專利名稱：利用tat核心肽段促進外源蛋白可溶性表達的方法及其專用表達載體的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于生物技術產品應用領域，涉及外源蛋白的大量制備方法，特別涉及種 利用TAT核心肽段促進外源蛋白高效、可溶性表達的方法及其專用表達載體。
背景技術：
眾所周知，蛋白質是機體生命活動的重要執(zhí)行者，也是目前市場上大量使用的蛋 白類藥物的物質基礎。如何實現(xiàn)有功能的、高活性蛋白質的大量制備并進一步顯著提升生 物制品的生產效率，不僅是生物工程領域亟待解決的問題，而且還是基于蛋白質藥物研發(fā) 領域的一大難題。TAT(Trans-activator transduction)是 HIV-I(Human Immunodeficiency Virus-l)編碼的一段富含堿性氨基酸序列的多肽，屬于蛋白轉導結構域家族的成員，目前 的研究揭示該家族主要還包括Antp、HSV VP22和人工合成的多聚精氨酸和多聚賴氨酸等， 能夠介導多種外源物質如蛋白質、核酸和其他顆粒性物質(如納米材料)等通過所有生物 膜性結構，而不失去外源物質的活性。根據(jù)病毒株的不同，TAT全長含有86-102個氨基酸不等，核心區(qū)含有11個氨基酸 (YGRKKRRQRRR)。Frankel與Green分別于1988年獨立證明全長TAT多肽能夠跨膜轉導入細 胞，激活HIV-LTR的啟動子，繼而激活后續(xù)蛋白的表達(Frankel et al，Cellularuptake of the TAT protein from human immunodeficiency virus. Cell 1988,55(6) :1189-1193; Green et al, Autonomous functional domains of chemicalIysynthesized human immunodeficiency virus TAT trans-activator protein.Celll988,55(6) :1179-1188)； 1994年，F(xiàn)awel等研究進一步揭示TAT具有蛋白轉導活性(Fawell et al，TAT-mediated delivery of heterologous proteins into cells. Proc Natl Acad Sci USA 1994,91(2) 664-668)；而Vives等于1997年揭示TAT中一段富含堿性氨基酸、帶正電荷的核心肽段 具有蛋白轉導活性，后續(xù)許多研究都是基于TAT核心區(qū)的跨膜轉導功能展開(Vives et al, A truncated HIV-I TAT proteinbasic domain rapidly translocates through the plasma membrane and accumulatesin the cell nucleus. J Biol Chem 1997,272(25) 1601016017)。但直到目前為止，所有的研究僅停留在TAT介導外源物質跨膜轉導現(xiàn)象的層 面，沒有資料介紹對TAT多肽其它功能的研究。

發(fā)明內容
本發(fā)明提供了一種利用TAT核心肽段(氨基酸序列序列表中序列幻促進外源蛋 白高效、可溶性表達的專用表達載體。本發(fā)明所提供的專用表達載體，是含有一個或多個TAT核心多肽編碼區(qū)的原核表 達載體。所述TAT核心多肽編碼區(qū)為能夠根據(jù)三聯(lián)體密碼組合成其氨基酸序列的任意核酸編碼序列，如序列1所示的tayggnmgna araarmgnmg ncarmgnmgn mgn序列，其中y = a、 t、g或c，m = a、t、g或c，η = a、t、g或c，r = a、t、g或c ；優(yōu)選的核苷酸序列可如序列 2 PffTjk^] tacggcagga agaagcggag acagcgacga agaD用于構建所述專用表達載體的出發(fā)載體可為任意一種外源基因的原核表達載體， 如 pET28、pBV220、pET30、pCRT7/CT-T0P0、pET101/D-T0P0 或 pQE30 等，優(yōu)選為 pET28。