專利名稱：一種豬產(chǎn)仔數(shù)性狀的分子標(biāo)記方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于動物的基因多態(tài)性技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及豬的性激素結(jié)合球蛋白(SHBG)基因多態(tài)性。

背景技術(shù)：
性激素結(jié)合球蛋白(Sex Hormone-Binding Globulin，SHBG)，又稱睪酮-雌二醇結(jié)合球蛋白，SHBG是一運輸性激素的載體，動物性激素到達(dá)靶組織是由血液中的SHBG來調(diào)控的，SHBG是在肝細(xì)胞中表達(dá)的一種糖蛋白質(zhì)，這種蛋白質(zhì)特異性地與性激素相結(jié)合并參與其轉(zhuǎn)運，調(diào)控血液中生物活性的性激素濃度。生理情況下，性激素結(jié)合球蛋白(SHBG)復(fù)合物的快速解離與游離性激素和SHBG相結(jié)合之間存在著動態(tài)平衡，性激素由于與SHBG結(jié)合而得到保護，從而避免了血管的吸附、生物和化學(xué)的破壞以及快速降解，只有游離的性激素才具有生物活性。性激素變化可引起性功能異常，但是，由于SHBG對游離性激素水平有調(diào)節(jié)作用，甚至即使血漿中性激素總體水平正常.而游離的性激素卻可能異常。SHBG基因主要在肝臟、卵巢(或睪丸)內(nèi)表達(dá)，雖然組織來源不同，但結(jié)構(gòu)基因是相同的，由于SHBG基因發(fā)生單核苷酸突變造成SHBG分子一級結(jié)構(gòu)的改變，改變了SHBG與性激素結(jié)合和運輸?shù)男?，從而使性激?雌二醇、睪酮等)不能作用于靶組織，造成母豬的卵巢機能紊亂，使母豬出現(xiàn)乏情。因此，研究豬的SHBG基因多態(tài)性與母豬繁殖性能的關(guān)系，將對提高母豬繁殖性能提供又一分子遺傳基礎(chǔ)。
豬的SHBG基因至今尚未見研究報道。但人的SHBG相關(guān)研究較多，為研究豬的SHBG基因提供了寶貴的可借鑒的資源，人的SHBG基因位于17號染色體上的p12→p13，基因全長4kb，它是在激素和代謝調(diào)節(jié)因子的調(diào)控下由肝細(xì)胞進行表達(dá)合成。目前較多的研究主要在于人的SHBG基因多態(tài)性對性激素的調(diào)控水平上，以期能在遺傳疾病方面獲得進展。在人類SHBG基因上的研究表明，在患有高雄激素癥，尤其是患有多囊卵巢綜合癥(Papillary SerousOvarian Carcinoma PSOC)和一些患有高度危險性的糖尿病和心臟病的人的血清中SHBG水平含量很低，說明SHBG與人的卵巢功能、血液中性激素及其他疾病有關(guān)。SHBG基因變異，尤其是在5’端座位上距翻譯起始位點第8個堿基的A→G，極顯著地影響血清中SHBG水平，Dunning等研究發(fā)現(xiàn)，該位點AA基因型個體比GG型個體的血液中SHBG含量高28％，Eriksson等也發(fā)現(xiàn)該位點AA基因型比AG和GG型個體分別高22％和26％。在內(nèi)含子1中有一突變位點C→T，該突變位點也與SHBG含量存在著相關(guān)。在第8外顯子存在一個A→G突變位點，該突變位點可導(dǎo)致SHBG蛋白的Asn氨基酸突變?yōu)锳SP氨基酸，使SHBG含量改變，但比其他位點突變所改變的程度小，但Asn突變?yōu)锳sp影響了一個潛在的糖基化位點，增大了少量等位基因編碼蛋白的半衰期。含有6個單核苷酸的重復(fù)序列個體明顯比不攜帶此重復(fù)序列的SHBG水平低。家兔SHBG的單體比人的短6個氨基酸殘基，兩個N-寡糖鏈連結(jié)于Asn345和Asn361上，沒有O-寡糖鏈，也沒有明確的內(nèi)部重復(fù)序列。
