專利名稱：檢測人K-ras基因外顯子12、13突變的核苷酸序列、方法及試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及檢測人K-ras基因外顯子12、13突變的核苷酸序列、檢測人K_ras基 因外顯子12、13突變的方法及試劑盒。
背景技術(shù)：
靶向治療是近年來腫瘤領(lǐng)域的新熱點(diǎn)，同以往經(jīng)典的化療治療效果比較，靶向 藥物顯著延長患者的無進(jìn)展生存期(PFS)和整體生存期(OS)，同時(shí)降低藥物的不良反 應(yīng)。美國FDA已經(jīng)成功的將下列藥物批準(zhǔn)用于上述腫瘤的治療，如Trastuzumab(赫 塞汀)治療乳腺癌，Gefitinib(易瑞沙)和Erlotinib(特羅凱)治療非小細(xì)胞肺癌， Cetuximab (愛必妥)治療結(jié)直腸癌，Sunitinib (舒尼替尼)和Sorafenib (索拉非尼)治療 腎細(xì)胞癌。由于在靶向治療之前需要進(jìn)行靶向診斷，所以如何準(zhǔn)確地進(jìn)行靶向診斷是決定 治療有效與否的前提。大量臨床研究資料證實(shí)，Kras基因突變狀態(tài)與針對EGFR的藥 物，如Cetuximab (愛必妥)和Panitumumab (帕尼單抗)等的療效有關(guān)，應(yīng)用抗EGFR的 藥物治療腫瘤有必要檢測Kras基因的突變。Kras基因突變檢測已被寫入最新版的《NCCN結(jié)直腸癌臨床實(shí)踐指南》，新指 南傳遞給廣大醫(yī)生和患者兩條重要信息一是所有轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者都應(yīng)檢測Kras基 因狀態(tài)；二是只對Kras基因野生型患者推薦介紹抗EGFR藥物治療。K-ras基因，是人體腫瘤中常見的致癌基因，位于EGFR下游的Ras-Raf-Mek 信號途徑，該途徑的異常也會導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的生長和腫瘤的進(jìn)程。K-ras基因某些關(guān)鍵 位點(diǎn)易發(fā)生突變，并且主要集中在特定的氨基酸密碼子(第12、13、61密碼子)上，其 中12、13占所有突變的90%，這些突變使KRAS蛋白持續(xù)保持活化狀態(tài)而不再受上游 EGFR的調(diào)控，導(dǎo)致針對EGFR靶標(biāo)的藥物(Erbitux，Vectibix, Iressa, Tavceva等)失 效。這種突變在胰腺癌、結(jié)直腸癌和肺癌中發(fā)生率較高較為常見。因此，Kras基因突變檢測是目前醫(yī)生了解結(jié)直腸癌患者癌基因狀況最直接、最 有效的方法，通過檢測不僅可以深入了解癌基因的情況，更重要的是篩選出針對抗EGFR 靶向藥物治療有效的結(jié)直腸癌患者，幫助臨床醫(yī)生選擇制定對腫瘤患者最有效的治療方 案。目前在歐美等發(fā)達(dá)國家，kras基因檢測已經(jīng)成為結(jié)直腸癌患者內(nèi)科治療前的常規(guī)檢 查。在通常情況下，60%左右的結(jié)直腸癌患者的kras基因是野生型的，如果都接受了 Kras基因檢測后，通過個(gè)體化的綜合治療方案，在化療基礎(chǔ)上加靶向藥物，有效率可以 達(dá)到60%左右，所以越早做Kras基因突變檢測，患者獲益越大。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，出現(xiàn)了很多檢測基因突變的方法一、核苷酸序列測定法核苷酸序列測定法是基因突變經(jīng)典的檢測方法，被譽(yù)為公認(rèn)的金標(biāo)準(zhǔn)，目前國 內(nèi)外報(bào)道的發(fā)現(xiàn)的新的基因突變，大多采用DNA測序法，該方法雖然可靠直觀，并可檢測出多位點(diǎn)的變異，但耗時(shí)、靈敏度低，尤其在混合模板時(shí)，最低檢出極限在10%以 上。二、基因芯片技術(shù)基因芯片(genechip)，又稱基因微矩陣(microarray)，其原理是將大量特定的基
