專利名稱：一種高效降解果膠多糖的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種用化學(xué)法和酶法相結(jié)合降解果膠多糖的方法，尤其涉及一種利用部分酸水解和果膠酶酶解相結(jié)合將果膠多糖降解成具有一定生物活性的聚合度為2 11的寡聚半乳糖醛酸的方法。
背景技術(shù)：
果膠是一類結(jié)構(gòu)復(fù)雜的酸性雜多糖，主要由半乳糖醛酸聚糖(HGA)、鼠李半乳糖醛酸聚糖-I (RG-I)和鼠李半乳糖醛酸聚糖-II (RG-II)三個(gè)結(jié)構(gòu)區(qū)域構(gòu)成，其中HGA為光滑區(qū)，RG-I和RG-II為須狀區(qū)。每種果膠隨植物來源、組織和發(fā)育階段的不同，其側(cè)鏈中殘基的數(shù)目、種類和連接方式以及其它取代基存在的情況都有相當(dāng)大的變化，體現(xiàn)出果膠多糖在結(jié)構(gòu)上的高度復(fù)雜性。目前多是通過降解果膠多糖得到果膠寡糖混合物對其進(jìn)行結(jié)構(gòu)和活性的研究，果膠寡糖混合物的主要成分是寡聚半乳糖醛酸，寡聚半乳糖醛酸是一類酸性寡糖，由2-20個(gè)單半乳糖醛酸分子通過α-1，4糖苷鍵連接構(gòu)成，寡聚半乳糖醛酸具有多種生物活性，可以作為植物防御反應(yīng)的誘導(dǎo)因子，誘導(dǎo)植物的抗性反應(yīng)；可用作雙歧桿菌增殖因子，高效、專一的促進(jìn)雙歧桿菌生長，改善菌群結(jié)構(gòu)；另外，在控制棉花黃萎病、蘋果花葉病、辣椒病毒病等方面效果顯著。目前果膠多糖的降解方法主要有化學(xué)法降解和酶解法降解?；瘜W(xué)法降解通常是用酸水解果膠，最大的特點(diǎn)是降解速度快(特別是在加熱的條件下)，降解的比較完全，得到大量單糖，寡糖產(chǎn)率低。并且由于在降解過程中引入了各種反應(yīng)試劑，使得對其降解反應(yīng)過程的控制難度增大，也使得降解產(chǎn)物的分離純化工作不易進(jìn)行下去。因此，目前較少采用單純酸水解的方法制備寡聚半乳糖醛酸。酶法降解果膠多糖，即選用特定的一種或幾種酶對果膠分子進(jìn)行降解，讓其選擇性地切斷果膠分子中的α -1，4糖苷鍵，從而制得特定的果膠寡糖。該方法降解果膠多糖不發(fā)生副反應(yīng)，反應(yīng)條件溫和，工藝較易控制，對果膠分子結(jié)構(gòu)幾乎沒有破壞，是一種較為理想的降解方法。但是，由于果膠結(jié)構(gòu)非常復(fù)雜，分子量大，分子中微環(huán)境影響果膠酶與作用位點(diǎn)的接觸，用果膠酶直接對果膠降解有一定的局限性，降解效率低，寡糖收率低，較難選擇合適的酶高效地制備果膠寡糖。

發(fā)明內(nèi)容
為了解決背景技術(shù)中存在的上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供了一種寡聚半乳糖醛酸含量高且聚合度較高的高效降解果膠多糖的方法。本發(fā)明的技術(shù)解決方案是本發(fā)明提供了一種高效降解果膠多糖的方法，其特殊之處在于所述高效降解果膠多糖的方法包括以下步驟1)果膠多糖的部分酸水解，其具體實(shí)現(xiàn)方式是1. 1)將果膠以 2%的質(zhì)量濃度溶解在0. 5 1. 5mol/L的酸溶液中；1. 2)將步驟1. 1)所得到的溶液在60 100°C水浴中部分酸水解3 7h，反應(yīng)完成后旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)蒸干；1. 3)加入上述酸溶液1/4 1/8體積的蒸餾水，充分振蕩，離心，上清和沉淀分別收集合并，得到上清與沉淀兩個(gè)組分；2)對步驟1. 