專利名稱：一種微量核酸檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及核酸檢測方法，具體是一種微量核酸檢測方法。
背景技術(shù)：
近年來，DNA分析技術(shù)廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)、法學(xué)、環(huán)境等諸多領(lǐng)域，成為科學(xué)研 究的一大重點。然而，用于分析的樣本DNA含量可能極其有限，少有遺損就可能導(dǎo)致無 法成功檢測或者沒有足夠的樣本DNA來滿足再次檢測的需要。因此如何對獲得的極其微 量的DNA樣本進(jìn)行準(zhǔn)確的定量，成為目前相關(guān)學(xué)科關(guān)注的熱點之一。因此開發(fā)一種經(jīng) 濟(jì)、簡便、快速的檢測手段顯得十分重要與迫切。石英晶體微天平可以適時檢測DNA， 操作較為簡便快捷，但是缺點是檢測精度不高，無法達(dá)到臨床檢測的要求，從而限制了 它的推廣。如(l)Patolsky，F(xiàn). ； Lichtenstein，A. ； Willner, LJ.Am.Chem.Soc.2001， 123，5194-5205 ； (2) Patolsky, F. ； Lichtenstein，A. ； Willner，LJ.Am.Chem.Soc.2000， 122, 418-419 ； (3) Bardea A ； Dagan A ； Ben—Dov I.A.Bardea，A.Dagan, I.Ben—Dov, B.Amitand I.Willner, Chem.Commun. (1998)，839-840，。國內(nèi)學(xué)者利用多重置換擴增技術(shù)用于法醫(yī)學(xué)微量DNA檢測，陳玲，劉超，王慧 君，邱平明.Evidence Science，2008Vol.l6, No.6, 754-756。但是這種方法操作較為繁 瑣，同時需要知道原始DNA樣本的濃度，因此該方法在實際使用中受到了很大限制。還 有人學(xué)者，對微量DNA檢測也是采用PCR方法，但是他們采用乙醇沉淀法回收PCR中 的模版從而較少了微量DNA樣本的損失，該操作的缺點一是操作較為繁瑣費時，另外在 PCR過程和乙醇沉淀過程中模版DNA都會有損失，因此實際應(yīng)用仍然受限?；谏鲜霾蛔?，本發(fā)明研究了新的微量核酸定量檢測方法，研究基于 UltraPowerDNA核酸染料與核酸結(jié)合熒光信號會增強800-1000倍的原理，可以方便的進(jìn) 行微量DNA的檢測，而且檢測的DNA分子量范圍寬，更具實用性。同時引入了計算機 程序分析手段，不僅提高了分辨率同時降低了誤差，最低可檢出12.5pg/yL核酸。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在提供一種微量核酸檢測方法，以解決背景技術(shù)中的不足。一種微量核酸檢測方法，利用UltraPowerDNA核酸染料與核酸結(jié)合熒光信號會 增強800-1000倍的原理，采用了計算機程序進(jìn)行分析最低可檢出12.5pg/μ L核酸，該方 法的具體步驟為(1)儀器安裝首先將UltraPower可見光凝膠透射儀置于水平桌面；使用時，直接把變壓器電 源插頭接變壓器插口，安裝完畢待用；(2)試驗操作將待測樣品準(zhǔn)備好，同時準(zhǔn)備已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)品DNA，染料為自主研發(fā)的 UltraPower核酸染料(即用型)，具體操作步驟