因片段或寡核苷酸片段作為探針有序地和高密度地排列固定于玻璃或硅等載體上，然后 與待測的有熒光標(biāo)記的樣品核酸按堿基配對的原則進(jìn)行雜交，通過激光共聚焦系統(tǒng)檢測 雜交信號強(qiáng)度，經(jīng)計(jì)算機(jī)分析處理數(shù)據(jù)資料，獲取樣品分子的數(shù)量和序列信息，從而可 對核酸序列進(jìn)行大規(guī)模、高通量的研究.基因芯片技術(shù)由于其具有大通量、快速、靈敏、 平行檢測基因的優(yōu)勢，已在生物學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域中得到廣泛的應(yīng)用。但由于目前技術(shù)還不 夠成熟，所以有一定的假陽性和假陰性率，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)不容易解釋，不可檢測出新位點(diǎn)的 變異。三、聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)-限制性片段長度多態(tài)性分析(RFLP)方法錯(cuò)配PCR結(jié)合RFLP分析技術(shù)能有效地鑒別不同的基因型，實(shí)驗(yàn)簡便、快速， 無需特殊儀器，適合于一般實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用及大規(guī)模臨床檢驗(yàn)使用，但靈敏度不夠，且該法 操作中需開蓋用PCR產(chǎn)物進(jìn)行酶切，增加了產(chǎn)物污染的風(fēng)險(xiǎn)造成污染。四、實(shí)時(shí)熒光定量PCR法近年來出現(xiàn)的實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real-time quantitative PCR)技術(shù)實(shí)現(xiàn)了 PCR從
定性到定量的飛躍，它以其特異性強(qiáng)、靈敏度高、重復(fù)性好、定量準(zhǔn)確、速度快、全封 閉反應(yīng)等優(yōu)點(diǎn)成為了分子生物學(xué)研究中的重要工具，實(shí)驗(yàn)診斷和操作嚴(yán)格的市場準(zhǔn)入制 度，基本解決了過去實(shí)驗(yàn)過程因污染出現(xiàn)的假陽性，成為臨床診斷中首選的核酸診斷技 術(shù)。在實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)中，特異性熒光探針的選擇和設(shè)計(jì)是至關(guān)重要的。它 是把熒光化合物標(biāo)記到特異性的寡核苷酸上形成熒光標(biāo)記的DNA探針，通過探針與PCR 產(chǎn)物特異性的結(jié)合，在PCR過程中可對產(chǎn)物實(shí)現(xiàn)均相、實(shí)時(shí)、定量檢測。根據(jù)熒光基團(tuán) 標(biāo)記和實(shí)現(xiàn)能量共振轉(zhuǎn)移方式的不同，熒光PCR所用的探針可以分為五大類，分別是 Taqman探針，分子信標(biāo)(molecular beacon)，光標(biāo)記引物，雜交探針，DNA-RNA-DNA 嵌合探針。Taqman探針是運(yùn)用最早的，普及率最高的熒光探針，目前國內(nèi)市場上用的熒 光PCR試劑盒幾乎都是使用該類探針，但由于此類探針本底較高和不能識別單個(gè)核苷酸 的差異，不利于用于Kras基因的突變檢測。近年來發(fā)展起來的AllGlo 探針，是最新一 代的熒光定量探針，它擁有普通Taqman、Taqman-MGB及分子信標(biāo)探針?biāo)袃?yōu)點(diǎn)，采用 兩端同樣的熒光集團(tuán)，在oligo上面互相互為報(bào)告及淬滅基團(tuán)，在雜交水解之后兩端標(biāo)記 的染料又全部變?yōu)閳?bào)告基團(tuán)，大大提高了熒光增量。