 每種方式均由一組基因控制。一個(gè)人的皮膚是否會(huì)出現(xiàn)皺紋，不僅與生活方式有關(guān)，也與基因有關(guān)。每個(gè)人的皮膚老化狀況是不同的，這與每個(gè)人攜帶的遺傳信息不同有很大關(guān)系。 皮膚抗老化能力可以分為四個(gè)指標(biāo)解毒能力；抗光老化能力；抗自由基能力；DNA損傷修復(fù)能力。在與皮膚老化相關(guān)的諸多基因中CYPIAl，CYP2E1，EPHXl，NQO1，GSTPl與皮膚的解毒能力相關(guān)；S0D3，CYBA，CAT，N0S3，P0N1，GPX1與皮膚抗自由基能力相關(guān)；XPA，XPD，XRCCl， MTHFR, hMLHl與NDA損傷修復(fù)能力相關(guān)；MMP1，MMP3，MMP9與皮膚抗光老化能力相關(guān)。通過(guò)檢測(cè)這些基因的突變情況就可以獲得皮膚老化的信息。目前，已報(bào)道的用于檢測(cè)皮膚老化相關(guān)基因突變的方法主要包括PCR直接測(cè)序和定性PCR等，這些方法普遍存在靈敏度低，特異性不高，費(fèi)時(shí)費(fèi)力且易污染等缺點(diǎn)，使應(yīng)用受到一定限制。實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，是指在PCR反應(yīng)體系中加入一對(duì)引物的同時(shí)加入一個(gè)特異性熒光探針，探針只與模板特異結(jié)合，其結(jié)合位點(diǎn)位于兩條引物之間，利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR過(guò)程。目前常用的TaqMan熒光探針為寡核苷酸，其5’端標(biāo)記有報(bào)告熒光基團(tuán)，如FAM，VIC等，3’端標(biāo)記有淬滅熒光基團(tuán)，如TAMRA等。探針完整時(shí)，報(bào)告基團(tuán)發(fā)出的熒光信號(hào)被淬滅基團(tuán)吸收，故檢測(cè)不到熒光，當(dāng)探針與靶序列配對(duì)時(shí)，PCR延伸反應(yīng)聚合酶的5’ 一 3’外切酶活性將探針酶切降解，是報(bào)告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)分離，從而熒光檢測(cè)系統(tǒng)可以接收到熒光信號(hào)。每經(jīng)過(guò)一個(gè)PCR循環(huán)，熒光信號(hào)也和目的片段一樣，有一個(gè)同步指數(shù)增長(zhǎng)的過(guò)程，每個(gè)循環(huán)結(jié)束后檢測(cè)一次熒光強(qiáng)度，整個(gè)反應(yīng)結(jié)束后，便可得到一條擴(kuò)增曲線，由已知濃度標(biāo)準(zhǔn)樣品的擴(kuò)增曲線可以得到一條標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)該標(biāo)準(zhǔn)曲線以及未知模板的擴(kuò)增曲線可對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析。但是，實(shí)際上，探針較長(zhǎng)使得兩端基團(tuán)距離較遠(yuǎn)，會(huì)導(dǎo)致熒光淬滅不徹底，而且，熒光基團(tuán)也會(huì)產(chǎn)生不同波長(zhǎng)的熒光，都會(huì)使得本底偏高。針對(duì)TaqMan探針熒光淬滅不徹底的問題，2000年美國(guó)ABI公司推出了一種新 TaqMan-MGB (TaqMan Minor Groove Binder Probe, TaqMan-MGB ), TaqMa-MGB ^ 針是帶有一個(gè)小溝結(jié)合物基團(tuán)的寡核昔酸探針，工作原理與TaqMan探針相同，報(bào)告熒光基團(tuán)連接在探針的5’端(如FAM、VIC等)，3’端標(biāo)記有淬滅基團(tuán)，不同的是淬滅基團(tuán)為不發(fā)光的淬滅基團(tuán)(Non-Fluorescent Quenoher，NFQ)，淬滅基團(tuán)吸收?qǐng)?bào)告基團(tuán)的能量后并不發(fā)光，大大降低了本底信號(hào)的干擾。此外，MGB探針的3’端還連接了一個(gè)二氫環(huán)化吲哚卟啉-三肽(dehydrocyclopyrroindole tripetide，DPI3)，DPI3 可折疊進(jìn)由探針末端 5_6bp 核營(yíng)酸形成的小溝內(nèi)。DPI3呈新月行，與B型DNA螺旋的淺深小溝一樣螺旋，主要通過(guò)范德華力穩(wěn)定。TaqMan-MGB探針顯示了更強(qiáng)的序列特異性?？梢源蟠蠓€(wěn)定探針與模板的雜交， 升高探針Tm值，使較短的探針同樣能達(dá)到較高的Tm值一而短探針的熒光報(bào)告基團(tuán)和淬滅基團(tuán)的距離更近，淬滅效果更好，熒光背景更低，使得信噪比更高?？