3)所得到的沉淀進(jìn)行酶解，其具體實(shí)現(xiàn)方式是2. 1)將步驟1. 3)制得的果膠沉淀組分以1 % 2%的質(zhì)量濃度溶于pH 4 5的醋酸鈉緩沖液；2.2)將步驟2.1)所得到的溶液用濃度為0.025 0. lmg/ml的果膠酶酶解 IOmin 4h，皂化，中和后除鹽，冷凍干燥，得果膠寡糖混合物。上述酸溶液是硫酸溶液、鹽酸溶液、三氟乙酸溶液或磷酸溶液。上述步驟2. 2)中的皂化條件是0. 5 lmol/L NaOH溶液室溫皂化20min lh。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是1、本發(fā)明所提供的高效降解果膠多糖的方法在果膠多糖部分酸水解時(shí)優(yōu)選的酸溶液為三氟乙酸，酸水解后，通過多次旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去三氟乙酸，可避免在降解后引入其他的反應(yīng)試劑，使樣品的后續(xù)處理過程簡單化；2、本發(fā)明所提供的高效降解果膠多糖的方法在部分酸水解過程可以降解掉果膠多糖中大部分的中性糖，糖醛酸主要存在于沉淀組分中，因此酶解沉淀組分可高效制備聚合度為2 11的寡聚半乳糖醛酸，為后續(xù)的寡聚半乳糖醛酸純品的分離，活性及其結(jié)構(gòu)的鑒定奠定了基礎(chǔ)。


圖ι為本發(fā)明中果膠多I■的單糖組成HPLC圖2為本發(fā)明中果膠多II酸水解上清組分的單II組成HPLC圖
圖3為本發(fā)明中果膠多II酸水解沉淀組分的單II組成HPLC圖
圖4為本發(fā)明中果膠寡I■混合物的TLC圖5為本發(fā)明中果膠寡I■混合物的MS圖。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明做進(jìn)一步的詳細(xì)說明本發(fā)明提供了一種高效降解果膠多糖的方法，包括以下步驟1、將2g果膠以的質(zhì)量濃度溶解在0. 5mol/L的三氟乙酸(TFA)中，在80°C水浴中酸水解5h，反應(yīng)完成后旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)蒸干，加入上述反應(yīng)1/6體積的蒸餾水，充分振蕩，離心，上清和沉淀分別收集合并，得到上清與沉淀兩個(gè)組分。上清0.591g，沉淀1. 142g，得率可達(dá)86. 65%，其中沉淀部分含量約是上清部分的兩倍。上清組分通過熒光輔助糖電泳(FACE)檢測，電泳圖譜顯示上清組分也是果膠寡糖混合物。分別將果膠，果膠上清及沉淀完全酸水解后采用3-氨基-9-乙基咔唑(AEC) -HPLC 柱前衍生化法測定各部分的單糖組成，所得的液相色譜圖如圖1，2，3所示。圖中各個(gè)色譜峰按出峰順序依次為 1. GalA,2. Gal,3. Glc,4. Ara,5. Xyl、6. Rha。液相色譜條件色譜柱為C18反相柱，流動(dòng)相為觀72的乙腈-水(0. lmol/L的
4醋酸銨緩沖液，PH = 4. 3)，流速為lml/min，檢測器為紫外檢測器。與混合單糖標(biāo)準(zhǔn)圖譜比較計(jì)算各組分的單糖組成如表1所示。根據(jù)各單糖分子量及其在各組分中的摩爾百分含量結(jié)合實(shí)際制備量計(jì)算可得，上清組分為含中性糖較多的果膠寡糖混合物，而果膠中79. 48%的(ialA都存在于部分酸水解后所得的沉淀中，沉淀中 feilA的含量(質(zhì)量百分含量)高達(dá)98. 22%，只含有微量其它單糖，因此，用果膠酸水解后所得的沉淀為原料，是制備寡聚半乳糖醛酸的有效方法。表1果膠、上清與沉淀的單糖組成比例
