專利名稱：混菌共發(fā)酵餐廚垃圾生產(chǎn)燃料乙醇的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于可再生能源制造領(lǐng)域，特別涉及一種以餐廚垃圾為原料發(fā)酵生產(chǎn)燃料乙醇的方法
背景技術(shù)：
餐廚垃圾是指產(chǎn)生于餐飲經(jīng)營與居民生活的食物加工下腳料(廚余)和食用殘余(泔腳)。餐廚垃圾具有含水率高和有機(jī)質(zhì)含量高的特點(diǎn)，不適于傳統(tǒng)的焚燒、填埋方法處理；且由于其含鹽量高，用于做堆肥原料受到很大的限制。因此，如何科學(xué)、合理地對(duì)餐廚垃圾進(jìn)行處置和資源化利用已經(jīng)成為亟待解決的問題，值得人們關(guān)注[1，2，3]。
乙醇是酒精燃料的主要成分，也是汽車可以使用的干凈燃料之一。目前，國內(nèi)外生產(chǎn)的燃料乙醇多是以糧食作為原料，對(duì)糧食的消耗較大，且生產(chǎn)成本較高。為降低成本，乙醇的生產(chǎn)應(yīng)該采用非糧食原料或部分使用非糧食原料，研究利用各種廢棄可再生資源，例如餐廚垃圾生產(chǎn)燃料乙醇具有環(huán)境保護(hù)及可再生能源開發(fā)的雙重意義[1，2，3]。
目前研究利用餐廚垃圾生產(chǎn)燃料乙醇的工藝通常為采用酶水解后發(fā)酵工藝(SHF)和同步糖化發(fā)酵工藝(SSF)[4，5]。兩者都要利用淀粉酶或纖維素酶的水解催化作用，使聯(lián)結(jié)淀粉、纖維素分子的各化學(xué)鍵經(jīng)液化、糖化工序，逐級(jí)水解為麥芽糖或葡萄糖，再通過釀酒酵母將餐廚垃圾中糖分發(fā)酵，轉(zhuǎn)化成燃料乙醇。
其中，同步糖化發(fā)酵(SSF)工藝是在加酶對(duì)底物進(jìn)行糖化作用的同時(shí)投加釀酒酵母菌種，使糖化和發(fā)酵同時(shí)進(jìn)行。由于酶水解的產(chǎn)生的葡萄糖可以很快被釀酒酵母轉(zhuǎn)化為乙醇，所以能在很大程度上解除產(chǎn)物對(duì)酶的反饋抑制作用，同時(shí)降低了基質(zhì)濃度，省去了單獨(dú)的酶催化水解處理原料的步驟，在工藝上要優(yōu)于分步水解發(fā)酵工藝[6]。
但酶活性受環(huán)境影響較大，因此很難保證在發(fā)酵全過程中都具有較好的催化水解效果，若想達(dá)到垃圾原料充分利用的效果，則需要在發(fā)酵中進(jìn)行酶的補(bǔ)加，這無疑會(huì)使發(fā)酵工藝復(fù)雜化，同時(shí)提高了發(fā)酵成本[7]。若采用將具有淀粉酶或纖維素酶活性的菌株與釀酒酵母混合進(jìn)行共發(fā)酵的工藝，在發(fā)酵全過程中不斷會(huì)有酶生成，避免了由于酶失活而產(chǎn)生的原料不能水解，發(fā)酵液中葡萄糖匱乏，乙醇發(fā)酵不能進(jìn)行的問題；省去了發(fā)酵過程中補(bǔ)加酶液的步驟，在簡化生產(chǎn)工藝的同時(shí)，降低了餐廚垃圾乙醇的生產(chǎn)成本，節(jié)約能源，提高了垃圾中淀粉、纖維素等大分子有機(jī)物的利用度，為難于處理的廚余垃圾尋找出一條種新的資源化途徑。
[1]J.D.Murphy，K.McCarthy.Ethanol Production from energy crops and wastes for use as atransport fuel in Ireland[J].Applied Energy，2005，82148-166 [2]馬鴻志，宮利娟，汪群慧，等.Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化餐廚垃圾發(fā)酵產(chǎn)燃料酒精的研究[J].環(huán)境科學(xué)，2008，29(5)1452-1456 [3]胡尚勤.利用有機(jī)垃圾發(fā)酵生產(chǎn)酒精新能源的研究[J].