其中，以pET28為出發(fā)載體構建的專用表達載體為pET28b_TAT。另一方面，用以上所述的專用表達載體構建的帶外源基因的原核表達載體也屬于 本發(fā)明。具體的，可以為圖2(B)所構建的原核表達載體pET28b-TAT-EGFP，或圖6(B)所構 建的原核表達載體pET2^-TAT-NGB。本發(fā)明的第二個目的是提供一種利用TAT核心肽段促進外源蛋白高效、可溶性表 達的方法。本發(fā)明所提供的利用TAT核心肽段促進外源蛋白高效、可溶性表達的方法，可包 括以下步驟1)將外源基因插入上述專用表達載體中，得到含有TAT核心多肽編碼區(qū)和外源基 因的原核表達載體；2)將原核表達載體向原核表達體系轉化；3)原核表達載體的誘導表達；4)外源蛋白的制備。制備得到的外源蛋白可采用SDS-PAGE、免疫印跡和熒光顯微鏡觀察等方法鑒定。在上述外源蛋白的表達方法中，步驟1)中的原核表達載體中，所述TAT核心肽段 可以是一個拷貝或多個拷貝與外源蛋白的核酸編碼序列相連接；所述TAT核心肽段編碼區(qū) 可以置于外源蛋白編碼序列的上游或下游。步驟幻中的原核表達體系可為大腸桿菌或枯草桿菌等，優(yōu)選為大腸桿菌。所述大腸桿菌可為E. coli BL21 (DE3)、E. coli BL21 (DE3)plys、BLR(DE3)、B834、 DH5a、HBlOl 或 JM109 等。上述重組表達載體和重組菌均可按照常規(guī)方法構建。步驟幻中可采用化學試劑誘導外源基因在宿主細胞中表達，其中，化學試劑誘導 表達條件可為采用500mL搖瓶發(fā)酵(150mL/瓶)；誘導劑IPTG誘導表達(終濃度ImM)； 誘導表達的OD6tltl = 0. 6-1. 0 ；誘導表達時間6-8小時。此外，還可低溫誘導外源蛋白的表達，低溫誘導表達條件為采用平皿涂布制備克 ??；4°C低溫誘導表達；誘導表達時間4天。步驟4)中外源蛋白的制備方法可為用預冷的PBS重懸菌體后超聲破碎、離心。本發(fā)明提出了 TAT核心肽段促進原核表達體系高效可溶性表達外源蛋白的新用 途，并具體提供了一種利用TAT核心肽段促進原核表達體系高效、可溶性表達外源蛋白的 方法及其專用表達載體。經(jīng)檢測，表達產物主要以可溶性的形式存在宿主菌裂解上清中，且 占裂解上清總蛋白的25-30%。通過本發(fā)明的實施，不僅可以獲得可溶性的外源蛋白，而且 還可以獲得高產量的外源蛋白，可為大量制備具有生物活性的外源蛋白奠定基礎和提供關 鍵技術，可望解決生物工程和藥物研發(fā)領域等外源蛋白難以高效表達的部分難題，從而可 顯著節(jié)約后續(xù)進行外源蛋白分離純化的成本等。雖然TAT核心肽段促進外源蛋白高效、可溶性表達的具體機制還有待進一步研究，但是這種通過與TAT核心肽段融合而促進外源蛋 白高效、可溶性表達的技術不僅可用于顯著提升外源蛋白的表達量并促進其形成正確的折 疊構象，而且在提高原核表達生產水平和提升生物工程產品生產效率等方面也具有十分重 要的應用價值。因此，本發(fā)明具有十分廣泛的應用前景，有望成為生物工程研究和藥物研 發(fā)的重要技術手段。 下面結合具體實施例對本發(fā)明做進一步詳細說明。


圖1為本發(fā)明利用TAT核心肽段促進外源蛋白高效、可溶性表達方法的流程圖
圖2為原核表達載體pET2^-EGFP/TAT-EGFP構建示意圖
圖3為離心后誘導表達菌體示意圖
圖4為TAT-EGFP和EGFP蛋白表達情況鑒定分析
圖5為熒光顯微鏡觀察分析TAT-EGFP和EGFP的熒光信號強弱
