專利名稱：：一種耐熱β-1,3-1,4-葡聚糖酶及其編碼基因的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及P-l，3-l，4-葡聚糖酶及其編碼基因與高效表達(dá)。
背景技術(shù)：
：葡聚糖是由葡萄糖通過不同糖苷鍵連接起來的一類聚合物，是自然界中含量最豐富的聚糖。P-l，3-l，4-D-葡聚糖是自然合成的多聚糖，與阿拉伯木聚糖、戊聚糖、纖維素、果膠等均屬植物細(xì)胞壁中的可溶性結(jié)構(gòu)性非淀粉多糖。大部分谷物都含P-l，3-l，4-D-葡聚糖，其中大麥中的含量最高為5_8%，主要存在于大麥乳細(xì)胞壁中。P-l，3-l，4-D-葡聚糖是由葡萄糖以P構(gòu)型通過P-l，3-和|3_1，4-混合鍵形成的直鏈結(jié)構(gòu)，大約含70%P-l，4-鍵和30%的P-l，3-鍵，它們的分子量和構(gòu)型因大麥品種、自然環(huán)境、生長階段等因素的不同而有所差異。按照水解13-葡聚糖的特異性可將葡聚糖酶主要分為特異性的13-1，3-l，4-D-葡聚糖酶或地衣多糖水解酶(EC3.2.1.73)、內(nèi)切P-l，4-D-葡聚糖酶(EC3.2.1.4)、P-l，3(4)-葡聚糖酶(EC3.2.1.6)禾PP-l，3-D-葡聚糖酶(EC3.2.1.39)等四類。迄今，報道的微生物P-l，3-l，4-葡聚糖酶大多屬于細(xì)菌產(chǎn)的糖苷水解酶16家族，包括細(xì)菌、真菌和瘤胃微生物。已有多種芽孢桿菌P-l，3-l，4-葡聚糖酶基因被克隆禾口表達(dá)，如芽胞桿菌B.amyloliquefaciens，B.circulans(KimJYetal.BiotechnolLett，2003，25:1445-1449)，B.licheniformisEGW039(Tengetal.AppliedMicrobiologyandBiotechnology,2006，72(4):705-712);類芽胞桿菌Paenibacilluspolymyxa(GosalbesMJetal.JBacteriol，1991，173(23):7705-7710)。這些葡聚糖酶都具有相似的核苷酸和氨基酸序列，且都有一個保守的氨基酸序列EIDIEF，其中兩個谷氨酸參與酶的水解(HahnMetal.JBiolChem，1995，270:3081-3088)。也從一些非芽胞桿菌的細(xì)菌中克隆得到P-1，3-1，4-葡聚糖酶基因，如牛鏈球菌Str印tococcusbovis(EkinciMSetal.ApplEnvironMicrobiol,1997，63:3752-3756)，產(chǎn)琥珀酸絲狀木干菌Fibrobactersuccinogenes(ChenJLetal.JBiolChem，2001，276:17895—17901)。近年來，也有一些報道研究真菌胞外P-l，3-l，4-葡聚糖酶的純化和性質(zhì)，如Orpinomycessp.PC_2、Cochlioboluscarbo皿m(G6rlachetal.ApplEnvironMicrobiol，1998，64(2):385-391)、Talaromycesemersonii(MurrayPGetal.EnzymeandMicrobialTechnology,2001，29(1)90-98)禾口Rhizopusmicrosporesvar.microsporus(Celestinoetal.BMCbiochemistry,2006，7:23)。但只有幾種真菌P-1，3-1，4-葡聚糖酶基因克隆和表達(dá)的報道，這些真菌包括Orpinomycessp.PC-2(ChenHetal.JournalofBacteriology,1997，179:6028-6034)，Aspergillusjaponicas(GrishutinSGetal.CarbohydrRes，2006，341:218—229)禾口Bisporasp.MEY—1(Luoetal.JAgricFoodChem，2009，57(12):5535-5341)。近年來，一些專利介紹了不同來源的P-l，3-l，4-葡聚糖酶基因在不同的載體和宿主得到表達(dá)，如大腸桿菌、畢赤酵母等，但表達(dá)水平低。類芽孢桿菌PaenibacillusspF-40的P-l，3-l，4-葡聚糖酶在畢赤酵母中表達(dá)(專利200610112092.8)，發(fā)酵液粗酶活4553.7U/mL。