可再生能源，2005，119(1)20-22 [4]Wan Q H，Narita J，Xie W M，et al.Effects of anaerobic/aerobic incubation and storagetemperature on preservation and deodorization of kitchen garbage[J].BioresourceTechnology，2002，84(3)213-220 [5]Mural T，Yoshlno T，Ueda M，et al.Evaluation of the function arming yeast displayingglucoamy lase on its cell surface by direct fermentation of corn to ethanol[J].Journal ofFermentation and Bioengineering，1998，86(6)569-572 [6]Hanne R.Sorensen，Sven Pedersen.Efficiencies of designed enzyme combinations in releasingarabinose and xylose from wheat arabinoxylan in an industrial ethanol fermentation residue[J].Enzyme and Microbial Technology，2005，36773-784 [7]Sauer J，Sigurskjold B W，Christensen U，er al.Glucoamylasestructure/function relationships，and protein engineering[J].Biochim Biophys Acta，2002，154375-293

發(fā)明內(nèi)容
技術(shù)問題本發(fā)明主要提供了一種混菌共發(fā)酵餐廚垃圾原料生產(chǎn)燃料乙醇的新方法，解決了餐廚垃圾混菌發(fā)酵生產(chǎn)燃料乙醇的相關(guān)工藝問題，以提高垃圾原料利用率，降低燃料乙醇生產(chǎn)成本，簡化發(fā)酵生產(chǎn)工藝。
技術(shù)方案本發(fā)明為一種混菌共發(fā)酵餐廚垃圾原料生產(chǎn)燃料乙醇的方法，其特征在于該方法以餐廚垃圾為原料，通過以下步驟生產(chǎn)燃料乙醇首先將餐廚垃圾分揀粉碎，加入3倍體積的水滅菌；然后接入10％釀酒酵母菌種子和5％的米根霉種子，25℃進(jìn)行靜置發(fā)酵96小時(shí)；接下來將發(fā)酵液離心，取上清液進(jìn)行蒸餾，餾出液即為燃料乙醇。
本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)采用將同時(shí)具有淀粉酶和纖維素酶活性的菌株與釀酒酵母混合進(jìn)行共發(fā)酵的工藝，避免了在發(fā)酵全過程由于酶失活而產(chǎn)生的原料不能水解，發(fā)酵液中葡萄糖匱乏，乙醇發(fā)酵不能進(jìn)行完全的問題；發(fā)酵過程中無需添加任何催化劑及營養(yǎng)物，垃圾中淀粉、纖維素等大分子有機(jī)物的利用度高，發(fā)酵殘?jiān)M分簡單，可作直接為單細(xì)胞蛋白類飼料添加劑使用。在簡化生產(chǎn)工藝的同時(shí)，降低了餐廚垃圾乙醇的生產(chǎn)成本，節(jié)約能源，所需設(shè)備簡單，投資費(fèi)用低，是一種新的，具有良好實(shí)用價(jià)值的廚余垃圾資源化途徑。



圖1本發(fā)明所提供餐廚垃圾原料生產(chǎn)乙醇方法的工藝流程； 圖2本發(fā)明篩選得到的米根霉菌株在纖維素-剛果紅培養(yǎng)基表面生長菌落形態(tài)； 圖3本發(fā)明篩選得到的米根霉菌株在淀粉-無機(jī)鹽培養(yǎng)基表面生長菌落形態(tài)。