更重要的是，染料上面含有特殊的 可以大大提高TM值的化學(xué)基團(tuán)，可以大大提高探針的特異性，特別適合用于基因單堿 基突變檢測。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的首要技術(shù)問題在于提出一種檢測人K-ras基因外顯子12、13突 變的核苷酸序列。本發(fā)明要解決的第二技術(shù)問題在于提出一種人檢測K-ras基因外顯子12、13突變的方法。本發(fā)明要解決的第三技術(shù)問題在于提出一種人檢測K-ras基因外顯子12、13突 變的試劑盒。本發(fā)明要解決的第四技術(shù)問題在于提出人檢測K-ras基因外顯子12、13突變的 試劑盒的應(yīng)用。為了解決本發(fā)明的技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為本發(fā)明涉及一種檢測人K-ras基因外顯子12、13突變的核苷酸序列，包含由 SEQ ID NO 1至SEQ ID NO 10所示的任一核苷酸序列。本發(fā)明的第一優(yōu)選技術(shù)方案為檢測人K-ras基因外顯子12、13突變的核苷酸 序列中，SEQ ID NO: 3所示的核苷酸序列兩端標(biāo)記有JUP熒光集團(tuán)，SEQ ID NO 4 10所示的核苷酸序列兩端標(biāo)記有MAR熒光集團(tuán)。本發(fā)明的第二優(yōu)選技術(shù)方案為檢測人K-ras基因外顯子12、13突變的核苷 酸序列包含SEQ ID NO : 1所示的上游引物、SEQ ID NO: 2所示的下游引物、SEQID NO: 3所示的野生型探針和SEQ ID NO: 4 SEQ IDNO 10所示的突變型探針中的至 少一個(gè)。本發(fā)明的第三優(yōu)選技術(shù)方案為檢測人K-ras基因外顯子12、13突變的核苷 酸序列包含SEQ ID NO : 1所示的上游引物、SEQ ID NO: 2所示的下游引物、SEQID NO: 3所示的野生型探針和SEQ ID NO: 4 SEQ IDNO 10所示的突變型探針。本發(fā)明還涉及一種檢測人K-ras基因外顯子12、13突變的方法，包括以下步 驟(1)提取核酸樣本；(2)以步驟(1)提取的核酸為模板，用權(quán)利要求1至4任意一項(xiàng)所述的引物和探 針序列，多重?zé)晒釶CR擴(kuò)增病原體的靶核酸序列；(3)采用熒光檢測儀對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行分析，并分析結(jié)果。其中，本發(fā)明所述的檢測方法的技術(shù)方案的第一優(yōu)選技術(shù)方案為所述的多重?zé)晒釶CR的反應(yīng)體系為50 μ L反應(yīng)體系中含有40 μ L反應(yīng) 體系中含有2.5 μ L 10 X PCR reaction buffer (Mg2+free), 3mmol/LMg2+，0.125mmol/ LdNTP，0.25ymol/L 上游引物，0.25 μ mol/L 下游引物，0.125 μ mol/L 野生型探針， 0.125μιηο1/Χ突變型探針，Taq聚合酶2U，UNG酶0.2U，模板量為3 μ L，補(bǔ)充水至 40 μ L。本發(fā)明所述的檢測方法的技術(shù)方案的第二優(yōu)選技術(shù)方案為PCR擴(kuò)增條件為 40 43°C 5 8分鐘、94 96°C 3分鐘預(yù)變性；92 94°C 5秒、58 60°C 30秒，重 復(fù)30 35個(gè)循環(huán)；最后37°C保溫。本發(fā)明所述的檢測方法的技術(shù)方案的第三優(yōu)選技術(shù)方案為PCR擴(kuò)增條件為 42°C 5分鐘、95°C 3分鐘預(yù)變性；94°C 5秒、60°C 50秒，重復(fù)32個(gè)循環(huán)；最后37°C保本發(fā)明還涉及一種檢測人K-ras基因外顯子12、13突變的試劑盒，含有本發(fā)明 所述的引物和探針。其中，本發(fā)明所述試劑盒的組成為