傊c傳統(tǒng)的TaqMan探針比較，TaqMan-MGB探針有以下優(yōu)勢(shì)MGB增加了探針熔點(diǎn)溫度(Tm)，這樣可使探針較短，尤其適合富含A/T的序列，并且提高配對(duì)與非配對(duì)模板間的Tm值差異，可進(jìn)行更多重的PCR ；提高信噪比，由于在探針的3 ‘端的淬滅基團(tuán)為不發(fā)光的熒光基團(tuán)，并且與報(bào)告基團(tuán)在空間的位置更接近，實(shí)驗(yàn)的結(jié)果更精確，分辨率更高；且實(shí)驗(yàn)步驟簡(jiǎn)單，雜交的穩(wěn)定性大大提高，重復(fù)性大大提高。目前尚沒有專門用于檢測(cè)皮膚老化相關(guān)基因突變的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)技術(shù)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供針對(duì)皮膚老化相關(guān)基因突變進(jìn)行定性、定量檢測(cè)的引物。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采取以下技術(shù)方案用于檢測(cè)CAT突變的引物，是由序列表中SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 2組成的引物對(duì)。用于檢測(cè)CYBA突變的引物，是由序列表中SEQ ID NO :3和SEQ ID NO :4組成的引物對(duì)。用于檢測(cè)CYPlAl突變的引物，是由序列表中SEQ ID NO :5和SEQ ID N0:6組成的引物對(duì)。用于檢測(cè)CYP2E突變的引物，是由序列表中SEQ ID NO 7和SEQ ID NO 8組成的引物。用于檢測(cè)EPHX突變的引物，是由序列表中SEQ ID NO 9和SEQ ID NO 10組成的引物對(duì)。用于檢測(cè)GSTPl突變的引物，是由序列表中SEQID NO: 11和SEQ ID N0:12組成的引物對(duì)。用于檢測(cè)MTHFR突變的引物，是由序列表中SEQ ID NO 13和SEQ ID NO 14組成的引物對(duì)。用于檢測(cè)N0S3突變的引物，是由序列表中SEQ ID N0:15和SEQ ID N0:16組成的引物對(duì)。用于檢測(cè)NQOl突變的引物，是由序列表中SEQ ID N0:17和SEQ ID N0:18組成的引物對(duì)。用于檢測(cè)PONl突變的引物，是由序列表中SEQ ID N0:19和SEQ ID N0:20組成的引物對(duì)。用于檢測(cè)S0D3突變的引物，是由序列表中SEQ ID N0:21和SEQ ID N0:22組成的引物對(duì)。
用于檢測(cè)XPA突變的引物，是由序列表中SEQ ID NO 23和SEQ ID NO 24組成的引物對(duì)。用于檢測(cè)XPD突變的引物，是由序列表中SEQ ID NO 25和SEQ ID NO 26組成的引物對(duì)。用于檢測(cè)XRCCl突變的引物，是由序列表中SEQ ID NO 27和SEQ ID NO 28組成的引物對(duì)與SEQ ID NO : 和SEQ ID NO 30組成的引物對(duì)。用于檢測(cè)MMP9突變的引物，是由序列表中SEQ ID N0:31和SEQ ID N0:32組成的引物對(duì)。用于檢測(cè)MMP3突變的引物，是由序列表中SEQ ID N0:33和SEQ ID而；34組成的引物對(duì)。用于檢測(cè)MMPl突變的引物，是由序列表中SEQ ID N0:35和SEQ ID N0:36組成的引物對(duì)。用于檢測(cè)hMLHl突變的引物，是由序列表中SEQ ID NO 37和SEQ ID NO 38組成的引物對(duì)。用于檢測(cè)GPXl突變的引物，是由序列表中SEQ ID N0:39和SEQ ID N0:40組成的引物對(duì)。本發(fā)明還提供了針對(duì)皮膚健康相關(guān)基因突變進(jìn)行定性、定量檢測(cè)的TaqMan-MGB 探針。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采取以下技術(shù)方案用于檢測(cè)突變的CAT TaqMan-MGB探針，是序列表中SEQ ID NO 41和SEQ ID NO 42的DNA序列。用于檢測(cè)突變的CYBA TaqMan-MGB探針，是序列表中SEQ ID N0:43和SEQ ID NO: 44的DNA序列。用于檢測(cè)突變的CYPlAl TaqMan-MGB探針，是序列表中SEQ ID NO 45和SEQ ID NO 46的DNA序列。用于檢測(cè)突變的CYP2E TaqMan-MGB探針，是序列表中SEQ ID NO 47和SEQ ID NO 48的DNA序列。用于檢測(cè)突變的EPHX TaqMan-MGB探針，是序列表中SEQ ID N0:49和SEQ ID NO: 50的DNA序列。用于檢測(cè)突變的GSTPl TaqMan-MGB探針，是序列表中SEQ ID NO :51和SEQ ID NO 52的DNA序列。用于檢測(cè)突變的MTHFR TaciMan-MGB探針，是序列表中SEQ ID NO 53禾口 SEQ ID NO 54的DNA序列。用于檢測(cè)突變的N0S3 TaqMan-MGB探針，是序列表中SEQ ID N0:55和SEQ ID NO: 56的DNA序列。用于檢測(cè)突變的NQOl TaqMan-MGB探針，是序列表中SEQ ID N0:57和SEQ ID NO: 58的DNA序列。用于檢測(cè)突變的PONl TaciMan-MGB探針，是序列表中SEQ ID N0:59禾口 SEQ ID NO: 60的DNA序列。
