專利名稱：一株胸腺嘧啶營養(yǎng)缺陷型炭疽芽孢桿菌及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一株胸腺嘧啶營養(yǎng)缺陷表型炭疽芽孢桿菌及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
炭疽芽孢桿菌(Bacillus anthracis)是一種G+菌，它引起的炭疽是一種烈性傳 染病，在我國列為乙類傳染病，已經(jīng)列入國家的計(jì)劃免疫?，F(xiàn)有炭疽疫苗A16R株仍保留有 大質(zhì)粒PX01，具有一定的殘留毒性。因此研究更加安全有效的新型炭疽桿菌疫苗就顯得非 常有必要。菌體組分加保護(hù)性抗原的組合是目前廣泛認(rèn)可的一種炭疽疫苗的研究策略，而以 減毒炭疽桿菌作為宿主進(jìn)行保護(hù)性抗原表達(dá)的研究也已有報(bào)道。但這種表達(dá)通常需要抗 生素提供抗性壓力，不符合當(dāng)今對疫苗類生物制品的要求。因此開以別的表達(dá)系統(tǒng)如染色 體_質(zhì)粒平衡致死系統(tǒng)就顯得很有意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一株胸腺嘧啶營養(yǎng)缺陷菌株及其應(yīng)用。本發(fā)明所提供的胸腺嘧啶營養(yǎng)缺陷菌株，是將炭疽芽孢桿菌(Bacillus anthracis)中的thyA基因和thyX基因滅活獲得的菌株。所述thyA基因可具有自GENBANK的基因ID為2850789的5 ‘端第1_957位核苷 酸序列；所述thyX基因可具有自GENBANK的基因ID為2851295的5'端第1-774位核苷 酸序列。所述胸腺嘧啶營養(yǎng)缺陷菌株還經(jīng)過去除構(gòu)建過程中引入的抗生素標(biāo)記。所述炭疽 芽孢桿菌(Bacillus anthracis)為減毒活疫苗，如減毒活疫苗B. anthracisAP422。上述技術(shù)方案使本發(fā)明的菌株具有無抗性標(biāo)記的胸腺嘧啶營養(yǎng)缺陷型減毒炭疽 芽孢桿菌的特征。所述胸腺嘧啶營養(yǎng)缺陷菌株優(yōu)選為炭疽芽孢桿菌(Bacillus anthracis) AP425CGMCC Ns · 3405。炭疽芽孢桿菌(Bacillus anthracis)AP425 CGMCC Ns · 3405 是經(jīng) 過同源重組對炭疽芽孢桿菌(Bacillus anthracis)負(fù)責(zé)胸腺嘧啶合成的關(guān)鍵酶胸腺嘧啶 合成酶基因(thyA)進(jìn)行了敲除，然后再對胸腺嘧啶合成酶補(bǔ)充蛋白基因(thyX)進(jìn)行敲除 并結(jié)合Cre-LoxP系統(tǒng)去除了抗性標(biāo)記，通過大量篩選獲得的無標(biāo)記抗性，兩個基因的聯(lián)合 缺失胸腺嘧啶營養(yǎng)依賴的炭疽桿菌。所述炭疽芽孢桿菌(Bacillus anthracis) AP425，已于2009年11月5日保藏于中 國微生物菌種保藏管委理員會普通微生物中心(簡稱CGMCC，地址為中國北京市朝陽區(qū)大 屯路)，保藏號為CGMCC Na · 3405。構(gòu)建上述胸腺嘧啶營養(yǎng)缺陷菌株的具體方法包括1.打靶質(zhì)粒構(gòu)建采用PCR的方法，從相應(yīng)的模板中擴(kuò)增得到thyA和thyX基因的上下游同源臂，以 及兩端帶有LoxP位點(diǎn)的壯觀霉素抗性基因元件，這幾部分DNA在T載體中連接成功得到打靶片段，該片段再與穿梭載體連接得到打靶載體。2. Cre重組酶表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建采用PCR的方法擴(kuò)增得到淀粉酶啟動子和Cre重組酶的編碼基因，再順次連入穿 梭載體就可以得到Cre重組酶表達(dá)載體。3. thyA基因的無痕敲除首先通過同源重組的方式，得到用壯觀霉素抗性元件替代部分thyA基因序列的 重組菌。