目前，由于豬的SHBG基因尚無研究報道，于是安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院立項研究豬的SHBG基因結(jié)構(gòu)及多態(tài)性分析，成功分離出了豬SHBG基因第4外顯子至第6外顯子的序列，建立了第6外顯子突變體的檢測方法，并分析了其多態(tài)性與產(chǎn)仔數(shù)之間的相關(guān)性。


發(fā)明內(nèi)容
為了實現(xiàn)豬性激素結(jié)合球蛋白基因第6外顯子突變體的檢測，本發(fā)明提供一種豬產(chǎn)仔數(shù)性狀的分子標(biāo)記方法。
本發(fā)明方法包括豬基因組DNA的提取、性激素結(jié)合球蛋白(SHBG)基因第6外顯子引物設(shè)計、體外擴增和基因型檢測。
具體的操作方法如下 一種豬產(chǎn)仔數(shù)性狀的分子標(biāo)記方法，其特征在于包括以下操作步驟 (1)采集耳組織樣 在仔豬出生當(dāng)天，采取豬的耳緣組織； (2)基因組DNA提取 從豬的耳緣組織中提取豬的基因組DNA； (3)引物設(shè)計 在豬性激素結(jié)合球蛋白(SHBG)基因第6外顯子兩端設(shè)計1對引物，即上游引物和下游引物，其序列如下 上游引物TGGTCTGCTCTGTGTCCTTTTC長度bp217退火溫度63℃， 下游引物GAGGTGGAGCCAAGAAGAGTTT長度bp217退火溫度63℃； (4)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) A、配制聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)體系 由4×dNTP2.5mmol/l脫氧核苷三磷酸2ul、10mmol/ml上游引物和10mmol/ml下游引物各0.5ul、10U/μl Taq聚合酶0.4ul、濃度為50ng/ul豬的DNA基因組溶液2ul、含20mmol/l氯化鎂(MgCl2)的10×聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)緩沖液2.5ul，加水17.1ul至終體積25ul；并混合均勻，制得25ul聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)體系； B、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)條件 將25μl聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)體系放入聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)儀器，反應(yīng)條件如下 ①94℃預(yù)變性4分鐘， ②94℃變性30秒， ③退火溫度63℃30秒， ④72℃延伸30秒， ⑤重復(fù)第②～④步驟35個循環(huán)， ⑥72℃延伸7分鐘，最后降溫至4℃保存，得到豬性激素結(jié)合球蛋白(SHBG)基因第6外顯子的體外擴增產(chǎn)物； (5)限制性內(nèi)切酶酶切反應(yīng)，多態(tài)位點限制性片段酶切多態(tài)性(RLFP)檢測 由于豬性激素結(jié)合球蛋白(SHBG)基因第6外顯子第17位堿基由A突變?yōu)镚，導(dǎo)致了一個Aval限制性內(nèi)切酶的酶切多態(tài)性位點，具體酶切反應(yīng)操作步驟是取豬性激素結(jié)合球蛋白(SHBG)基因第6外顯子的體外擴增產(chǎn)物10ul于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)管中，分別加入10U/ul Aval限制性內(nèi)切酶1ul，Aval限制性內(nèi)切酶緩沖液2ul，加水7ul，混勻，溫度37℃反應(yīng)3小時，得到酶切產(chǎn)物； 將酶切產(chǎn)物用12％聚丙烯酰胺凝膠電泳2小時，電泳條件常溫，電壓120V，得到含酶切產(chǎn)物的凝膠；將含酶切產(chǎn)物的凝膠置于凝膠成像系統(tǒng)下觀測基因型，GG型個體為產(chǎn)仔數(shù)性狀優(yōu)良基因類型，選擇其中條帶為GG型的個體留種，可提高選留群體的產(chǎn)仔數(shù)。