用于檢測(cè)突變的S0D3 TaqMan-MGB探針，是序列表中SEQ ID N0:61和SEQ ID NO: 62的DNA序列。用于檢測(cè)突變的XPA TaqMan-MGB探針，是序列表中SEQ ID NO 63和SEQ ID NO 64的DNA序列。用于檢測(cè)突變的XPD TaqMan-MGB探針，是序列表中SEQ ID NO 65和SEQ ID NO 66的DNA序列。用于檢測(cè)突變的XRCC IiTaciMan-MGB 探針，是序列表中 SEQ ID NO :67，SEQ ID NO: 68，SEQ ID NO :69 和 SEQ ID NO 70 的 DNA 序列。用于檢測(cè)突變的MMP9 TaciMan-MGB探針，是序列表中SEQ ID N0:71禾口 SEQ ID NO: 72的DNA序列。用于檢測(cè)突變的MMP3 TaqMan-MGB探針，是序列表中SEQ ID NO 73的DNA序列。用于檢測(cè)突變的MMPl TaqMan-MGB探針，是序列表中SEQ ID NO 74的DNA序列。用于檢測(cè)突變的hMLHl TaciMan-MGB探針，是序列表中SEQ ID NO 75禾P SEQ ID NO 76的DNA序列。用于檢測(cè)突變的GPXl TaqMan-MGB探針，是序列表中SEQ ID N0:77和SEQ ID NO: 78的DNA序列。所述探針經(jīng)過(guò)熒光標(biāo)記，5’端標(biāo)記有發(fā)光顏色不同的報(bào)告熒光基團(tuán)，3’端不僅標(biāo)記有不發(fā)光的淬滅集團(tuán)，還連接有二氫環(huán)化吲哚卟啉-三肽。報(bào)告熒光基團(tuán)為FAM或VIC， 不發(fā)光的淬滅基團(tuán)為NFQ。本發(fā)明還提供了一種檢測(cè)皮膚健康相關(guān)基因突變的試劑盒，可包括上述用于檢測(cè)皮膚健康相關(guān)基因突變的引物又以及TaqMan-MGB探針。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明結(jié)合具體實(shí)施例做進(jìn)一步說(shuō)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明目的，而不用限制本發(fā)明范圍實(shí)施例1、用于對(duì)皮膚健康相關(guān)基因CAT突變進(jìn)行檢測(cè)的引物和TaqMan-MGB探針的設(shè)計(jì)CAT基因序列的突變位點(diǎn)，用Primer Express Software 2. 0軟件設(shè)計(jì)PCR引物， 同時(shí)根據(jù)野生型CAT基因及突變型CAT基因的反向互補(bǔ)序列設(shè)計(jì)2條TaqMan-MGB探針，將 2條TaqMan-MGB探針的5’端分別標(biāo)記報(bào)告熒光基因FAM(紅色熒光)和VIC(綠色熒光)， 3’端標(biāo)記不發(fā)光淬滅基團(tuán)，并連接DIP3。引物及TaqMan-MGB探針序列為引物5， -attttactcttcaacatagctttt-3，5， -attggcttctttaaacactggaga-3，TaqMan-MGB 探針5， -VIC-cttacctgggggtaaaatttg-MGB-3，5' -FAM-cttacctgggagtaaaatttg-MGB-3'實(shí)施例2、皮膚健康相關(guān)基因CAT突變的檢測(cè)1)樣本基因組DNA的獲取
8
用細(xì)胞裂解法提取口腔粘膜脫落細(xì)胞中的DNA，懸浮于Iml生理鹽水中，2000Xg 離心IOmin ；棄上清，每管加Iml生理鹽水重復(fù)洗滌一次，再2000 X g離心IOmin ；棄上清，每管加 400 μ 1 細(xì)胞裂解緩沖液(10mmol/L Tris-HCl, PH 8. 0 ；0. Imol EDTA, PH 8. 0 ；0. 5% SDS)，放在50°C水浴中溫育30分鐘；然后冷卻至室溫，加等體積的酚一氯仿一異戊醇(體積比25 24 1)，混勻，5000 Xg離心IOmin ；轉(zhuǎn)移上層水相到另一 Eppendorf管中，重復(fù)抽提一次；再轉(zhuǎn)移上層水相到另一 Eppendorf管中，加1/10體積的3M NaAc (pH5. 2)，混勻； 加入2. 5倍體積的95%冷乙醇，混勻，-20°C沉淀DNA 30分鐘；10000 Xg離心15分鐘，棄上清；加lml70%冷乙醇清洗沉淀，IOOOOXg離心分鐘，棄上清；37°C溫箱30分鐘烘干；將DNA 沉淀溶于20 μ 1 TE緩沖液中，加1 μ 1 RNA酶，37°C 30分鐘，置于_20°C保存。2) PCR 擴(kuò)增以步驟1)提取的DNA為模板，在實(shí)施例1所述引物及TaqMan-MGB探針的引導(dǎo)下， 用ABI7900實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并按等位基因鑒別實(shí)驗(yàn)操作步驟完成并分析，即依次進(jìn)行讀取等位基因鑒別實(shí)驗(yàn)PCR擴(kuò)增前信號(hào)、執(zhí)行擴(kuò)增程序及讀取、分析擴(kuò)增后信號(hào)。