具體實(shí)施例方式 菌種的分離鑒定 收集酒廠發(fā)酵糟、及市售小曲樣品若干，對(duì)不同種類的酒糟、曲藥樣品進(jìn)行富集培養(yǎng)。稀釋后采用平板稀釋法分離法分離出的菌落接種于斜面試管，并進(jìn)行初步形態(tài)學(xué)鑒定。
用生理鹽水沖洗霉菌斜面試管培養(yǎng)物表面，獲得的細(xì)胞懸浮液進(jìn)行梯度稀釋，選取合適梯度的稀釋液分別涂布于纖維素-剛果紅培養(yǎng)基表面和淀粉-無機(jī)鹽培養(yǎng)基表面進(jìn)行初篩，將初篩得到的既可以產(chǎn)生纖維素酶又可以產(chǎn)生淀粉酶的菌株分別用產(chǎn)酶培養(yǎng)基復(fù)篩，篩選出一株同時(shí)具有纖維素酶活性和淀粉酶活性的菌株。
將純化的菌株劃線接種于察氏和PDA培養(yǎng)基上，取無菌的蓋玻片以45度角插入培養(yǎng)基中，30℃恒溫培養(yǎng)，不定期觀察菌落、菌絲以及孢子形態(tài)，并參考《真菌鑒定手冊(cè)》對(duì)其進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定。經(jīng)觀察發(fā)現(xiàn)該菌菌落稠密，最初呈白色，后變?yōu)楹稚?。菌絲匍匐爬行，無色；假根發(fā)達(dá)，分枝呈根狀。孢囊梗直立多分支，與假根對(duì)生。囊軸卵圓形，淡褐色；孢子囊近球形，孢囊孢子橢圓形、呈黃灰色，直徑5-8μm。
采用CTAB法提取該菌總DNA。以所得到的總DNA作為模板，依Takara Fungi Identi-fication PCR Kit進(jìn)行26S rDNA D1/D2區(qū)域擴(kuò)增。擴(kuò)增完成后，取2μL于1％的瓊脂糖凝膠上電泳檢查，其余PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用UNIQ-10柱式PCR產(chǎn)物純化試劑盒(上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司產(chǎn)品)回收純化，由上海生工生物工程技術(shù)有限公司進(jìn)行序列測定。所得序列在Genbank上進(jìn)行核苷酸序列相似性搜索比對(duì)，并結(jié)合形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果，初步判定其為米根霉(Rhizopus Oryzae) 垃圾原料的預(yù)處理 首先將收集的餐廚垃圾進(jìn)行人工分揀，揀出如大塊骨頭等體積較大的塊狀物及金屬物、塑料等不能做發(fā)酵原材料使用的物質(zhì)；然后將垃圾打漿粉碎，并加入5％的氨水進(jìn)行超聲，對(duì)纖維素進(jìn)行破晶處理。處理后的垃圾添加3倍體積的水進(jìn)行高溫滅菌，滅菌后即為發(fā)酵原液。
共發(fā)酵 本實(shí)驗(yàn)室保存的釀酒酵母菌株單克隆接入50ml YEPD液體培養(yǎng)活化培養(yǎng)24小時(shí)；按10％的接種量接入麥芽汁種子培養(yǎng)基培養(yǎng)24小時(shí)以獲得釀酒酵母種子。無菌水沖洗米根霉斜面培養(yǎng)物獲得孢子懸浮液，血球計(jì)數(shù)板對(duì)懸浮液中的孢子進(jìn)行計(jì)數(shù)，在懸浮液中加入無菌水調(diào)整每毫升懸浮液中孢子的數(shù)目為106個(gè)，取5ml孢子懸浮液接入50ml PDA液體培養(yǎng)基活化培養(yǎng)24小時(shí)；按10％的接種量接入麥芽汁種子培養(yǎng)基培養(yǎng)24小時(shí)以獲得米根霉種子。以發(fā)酵原液作為培養(yǎng)基，接入10％釀酒酵母種子和5％的米根霉種子，25℃進(jìn)行靜置發(fā)酵96小時(shí)。