PCR反應(yīng)液840 μ 1，國際單位比為10: 1的Taq聚合酶和UNG酶的混合物 48 μ 1，陰性對照品20 μ 1，陽性對照品I 20 μ 1，陽性對照品II 20 μ 1 ；其中，PCR反應(yīng)液的組成為10 XPCR 緩沖液 4ml，25mmol/L dNTP0.2ml, 50 μ mol/L 上游引物 0.2ml，50 μ mol/L 下游引物 0.2ml，50 μ mol/L 野生型探針 0.1ml， 50ymol/L突變型探針0.1ml，用純化水定容至35ml，充分混勻；陽性對照I和陽性對照II分別為Kras野生型和突變型質(zhì)粒DNA溶液；陰性對照品為純化水。本發(fā)明還涉及檢測人K-ras基因外顯子12、13突變的試劑盒的應(yīng)用。下面對本發(fā)明的技術(shù)方案做進(jìn)一步的詳細(xì)說明本發(fā)明建立了一種運(yùn)用基于AllGlo 探針的雙重?zé)晒舛縋CR技術(shù)，一次性定 性檢測人類K-ras基因外顯子12，13突變的快速檢測方法和試劑盒，適用于指導(dǎo)對愛必 妥等表皮生長因子受體(EGFR)抗體藥物臨床用藥。其中，本發(fā)明的引物和探針為上游引物SEQID NO: 1TTAGCTGTATCGTCAAGGCACTC下游引物SEQID NO : 2GCCTGCTGAAAATGACTGAATATA野生型探針SEQID NO 3JUP-TTGGAGCTGGTGGCGT-JUP突變型探針SEQID NO 4MAR-TTGGAGCTCGTGGCGT-MARSEQ ID NO 5MAR-AGCTGGTGACGTAGGC-MARSEQ ID NO 6MAR-TGGAGCTAGTGGCGT-MARSEQ ID NO 7MAR-GTTGGAGCTGTTGGCGT-MARSEQ ID NO 8MAR-GTTGGAGCTTGTGGCGT-MARSEQ ID NO 9MAR-TGGAGCTGCTGGCGT-MARSEQ ID NO 10MAR-TGGAGCTGATGGCG-MAR本發(fā)明的引物的合成方法是固相亞磷酸三酯法進(jìn)行化學(xué)DNA合成，純化方法 為聚丙烯酰胺凝膠電泳。引物在使用前經(jīng)稀釋后，使用紫外分光光度計(jì)進(jìn)行檢測、重定 量，確保其 A260/A280 > 1.7。探針的合成方法為，將一個(gè)染料通過柔性脂肪酸接頭連接到磷酸骨架3’末端， 而另一相同的染料通過另一柔性脂肪酸接頭連接到磷酸骨架5’末端，柔性接頭是C2 30直鏈或者分支的、飽和或不飽和的烴鏈，任選由雜原子、芳基、低級烷基、低級羥基 烷基和低級烷氧基取代。探針通過在HitachiD7000 HPLC系統(tǒng)上通過反相HPLC純化系統(tǒng)進(jìn)行純化，對于
純化后產(chǎn)品我們將檢驗(yàn)其出峰位置及純度，再用紫外分光光度計(jì)在260nm波長下定量包裝。探針在使用前經(jīng)稀釋后，使用紫外分光光度計(jì)進(jìn)行檢測、重定量，確保其 A260/A280 >1.7。陰性對照品為純化水。替代試驗(yàn)檢驗(yàn)合格。陽性對照品為已知濃度的Kras野生型和突變型質(zhì)粒DNA溶液。本發(fā)明應(yīng)用雙重PCR熒光原理，在同一反應(yīng)管內(nèi)同時(shí)檢測Kras野生型和突變 型，野生型和突變型5’端分別標(biāo)記不同波長的報(bào)告熒光。PCR反應(yīng)進(jìn)行時(shí)，不同的報(bào)告熒光基團(tuán)釋放熒光，熒光測定儀器分別讀取兩種波長的熒光信號進(jìn)行分析，使兩種基 因型的診斷在一次實(shí)驗(yàn)中完成。