其中，PCR反應(yīng)體系為2 XTaqMan通用PCR擴(kuò)增預(yù)混試劑 (購(gòu)自美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司)，引物各900nM，熒光標(biāo)記的2條I1aqMan-MGB探針各200nM， 150ng DNA。PCR反應(yīng)條件為先95°C 10分鐘；然后95°C 15秒，60°C 1分鐘，共40個(gè)循環(huán)。3)得出結(jié)果用SDS軟件(美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司)分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果。本次實(shí)驗(yàn)共取100名受試
者樣本進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，最終的基因型分布見下表。
受試者數(shù)AAAGGG
1OO51445序列表<160>64<210>1<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><230><400>1attttactct tcaacatagc tttt<210>2<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><230><400>2
attggcttct ttaaacactggaga
<210>3
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<230>
<400>3
ccgagtggga gaggcccagcCgCg
<210>4
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<230>
<400>4
atagtaattc ctggtaaagggccc
<210>5
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<230>
<400>5
agaaggtgat tatctttggcatgg
<210>6
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<230>
<400>6
ttccacccg ttgcagcaggatagc
<210>7
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<230>
<400>7cttcatttct catcatattt tcta<210>8<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><230><400>8ttctgttcta actggcaata tata<210>9<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><230><400>9atctcctact ggcggaatga at tt<210>10<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><230><400>10tcggtctctc cctacataca gtac<210>11<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><230><400>11Bgccctggtg gacatggtga atga<210>12<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<230><400>12ccaaccctgg tgcagatgct caca<210>13<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><230〉<400>13atgtgtcagc ctcaaagaaa agct<210>14<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><230><400>14ccgaagcagg gagctttgag gctg<210>15<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><230><400>15aggaaacggt cgcttcgacg tgct<210>16<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><230><400>16acgtggggtg ctccaggggc acct<210>17<211>24<212>DNA<213>人工序列
12
<220>
<230>
<400>17
cttccaggat ttgaattcgggcgt
<210>18
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<230>
<400>18
cctcagagtg gcattctgcatttc
<210>19
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<230>
<400>19
tcacttggac tatagtagac3.3.C3.