然后通過轉(zhuǎn)入表達(dá)Cre重組酶的質(zhì)粒，通過Cre重組酶識別spc元件兩端的LoxP 位點(diǎn)，去除抗性標(biāo)記，從而得到不含抗性標(biāo)記的基因敲除菌株。4.thyX基因的敲除thyX基因的敲除與thyA基因所用的方法完全相同。本發(fā)明的胸腺嘧啶營養(yǎng)缺陷菌株可以用于構(gòu)建蛋白表達(dá)系統(tǒng)，所述構(gòu)建蛋白表達(dá) 系統(tǒng)為基于染色體-質(zhì)粒平衡致死原理的外源蛋白表達(dá)系統(tǒng)。所述免疫制劑優(yōu)選為滅活疫 苗、減毒活疫苗、亞單位疫苗和基因工程疫苗。實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明炭疽芽孢桿菌(Bacillusanthracis)AP425 CGMCC Ns · 3405 無 抗生素抗性標(biāo)記，是胸腺嘧啶營養(yǎng)缺陷型的減毒炭疽芽孢桿菌，且該菌株能夠形成芽孢。本 發(fā)明構(gòu)建的菌株可作為宿主，構(gòu)建平衡致死表達(dá)系統(tǒng)，進(jìn)而研究相關(guān)的炭疽桿菌疫苗，為新 型疫苗的研究打下基礎(chǔ)。


圖1為pT-l0Xp::Spc酶切鑒定結(jié)果。圖2為打靶質(zhì)粒構(gòu)建過程中獲得的陽性克隆的酶切鑒定結(jié)果。圖3為Cre重組酶表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建酶切鑒定結(jié)果。圖4為thyA基因敲除的過程示意圖。圖5為thyA基因敲除的PCR鑒定篩選的結(jié)果。圖6為PCR的方法篩選去除抗性基因的菌株的結(jié)果。圖7為得到的thyX基因敲除株進(jìn)行PCR鑒定的結(jié)果。圖8為缺陷菌炭疽芽孢桿菌(Bacillus anthracis)AP425表型分析結(jié)果。圖9為炭疽芽孢桿菌(Bacillus anthracis)AP425的芽孢形成能力分析結(jié)果。
具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中的方法，如無特別說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中的百分含量，如無特別說明，均為質(zhì)量百分含量。實(shí)施例1、無抗性標(biāo)記的營養(yǎng)缺陷型減毒炭疽芽孢桿菌的獲得1、打靶質(zhì)粒構(gòu)建根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道的LoxP序列設(shè)計(jì)兩個長引物IoxpF和LoxpR直接退火合成含兩個 LoxP序列及一個Sal I位點(diǎn)的片段，將該片段連入pEASY-Tl載體(購自北京全式金生物技 術(shù)有限公司)得到新的載體pT-loxP。其中，引物IoxpF和LoxpR序列為IoxpF :CCGCGGATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTATGTCGACATAACTTCGTATA(序列表中序列 1)
IoxpR :GAATTCATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTATGTCGACATAACTTC (序列表中序列2)。pSET4s (Daisuke Takamatsu, Makoto Osaki, and Tsutomu Sekizaki. Thermosensitive Suicide Vectors for Gene Replacement in Streptococcus suis. Plasmid，200，146，140-148，中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所已保存)為 模板，以引物spcF和spcR擴(kuò)增出兩端均為Sal I切點(diǎn)的spc抗性元件。