圖6為原核表達載體pET28b-NGB/TAT-NGB構建示意圖
圖7為離心后誘導表達菌體示意圖
圖8為TAT-NGB菌液裂解上清示意圖
圖9為TAT-NGB和NGB蛋白表達情況鑒定分析
圖10為熒光顯微鏡觀察及分析TAT-EGFP和EGFP熒光信號變化
具體實施例方式下述實施例中所用方法如無特別說明均為常規(guī)方法。實施例1、構建利用TAT核心肽段促進外源蛋白高效、可溶性表達的專用表達載體 pET28b-TAT首先通過化學合成的方法合成含有酶切位點為NcoI (上游)和NdeI (下游)的 雙鏈TAT的核心編碼序列片段(本實施例中選用序列表中序列2)，然后采用限制性內切酶 NcoI和NdeI雙酶切該核心片段和空載體pET28b，分別回收目的片段后，經(jīng)T4 DNA連接酶 連接外源DNA片段和空載體，轉化入感受態(tài)細胞BL21 (DE3)。按照常規(guī)方法提取質粒DNA并 進行NcoI和NdeI雙酶切鑒定，最后送英駿公司直接測序，確證含有TAT核心片段的原核表 達載體pET28b-TAT構建成功，為后續(xù)TAT功能的鑒定奠定了基礎。實施例2、利用TAT核心肽段促進增強型綠色熒光蛋白(EGFP)高效、可溶性表達如圖1所示，用本發(fā)明的方法促進增強型綠色熒光蛋白(EGFP)高效、可溶性表達， 具體方法包括以下步驟一、構建攜帶增強型綠色熒光蛋白(EGFP)編碼基因的原核表達載體 pET28b-TAT-EGFP 和 pET28b_EGFP1、通過聚合酶鏈式反應技術(PCR)擴增目的基因EGFP通過常規(guī)PCR方法擴增出EGFP的cDNA片段，50 μ 1 PCR反應體系為模板DNA 0. 5μ 1 ； 10 XdNTP 5μ 1 ；IOXLA Taq 緩沖液 5 μ 1 ；上下游引物各 0. 5 μ 1 ;LA Taq 酶 0. 25 μ l,ddH20 38. 25 μ 1。PCR 反應條件為95°C 2 分鐘；95°C 30 秒，56°C 45 秒，72°C 60 秒 (32個循環(huán))；72°C 7分鐘。反應結束后，對PCR產物進行1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測，回收并純化約717bp的目的片段。2、限制性內切酶分別酶切目的基因EGFP、載體pET28b和pET28b_TAT如圖2所示(㈧pEI^8b多克隆位點示意圖；(B)原核表達載體 pET28b-TAT-EGFP的構建示意圖；(C)原核表達載體pET28b_EGFP的構建示意圖)，用限制 性內切酶EcoRI和NotI切割目的基因EGFP和載體pET28b_TAT，用限制性內切酶BamHI和 XhoI切割目的基因EGFP和載體pET28b，回收酶切產物后用T4 DNA連接酶連接，將連接產 物轉化涂布LB平皿。3、鑒定將長出的克隆分別通過限制性內切酶酶切及測序鑒定，得到序列及插入位置均正 確的攜帶TAT核心肽段編碼區(qū)和EGFP的原核表達載體pET28b-TAT-EGFP和作為對照的攜 帶EGFP的原核表達載體pET2^-EGFP。二、轉化宿主大腸桿菌及菌體復蘇將步驟一構建正確的原核表達載體pET2m3-TAT-EGFP和pET2m3-EGFP轉化入大 腸桿菌BL21 (DE3)并涂布至LB平皿待長出克隆，各組分別挑取一個克隆接種到5mL含有 Kana+(終濃度ΙΟΟμ g/mL)的LB培養(yǎng)基中，37°C、220rpm搖菌約16小時，待菌體完全復蘇。三、原核表達載體pET28b-TAT-EGFP和pET28b_EGFP的誘導表達將復蘇的菌液稀釋至OD6tltl = 0. 8，然后吸取5mL菌液接種到150mL含有Kana+ (終 濃度ΙΟΟμ g/mL)的LB培養(yǎng)基中，37 °C、220rpm搖菌約4-5小時后測定OD6tltl,待OD6tltl = 0.6-1. O時迅速加入誘導劑IPTG (終濃度ImM)，并于30°C、220rpm誘導表達6小時。