對反應(yīng)的條件進(jìn)行優(yōu)化，最終確定的反應(yīng)體系及反應(yīng)條件如下多重?zé)晒釶CR反應(yīng)體系優(yōu)選采用反應(yīng)體系反應(yīng)體系中含 有2.5 μ L 10XPCR reaction buffer(Mg2+free)，3mmol/L Mg2+，0.125mmol/L dNTP, 0.25ymol/L 上游引物，0.25 μ mol/L 下游引物，0.125 μ mol/L 野生型探針，0.125 μ mol/ L突變型探針，Taq聚合酶2U，UNG酶0.2U，，模板量為3 μ L，補(bǔ)充水至40 μ L。多重?zé)晒釶CR擴(kuò)增條件優(yōu)選為PCR擴(kuò)增條件為42 V 5分鐘、95°C 3分鐘預(yù) 變性；94°C 5秒、60°C 50秒，重復(fù)32個(gè)循環(huán)；最后37°C保溫。采用的PCR儀為ABI PRISM PCR熒光檢測儀，選定檢測熒光為FAM，VIC通道，并在PCR循環(huán)第二步60°C 時(shí)收集熒光信號。儀器檢測通道選擇通道1，2，其它為默認(rèn)值。根據(jù)樣品，陽性對照，陰性對照的Ct值確定樣品中是否存在Kras基因突變，從 而指導(dǎo)臨床用藥。


圖1為本發(fā)明試劑盒開發(fā)流程的示意圖。圖2為本發(fā)明試劑盒檢測Kras突變型或雜合型標(biāo)本的實(shí)驗(yàn)結(jié)果多重?zé)晒釶CR 檢測儀FAM通道檢測結(jié)果1為Kras基因突變型標(biāo)本，2為Kras基因雜合型標(biāo)本；圖3為本發(fā)明試劑盒檢測Kras突變型或雜合型標(biāo)本的實(shí)驗(yàn)結(jié)果多重?zé)晒釶CR 檢測儀HEX通道檢測結(jié)果3為Kras基因突變型標(biāo)本，4為Kras基因雜合型標(biāo)本。本發(fā)明的具體實(shí)施方式
僅對本發(fā)明的內(nèi)容做進(jìn)一步的解釋和說明，并不對本發(fā) 明的內(nèi)容作出限制。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例11.本發(fā)明所采用的原材料1.1引物及探針引物及探針由上海超世生物科技有限公司負(fù)責(zé)合成。1.2其他材料純化水符合《中國生物制品主要原輔材料質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)》要求；Taq酶、 dNTP (dATP dCTP dGTP dUTP = 25mM 25mM 25mM 25mM)、UNG 酶由 普洛麥格公司提供。所有化學(xué)試劑為分析純或分析純以上級別，所有試劑均檢驗(yàn)合格。1.3對照品1.3.1陰性對照品純化水；替代試驗(yàn)檢驗(yàn)合格。1.3.2陽性對照品已知Kras野生型和突變型質(zhì)粒DNA溶液。2.檢測方法2.1標(biāo)本抽提用基因組DNA抽提試劑盒進(jìn)行人結(jié)腸癌組織中基因組DNA的抽提。2.2PCR反應(yīng)試劑的制備
2.2.1引物及探針的制備引物、探針均為50D/管，將裝有引物或探針的1.5ml離心管13000rpm離心數(shù) 秒，使引物干粉聚集于管底，加入500μ1純化水，振蕩混勻后靜置10分鐘，探針需要避 光靜置，使之充分溶解，13000rpm離心數(shù)秒。2.2.2 100人份三聯(lián)檢PCR反應(yīng)液的制備取4ml 10Xbuffer, 0.2ml 25mmol/L dNTP, 0.2ml 50 μ mol/L 上游引物，0.2ml 50ymol/L下游引物，0.1ml 50 μ mol/L野生型探針，0.1ml 50 μ mol/L突變型探針，用純
化水定容至35ml，充分混勻。2.2.3反應(yīng)液的質(zhì)控用待檢的反應(yīng)液檢測陰性對照品、陽性對照品，檢測結(jié)果符合陰性對照品的 Ct值大于32或無Ct值，陽性對照品CT《30，則為合格。其中，CT值的定義為C代表Cycle，T代表threshold，CT值是指每個(gè)反應(yīng)管