該片段用Sal I 單切后純化回收，再與同樣經(jīng)Sal I單切的質(zhì)粒pT-loxP連接轉(zhuǎn)化E. coli DH5 α，并在含壯 觀霉素的LB平板上進(jìn)行篩選，得到的陽性克隆即為連接正確的克隆，質(zhì)粒雙酶切鑒定結(jié)果如圖1。圖1中，泳道1為pT-loxp:: spc酶切結(jié)果，泳道M為分子量Marker。將鑒定表明 正確的重組質(zhì)粒命名為pT-loxp: :spc。其中，引物spcF和spcR的序列為spcF :ACGCGTCGACGTAACAATCACTAGCC (序列表中序列 3)；spcR :ACGCGTCGACAGCTTATTTTCCTTG (序列表中序列 4)。再根據(jù) GenBank 登錄的 Bacillus anthracis sterne 株 thyA 序列，基因 ID 為 2850789，設(shè)計(jì)兩對特異性引物thyAuF和thyAuR以及thyAdF和thyAdR，它們的序列如下所 示thyAuF :cgcggatccagtgaagaagtaccc (序列 表中序 列 5), thyAuR tccccgcggattaccgaaagtatag (序列表中序列 6)；thyAdF :ccggaattccatttaacattgcaag (序列表中序列 7) , thyAdR ccgctcgagaatctcatctataaac (序列表中序列 8)。以炭疽桿菌A16R株(炭疽芽孢桿菌A16R株無菌培養(yǎng)濾液的蛋白質(zhì)組學(xué)分析董 梅，莊漢瀾，王希良軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院院刊2009年2月第33卷第1期；由中國人民解放軍 軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所保存)基因組DNA為模板，分別擴(kuò)增thyA基因上下游各約 500bp的同源臂。上游同源臂的擴(kuò)增引物為thyAuF和thyAuR;下游同源臂的擴(kuò)增引物為 thyAdF 禾口 thyAdR。將擴(kuò)增得到的下游同源臂用EcoR I和Xhol I雙酶切與經(jīng)同樣酶雙酶切的質(zhì)粒 pT-l0Xp::Spc連接后轉(zhuǎn)化E.coli DH5 α，得到的克隆過夜培養(yǎng)后提質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定，得 到重組質(zhì)粒，將酶切和測序鑒定的連接正確的質(zhì)粒命名為pT-loxp: spc-1。將上述擴(kuò)增得 到的上游同源臂用BamH I和Sac II雙酶切插入到pT-loxp: spc-1的相同酶切位點(diǎn)之間， 得到重組載體，將該重組質(zhì)粒經(jīng)雙酶切鑒定和測序鑒定，將經(jīng)鑒定表明連接正確的質(zhì)粒命 名為 pT-thyA spc ο質(zhì)粒pT-thyA: spc用BamH I和Xho I雙酶切后回收2800bp目標(biāo)片段(其 中包括上下游同源臂和壯觀霉素抗性基因元件)，再與用Sal I和BamH I雙酶切的質(zhì) 粒 pMAD(Arnaud Μ, Chastanet A, and De' barbouille Μ. New vector for efficient allelicreplacement in naturally nontransformable, low-GC-content, gram-positive bacteria. ApplEnviron Microb，2004，70 (11) 6887 6891，中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科 學(xué)院生物工程研究所已保存)連接，轉(zhuǎn)化E.coli DH5 α，涂布于含Spc (壯觀霉素，5 μ g/ mL)和X-gal(50yg/mL)的LB平板。平板上長出的藍(lán)色菌落即為正確連接的克隆(質(zhì) 粒pMAD能編碼半乳糖苷酶)，重組質(zhì)粒的酶切鑒定結(jié)果如圖2所示。圖2中，泳道1為 pMAD，泳道2為pMAD-thyA: :spc，泳道M為分子量Marker。