A標(biāo)準(zhǔn)品的處理標(biāo)準(zhǔn)品的濃度并不十分固定，可根據(jù)需要進(jìn)行調(diào)整，一般核 酸的終濃度在10-2000pg/y L的條件下，可以得到比較好的線性關(guān)系。因此可將標(biāo)準(zhǔn)品 用蒸餾水稀釋至濃度為1600，800，400，200，100，50，25pg/ μ L,同時以用于稀釋 標(biāo)準(zhǔn)品核酸的蒸餾水做空白對照；B在透明管內(nèi)進(jìn)行操作，如可以使用PCR管或八連管等。將標(biāo)準(zhǔn)品和樣品與 UltraPower核酸染料(即用型)等體積混勻(如5 μ L核酸溶液與5 μ L UltraPower 核酸 染料(即用型)混勻)此時標(biāo)準(zhǔn)品核酸的終濃度為800，400，200，100，50，25，12.5， Opg/ μ L,在室溫下避光放置30min，使UltraPower 核酸染料與待測DNA充分反應(yīng)，反 應(yīng)結(jié)束后將反應(yīng)管放在透射儀的藍(lán)色顯色板上，將暗箱蓋好；(3) DNA 成像打開UltraPower可見光凝膠透射儀的電源，由于UltraPower核酸染料與待測 DNA反應(yīng)后會發(fā)出熒光，通過暗箱上方的顯色片就可以清楚的觀測到發(fā)光的DNA樣品， 用數(shù)碼相機拍照；(4) DNA樣品濃度分析拍照后，打開計算機，進(jìn)入pgdetect程序，將上步中拍好的圖片導(dǎo)入pgdetect程
序，點擊檢測按鈕進(jìn)行DNA濃度分析；
pgdetect程序界面主要有以下幾個部分組成
A添加控制點首先點擊添加控制點，對標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行設(shè)定，鼠標(biāo)點擊對應(yīng)的標(biāo) 在pgdetect的界面右上角的表格中的序號一列中會自動出現(xiàn)控制點序號即1，2， 5等，雙擊序號在濃度一欄中輸入相應(yīng)的濃度； B刪除選中控制點對控制點進(jìn)行刪除，首先選中要刪除的控制點，點擊此按
對控制點信息進(jìn)行保存。點擊此按鈕，即可保存當(dāng)前界面 點擊此按鈕，即可利用已經(jīng)保存的控制點信息，對當(dāng)前的 點擊此按鈕后，鼠標(biāo)點擊樣品點處，在程序左下角即會出
準(zhǔn)品， 3，4，
鈕即可，C保存控制點信息. 的控制點信息。D讀取控制點信息 未知樣品進(jìn)行定量檢測。E計算當(dāng)前點濃度 現(xiàn)未知樣品濃度值。在本發(fā)明中，檢測的核酸堿基數(shù)大于幾十bp，所用的檢測器為UltraPower可見
光凝膠透射儀。在本發(fā)明中，所述的成像系統(tǒng)主要由發(fā)射光源、濾光片和暗箱三部分組成，其 中光源由順序排列的多個發(fā)光二極管構(gòu)成，濾光片由塑料材質(zhì)的亞克力板構(gòu)成，暗箱是 由特質(zhì)材料制備的箱體和長波濾光片兩部分構(gòu)成。在本發(fā)明中，所用的檢測染料為的UltraPower核酸染料。在本發(fā)明中，待測核酸的終濃度在10_2000pg/yL范圍內(nèi)效果較好。在本發(fā)明中，核酸與UltraPower核酸染料的反應(yīng)容器為透明的PCR管、八連管 等質(zhì)地均勻的透明薄壁管。在本發(fā)明中，用于分析DNA濃度的計算機程序為pgdetect程序。本發(fā)明中，首先選擇一種DNA染料，該染料可需具備以下幾個特點，第一染料能和核酸樣品結(jié)合并發(fā)出熒光，第二該染料靈敏度必須非常高，即有微量的DNA與之結(jié) 合便可以發(fā)出能被有效檢測，第三染料最好對不同大小的DNA分子都有較好的結(jié)合效 果，然后必須找到一臺對應(yīng)的儀器可以準(zhǔn)確的檢測到DNA與核酸染料結(jié)合后發(fā)出的熒 光，并進(jìn)行記錄。最后為了克服人眼的主觀性，保證檢測數(shù)據(jù)有更高的可信度，應(yīng)該有 一套計算程序用于對DNA與核酸染料結(jié)合后發(fā)出的熒光信號進(jìn)行分析。有益效果本發(fā)明極大的避免外部因素如鹽離子濃度、pH、DNA提取試劑殘留(如乙醇， 苯酚，氯仿等)的影響，尤其適用于對微量DNA的定量。


圖1 標(biāo)準(zhǔn)品 DNA 樣品的測定。I8OOpg/ μ 1，2 400pg/ μ 1，3 200pg lOOpg/μΙ, 5 50pg/yl, 6 25pg/yl, 7 12.5pg/yl, 8 空白對照。圖2未知濃度的DNA樣品的測定。1原液，2稀釋2倍，3稀釋4倍， 倍，5稀釋16倍，6稀釋32倍，7稀釋64倍，8空白對照。