通過實驗，對瘦肉型淮豬品系一世代豬群性激素結(jié)合球蛋白基因多態(tài)性與產(chǎn)仔數(shù)的相關(guān)性分析如下 224頭淮豬新品系II系一世代母豬群性激素結(jié)合球蛋白(SHBG)基因多態(tài)性檢測結(jié)果，見表3。A等位基因頻率為0.487，G等位基因頻率為0.513，該豬群在該位點存在著豐富的多態(tài)性，經(jīng)卡方(x2)檢驗，在A17G位點上處于哈德-溫伯格(Hardy-Weinberg)平衡狀態(tài)。
表3淮豬新品系一世代豬群SHBG基因多態(tài)位點遺傳參數(shù)
性激素結(jié)合球蛋白(SHBG)基因多態(tài)性與產(chǎn)仔數(shù)的關(guān)聯(lián)分析 利用SPSS13.0軟件的一般線性模型(GLM)程序?qū)?24頭的初產(chǎn)仔數(shù)進行最小二乘分析，并對基因效應(yīng)進行了分析，結(jié)果見表4。GG型個體平均總產(chǎn)仔數(shù)最高為11.62頭，顯著高于AA型和AG型個體；GG型個體平均活產(chǎn)仔數(shù)為11.28頭，極顯著高于AA型和AG型個體，因此突變型(GG型)個體為該位點產(chǎn)仔數(shù)性狀的優(yōu)良基因型。從基因效應(yīng)分析看，顯性效應(yīng)均為不完全顯性，SHBG基因?qū)偖a(chǎn)仔數(shù)和產(chǎn)活仔數(shù)均表現(xiàn)出負(fù)的加性效應(yīng)；A等位基因的平均效應(yīng)值(總產(chǎn)仔數(shù)和產(chǎn)活仔數(shù))分別為-0.549和-0.593，G等位基因的平均效應(yīng)值(總產(chǎn)仔數(shù)和產(chǎn)活仔數(shù))分別為0.522和0.563；G等位基因替代A等位基因的平均效應(yīng)值分別為1.071和1.156。
表4SHBG基因多態(tài)性與初產(chǎn)仔數(shù)相關(guān)性及基因效應(yīng)分析(均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤)
注同一行肩標(biāo)*與**(或**與***)表示差異顯著(P＜0.05)；標(biāo)有*與***表示差異極顯著(P＜0.01)。
結(jié)論 在世代選育過程中未打破該位點的平衡狀態(tài)。并分析了該突變與豬產(chǎn)仔數(shù)的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)該位點與產(chǎn)仔數(shù)性狀呈顯著相關(guān)，GG型個體總產(chǎn)仔數(shù)比AA型個體高2.12頭，活產(chǎn)仔數(shù)高2.28頭，該群體中突變型個體(GG型)在產(chǎn)仔數(shù)性狀上表現(xiàn)出較強的優(yōu)勢，是產(chǎn)仔數(shù)性狀的優(yōu)勢基因型。G等位基因替代A等位基因的平均效應(yīng)值為正效應(yīng)，表明G等位基因為該群體的優(yōu)良基因，增加G等位基因的頻率可增加該群體的產(chǎn)仔數(shù)。
本發(fā)明的有益技術(shù)效果體現(xiàn)在以下方面 1、首次發(fā)現(xiàn)豬性激素結(jié)合球蛋白基因，并建立了檢測第6外顯子突變位點的檢測方法。
2、首次發(fā)現(xiàn)第6位點多態(tài)性與豬產(chǎn)仔數(shù)存在著顯著相關(guān)。
3、可以用于豬的育種中產(chǎn)仔數(shù)性狀的輔助選擇，可實現(xiàn)種豬的早期選種，甚至在豬剛出生時就可準(zhǔn)確地進行選留，運用該基因聚合方法可以經(jīng)過一個世代就可以將性激素結(jié)合球蛋白基因的優(yōu)良基因型穩(wěn)定下來，即經(jīng)一個世代的選育即將該品系的生長性狀的優(yōu)良基因達(dá)到純合，而常規(guī)育種方法要經(jīng)過大量的生產(chǎn)性能測定和后裔測定，并且要繼代選育5個世代以上才能達(dá)到需要的效果，大大縮短了世代間隔，加快選擇進程。