淀粉液化芽胞桿菌B.amyloliquefaciens的P_1，3-1，4_葡聚糖酶在大腸桿菌中表達(dá)(專利200910031553.2)，LB培養(yǎng)基總酶活322.0U/mL，胞外酶活127.5U/mL。從國內(nèi)外公布的專利分析，關(guān)于真菌P-l，3-l，4-葡聚糖酶基因的專利較少，在不同表達(dá)系統(tǒng)的葡聚糖酶活差別也較大。關(guān)于嗜熱真菌的P-l，3-l，4-葡聚糖酶基因、克隆表達(dá)的報道和專利。因此克隆和表達(dá)具有高比活、熱穩(wěn)定性好和底物特異性強(qiáng)的嗜熱真菌13-1，3-1，4-葡聚糖酶對于飼料、食品等行業(yè)具有重要的作用。種P-l，3-l，4-葡聚糖酶，來源于嗜熱擬青霉
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供(Paecilomycesthermophila)。本發(fā)明提供的P-l，3-l，4-葡聚糖酶，是如下1)或2)或3)的蛋白質(zhì)1)由序列表中序列2的第19-314位所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；2)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；3)將序列表中序列2的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有P-l，3-l，4-葡聚糖酶活性的由1)衍生的蛋白質(zhì)。其中，序列表中的序列2由314個氨基酸組成，分子量約為34.54X103kDa。為了使l)或2)中的蛋白便于純化，可在由序列表中1)或2)的蛋白質(zhì)的氨基末端或羧基末端連接上如表1所示的標(biāo)簽。表1.標(biāo)簽的序列<table>tableseeoriginaldocumentpage4</column></row><table>上述3)中的蛋白可人工合成，也可先合成其編碼基因，再進(jìn)行生物表達(dá)得到。上述3)中的蛋白的編碼基因可通過將序列表中序列1所示的DNA序列中缺失一個或幾個氨基酸殘基的密碼子，和/或進(jìn)行一個或幾個堿基對的錯義突變，和/或在其5'端和/或3'端連上表1所示的標(biāo)簽的編碼序列得到。上述蛋白的編碼基因也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。上述蛋白的編碼基因?yàn)槿缦?)_4)中任一所述的基因1)其編碼序列是序列表中序列1的自5'末端第55-945位；2)其編碼序列是序列表中序列1;3)在嚴(yán)格條件下與1)或2)的基因雜交且編碼所述蛋白的基因；4)與1)或2)的基因具有90%以上的同源性且編碼所述蛋白的基因。上述嚴(yán)格條件可為用O.IXSSPE(或O.IXSSC)，O.1%SDS的溶液，在DNA或者RNA雜交實(shí)驗(yàn)中65t:下雜交并洗膜。序列表中序列1有945個堿基，可編碼序列表中序列2所示的蛋白。其中序列表中序列1的自5'端第1-54位編碼序列表中序列2所示的第1-18位的信號肽；序列1的自5'端第55-945位所示的DNA片段可編碼序列表中序列2的第19-314位所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)。擴(kuò)增上述基因全長或其任一片段的引物對也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。含有上所述基因的重組載體也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。上述重組載體可以是將上述的基因插入pPIC9K的多克隆位點(diǎn)得到的重組表達(dá)載體。具體地將，上述的基因是插入pPIC9K的SnaBI和AvrII限制性酶切位點(diǎn)之間的，使得核苷酸序列位于A0X1啟動子的下游并受其調(diào)控。含有上述基因的表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。上述重組菌具體是將上述的基因通過所述的重組表達(dá)載體導(dǎo)入畢赤酵母(Pichi即astoris)中，得到的轉(zhuǎn)基因重組菌。