在誘 導表達O小時、2小時、4小時和6小時時各組分別取菌液IOmL待制備樣品檢測。四、蛋白樣品的制備上述誘導表達菌液于4°C、12000rpm離心10分鐘收集菌體，然后于4°C低溫下拍 照，如圖3所示(左邊兩個為TAT-EGFP離心菌體，右邊兩個為EGFP離心菌體。)，從實驗結 果可以直觀地看出TAT-EGFP表現(xiàn)出明顯的綠色熒光，且其熒光信號明顯強于EGFP，這說明 制備的TAT-EGFP具有顯著的活性；預冷的PBS重懸菌體后超聲破碎，制備總蛋白；另取預 冷的PBS重懸菌體后超聲破碎，在4°C、12000rpm離心收集上清和沉淀，分別制備上清蛋白 和沉淀蛋白樣品待鑒定。五、蛋白樣品鑒定1、SDS-PAGE和免疫印跡鑒定上述制備的蛋白樣品分別采用15% SDS-PAGE和免疫印跡鑒定，然后采用ImageJ 圖像分析軟件和Origin 8. 0統(tǒng)計軟件分析作圖，結果如圖4所示((A) 15% SDS-PAGE鑒 定；(B)免疫印跡鑒定；(C)柱狀圖顯示)。從圖中可以看出，TAT-EGFP和EGFP蛋白均以可 溶性的形式表達于上清中，且TAT-EGFP總蛋白表達量及上清蛋白表達量明顯高于EGFP (參 見圖4中(A)和(B))，柱狀圖分析也顯示了同樣的結果(圖4中(C)，** :P< 0.01，與EGFP 比較)。上述實驗數(shù)據(jù)顯示TAT核心肽段不僅能夠提高外源蛋白的表達量，而且能夠促進外 源蛋白可溶性表達。2、熒光顯微鏡觀察結果如圖5所示(㈧圖像采集及組合分析；⑶=TAT-EGFP和EGFP圖片放大2倍 的效果圖)，從圖中可以看出TAT-EGFP的熒光信號明顯強于EGFP，而對照組未見任何熒光信號(圖5 (A))；當將TAT-EGFP和EGFP組合圖片放大后，還可以清楚地看到TAT-EGFP單 個細胞的熒光強度也明顯強于EGFP(圖5(B))。實施例3、利用TAT核心肽段促進人源腦紅蛋白(rhNGB)高效、可溶性表達如圖1所示，用本發(fā)明的方法促進人源腦紅蛋白(rhNGB)高效、可溶性表達，具體 方法包括以下步驟一、構建攜帶人源腦紅蛋白(rhNG^編碼基因的原核表達載體pET28b-TAT_NGB和 pET28b-NGB1、通過聚合酶鏈式反應技術(PCR)擴增目的基因NGB通過常規(guī)PCR方法擴增出NGB的cDNA片段，50μ 1 PCR反應體系為質粒模 板 0. 5μ 1 ;10XdNTP 5μ 1 ；IOXEx Taq 緩沖液 5 μ 1 ；上下游引物各 0· 5 μ 1 ;Ex Taq 酶 0. 25 μ l,ddH20 38. 25 μ L· PCR 反應條件為95°C 4 分鐘；95°C 45 秒，56°C 30 秒，72°C 45 秒 (30個循環(huán))；72°C 7分鐘。反應結束后，對PCR產物進行1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測，回收并 純化約45!3bp的目的片段。2、限制性內切酶分別酶切目的基因NGB、載體pET28b和pET28b_TAT如圖6所示((A) :ρΕΤ2^3多克隆位點示意圖；⑶原核表達載體pET2m3-TAT-NGB 的構建示意圖；(C):原核表達載體pET28b-NGB的構建示意圖)，用限制性內切酶BamHI和 Xho I切割目的基因NGB和載體pET28b-TAT,用限制性內切酶BamH I和Xho I切割目的基 因NGB和載體pET28b-TAT，回收酶切產物后用T4 DNA連接酶連接，將連接產物轉化涂布LB 平皿。3、鑒定將長出的克隆分別通過限制性內切酶酶切及測序鑒定，得到序列及插入位置均正 確的攜帶TAT核心肽段編碼區(qū)和NGB的原核表達載體pET28b-TAT-NGB和作為對照的攜帶 NGB的原核表達載體pET2^-NGB。