4、該方法操作簡便，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)過程中條件要求不高，擴增片段長度較短(217bp)，擴增較容易，提高了擴增效率及判斷基因型的準(zhǔn)確性。



圖1為本發(fā)明性激素結(jié)合球蛋白(SHBG)基因PCR擴增瓊脂糖凝膠電泳圖， 圖2為性激素結(jié)合球蛋白(SHBG)基因SSCP非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳圖， 圖3為性激素結(jié)合球蛋白(SHBG)基因部分序列比對分析圖， 圖4為性激素結(jié)合球蛋白(SHBG)基因第6外顯子限制性內(nèi)切酶(Aval)酶切圖。

具體實施例方式 下面結(jié)合附圖，通過實施例對本發(fā)明作進一步地描述。
實施例 一種豬產(chǎn)仔數(shù)性狀的分子標(biāo)記方法的具體操作方法如下 (1)采集耳組織樣 在仔豬出生當(dāng)天，用豬耳號鉗采取豬的耳緣組織0.2克左右，放入1.5ml的離心管中，倒入75％的酒精1ml左右，然后放入-20℃冰箱保存待用。
(2)基因組DNA提取 從冰箱中取出耳緣組織，用剪刀將其剪碎，倒入DAN組織提取液600ul，其DNA組織提取液配方見表1，提取液現(xiàn)用現(xiàn)配。然后放入55℃溫浴12小時，然后加入Tris飽和酚600ul，上下?lián)u動混勻15分鐘，用低溫高速離心機離心10分鐘，離心機轉(zhuǎn)速要求12000轉(zhuǎn)/分鐘；用1ml移液器取出上清液至已滅菌的1.5ml離心管中，再加入等體積的Tris飽和酚，再上下?lián)u動混勻15分鐘，再離心10分鐘(12000轉(zhuǎn)/分鐘)；取上清液，加入等體積的Tris飽和酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)混勻10分鐘，離心10分鐘(12000轉(zhuǎn)/分鐘)。取上清液加入等體積的氯仿∶異戊醇(24∶1)，混勻10分鐘，離心10分鐘(12000轉(zhuǎn)/分鐘)。取上清液加入2倍體積的冰乙醇(約1ml)，再加1/10體積的約60μl的NaAc(醋酸鈉)水平搖動，可見絮狀、白色DNA樣品出現(xiàn)。將樣品置于-20℃冷凍30分鐘，取出或挑出DNA或離心(12000轉(zhuǎn)/分鐘)10分鐘，DNA沉于管底。用75％乙醇洗滌DNA，搖動洗滌后，離心5-10(12000轉(zhuǎn)/分鐘)。棄去75％的乙醇，自然干燥后，加入適量(約50μl)TE溶解，放-20℃冰箱中保存。
表1DNA組織提取液配方(總體積200ml) (3)引物設(shè)計 用Primer 5.0軟件對豬的SHBG基因第6外顯子兩端設(shè)計1對引物，引物序列見表2。
表2SHBG基因第6外顯子引物序列
(4)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR) 25ul聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)體系，由4×dNTP2.5mmol/l脫氧核苷三磷酸2ul、10mmol/ml上游引物和10mmol/ml下游引物各0.5ul、10U/ul Taq聚合酶0.4ul、濃度為50ng/ul的DNA基因組模板溶液2ul、含20mmol/l MgCl2的10×聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)緩沖液2.5ul，加水17.1ul至終體積25ul；并混合均勻。
聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)儀器的反應(yīng)條件 ①94℃預(yù)變性4分鐘； ②94℃變性30秒； ③退火溫度63℃30秒； ④72℃延伸30秒； ⑤重復(fù)第②～④步驟35個循環(huán)； ⑥72℃延伸7分鐘，最后降溫至4℃保存。