上述畢赤酵母是GS115。本發(fā)明的另一目的在于提供上述蛋白的制備方法。本發(fā)明提供的方法是是將所述的重組菌進(jìn)行發(fā)酵得到，所述發(fā)酵條件是取含有重組質(zhì)粒的GS115菌株，接種于200mLBMGY培養(yǎng)基中，30°C，250rpm振蕩過夜培養(yǎng)至0D6。。10.0左右，然后接種于發(fā)酵基本培養(yǎng)基于5L發(fā)酵罐中發(fā)酵。經(jīng)過基礎(chǔ)培養(yǎng)、甘油分批補(bǔ)料培養(yǎng)和甲醇誘導(dǎo)三個階段，使重組P-l，3-l，4-葡聚糖酶得到高效表達(dá)。整個發(fā)酵過程溫度控制在30°C，通過調(diào)整轉(zhuǎn)速、通氣量和補(bǔ)料速率控制溶氧>20%，發(fā)酵的三個階段pH分別控制在4.0、5.0和6.0。實(shí)驗(yàn)證明本發(fā)明提供的方法可高效制備重組P-l，3-l，4-葡聚糖酶，重組畢赤酵母發(fā)酵液上清酶活最高達(dá)55，300U/mL，粗蛋白9.lg/L。本發(fā)明的P_1，3_1，4-葡聚糖酶最適反應(yīng)溫度為7(TC，最適pH值為7.0。本發(fā)明的P-l，3-l，4-葡聚糖酶具有表達(dá)水平高和耐熱特性，可廣泛應(yīng)用于飼料、食品及啤酒工業(yè)等，在生產(chǎn)中具有很大的推廣應(yīng)用潛力。圖1為本發(fā)明的耐熱P-1，3-1，4-葡聚糖酶基因保守區(qū)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖(列M:marker，列1:PCR擴(kuò)增產(chǎn)物)。圖2為本發(fā)明的耐熱13-1，3-1，4_葡聚糖酶基因編碼區(qū)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖(列M:marker，列1:PCR擴(kuò)增產(chǎn)物)。圖3為本發(fā)明耐熱P-l，3-l，4-葡聚糖酶發(fā)酵罐高密度發(fā)酵過程圖蛋白含量參酶活)。圖4為本發(fā)明耐熱e-l，3-1,4-葡聚糖酶發(fā)酵罐高密度發(fā)酵過程SDS-PAGE圖(列M:低分子量標(biāo)準(zhǔn)；列1，2，3，4，5分別為發(fā)酵24h，48h，60h，72h，84h樣品，上樣量1yL發(fā)酵液)。圖5為本發(fā)明的耐熱P-l，3-l，4-葡聚糖酶純化過程圖(列M:低分子量標(biāo)準(zhǔn)；列1:發(fā)酵液上清；列2:過QSFF柱樣品；列3:過S-100純化蛋白)。圖6為耐熱P-l，3-l，4-葡聚糖酶最適pH(其中B:Citric-Na2HP04緩沖液；參MES緩沖液；▲:磷酸緩沖液；▼:Glycine-NaOH緩沖液)。圖7為本發(fā)明的耐熱P-l，3-l，4-葡聚糖酶的最適溫度。具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明，但本發(fā)明并不限于以下實(shí)施例。下述實(shí)施例中，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。嗜熱擬青霉(Paecilomycesthermophila)J18:中國農(nóng)業(yè)大學(xué)，非專利文獻(xiàn)是江正強(qiáng)等.嗜熱擬青霉木糖苷酶的性質(zhì)及其與木聚糖酶的協(xié)同作用，食品與發(fā)酵工業(yè)，2008(07):12-16。實(shí)施例1、P-l，3-l，4-葡聚糖酶基因的發(fā)現(xiàn)—、葡聚糖酶基因基因組保守區(qū)片斷PCR擴(kuò)增以嗜熱擬青霉(Paecilomycesthermophila)J18(中科院微生物研究所菌種保藏中心，保藏號為CGMCC6885)的基因組DNA為模板，根據(jù)GeneBank報道的絲狀真菌P_葡聚糖酶的氨基酸序列，利用在線軟件BlockMaker(htto:〃blocks.fhcrc.org/blocks/blockmkr/makeblocks,html)搜索保守區(qū)，再利用在線引物設(shè)計軟件CODEHOP(http:〃blocks,fhcrc.org/codehop.html)設(shè)計兼并引物PtLicl6CPl(正向)5'-CGGCGAGATCGACATCATHGARGGNGT-3'，PtLicl6CP2(反向)5'-GCCCAGTCGCCGCARAANGTNRTRTC-3'。