二、轉化宿主大腸桿菌及菌體復蘇將步驟一構建正確的原核表達載體pET28b-TAT-NGB和pET28b_NGB轉化入大腸 桿菌BL21(DE3)并涂布至LB平皿待長出克隆，各組分別挑取一個克隆接種到5mL含有 Kana+(終濃度100μ g/mL)的LB培養(yǎng)基中，37°C、220rpm搖菌約16小時，待菌體完全復蘇。三、原核表達載體pET28b-TAT-NGB和pET28b_NGB的誘導表達將復蘇的菌液稀釋至0D_ = 0. 8，然后吸取5mL菌液接種到150mL含有Kana+ (終 濃度100μ g/mL)的LB培養(yǎng)基中，37 °C、220rpm搖菌約4-5小時后測定OD6tltl,待OD6tltl = 0. 6-1. 0時迅速加入誘導劑IPTG (終濃度ImM)，并于30°C、220rpm誘導表達8小時。四、蛋白樣品的制備上述誘導表達菌液于4°C、12000rpm離心10分鐘以收集菌體，然后于4°C低溫下拍 照(如圖7所示，左邊為TAT-NGB離心菌體，右邊為NGB離心菌體)，從實驗結果可以直觀 地看出TAT-NGB呈現(xiàn)出鮮艷的肉紅色，且其肉紅色明顯強于NGB，這說明制備的TAT-NGB具 有明顯的活性；預冷的PBS重懸菌體后超聲破碎，4°C、12000rpm離心收集上清并于4°C低溫 條件下拍照(如圖8)，超聲上清也呈現(xiàn)出鮮艷的肉紅色，進一步說明TAT-NGB具有活性，最 后制備蛋白樣品待鑒定。五、蛋白樣品鑒定
步驟四制備的蛋白樣品采用15% SDS-PAGE和免疫印跡鑒定，然后采用ImageJ圖 像分析軟件和Origin 8. O統(tǒng)計軟件分析作圖，結果如圖9所示((A) : 15% SDS-PAGE鑒定； ⑶免疫印跡鑒定；(C)柱狀圖顯示)。從圖中可以看出，TAT-NGB和NGB蛋白均主要以可 溶性的形式表達于上清中，且TAT-NGB總蛋白表達量及上清蛋白表達量明顯高于NGB(圖 9(A)和(B))，柱狀圖分析也顯示了同樣的結果(圖9(C)，** :Ρ<0·01，與NGB比較)。實施例4、利用TAT核心肽段在未添加誘導劑及4°C低溫條件下促進增強型綠色熒 光蛋白(EGFP)的高效、可溶性表達如圖1所示，用本發(fā)明的方法促進增強型綠色熒光蛋白(EGFP)高效、可溶性表達， 具體方法包括以下步驟—、構建攜帶增強型綠色熒光蛋白(EGFP)編碼基因的原核表達載體 pET28b-TAT-EGFP 和 pET28b_EGFP具體構建方法見實施例2。二、轉化宿主大腸桿菌及菌體復蘇將步驟一構建正確的原核表達載體pET2^-TAT-EGFP和pET2^_EGFP轉化入大腸 桿菌BL21 (DE3)并涂布至含有Kana+ (終濃度100 μ g/mL)的LB平皿上，置于37°C恒溫箱孵 育10-12小時待長出克隆。三、原核表達載體的誘導表達將上述長出克隆的平皿(平皿上不含任何誘導劑)迅速置于4°C恒溫冰箱低溫誘 導表達4天，其間0小時、24小時、48小時、72小時和96小時分別采集圖像。四、熒光顯微鏡觀察分析將步驟三4°C低溫條件下誘導表達的克隆置于熒光顯微鏡下觀察蛋白表達情況， 實驗結果如圖10所示((A)熒光顯微鏡觀察TAT-EGFP和EGFP單克隆熒光信號變化；(B) 線條圖顯示TAT-EGFP和EGFP熒光變化)。TAT-EGFP單克隆的熒光信號隨著時間的增加 在增強，且在M小時時增加最快(圖10(A))；統(tǒng)計分析也顯示了同樣的結果，24小時時， TAT-EGFP和EGFP都達到了較高表達水平，隨著時間的增加二者的表達水平緩慢增加，但總 體上 TAT-EGFP 的表達量明顯高于 EGFP (圖 10(B)，* :P < 0. 05，** =P < 0. 01，與 EGFP 比 較用實施例1 同樣方法，以 pBV220、pET30、pCRT7/CT-T0P0、pET101/D-T0P0 或 pQE30 為出發(fā)載體可以得到系列的利用TAT核心肽段促進外源蛋白高效、可溶性表達的專用表達 載體，并可進一步按照實施例2或3或4的方法得到高表達水平的外源蛋白。另外，轉化宿 主不限于大腸桿菌，也可為枯草桿菌等；所用的大腸桿菌也不限于E. coliBL21 (DE3)，也可 以為 E. coli BL21 (DE3)plys,BLR(DE3) ,B834.DH5 α、ΗΒ101 或 JM109 等。借鑒本發(fā)明技術， 這些過程均成為常規(guī)操作，恕不再一一例舉。