內(nèi)的熒光信號到達(dá)設(shè)定的域值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。研究表明，每個(gè)模板的CT值與該模板的起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在線性關(guān)系，起始 拷貝數(shù)越多，CT值越小。利用已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，其中橫坐標(biāo)代 表起始拷貝數(shù)的對數(shù)，縱坐標(biāo)代表CT值。因此，只要獲得未知樣品的CT值，即可從標(biāo) 準(zhǔn)曲線上計(jì)算出該樣品的起始拷貝數(shù)。2.3Taq聚合酶+UNG酶混合液的制備和質(zhì)控Taq聚合酶+UNG酶混合液含0.5U/ μ 1 Taq聚合酶和0.05U/ μ 1 UNG酶分別取 2500UTaq聚合酶、250UUNG酶混合，配備5ml酶溶液。替代試驗(yàn)合格。2.4對照品的制備2.4.1陽性對照品的制備和質(zhì)控已知Kras野生型和突變型質(zhì)粒DNA溶液，用TE稀釋，測定陽性對照品CT<28。2.4.2陰性對照品的制備取純化水，測定陰性對照SCt大于或等于32。2.5半成品檢定2.5.1特異性檢定取5份臨床確診Kras野生型的標(biāo)本作為野生型參考品并進(jìn)行PCR試驗(yàn)，操作嚴(yán) 格按照試劑盒說明書進(jìn)行一野生型符合率應(yīng)為100%，為合格。2.5.2準(zhǔn)確性檢定取5份臨床確診Kras突變型的標(biāo)本作為突變型參考品并進(jìn)行PCR試驗(yàn)，操作嚴(yán) 格按照試劑盒說明書進(jìn)行一突變型符合率應(yīng)為100%，為合格。2.5.3靈敏度檢定用107copies/ml濃度的突變型質(zhì)粒DNA溶液以10倍的梯度逐級稀釋至 103copies/ml,取 103copies/ml、104copies/ml、105copies/ml、106copies/ml 的突變型質(zhì)粒 DNA溶液作為靈敏度參考品，檢測結(jié)果C#30，為合格。2.6分裝、貼簽、包裝2.6.1 分裝用微量移液器將準(zhǔn)備好的試劑分裝入清潔的離心管中，蓋緊管蓋，
裝量如下
權(quán)利要求
1.一種檢測人K-raS基因外顯子12、13突變的核苷酸序列，其特征在于，包含由SEQ IDNO 1至SEQ ID NO 10所示的任一核苷酸序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測人K-ras基因外顯子12、13突變的核苷酸序列，其特 征在于，SEQ ID NO: 3所示的核苷酸序列兩端標(biāo)記有JUP熒光集團(tuán)，SEQ ID NO 4 10所示的核苷酸序列兩端標(biāo)記有MAR熒光集團(tuán)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測人K-ras基因外顯子12、13突變的核苷酸序列，其特 征在于，所述核苷酸序列包含SEQ ID NO: 1所示的上游引物、SEQ ID NO: 2所示的下 游引物、SEQ ID NO 3所示的野生型探和SEQ ID NO 4 SEQ ID NO 10所示的突 變型探針中的至少一個(gè)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測人K-ras基因外顯子12、13突變的核苷酸序列，其特 征在于，所述核苷酸序列包含SEQ ID NO: 1所示的上游引物、SEQ ID NO: 2所示的下 游引物、SEQ ID NO 3所示的野生型探針和SEQ ID NO 4 SEQ ID NO 10所示的 突變型探針。