經(jīng)以上反應(yīng)得到SHBG基因的體外擴增產(chǎn)物，用2％瓊脂糖凝膠電泳檢測。SHBG基因擴增片段長度為217bp；見圖1。由圖1看出沒有非特異性擴增產(chǎn)物，可以進行下一步分析。
(5)單鏈構(gòu)象多態(tài)性(Single-Strand Conformation Polymorphism，SSCP)分析 取4ulPCR產(chǎn)物與變性緩沖液(1ml變性緩沖液中含去離子甲酰胺980uL、0.5M的EDTA20uL，溴酚藍(lán)25mg)混勻置于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)管中，在98℃下變性10分鐘，立即放冰浴5分鐘，取出后立即上樣于12％非變性聚丙烯酰胺凝膠孔中，室溫下電壓120V電泳13小時，銀染顯色，利用凝膠成像系統(tǒng)進行帶型分析。見圖2，由圖2可知該位點存在3種基因型，即AA型、GG型和AG型。
(6)擴增產(chǎn)物的測序 對第(5)步的單鏈構(gòu)象多態(tài)性檢測(SSCP)分型后的兩種純合基因型，即AA型和GG型個體的PCR擴增產(chǎn)物進行回收純化，并進行克隆，進行正反向測序，進一步驗證電泳分型結(jié)果。然后將測得含突變位點的序列與GenBank中12號染色體和GQ478019序列進行同源性比對分析，分析發(fā)現(xiàn)外顯子6的第17位發(fā)生了一個堿基A→G的突變，該突變導(dǎo)致了一個谷氨酰胺(Gln)被精氨酸(Arg)替換，即產(chǎn)生了錯義突變，使野生型性激素結(jié)合球蛋白該位點的谷氨酰胺(Gln)突變?yōu)榫彼?Arg)，造成性激素結(jié)合球蛋白的一級結(jié)構(gòu)的改變，變?yōu)橥蛔凅w。如圖3，左端第1個堿基為外顯子6第1堿基。
(7)多態(tài)位點的限制性片段酶切多態(tài)性(RLFP)檢測方法的建立 由于第6外顯子第17位堿基的突變(A突變?yōu)镚)導(dǎo)致了一個限制性內(nèi)切酶Aval的酶切多態(tài)性位點，具體酶切步驟是取該基因的擴增產(chǎn)物10ul于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)管中，分別加入濃度為10U/ul的AvaI限制性內(nèi)切酶1ul，Aval限制性內(nèi)切酶緩沖液2ul，加水7ul，混勻后入于37℃環(huán)境下反應(yīng)3小時，后用12％聚丙烯酰胺凝膠，常溫，120V電壓電泳2小時，將凝膠置于凝膠成像系統(tǒng)下觀測，其Aval限制性內(nèi)切酶酶切結(jié)果，見圖4，豬的性激素結(jié)合球蛋白SHBG基因第6外顯子Aval限制性內(nèi)切酶酶切圖其中第5泳道條帶為AA型，第8泳道條帶為GG型，第1、2、3、4、6、7、9、10、11、12泳道條帶為AG型。
權(quán)利要求
1.一種豬產(chǎn)仔數(shù)性狀的分子標(biāo)記方法，其特征在于包括以下操作步驟
(1)采集耳組織樣
在仔豬出生當(dāng)天，采取豬的耳緣組織；
(2)基因組DNA提取
從豬的耳緣組織中提取豬的基因組DNA；
(3)引物設(shè)計
在豬性激素結(jié)合球蛋白(SHBG)基因第6外顯子兩端設(shè)計1對引物，即上游引物和下游引物，其序列如下
上游引物TGGTCTGCTCTGTGTCCTTTTC，
下游引物GAGGTGGAGCCAAGAAGAGTTT；
(4)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)
A、配制聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)體系