<210>20
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<230>
<400>20
ttatgtgtgt atgttttaattgca
<210>21
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<230>
<400>21
tgggcgtgtg CgggCCSgggctct
<210>22
<211>24
<212>DNA<213>人工序列 <220> <230> <400>22
tggccgccgc cgggtggggg CCgC <210>23 <211>24 <212>DNA <213>人工序列 <220> <230> <400>23
ctaaagccgc cgcctccggc aaag
<210>24
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<230>
<400>24
ctggctcgcc tcggcgtgca gtgc
<210>25 <211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<230>
<400>25
gaaccgttta tggccccacc cgcc
<210>26
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<230>
<400>26
cctgtccctg ctcatcctgg agca
<210>27
<211>24
CN 102168128 A
說(shuō)明書10/21頁(yè)
[0243 [0244 [0245 [0246 [0247 [0248 [0249 [0250 [0251 [0252 [0253 [0254 [0255 [0256 [0257 [0258 [0259 [0260 [0261 [0262 [0263 [0264 [0265 [0266 [0267 [0268 [0269 [0270 [0271 [0272 [0273 [0274 [0275 [0276 [0277 [0278 [0279 [0280 [0281
1權(quán)利要求
1.用于檢測(cè)CAT突變的引物，是由序列表中SEQID NO :1和SEQ ID NO :2組成的引物對(duì)。
2.用于檢測(cè)CYBA突變的引物，是由序列表中SEQID NO :3和SEQ ID NO :4組成的引物對(duì)。
3.用于檢測(cè)CYPlAl突變的引物，是由序列表中SEQID NO :5和SEQ ID NO :6組成的引物對(duì)。
4.用于檢測(cè)CYP2E突變的引物，是由序列表中SEQID NO :7和SEQ ID NO :8組成的引物對(duì)。
5.用于檢測(cè)EPHX突變的引物，是由序列表中SEQID NO :9和SEQ ID N0:10組成的引物對(duì)。
6.用于檢測(cè)GSTPl突變的引物，是由序列表中SEQID N0:11和SEQ ID N0:12組成的引物對(duì)。
7.用于檢測(cè)MTHFR突變的引物，是由序列表中SEQIDN0:13和SEQ ID N0:14組成的引物對(duì)。
8.用于檢測(cè)N0S3突變的引物，是由序列表中SEQID N0:15和SEQ ID N0:16組成的引物對(duì)。
9.用于檢測(cè)NQOl突變的引物，是由序列表中SEQID NO 17和SEQ ID NO 18組成的引物對(duì)。
10.用于檢測(cè)PONl突變的引物，是由序列表中SEQID N0:19和SEQ ID N0:20組成的引物對(duì)。
11.用于檢測(cè)S0D3突變的引物，是由序列表中SEQID NO :21和SEQ ID N0:22組成的引物對(duì)。
12.用于檢測(cè)XPA突變的引物，是由序列表中SEQID NO 23和SEQ ID NO 24組成的引物對(duì)。
13.用于檢測(cè)XPD突變的引物，是由序列表中SEQID NO 25和SEQ ID NO J6組成的引物對(duì)。
14.用于檢測(cè)XRCCl突變的引物，是由序列表中SEQID NO 27和SEQ ID NO J8組成的引物對(duì)與SEQ ID NO 29和SEQ ID NO 30組成的引物對(duì)。
15.用于檢測(cè)MMP9突變的引物，是由序列表中SEQID NO :31和SEQ ID N0:32組成的引物對(duì)。
16.用于檢測(cè)MMP3突變的引物，是由序列表中SEQID N0:33和SEQ ID而；34組成的引物對(duì)。
17.用于檢測(cè)MMPl突變的引物，是由序列表中SEQID NO 35和SEQ ID NO :36組成的引物對(duì)。
18.用于檢測(cè)hMLHl突變的引物，是由序列表中SEQID NO 37和SEQ ID NO 38組成的引物對(duì)。
19.用于檢測(cè)GPXl突變的引物，是由序列表中SEQID NO 39和SEQID NO :40組成的引物對(duì)。