PCR反應(yīng)混合物(50iiL):水37.25iiL;10XExTaqbuffer,2.5iiL;2.5mmol/LdNTPs，4iiL;引物(10iimol/L)，各2.5iiL;DNA模板(50-100ng)，1iiL;ExTaq(5U/iiL)，0.25iiL。PCR反應(yīng)條件94°C5min;6TC-55t:每個循環(huán)降落0.5°C，30s;72°Clmin，10個循環(huán)；94°C5min;55。C30s;72。Clmin，20個循環(huán)，72°C10min。PCR反應(yīng)完畢后取5iiL進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果顯示500bp左右有一特異條帶(圖1)，經(jīng)瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收后連入pMD-18T載體，經(jīng)熱激法轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109,菌落PCR鑒定重組子后測序。測序結(jié)果經(jīng)NCBIBlast搜索比對，與其他真菌來源的P-l，3(4)-葡聚糖酶基因有較高的同源性。二、P-l，3-l，4-葡聚糖酶基因全長cDNA擴(kuò)增根據(jù)克隆得到的DNA片段及閱讀框分析，分別設(shè)計3'RACE和5'RACE引物，利用SMARTRACE方法(SMARTRACEcDNAAmplificationKit,Takara)擴(kuò)增cDNA的3'禾P5'末端。3'RACE特異引物PtLicl6AGSP2:5'-CGATAACGACGGCTTCACGGGCAAT-3';5'RACE特異弓l物PtLicl6AGSPl:5'-CTTGGCAGCGGGCGTGTCCCAGTTC-3'，PtLicl6ANGSPl:5'-CGTAGATGCCGCCGCCAATGCTGTT-3'。瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收目標(biāo)片段連入pMD-18T載體，熱激法轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109,菌落PCR鑒定重組子后，分別測序。為了獲得5'末端最大長度，其中對于5'RACE產(chǎn)物測序10個克隆，最后，根據(jù)測序結(jié)果拼接5'末端和3'末端，得到全長cDNA序列?；蛐蛄薪?jīng)NCBIBlast搜索比對分析，其全長cDNA包含一945bp完整開放閱讀框(0RF)(序列l(wèi))，編碼314個氨基酸。和煙曲霉(Aspergillusfumigatus)內(nèi)切P_1，3(4)-葡聚糖酶基因(EAL88240.1)同源性最高，相似度達(dá)69%。氨基酸序列與費(fèi)希爾新薩托菌(Neosartoryafischeri)內(nèi)切P-l，3(4)-葡聚糖酶(EAW23242)同源性最高，相似度達(dá)61%。經(jīng)蛋白數(shù)據(jù)庫比對分析，屬于糖苷水解酶16家族。實(shí)施例2、重組P-l，3-l，4-葡聚糖酶基因的表達(dá)—、構(gòu)建重組菌完整開放閱讀框(0RF)編碼蛋白序列經(jīng)SignalP3.0分析，有一信號肽，可能切割位點(diǎn)在18和19位氨基酸之間(AAA-YH)。據(jù)此設(shè)計引物，去除原基因終止密碼子，兩對引物分別為PtLicl6ASnaBIF:5'-TACGTATATCATCTTGTTGACGACTACG-3'(含SnaBI酶切位點(diǎn))；PtLicl6AAvrIIR:5'-CCTAGGTTAGGGTGCGTACACGCGGAG-3'(含AvrII酶切位點(diǎn))，用上述引物，以嗜熱擬青霉(Paecilomycesthermophila)J18的cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳如圖2，經(jīng)凝膠試劑盒回收后經(jīng)TA克隆連接入pMD-18T載體，熱激法轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109,經(jīng)菌落PCR鑒定重組子，陽性重組質(zhì)粒命名為pMD-18T-Glu。