將得到的重組質(zhì)粒再電轉(zhuǎn)化Ε. coliSCSllO。從SCSllO中提取質(zhì)粒得到去甲基化的打靶用質(zhì)粒，將經(jīng)測序表明正確的質(zhì) 粒命名為 pMAD-thyA: :spc。2、Cre重組酶表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建以枯草芽孢桿菌No. 168 (購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心，簡稱ATCC，保藏編號 為ATCC No. 23857)為模板，利用引物amyrF和amyrR擴(kuò)增得到淀粉酶啟動子AmyRl,并 在兩端分別引入BamH I和Hind III位點(diǎn)。將擴(kuò)增回收的片段用BamH I和HindIII 酶雙酶切處理后與經(jīng)同樣的內(nèi)切酶雙酶切的質(zhì)粒PHY304連接后轉(zhuǎn)化E. coli ToplO, 得到的重組質(zhì)粒，酶切和測序鑒定，將鑒定正確的質(zhì)粒命名為pHY-AmyR。然后以質(zhì)粒 pBS185(購自GibcoBRL公司)為模板，以creF和creR為引物，擴(kuò)增Cre重組酶基因， 通過引物序列在兩端分別引入HindIII和Xho I位點(diǎn)。將PCR擴(kuò)增得到的Cre重組酶 基因片段用HindIII和Xho I雙酶切后與經(jīng)過同樣雙酶切的質(zhì)粒pHY-AmyR連接轉(zhuǎn)化 E. coli ToplO，得到的重組質(zhì)粒，酶切和測序鑒定，結(jié)果如圖3所示，將鑒定正確質(zhì)粒命名 為pHY-Cre。圖3中，泳道1為pHY-AmyR，泳道2為pHY-Cre，泳道M為分子量Marker。 質(zhì)粒pHY-Cre再轉(zhuǎn)化E.C0li SCS110，最終得到可用于轉(zhuǎn)化炭疽桿菌的去甲基化的質(zhì)粒 pHY-Cre。上述引物序列為amyrF :GCGGATCCGACGACAGGGGGATTC(序列表中序列 9)，amyrR CCCAAGCTTTCTTGACTCCTTAT(序列表中序列 10) ； creF :CCCAAGCTTATGTCCAATTTACTG (序列表 中序列 11)，creR :CCGCTCGAGCTAATCGCCATCTTCC (序列表中序列 12)。3、thyA基因的無痕敲除thyA基因(具有自GENBANK的ID號為2850789的5 ‘端第1-957位核苷酸)敲 除的大致過程如圖4所示。具體方法如下所述1)感受態(tài)的制備從_70°C保存的B. anthracis AP422 (CGMCC Na . 1569，專利菌株，發(fā)明人為本專利 發(fā)明人之一)(保藏于中國微生物菌種保藏管委理員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC Na . 1569 ；專利號為ZL200610007229. 3，授權(quán)公告號為CN 100362094C)菌種中劃線分離單 菌落，接種于5mL BHIG(HBI培養(yǎng)基加0.5%甘油)培養(yǎng)基中，37°C過夜培養(yǎng)。將過夜培養(yǎng)物 按的比例接種到IOOmL新的BHIG培養(yǎng)基(3. 7%的腦心浸出物BHI加0.5%甘油)中， 37°C劇烈振蕩培養(yǎng)。當(dāng)0D_值達(dá)到0. 5-0. 6時(約2小時)，從搖床中取出，離心收集菌 體，用10%甘油洗三次，最后用1/10體積10%甘油重懸菌體，分裝得到電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞。2)感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化每80 μ L感受態(tài)細(xì)胞加5 μ L (約1. 5 μ g)質(zhì)粒pMAD-thyA: spc，混合后于0. 2cm 電擊杯中冰浴5分鐘，然后用Bio-Rad電轉(zhuǎn)儀進(jìn)行電轉(zhuǎn)化，條件為2. 