5.—種檢測人K-ras基因外顯子12、13突變的方法，其特征在于，包括以下步驟(1)提取核酸樣本；(2)以步驟(1)提取的核酸為模板，用權(quán)利要求1至4任意一項(xiàng)所述的引物和探針序 列，多重?zé)晒釶CR擴(kuò)增病原體的靶核酸序列；(3)采用熒光檢測儀對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行分析，并分析結(jié)果。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的檢測人K-ras基因外顯子12、13突變的方法，其特征在 于，所述的多重?zé)晒釶CR的反應(yīng)體系為50 μ L反應(yīng)體系中含有40 μ L反應(yīng)體系中 含有2.5 μ L 10 X PCR reaction buffer (Mg2+free)，3mmol/L Mg2+，0.125mmol/L dNTP, 0.25ymol/L 上游引物，0.25 μ mol/L 下游引物，0.125 μ mol/L 野生型探針，0.125 μ mol/ L突變型探針，Taq聚合酶2U，UNG酶0.2U，模板量為3 μ L，補(bǔ)充水至40 μ L。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的檢測人K-ras基因外顯子12、13突變的方法，其特征在于， 所述的PCR擴(kuò)增條件為40 43°C 5 8分鐘、94 96°C 3分鐘預(yù)變性；92 94°C 5 秒、58 60°C30秒，重復(fù)30 35個(gè)循環(huán)；最后37°C保溫。
8.根據(jù)權(quán)利要求8所述的檢測人K-ras基因外顯子12、13突變的方法，其特征在于， 所述的PCR擴(kuò)增條件為42°C 5分鐘、95°C 3分鐘預(yù)變性；94°C 5秒、60°C 50秒，重復(fù) 32個(gè)循環(huán)；最后37°C保溫。
9.一種檢測人K-ras基因外顯子12、13突變的試劑盒，其特征在于，含有權(quán)利要求 1 5任一所述的引物和探針。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒的組成為PCR反應(yīng)液840 μ 1，國際單位比為10 1的Taq聚合酶和UNG酶的混合物48 μ 1， 陰性對照品20 μ 1，陽性對照品I 20 μ 1，陽性對照品II 20 μ 1 ；其中，PCR反應(yīng)液的組成為IOXPCR緩沖液4ml，25mmol/L dNTP0.2ml, 50 μ mol/L 上游引物 0.2ml，50 μ mol/L 下游引物 0.2ml，50 μ mol/L 野生型探針 0.1ml， 50 μ mol/L突變型探針0.1ml，用純化水定容至35ml，充分混勻；陽性對照I和陽性對照II分別為Kras野生型和突變型質(zhì)粒DNA溶液；陰性對照品為純化水。
11.檢測人K-raS基因外顯子12、13突變的試劑盒在表皮生長因子受體抗體藥物臨床 用藥方面的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及檢測人K-ras基因外顯子12、13突變的核苷酸序列、檢測人K-ras基因外顯子12、13突變的方法及試劑盒。所述的檢測人K-ras基因外顯子12、13突變的核苷酸序列，包含由SEQ ID NO1至SEQ IDNO10所示的任一核苷酸序列。其中，SEQ ID NO3所示的核苷酸序列兩端標(biāo)記有JUP熒光集團(tuán)，SEQ ID NO4～10所示的核苷酸序列兩端標(biāo)記有MAR熒光集團(tuán)。本發(fā)明的試劑盒可用于指導(dǎo)對愛必妥等EGFR抗體藥物臨床用藥。
文檔編號C12Q1/68GK102010894SQ20101012021
公開日2011年4月13日 申請日期2010年3月9日 優(yōu)先權(quán)日2010年3月9日
發(fā)明者熊慧 申請人:上海源奇生物醫(yī)藥科技有限公司