20.用于檢測(cè)突變的CATTaqMan-MGB探針，是序列表中SEQ ID NO :41禾口 SEQ ID NO:(42的DNA序列。
21.用于檢測(cè)突變的CYBATaqMan-MGB探針，是序列表中SEQ ID N0:43和SEQ ID NO: 44的DNA序列。
22.用于檢測(cè)突變的CYPlAlTaqMan-MGB探針，是序列表中SEQ ID NO 45和SEQ ID NO 46的DNA序列。
23.用于檢測(cè)突變的CYP2EiTaqMan-MGB探針，是序列表中SEQ ID N0:47和SEQ ID NO: 48的DNA序列。
24.用于檢測(cè)突變的EPHXTaqMan-MGB探針，是序列表中SEQ ID N0:49和SEQ ID NO: 50的DNA序列。
25.用于檢測(cè)突變的GSTPlTaqMan-MGB探針，是序列表中SEQ ID N0:51和SEQ ID NO: 52的DNA序列。
26.用于檢測(cè)突變的MTHFRTaciMan-MGB探針，是序列表中SEQ ID NO :53和SEQ ID NO: 54的DNA序列。
27.用于檢測(cè)突變的N0S3TaqMan-MGB探針，是序列表中SEQ ID N0:55和SEQ ID N0: 56的DNA序列。
28.用于檢測(cè)突變的NQOlTaqMan-MGB探針，是序列表中SEQ ID N0:57和SEQ ID N0: 58的DNA序列。
29.用于檢測(cè)突變的PONlTaqMan-MGB探針，是序列表中SEQ ID N0:59和SEQ ID N0: 60的DNA序列。
30.用于檢測(cè)突變的S0D3TaqMan-MGB探針，是序列表中SEQ ID N0:61禾口 SEQ ID N0: 62的DNA序列。
31.用于檢測(cè)突變的XPATaqMan-MGB探針，是序列表中SEQ ID NO :63禾口 SEQ ID N0: 64的DNA序列。
32.用于檢測(cè)突變的XPDTaqMan-MGB探針，是序列表中SEQ ID NO 65禾口 SEQ ID N0: 66的DNA序列。
33.用于檢測(cè)突變的XRCCITaqMan-MGB探針，是序列表中SEQID NO :67，SEQ ID N0: 68，SEQ ID NO :69 和 SEQ ID NO 70 的 DNA 序列。
34.用于檢測(cè)突變的MMP9TaciMan-MGB探針，是序列表中SEQ ID N0:71禾口 SEQ ID N0: 72的DNA序列。
35.用于檢測(cè)突變的MMP3TaqMan-MGB探針，是序列表中SEQ ID NO :73的DNA序列。
36.用于檢測(cè)突變的MMPlTaqMan-MGB探針，是序列表中SEQ ID NO :74的DNA序列。
37.用于檢測(cè)突變的hMLHlTaqMan-MGB探針，是序列表中SEQ ID N0:75和SEQ ID N0: 76的DNA序列。
38.用于檢測(cè)突變的GPXlTaqMan-MGB探針，是序列表中SEQ ID N0:77和SEQ ID N0: 78的DNA序列。
39.根據(jù)權(quán)利要求20-38所述的DNA序列，其特征在于5’端標(biāo)記有發(fā)光顏色不同的報(bào)告熒光基團(tuán)，3’端不僅標(biāo)記有不發(fā)光的淬滅集團(tuán)，還連接有二氫環(huán)化吲哚卟啉-三肽。
40.根據(jù)權(quán)利要求20-38所述的TaqMan-MGB探針，其特征在于所述報(bào)告熒光基團(tuán)為 FAM或VIC，不發(fā)光的淬滅基團(tuán)為NFQ。
41. 一種檢測(cè)皮膚老化相關(guān)基因突變的試劑盒，包括權(quán)利要求1-19所述的引物以及權(quán)利要求20-38所述的TaqMan探針。
全文摘要
本發(fā)明公開了用于檢測(cè)皮膚老化相關(guān)基因突變的方法及其專用引物與TaqMan-MGB探針。用于檢測(cè)皮膚老化相關(guān)基因突變的引物，是由序列表中SEQ ID1～SEQ ID40共40條DNA序列組成。該TaqMan-MGB探針是序列表中SEQ ID41～SEQ ID78共38條DNA序列所述DNA序列5’端標(biāo)記有發(fā)光顏色不同的報(bào)告熒光基團(tuán)，3’端不僅標(biāo)記有不發(fā)光的淬滅集團(tuán)，還連接有二氫環(huán)化吲哚卟啉-三肽。本發(fā)明為皮膚老化的檢測(cè)、測(cè)試、分析、評(píng)估提供了一條快速、可靠、準(zhǔn)確的新途徑。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102168128SQ20101011452
公開日2011年8月31日 申請(qǐng)日期2010年2月26日 優(yōu)先權(quán)日2010年2月26日
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