5kV、200Q和25 μ F。 電擊完畢后立即加入ImL冰冷的LB培養(yǎng)基，30度孵育2. 5小時。分別取100和200 μ L涂 布于含紅霉素(5 μ g/mL)和X-gal (50 μ g/mL)的LB平板上，30°C過夜培養(yǎng)。3)重組轉(zhuǎn)化子的篩選挑取步驟2)獲得的單個藍(lán)色菌落，接種到5mL LB培養(yǎng)基中，30°C培養(yǎng)2小時，然后轉(zhuǎn)到42°C培養(yǎng)2個小時.取5 μ L培養(yǎng)物梯度稀釋，取10_2、10_3和10_4稀釋液各100 μ L 涂布于含壯觀霉素(50 μ g/mL)和X-gal (50 μ g/mL)的LB平板上，42 °C過夜培養(yǎng)。取于42°C培養(yǎng)生長出的白色菌落，取50個單菌落接種到含壯觀霉素(100μ g/ml) 的LB培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)過夜。
取過夜培養(yǎng)物5 μ L進(jìn)行全菌PCR鑒定篩選，引物用thyAiF (位于thyA基因上游同源臂外側(cè)和spcmR(位于壯觀霉素基因內(nèi)部)(thyAiF TAAGCGCTTATAAACCAACCAA ；spcmR GTCGTCGTATCTGAACCATTGA)，同時以正常B. anthracis AP422菌株做對照。結(jié)果如圖5所 示，圖5中，泳道M為分子量Marker，泳道1為正常菌株對照，泳道2_10為用于鑒定的可能 的重組菌。因?yàn)橛蒙鲜鲆镞M(jìn)行擴(kuò)增時，只有發(fā)生重組的菌株才能擴(kuò)增出相應(yīng)的目標(biāo)條帶， 所以第7泳道對應(yīng)的菌株中打靶質(zhì)粒與基因組發(fā)生了重組，即spc表達(dá)元件取代了基因組 中部分thyA的序列。將上述鑒定表明發(fā)生重組的菌在無抗生素的LB培養(yǎng)基上傳代培養(yǎng)5 代，篩選得到失去紅霉素抗性的菌株，通過抗生素抗性分析證明其不再有紅霉素抗性，按照 前述方法制備感受態(tài)，然后轉(zhuǎn)入質(zhì)粒pHY-Cre，方法同樣采用電轉(zhuǎn)化，條件同前述。電擊完畢 后立即加入ImL冰冷的BHIG培養(yǎng)基，30度孵育2. 5小時.取50 μ L涂布于含紅霉素(5 μ g/ mL)的LB平板上，30°C過夜培養(yǎng)，得到陽性克隆。將上述篩選得到的陽性克隆在含紅霉素(5yg/mL)的LB液體培養(yǎng)基 中30°C傳兩代后，再在無抗生素的LB培養(yǎng)基上37 °C傳代培養(yǎng)三代，取過夜培養(yǎng)物 5μ L 進(jìn)行全菌 PCR 鑒定(弓I 物用 thyAuF cgcggatccagtgaagaagtaccc 禾口 thyAdR ccgctcgagaatctcatctataaac)，篩選去除抗性基因的菌株，結(jié)果如圖6。圖6中，泳道M為分 子量Marker。理論上來講，去除抗性標(biāo)記后，PCR產(chǎn)物的大小約1. 6kb，而對照正常菌株擴(kuò) 增出的從的片段應(yīng)為2. Okb (泳道1)。從PCR結(jié)果看，所取的四個克隆均已經(jīng)去除壯觀霉素 抗性基因(泳道2-5)。最終通過上述一系列實(shí)驗(yàn)，篩選得到不含質(zhì)粒的thyA基因敲除的菌 株,命名為 Bacillus anthracis AP422AthyA。4、thyX基因(具有自GENBANK的基因ID為2851295的5'端第1-774位核苷酸 序列)的敲除與thyA基因敲除類似，再根據(jù)GenBank登錄的Bacillus anthracis sterne株 thyX基因的序列，基因ID為2851295，設(shè)計(jì)兩對特異性引物(引物對thyXuF和thyXAuR ； 引物對 thyXdF 和 thyXdR)，它們的序列如下所示thyXuF :CGCGGATCCCCTTAGTTTTGTTC (序 列表中序列 13)，thyXuR :TCCCCGCGGTGGAAAGTAACAGAAG (序列表中序列 14) ； thyXdF CCGGAATTCAGACAAGTTTTTATAT (序列表中序列 15)，thyXdR CCGCTCGAGGGAGTTCAATCAAAA (序 列表中序列16)。