具體實施例方式以下結(jié)合實施例對本發(fā)明所涉及納米焦磷酸氧鈦新型光催化材料的制備及其光 催化降解應(yīng)用作進(jìn)一步說明。實施例1 標(biāo)準(zhǔn)品DNA樣品的測定將10ug/ul的DNA標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行梯度稀釋，稀釋至濃度為1600，800，400， 200，100，50，25pg/yL。(1)取上述不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品DNA5ul于八連管中，每管中加入5ulUltraPower
核酸染料，用微量移液器混勻，避光放置30min。(2)將反應(yīng)好的八連管放置于UltraPower可見光凝膠透射儀表面上，蓋好透射儀 的蓋子，打開電源進(jìn)行觀察，用數(shù)碼相機進(jìn)行拍照。(3)打開計算機，進(jìn)入pgdetect程序，將照片輸入計算機進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，用于未 知濃度的DNA樣品濃度的分析。實施例2未知微量DNA濃度的檢測取一根正常人的頭發(fā)，從毛囊部分提取的DNA樣本，將樣品分別稀釋O、2、 4、8、16、32、64 倍。(1)取上述不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品DNA5ul于八連管中，每管中加入5ul UltraPower核
酸染料，用微量移液器混勻，避光放置30min。(2)將反應(yīng)好的八連管放置于UltraPower可見光凝膠透射儀表面上，蓋好透射儀 的蓋子，打開電源進(jìn)行觀察，用數(shù)碼相機進(jìn)行拍照。(3)打開計算機，進(jìn)入pgdetect程序，將照片輸入計算機進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，根據(jù)標(biāo) 準(zhǔn)品DNA的濃度分析未知濃度的DNA樣品濃度。以上顯示和描述了本發(fā)明的基本原理和主要特征和本發(fā)明的優(yōu)點。本行業(yè)的
/μ ，2 4
4稀釋8技術(shù)人員應(yīng)該了解，本發(fā)明不受上述實施例的限制，上述實施例和說明書中描述的只是 說明本發(fā)明的原理，在不脫離本發(fā)明精神和范圍的前提下，本發(fā)明還會有各種變化和改 進(jìn)，這些變化和改進(jìn)都落入要求保護(hù)的本發(fā)明范圍內(nèi)。本發(fā)明要求保護(hù)范圍由所附的權(quán) 利要求書及其等效物界定。
權(quán)利要求
1.一種微量核酸檢測方法，其特征在于該方法的步驟為(1)儀器安裝首先將UltraP0wer可見光凝膠透射儀置于水平桌面；使用時，直接把 變壓器電源插頭接變壓器插口，安裝完畢待用；(2)試驗操作將待測樣品準(zhǔn)備好，同時準(zhǔn)備已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)品DNA，染料為自主 研發(fā)的UltraPower核酸染料(即用型)，具體操作步驟A標(biāo)準(zhǔn)品的處理標(biāo)準(zhǔn)品的濃度并不十分固定，可根據(jù)需要進(jìn)行調(diào)整，一般核酸的 終濃度在10-2000pg/yL的條件下，可以得到比較好的線性關(guān)系，將標(biāo)準(zhǔn)品用蒸餾水稀 釋至濃度為1600，800，400，200，100，50，25pg/L，同時以用于稀釋標(biāo)準(zhǔn)品核酸的 蒸餾水做空白對照；B在透明管內(nèi)進(jìn)行操作，如可以使用PCR管或八連管，將標(biāo)準(zhǔn)品和樣品與UltraPower 核酸染料(即用型)等體積混勻(如5 μ L核酸溶液與5 μ LUltraPower 核酸染料(即用 型)混勻)此時標(biāo)準(zhǔn)品核酸的終濃度為800，400，200，100，50，25，12.5，Opg/ μ L, 在室溫下避光放置30min，使UltraPower 核酸染料與待測DNA充分反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后 將反應(yīng)管放在透射儀的藍(lán)色顯色板上，將暗箱蓋好；(3)DNA 成像打開UltraPower可見光凝膠透射儀的電源，由于UltraPower核酸染料與待測DNA反應(yīng)后會發(fā)出熒光，通過暗箱上方的顯色片就可以清楚的觀測到發(fā)光的DNA樣品，用數(shù)碼 相機拍照；(4)DNA樣品濃度分析拍照后，打開計算機，進(jìn)入pgdetect程序，將上步中拍好的 圖片導(dǎo)入pgdetect程序，點擊檢測按鈕進(jìn)行DNA濃度分析；Pgdetect程序界面主要有以下幾個部分組成A添加控制點首先點擊添加控制點，對標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行設(shè)定，鼠標(biāo)點擊對應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn) 品，在pgdetect的界面右上角的表格中的序號一列中會自動出現(xiàn)控制點序號即1，2，3， 4，5等，雙擊序號在濃度一欄中輸入相應(yīng)的濃度；B刪除選中控制點對控制點進(jìn)行刪除，首先選中要刪除的控制點，點擊此按鈕即可，C保存控制點信息對控制點信息進(jìn)行保存。點擊此按鈕，即可保存當(dāng)前界面的控 制點信息；D讀取控制點信息點擊此按鈕，即可利用已經(jīng)保存的控制點信息，對當(dāng)前的未知 樣品進(jìn)行定量檢測；E計算當(dāng)前點濃度點擊此按鈕后，鼠標(biāo)點擊樣品點處，在程序左下角即會出現(xiàn)未 知樣品濃度值。
2.根據(jù)權(quán)利要求書1所述的一種微量核酸檢測方法，其特征在于可以檢測的核酸 堿基數(shù)大于十bp。
3.根據(jù)權(quán)利要求書1所述的一種微量核酸檢測方法，其特征在于所用的檢測器為 UltraPower可見光凝膠透射儀。
4.根據(jù)權(quán)利要求書1所述的一種微量核酸檢測方法，其特征在于所述成像系統(tǒng)主 要由發(fā)射光源、濾光片和暗箱三部分組成，其中光源由順序排列的多個發(fā)光二極管構(gòu) 成，濾光片由塑料材質(zhì)的亞克力板構(gòu)成，所述暗箱是由特質(zhì)材料制備的箱體和長波濾光片兩部分構(gòu)成。
5.根據(jù)權(quán)利要求書1所述的一種微量核酸檢測方法，其特征在于所用的檢測染料 為的UltraPower核酸染料。
6.根據(jù)權(quán)利要求書1所述的一種微量核酸檢測方法，其特征在于待測核酸的終濃 度在10-2000pg/yL范圍內(nèi)效果較好。
7.根據(jù)權(quán)利要求書1所述的一種微量核酸檢測方法，其特征在于核酸與UltraPower 核酸染料的反應(yīng)容器為透明的PCR管、八連管等質(zhì)地均勻的透明薄壁管。
8.根據(jù)權(quán)利要求書1所述的一種微量核酸檢測方法，其特征在于用于分析DNA濃 度的計算機程序為pgdetect程序。
全文摘要
一種微量核酸檢測方法，本方法利用UltraPower DNA核酸染料與核酸結(jié)合熒光信號會增強800-1000倍的原理，采用了計算機程序進(jìn)行分析最低可檢出12.5pg/μL核酸。本發(fā)明極大的避免外部因素如鹽離子濃度、pH、DNA提取試劑殘留(如乙醇，苯酚，氯仿等)的影響，尤其適用于對微量DNA的定量。
文檔編號C12Q1/68GK102010893SQ20101011472
公開日2011年4月13日 申請日期2010年2月26日 優(yōu)先權(quán)日2010年2月26日
發(fā)明者萬俊松, 周志圖, 胡勝標(biāo) 申請人:萬俊松