專利名稱：一種漆酶產(chǎn)生真菌菌株白耙齒菌及其培養(yǎng)方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種新的生長迅速的高效漆酶產(chǎn)生真菌菌株白耙齒菌及其培養(yǎng)方法 和應(yīng)用，屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
漆酶是一種被人類最早應(yīng)用的蛋白質(zhì)。漆酶是一種糖蛋白，單體的分子量從50kD 到llOkD大小不等，含糖量大概占分子量的10% 45%不等。目前發(fā)現(xiàn)的漆酶主要為四聚 體，此外還有二聚體和單體漆酶，并且在序列同源性上也相差較大。生物界蛋白質(zhì)的趨同進 化且漆酶具有廣泛的底物專一性，使得漆酶的分類并不是很明確，存在著大量的具有漆酶 類似活性的蛋白。漆酶具有典型的四個銅離子的結(jié)構(gòu)使得人們可以通過漆酶的光譜學吸收 來界定漆酶以及測定漆酶的純度。漆酶的四個銅離子組成了兩個活性中心銅離子與漆 酶的底物的氧化能力有關(guān)，T2以及兩個T3銅原子組成還原中心，能夠接收從位點得到的 電子將氧氣還原成為水，其中三銅簇也是漆酶與酪氨酸氧化酶(酪氨酸氧化酶的還原中心 為兩個銅離子)的本質(zhì)區(qū)別。我們的祖先于6000年前就能夠利用漆酶生產(chǎn)漆器。漆酶廣 泛分布于動物、植物、真菌、細菌當中。目前人們對漆酶的研究主要集中在真菌和細菌當中。 漆酶能夠利用氧氣作為電子供體直接氧化芳香族化合物和一些氧化還原電勢較低的非酚 型化合物；同時漆酶在介體的介導(dǎo)下能夠氧化氧化還原電勢較高的底物和木素等大分子物 質(zhì)。介體的發(fā)現(xiàn)極大地擴大了漆酶的底物范圍同時也擴大了漆酶的應(yīng)用范圍。漆酶在紙漿 造紙、染料脫色、食品加工、飲料加工、有機合成、服裝制造、傳感器制造等行業(yè)中有著重要 的應(yīng)用前景。新型漆酶的尋找一直都是一個研究熱點，真菌漆酶的產(chǎn)量遠遠高于細菌漆酶，但 真菌特別是木腐真菌的生長比細菌要慢，漆酶是一種次生代謝中需要的酶類，分泌時需要 菌體進入穩(wěn)定期以后，因此漆酶的發(fā)酵時間比較長。尋找能夠快速生長并分泌漆酶的菌株 能夠有效地縮短真菌的培養(yǎng)時間，降低發(fā)酵成本。液體發(fā)酵往往對發(fā)酵的儀器設(shè)備要求比 較高，且耗能，需要誘導(dǎo)物等發(fā)酵成本比較高。固體發(fā)酵能夠有效的縮短發(fā)酵時間，降低發(fā) 酵成本，并且白腐真菌的固體發(fā)酵培養(yǎng)基往往都是農(nóng)產(chǎn)品或者工業(yè)產(chǎn)品廢料，發(fā)酵過程不 需要添加誘導(dǎo)物等優(yōu)點。固體發(fā)酵一般發(fā)酵周期較長，一般需要20天到一個月左右，因此 尋找生長迅速的產(chǎn)漆酶能力強的菌株能夠有效的降低發(fā)酵成本。目前固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)漆酶的方法在國內(nèi)外都有些報道。原料來源比較廣泛，包括玉米、 棉花、蔗渣、麩皮、秸稈、鋸末、香蕉皮、葡萄核、花生皮等，以及他們的混合物發(fā)酵。固體發(fā)酵 時間集中在一個月左右，發(fā)酵周期較長，并且在發(fā)酵過程中大多數(shù)添加微量元素以及誘導(dǎo)劑等。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種新的具有高產(chǎn)漆酶快速生長的白耙齒菌及 其培養(yǎng)方法和應(yīng)用，此菌株生長迅速，能夠利用工業(yè)廢料木糖渣和麩皮生產(chǎn)漆酶。