經(jīng)pMD-18T-Glu質(zhì)粒提取、SnaBI和AvrII雙酶切后，回收目標(biāo)帶，連接由SnaBI和AvrII雙酶切的表達(dá)載體pPIC9K(Invitrogen公司)，經(jīng)PCR及測序驗(yàn)證后，陽性重組質(zhì)粒命名為pPIC9K-Licl6A。測序結(jié)果表明，pPIC9K-Licl6A是序列表中序列1的自5'端第55-945位所示的DNA片段插入pPIC9K的SnaBI和AvrII酶切位點(diǎn)之間構(gòu)成的重組表達(dá)載體。序列1的自5'端第55-945位所示的DNA片段可編碼序列表中序列2的第19-314位所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)。重組質(zhì)粒pPIC9K-Licl6A采用Sacl線性化后電轉(zhuǎn)化嗜甲醇畢赤酵母GS115,構(gòu)成重組菌。將得到的重組菌涂布MD平板(1.34X酵母無氨基氮源YNB，4X10—5%生物素，2%葡萄糖)，從MD平板得到的His+轉(zhuǎn)化子經(jīng)滅菌水刮取后取100iiL涂布不同濃度的YPD-G418平板(1%酵母粉，2%蛋白胨，2%葡萄糖，2%瓊脂糖，不同濃度的6418)，3-5(1后挑取轉(zhuǎn)化子，分別點(diǎn)種匪(l.34%酵母無氨基氮源YNB，4X10—5%生物素，0.5%甲醇)、MD板，然后分別按搖瓶培養(yǎng)誘導(dǎo)目標(biāo)蛋白表達(dá)，每隔24小時取樣，1000rpm離心10min，取上清按下述DNS法測定酶活，經(jīng)篩選從YPD-G418(8mg/mL)平板得到含有重組質(zhì)粒pPIC9K-Licl6A的GS115菌株，菌株表型Mut+His+。二、搖瓶培養(yǎng)將上述篩選酶活最高的菌株在BMGY培養(yǎng)基(1%酵母粉，2%蛋白胨，100mM、pH7.0的磷酸鹽緩沖液，1.34%YNB，4X10—5%生物素，1%甘油)搖瓶培養(yǎng)16_18h，3000g離心5min，收集菌體，用B匪Y培養(yǎng)基(1%酵母粉，2%蛋白胨，100mM、pH7.0的磷酸鹽緩沖液，1.34%YNB，4X10—5%生物素，0.5%甲醇)重懸菌體0D6。。至1.0左右，誘導(dǎo)目標(biāo)蛋白表達(dá)。以上培養(yǎng)條件為500mL三角瓶裝量100mL培養(yǎng)基，溫度3(TC，轉(zhuǎn)速250rpm。誘導(dǎo)96h，酶活可達(dá)1698U/mL上清液。酶活力通過DNS法(Miller,G丄1959.Useofdinitrosalicylicacidreagentfordeterminationofreducingsugars.Anal.Chem.31，426-428)測定將大麥葡聚糖底物配制成lg/100mL濃度，測定時在小試管中加入50L底物，然后加入100yLpH7.0、75mM的MES緩沖液，混勻使緩沖液濃度為50mM，底物濃度為0.25g/100ml。70。C預(yù)熱3min，加入50iiL適當(dāng)稀釋的酶液，反應(yīng)lOmin后加入200yLDNS試劑，煮沸15min后加入200iiL飽和酒石酸鉀鈉溶液，冷卻后測定540nm吸光度值，以葡萄糖作為標(biāo)準(zhǔn)。l個酶活力(U)的單位定義為在上述條件下(pH7.0，溫度7(TC)，每分鐘生成lymol葡萄糖所需要的酶量。三、高密度發(fā)酵本步驟設(shè)置空載體對照按照實(shí)施例2步驟一獲得重組菌的方法，將pPIC9K質(zhì)粒線性化后電轉(zhuǎn)化嗜甲醇畢赤酵母GS115，得到空載體對照pPIC9K/GS115。71、發(fā)酵罐高密度發(fā)酵表達(dá)采用5L的發(fā)酵罐(BIOTECH,上海保興生物設(shè)備工程有限公司)。種子培養(yǎng)基BMGY;發(fā)酵基本培養(yǎng)基BSM(85%H3P04，26.7mL;CaS04，0.93g;K2S04，18.2g;MgS047H20，14.9g;K0H，4.13g;甘油，40.Og，加蒸餾水水至1L)。