單糖(摩爾百分含量)XylGlcAraRhaGalGalA果膠0. 391. 562. 854. 4011. 4879. 32上清0. 724. 235. 6313. 3423. 1452. 94沉淀0. 530. 200. 230. 910. 2997. 842、取實(shí)施例1中的果膠沉淀組分以的質(zhì)量濃度溶于pH 4.5的醋酸鈉緩沖 ^43^ ] 0. 05mg/ml 白勺胃月交_ (Pectinase from Aspergillus niger, Fluka) 角軍 60min,酶解后的混合物用0. 5mol/L NaOH室溫皂化30min，中和后除鹽，冷凍干燥，得寡聚半乳糖醛酸混合物。寡聚半乳糖醛酸混合物的TLC圖如圖1所示，圖中1為半乳糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)單糖，2為 0. 05mg/ml的酶解液對沉淀酶解60min所得寡糖混合物，A I分別表示半乳糖醛酸及聚合度為2 9的寡聚半乳糖醛酸。純化后的混合物MS譜圖如圖2所示，MS峰值與nfeilA對應(yīng)表見表2。表2nGalA與MS峰值對應(yīng)表
η(聚合度)1234567891011[M+Na]+217393569745921109712731449162518011977 結(jié)果表明，由沉淀組分酶解可得到半乳糖醛酸和聚合度為2 11的寡聚半乳糖醛酸，因此，用果膠部分酸水解后所得的沉淀為原料，是制備寡聚半乳糖醛酸的有效方法，對該混合物進(jìn)行分離純化即可得到各個(gè)聚合度的半乳糖醛酸純品。
權(quán)利要求
1. 一種高效降解果膠多糖的方法，其特征在于所述高效降解果膠多糖的方法包括以下步驟1)果膠多糖的部分酸水解，其具體實(shí)現(xiàn)方式是1. 1)將果膠以 2%的質(zhì)量濃度溶解在0. 5 1. 5mol/L的酸溶液中；1. 2)將步驟1. 1)所得到的酸溶液在60 100°C水浴中部分酸水解3 7h，反應(yīng)完成后旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)蒸干；1.3)加入上述酸溶液1/4 1/8體積的蒸餾水，充分振蕩，離心，上清和沉淀分別收集合并，得到上清與沉淀兩個(gè)組分；2)對步驟1.3)所得到沉淀進(jìn)行酶解，其具體實(shí)現(xiàn)方式是2.1)將步驟1. 3)制得的果膠沉淀組分以 2%的質(zhì)量濃度溶于pH 4 5的醋酸鈉緩沖液；2. 2)將步驟2. 1)所得到的溶液用濃度為0. 025 0. lmg/ml的果膠酶酶解IOmin 4h，皂化，中和后除鹽，冷凍干燥，得果膠寡糖混合物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高效降解果膠多糖的方法，其特征在于所述酸溶液是硫酸溶液、鹽酸溶液、三氟乙酸溶液或磷酸溶液。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的高效降解果膠多糖的方法，其特征在于所述步驟2.2) 中的皂化條件是0. 5 lmol/L NaOH溶液室溫皂化20min lh。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種高效降解果膠多糖的方法，該方法包括以下步驟1)果膠多糖的部分酸水解；2)對步驟1)所得到產(chǎn)物的酶解。本發(fā)明提供了一種寡聚半乳糖醛酸含量高且聚合度較高的高效降解果膠多糖的方法。
文檔編號C12P19/14GK102191298SQ201010115598
公開日2011年9月21日 申請日期2010年3月1日 優(yōu)先權(quán)日2010年3月1日
發(fā)明者王仲孚, 黃琳娟 申請人:西北大學(xué)