乙醇提純與檢測 發(fā)酵液5000轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘，上清液取出后控制溫度85℃-90℃之間進(jìn)行蒸餾30分鐘，氣相色譜檢測餾出液中乙醇的濃度及其他組分含量。氣相色譜分析按如下條件進(jìn)行儀器為FULI 9790 II氣相色譜儀，柱子彈性石英毛細(xì)管柱，0.32×30m，固相支持物聚二乙二醇丁二酸酯(Poly-diethylene glycol succinate，DEGS)鍍膜物聚酰亞胺。載氣N2。氣化室溫度250℃，柱溫80℃，尾吹50ml/min，檢測器氫火焰離子化檢測器。以色譜級(jí)無水乙醇為標(biāo)準(zhǔn)品，把上述餾出液樣品，進(jìn)行GC分析，上樣量為5μl。色譜分析結(jié)果如表1所示。
表1餐廚垃圾混菌發(fā)酵餾出液及發(fā)酵液中乙醇的含量 垃圾原液及發(fā)酵液糖類組分的檢測 垃圾原料及發(fā)酵液中可溶性糖--還原糖含量測定采用比色-分光光度法方法測定；淀粉含量采用GB/T 5009.9-2003所列方法進(jìn)行測定；纖維素含量采用GB 05009-10所列方法進(jìn)行測定。
測定結(jié)果如表2所示。
表2垃圾原料及發(fā)酵液糖類組分含量(編號(hào)含義同表1)
權(quán)利要求
1.一種混菌共發(fā)酵餐廚垃圾原料生產(chǎn)燃料乙醇的新方法，其特征在于該方法為
(1)分離篩選到一株同時(shí)具有淀粉酶和纖維素酶活性的米根霉菌株；
(2)按一定比例將酵母菌種子和的米根霉接入僅以餐廚垃圾為原料的培養(yǎng)基，25℃進(jìn)行靜置發(fā)酵96小時(shí)；發(fā)酵液離心后取上清液蒸餾得到燃料乙醇。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種混菌共發(fā)酵餐廚垃圾原料生產(chǎn)燃料乙醇的新方法，其特征在于用于發(fā)酵的兩株菌株為釀酒酵母和米根霉菌株。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種混菌共發(fā)酵餐廚垃圾原料生產(chǎn)燃料乙醇的新方法，其特征在于僅使用餐廚垃圾作為發(fā)酵培養(yǎng)基原料。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種混菌共發(fā)酵餐廚垃圾原料生產(chǎn)燃料乙醇的新方法，其特征在于靜置發(fā)酵。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種混菌共發(fā)酵餐廚垃圾原料生產(chǎn)燃料乙醇的新方法，其特征在于發(fā)酵溫度為25℃，發(fā)酵時(shí)間為96小時(shí)。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種混菌共發(fā)酵餐廚垃圾原料生產(chǎn)燃料乙醇的新方法，其特征在于1、分離篩選到一株同時(shí)具有淀粉酶和纖維素酶活性的米根霉菌株；2、僅以餐廚垃圾為原料，將該米根霉與釀酒酵母按一定比例混合進(jìn)行共發(fā)酵生產(chǎn)燃料乙醇。該方法避免了在餐廚垃圾發(fā)酵生產(chǎn)燃料乙醇過程中由于酶失活而產(chǎn)生的原料不能水解，發(fā)酵液中葡萄糖匱乏，乙醇發(fā)酵不能完全進(jìn)行的問題；發(fā)酵過程中無需添加任何催化劑及營養(yǎng)物，垃圾中淀粉、纖維素等大分子有機(jī)物的利用度高，降低了餐廚垃圾乙醇的生產(chǎn)成本，節(jié)約能源，所需設(shè)備簡單，投資費(fèi)用低，是一種新的，具有良好實(shí)用價(jià)值的廚余垃圾資源化途徑。
文檔編號(hào)C12P7/06GK101760498SQ201010121069
公開日2010年6月30日 申請(qǐng)日期2010年1月26日 優(yōu)先權(quán)日2010年1月26日
發(fā)明者張昕欣, 奚立民, 柯中爐, 于紅艷, 曹樹勇, 閆啟東 申請(qǐng)人:臺(tái)州職業(yè)技術(shù)學(xué)院