由4×dNTP2.5mmol/l脫氧核苷三磷酸2ul、10mmol/ml上游引物和10mmol/ml下游引物各0.5ul、10U/μl Taq聚合酶0.4ul、濃度為50ng/ul豬的DNA基因組溶液2ul、含20mmol/l氯化鎂(MgCl2)的10×聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)緩沖液2.5ul，加水17.1ul至終體積25ul；并混合均勻，制得25ul聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)體系；
B、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)條件
將25μl聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)體系放入聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)儀器，反應(yīng)條件如下
①94℃預(yù)變性4分鐘，
②94℃變性30秒，
③退火溫度63℃30秒，
④72℃延伸30秒，
⑤重復(fù)第②～④步驟35個循環(huán)，
⑥72℃延伸7分鐘，最后降溫至4℃保存，得到豬性激素結(jié)合球蛋白(SHBG)基因第6外顯子的體外擴增產(chǎn)物；
(5)限制性內(nèi)切酶酶切反應(yīng)，多態(tài)位點限制性片段酶切多態(tài)性(RLFP)檢測
由于豬性激素結(jié)合球蛋白(SHBG)基因第6外顯子第17位堿基由A突變?yōu)镚，導(dǎo)致了一個Aval限制性內(nèi)切酶的酶切多態(tài)性位點，具體酶切反應(yīng)操作步驟是取豬性激素結(jié)合球蛋白(SHBG)基因第6外顯子的體外擴增產(chǎn)物10ul于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)管中，分別加入10U/ul Aval限制性內(nèi)切酶1ul，Aval限制性內(nèi)切酶緩沖液2ul，加水7ul，混勻，溫度37℃反應(yīng)3小時，得到酶切產(chǎn)物；
將酶切產(chǎn)物用12％聚丙烯酰胺凝膠電泳2小時，電泳條件常溫，電壓120V，得到含酶切產(chǎn)物的凝膠；將含酶切產(chǎn)物的凝膠置于凝膠成像系統(tǒng)下觀測基因型，GG型個體為產(chǎn)仔數(shù)性狀優(yōu)良基因類型，選擇其中條帶為GG型的個體留種，可提高選留群體的產(chǎn)仔數(shù)。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種豬產(chǎn)仔數(shù)性狀的分子標(biāo)記方法。本發(fā)明方法包括豬基因組DNA的提取、性激素結(jié)合球蛋白(SHBG)基因第6外顯子引物設(shè)計、體外擴增和基因型檢測。本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)豬性激素結(jié)合球蛋白基因，發(fā)現(xiàn)第6外顯子的多態(tài)性與豬產(chǎn)仔數(shù)存在著顯著相關(guān)；并建立了檢測第6外顯子突變位點的限制性片段酶切多態(tài)性檢測方法。本發(fā)明方法可以用于豬的育種中產(chǎn)仔數(shù)性狀的輔助選擇，可實現(xiàn)種豬的早期選種，甚至在豬剛出生時就可準(zhǔn)確地進行選留，大大縮短了世代間隔，加快選擇進程；該方法操作簡便，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)過程中條件要求不高，擴增片段長度較短(217bp)，擴增較容易，提高了擴增效率及判斷基因型的準(zhǔn)確性。
文檔編號C12Q1/68GK101768642SQ20101011724
公開日2010年7月7日 申請日期2010年3月3日 優(yōu)先權(quán)日2010年3月3日
發(fā)明者李慶崗, 陶立, 劉林清 申請人:安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所