甘油分批補(bǔ)料培養(yǎng)基50g/100ml甘油高壓滅菌后，加入PTM1(CuS04*7H20，6.Og;NaI，O.08g;MnS04H20，3.Og;Na2Mo042H20，0.2g;硼酸，O.02g;CoC12，0.5g;ZnC12，20.Og;FeS047H20，65.Og;生物素，O.2g;濃硫酸，5.OmL;加水至1L)12mL/L甘油。100%甲醇誘導(dǎo)培養(yǎng)基100%甲醇，加入PTMi12mL/L甲醇。發(fā)酵過程(1)種子培養(yǎng)從保藏的甘油管吸取0.2mL菌液接種200mLBMGY培養(yǎng)基，3(TC，250rpm過夜培養(yǎng)至0D6。。10.0左右。(2)分批培養(yǎng)裝量2.OL(發(fā)酵基本培養(yǎng)基BSM)，發(fā)酵罐滅菌，28%濃氨水調(diào)pH4.O，加入PTM^.35mL/L起始發(fā)酵液(2L發(fā)酵基本培養(yǎng)基BSM)，接種量10%，轉(zhuǎn)速700rpm，通氣量1.Ovvm，發(fā)酵18-24h。(3)甘油分批補(bǔ)料培養(yǎng)待分批培養(yǎng)至甘油耗盡(根據(jù)DOspikes操作，30s內(nèi)溶氧迅速上升至接近100%又迅速下降)，流加甘油分批補(bǔ)料培養(yǎng)基，流速18.4mL/h/L起始發(fā)酵液，始終監(jiān)視DO，通過停止流加、調(diào)整轉(zhuǎn)速和通氣量等保持DO>20%。流加時間4小時，待0De。。220左右，停止流加。(4)100%甲醇誘導(dǎo)培養(yǎng)停止流加甘油后，根據(jù)DOspikes，饑餓30min左右，流加100%甲醇誘導(dǎo)培養(yǎng)基，在4h內(nèi)使流速從3.6mL/h/L起始發(fā)酵液增加至10.9mL/h/L起始發(fā)酵液左右，監(jiān)控溶氧(DO)>20%。發(fā)酵過程中取樣分析細(xì)胞濃度及酶活(測定方法同步驟二)，結(jié)果顯示，在72h達(dá)到最高酶活，發(fā)酵液上清酶活55，300U/mL，粗蛋白9.lg/L。蛋白濃度參照Lowry等(Lowry，0.H.，Rosebrough，N.J.，F(xiàn)arr，A.L，andRandall,R.J.Proteinmeasurementwiththefolinphenolreagent.JBiolChem，1951，193:265-275)的方法，以牛血清白蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白)。而空載體對照無酶活，故未在圖中顯示。蛋白經(jīng)Gelpro4.5凝膠分析軟件分析，目標(biāo)蛋白占胞外總蛋白的80%以上，發(fā)酵過程參數(shù)見圖3、圖4。四、重組P-l，3-l，4-葡聚糖酶純化取步驟三中的發(fā)酵(72h放罐)上清液10mL，10000rpm/min離心10min，取上清10mL，用pH9.OTris-Cl平衡緩沖液交換三次，最終濃縮至lmL，上樣經(jīng)pH9.0、20mM的Tris-Cl平衡緩沖液平衡的Q-S印haroseFastFlow強(qiáng)陰離子交換柱(1X10cm)，200mMNaCl洗滌5-10個柱體積，300mMNaCl洗脫，流速lmL/min，收集有活性的部分，超濾濃縮至lmL，分兩次上樣經(jīng)pH7.2、20mM磷酸緩沖液(含lOOmMNaCl)平衡的S印hacrylS-100HR(1X100cm)，用同樣的磷酸緩沖液洗脫，流速0.3mL/min，電泳檢測，收集目標(biāo)蛋白。純化蛋白經(jīng)SDS-PAGE(XaemmliUK.CleavageofstructuralproteinsduringtheassemblyoftheheadofbacteriophageT4.Nature,1970，277:680-685)檢測達(dá)至lj電泳純(圖5)。純化結(jié)果見表2。其中酶活和蛋白含量的測定方法分別同步驟二和步驟三。表2重組蛋白純化表<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>a10mL發(fā)酵上清液實(shí)施例3、P-l，3-l，4-葡聚糖酶的性質(zhì)—、P-l，3-l，4-葡聚糖酶最適pH將實(shí)施例2中純化后的蛋白溶于不同pH值的4種50mM不同緩沖液體系中(Citric_Na2HP04，pH2.5-5.5;MES，pH5.0-6.5;磷酸緩沖液，pH6.5-8.5;Glycine-NaOH，pH8.5-11.0)，然后在7(TC條件下測定酶活力(酶活力測定方法同步驟二)，以酶活力最高點(diǎn)作為100%作圖。