權利要求
1.一種利用TAT核心肽段促進外源蛋白高效、可溶性表達的專用表達載體，是含有一 個或多個TAT核心多肽編碼區(qū)的原核表達載體。
2.根據(jù)權利要求1所述的專用表達載體，其特征在于所述TAT核心多肽編碼區(qū)為能 夠根據(jù)三聯(lián)體密碼組合成其氨基酸序列的任意核酸編碼序列，如序列表中序列1所示，其 中優(yōu)選的核苷酸序列可如序列表中序列2所示。
3.根據(jù)權利要求1或2所述的專用表達載體，其特征在于用于構建所述專用表達載 體的出發(fā)載體為 pET28、pBV220、pET30、pCRT7/CT_T0P0、pET101/D-T0P0 或 pQE30。
4.利用權利要求1-3任一所述的專用表達載體構建的帶外源基因的原核表達載體。
5.根據(jù)權利要求4所述的原核表達載體，其特征在于，為圖2(B)所構建的原核表達載 體pET28b-TAT-EGFP，或圖6 (B)所構建的原核表達載體pET28b_TAT_NGB。
6.一種利用TAT核心肽段促進外源蛋白高效、可溶性表達的方法，包括以下步驟1)將外源基因插入權利要求1-4任一項所述的專用表達載體中，得到含有TAT核心多 肽編碼區(qū)和外源基因的原核表達載體；2)將原核表達載體向原核表達體系轉化；3)原核表達載體的誘導表達；4)外源蛋白的制備。
7.根據(jù)權利要求6所述的方法，其特征在于所述步驟1)中的原核表達載體中，TAT核 心肽段可以是一個拷貝或多個拷貝與外源蛋白的核酸編碼序列相連接；TAT核心肽段編碼 區(qū)可以置于外源蛋白編碼序列的上游或下游。
8.根據(jù)權利要求6或7所述的方法，其特征在于所述步驟2)中的原核表達體系 為大腸桿菌、枯草桿菌等；所述大腸桿菌為E. coli BL21(DE3)、E. coliBL21 (DE3)plys、 BLR(DE3)、B834、DH5a、HBlOl 或 JM109 等。
9.根據(jù)權利要求6或7或8所述的方法，其特征在于所述步驟幻中的化學試劑誘導 表達條件為終濃度ImM的誘導劑IPTG誘導表達；誘導表達的0D_ = 0. 6-1. O ；誘導表達 時間6-8小時。
10.根據(jù)權利要求6至9任一所述的方法，其特征在于所述步驟幻中的低溫誘導表 達條件為采用平皿涂布制備克?。?°C低溫誘導表達；誘導表達時間4天。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種利用TAT核心肽段促進原核表達體系高效、可溶性表達外源蛋白的方法及其專用表達載體。該專用表達載體是含有一個或多個TAT核心多肽編碼區(qū)的原核表達載體。該方法包括以下步驟1)將外源基因插入該專用表達載體中，得到含有TAT核心多肽編碼區(qū)和外源基因的原核表達載體；2)將原核表達載體向原核表達體系轉化；3)原核表達載體的誘導表達；4)外源蛋白的制備。經(jīng)檢測，表達產物主要以可溶性的形式存在宿主菌裂解上清中，且占裂解上清總蛋白的25-30％，可以獲得高產量的外源蛋白，可大量制備具有生物活性的外源蛋白。
文檔編號C12N15/70GK102146417SQ20101011939
公開日2011年8月10日 申請日期2010年3月8日 優(yōu)先權日2010年2月10日
發(fā)明者吳永紅, 張成崗, 高艷 申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院放射與輻射醫(yī)學研究所