以A16R株基因組DNA為模板，分別擴(kuò)增thyX基因上下游各約500bp的同源臂。上 游同源臂的擴(kuò)增引物為thyXuF和thyXuR ；下游同源臂的擴(kuò)增引物為thyXdF和thyXdR。將擴(kuò)增得到的下游同源臂用EcoR I和Xho I雙酶切后，插入到pT-loxp spc的 EcoR I和Xho I酶切位點(diǎn)之間，得到重組載體，然后將上游同源臂用BamH I和SacII雙酶 切后，插入到獲得的插入了下游同源臂的重組載體的BamH I和SacII酶切位點(diǎn)之間，得到 重組載體，將獲得的重組載體進(jìn)行酶切和測序鑒定，將酶切和測序鑒定表明正確的重組載 體命名為 pT-thyX: :spc。將質(zhì)粒pT-thyX: spc用BamH I禾Π Xho I雙酶切后與用Sal I和BamH I雙 酶切的質(zhì)粒PMAD連接，轉(zhuǎn)化Ε. coli DH5a.得到的重組質(zhì)粒酶切鑒定正確后再電轉(zhuǎn)化 E. coliSCSllO。從SCSllO中提取質(zhì)粒得到打靶用質(zhì)粒pMAD-thyX: spc。thyX基因敲除的過程按照上述thyA基因敲除的過程進(jìn)行，不同的是，其中，出發(fā) 菌株是 Bacillus anthracis AP422 Δ thyA，使用的質(zhì)粒為 pMAD-thyX: spc ；以及在這一部分實(shí)驗(yàn)中所用LB培養(yǎng)基中除必要的抗生素(同前一部分thyA基因的無痕敲除)外，全部添加50yg/ml的胸腺嘧啶。將獲得的陽性菌落培養(yǎng)物進(jìn)行PCR鑒定篩選，引物用thyXiF和thyXiR(thyXiF TAGGATTATTTTATTAAGTTTCT(序列表中序列 17) ；thyXiR :AAGAAGAAAACTACTCGACAA (序列表 中序列18))，同時以正常B.anthraciSAP422菌株做對照。結(jié)果如圖7所示。圖7中，泳道M 為分子量Marker。去除thyX基因后，PCR產(chǎn)物的大小約1. 6kb (泳道2_3)，而對照正常菌株 擴(kuò)增出的從的片段應(yīng)為2. 4kb (泳道1)。PCR結(jié)果表明，通過上述一系列基因水平的操作，我 們最終得到了一株thyA和thyX兩個基因都缺失的突變株，命名為炭疽芽孢桿菌(Bacillus anthracis)AP425。所述炭疽芽孢桿菌(Bacillus anthracis) AP425，已于2009年11月5日保藏于中 國微生物菌種保藏管委理員會普通微生物中心(簡稱CGMCC，地址為中國北京市朝陽區(qū)大 屯路)，保藏號為CGMCC Na · 3405。實(shí)施例2、無抗性標(biāo)記的營養(yǎng)缺陷型減毒炭疽芽孢桿菌的功能驗(yàn)證一、缺陷菌表型分析分別用兩份液體LB和兩份固體LB培養(yǎng)缺陷菌株炭疽芽孢桿菌 (Bacillusanthracis) AP425，其中一份液體LB或固體LB添加胸腺嘧啶，另一份液體LB或 固體LB不添加胸腺嘧啶，37°C培養(yǎng)14小時后，觀察其生長狀況。結(jié)果表明，在添加胸腺嘧 啶的情況下，無論是液體培養(yǎng)還是固體培養(yǎng)，菌體均生長良好，而不添加胸腺嘧啶菌體生 長極為緩慢(如圖8)。圖8中A為添加胸腺嘧啶的液體LB(左)和未添加胸腺嘧啶的液 體LB(右)培養(yǎng)炭疽芽孢桿菌(Bacillus anthracis)AP425的照片，圖8中B為添加胸 腺嘧啶的固體LB(左)和未添加胸腺嘧啶的固體LB(右)培養(yǎng)炭疽芽孢桿菌(Bacillus anthracis)AP425 的照片。二、芽孢形成能力分析缺陷菌株炭疽芽孢桿菌(Bacillus anthracis) AP425接種于添加50 μ g/ml的胸 腺嘧啶的LB培養(yǎng)基中，37度培養(yǎng)3天后取樣涂片進(jìn)行芽孢染色，觀察芽孢形成情況。結(jié)果 如圖9所示，結(jié)果表明營養(yǎng)缺陷菌株炭疽芽孢桿菌(Bacillus anthracis) AP425仍具有芽 孢形成能力。圖9中，A為AP422培養(yǎng)16小時后染色結(jié)果，B為AP425培養(yǎng)16小時后染色 結(jié)果，C為AP422培養(yǎng)120小時后染色結(jié)果。