結(jié)果表明重組P-l，3-l，4-葡聚糖酶的最適pH為7.0(圖6)。二、e-l，3-1,4-葡聚糖酶最適反應(yīng)溫度將實(shí)施例2中純化后的蛋白適當(dāng)稀釋于50mMpH7.0的MES緩沖液中，然后分別在40-10(TC不同溫度下按照上述方法測定P-l，3-l，4-葡聚糖酶的酶活力(酶活力測定方法同步驟二)。以酶活力最高點(diǎn)作為100%作圖。結(jié)果顯示，P-l，3-l，4-葡聚糖酶的最適反應(yīng)溫度為70°C(圖7)。權(quán)利要求一種蛋白，是如下1)或2)或3)的蛋白質(zhì)1)由序列表中序列2的第19-314所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；2)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；3)將序列表中序列2的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有β-1，3-1，4-葡聚糖酶活性的由1)衍生的蛋白質(zhì)。2.權(quán)利要求l所述蛋白的編碼基因。3.如權(quán)利要求2所述的編碼基因，其特征在于所述蛋白的編碼基因?yàn)槿缦?)-4)中任一所述的基因1)其編碼序列是序列表中序列1的自5'末端第55-945位；2)其編碼序列是序列表中序列1;3)在嚴(yán)格條件下與1)或2)的基因雜交且編碼權(quán)利要求1所述蛋白的基因；4)與1)或2)的基因具有90%以上的同源性且編碼權(quán)利要求1所述蛋白的基因。4.含有權(quán)利要求2或3所述基因的重組載體。5.如權(quán)利要求4所述的重組載體，其特征在于，所述重組載體是將權(quán)利要求2或3所述的基因插入pPIC9K的多克隆位點(diǎn)得到的重組表達(dá)載體。6.含有權(quán)利要求2或3所述基因的表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌。7.如權(quán)利要求6所述的重組菌，其特征在于所述重組菌是將權(quán)利要求2或3所述的基因通過權(quán)利要求4或5所述的重組表達(dá)載體導(dǎo)入畢赤酵母中，得到的轉(zhuǎn)基因重組菌。8.權(quán)利要求1所述蛋白的制備方法，是將權(quán)利要求6或7所述的重組菌進(jìn)行發(fā)酵得到，所述發(fā)酵條件是溫度是3(TC，溶氧〉20%。全文摘要本發(fā)明公開了一種β-1，3-1，4-葡聚糖酶及其編碼基因。本發(fā)明提供的β-1，3-1，4-葡聚糖酶是如下1)或2)或3)的蛋白質(zhì)1)由序列表中序列2的第19-314位所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；2)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；3)將序列表中序列2的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有β-1，3-1，4-葡聚糖酶活性的由1)衍生的蛋白質(zhì)。將該蛋白的編碼基因?qū)氘叧嘟湍负髽?gòu)成的重組畢赤酵母也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。實(shí)驗(yàn)證明重組畢赤酵母發(fā)酵液上清酶活最高達(dá)55,300U/mL，粗蛋白9.1g/L。本發(fā)明的β-1，3-1，4-葡聚糖酶最適反應(yīng)溫度為70℃，最適pH值為7.0。該β-1，3-1，4-葡聚糖酶在生產(chǎn)中具有很大的推廣應(yīng)用潛力。文檔編號C12N15/56GK101775385SQ20101011577公開日2010年7月14日申請日期2010年3月1日優(yōu)先權(quán)日2010年3月1日發(fā)明者華承偉,唐艷斌,李一男,江正強(qiáng),閆巧娟申請人:中國農(nóng)業(yè)大學(xué)