權(quán)利要求
一株胸腺嘧啶營養(yǎng)缺陷菌株，是將炭疽芽孢桿菌(Bacillus anthracis)中的thyA基因和thyX基因滅活獲得的菌株。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的菌株，其特征在于thyA基因是自GENBANK基因ID為 2850789的5'端第1-957位核苷酸序列；所述thyX基因是自GENBANK基因ID為2851295 的5'端第1-774位核苷酸序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的菌株，其特征在于所述胸腺嘧啶營養(yǎng)缺陷菌株還經(jīng)過 去除構(gòu)建過程中引入的抗生素標(biāo)記。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任意一項(xiàng)所述的菌株，其特征在于所述炭疽芽孢桿菌 (Bacillus anthracis)
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的菌株，其特征在于胸腺嘧啶營養(yǎng)缺陷菌株為炭疽芽孢桿菌 (Bacillus anthracis)CGMCC Ns·3405。
6.一種構(gòu)建權(quán)利要求1所述的胸腺嘧啶營養(yǎng)缺陷菌株的方法，是將炭疽芽孢桿菌 (Bacillus anthracis)中的 thyA 基因和 thyX 基因滅活。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于所述滅活thyA基因和thyX基因的方法 是通過利用同源重組的方法將thyA基因和thyX基因敲除；thyA基因是自GENBANK的基因 ID為2850789的5'端第1-957位核苷酸序列；所述thyX基因是自GENBANK的基因ID為 2851595的5'端第1-774位核苷酸序列。
8.權(quán)利要求1-5中任意一項(xiàng)所述的胸腺嘧啶營養(yǎng)缺陷菌株在構(gòu)建蛋白表達(dá)系統(tǒng)中的 應(yīng)用。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于所述構(gòu)建蛋白表達(dá)系統(tǒng)是構(gòu)建平衡致死 外源蛋白表達(dá)系統(tǒng)。
10.權(quán)利要求1-5中任意一項(xiàng)所述的胸腺嘧啶營養(yǎng)缺陷菌株在制備免疫制劑中的應(yīng) 用；所述免疫制劑優(yōu)選為滅活疫苗、減毒活疫苗、亞單位疫苗或基因工程疫苗。
全文摘要
本發(fā)明公開了一株胸腺嘧啶營養(yǎng)缺陷菌株及其應(yīng)用。該菌株，是將炭疽芽孢桿菌(Bacillus anthracis)中的thyA基因和thyX基因滅活獲得的菌株，具體可為炭疽芽孢桿菌(Bacillus anthracis)CGMCC №.3405。該菌株可作為宿主，構(gòu)建平衡致死表達(dá)系統(tǒng)，進(jìn)而研究相關(guān)的炭疽桿菌疫苗，為新型疫苗的研究打下基礎(chǔ)。
文檔編號C12N1/20GK101812424SQ20101011560
公開日2010年8月25日 申請日期2010年2月26日 優(yōu)先權(quán)日2010年2月26日
發(fā)明者劉純杰, 展德文, 王令春, 王艷春, 王芃, 袁盛凌, 陶好霞 申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所