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一種白耙齒菌(Irpex lacteus) sdu_5，該菌株已于2009年12月28日保藏于中國 微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號中國 科學院微生物研究所，保藏編號為CGMCC No. 3548。本發(fā)明涉及的快速生長的產(chǎn)漆酶菌-白耙齒菌(Irpex lacteus) sdu-5是從山東 大學通過選擇性培養(yǎng)基分離得到的一株擔子菌。該菌株通過采集子實體后通過選擇性培養(yǎng) 基分離得到，通過與本實驗室收藏以及分離得到的產(chǎn)漆酶菌株進行對比發(fā)現(xiàn)該菌株生長迅 速，能夠產(chǎn)生組成型漆酶和誘導(dǎo)型漆酶，在用麩皮和木糖渣進行固態(tài)發(fā)酵的時候不需要添 加任何誘導(dǎo)劑。本發(fā)明涉及的生長迅速，能夠利用工業(yè)廢棄原料木糖渣和麩皮高效產(chǎn)漆酶的菌 株_白耙齒菌具有如下生物學特征菌株成熟后實層體內(nèi)裂呈把齒狀，而在發(fā)育初期是孔狀的。上表面白色至奶油色 或淡黃色、有密生的硬毛，無環(huán)帶，有淺的溝紋，邊緣同色?？卓诿姘咨聊逃蜕?，孔口有棱 角，近邊緣處每毫米間一個孔，孔間隔壁薄，初期就深裂成耙齒狀。菌肉白色至淡色，軟纖維 質(zhì)，無環(huán)帶。擔子果一年生，平展至反卷，菌蓋8 15X9 20mm，厚1. 5 3mm，表面白色， 有細長毛，菌管長1 2mm孔面微黃白色，管口約2個/mm，常裂為齒狀.菌絲系統(tǒng)二體型生 殖菌絲具簡單隔膜，直徑3 4um，囊狀體顯著。菌絲體能夠在頂端產(chǎn)生鎖狀聯(lián)合。在液體 產(chǎn)酶培養(yǎng)基震蕩培養(yǎng)條件下能夠產(chǎn)生白色的球狀菌絲體。本發(fā)明涉及到的白耙齒菌(Irpex lacteus) sdu-5 CGMCC No. 3548的轉(zhuǎn)錄間隔區(qū) 的(internaltranscribed spacer, ITS)核苷酸序列(包括 18SDNA 和 28SDNA 的一部分以 及5. 8SDNA和三者之間的兩段間隔序列)長度為696個堿基，如序列表SEQ ID No. 1所示。通過美國生物技術(shù)信息中心(NationalCenter for Biotechnology Information, NCBI)序列同源性分析，將本發(fā)明的菌株白耙齒菌(Ir印x lacteus) sdu-5 CGMCC No. 3548的ITS核苷酸通過Blast進行比對，比對結(jié)果表明該菌株屬于白耙齒菌。結(jié) 合該菌株的子實體形態(tài)分析以及菌絲體形態(tài)分析根據(jù)《真菌鑒定手冊》(魏景超著)表明該 菌株屬于真菌擔子菌屬中的白耙齒菌。該菌株已經(jīng)于2009年12月28日保存與中國普通 微生物菌種保藏管理中心保存號為CGMCC No. 3548。一種白耙齒菌(Irpex lacteus) sdu-5的培養(yǎng)方法，其特征在于，具體步驟如下取菌種保藏編號為CGMCC No. 3548的白耙齒菌sdu-5菌株，將該菌株接種至麩皮 浸出液斜面培養(yǎng)基中活化3 4天，溫度為28 30°C ；取活化后的白耙齒菌sdu-5接種于 麩皮液體培養(yǎng)基擴大培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為28 30°C ；培養(yǎng)時間為3 4天，震蕩型搖床的速 度為80轉(zhuǎn)/分鐘；將經(jīng)擴大培養(yǎng)的菌液接種于優(yōu)化產(chǎn)酶合成培養(yǎng)基中或固體發(fā)酵培養(yǎng)基中 發(fā)酵培養(yǎng)。所述麩皮浸出液體培養(yǎng)基的制備方法如下麩皮195 205g加到1L水中，沸煮 30min，六層紗布過濾，自然pH，121°C滅菌20 30min。所述麩皮浸出液斜面培養(yǎng)基的制備方法如下麩皮195 205g加到1L水中，沸煮 30min，六層紗布過濾，添加19. 5 20. 5g瓊脂，自然pH，121°C滅菌20 30min。所述優(yōu)化產(chǎn)酶合成培養(yǎng)基的配方為每升液體培養(yǎng)基含9. 5 10. 5g葡萄糖， 0. 4 0. 5gK2HP04,1. 5 2. 5g(NH4) 2HP04,0. 3 0. 5g NaH2P04，0. 4 0. 6g MgS04 7H20, 1.5 2. 5g酵母浸膏，0. OOlg ZnS04,0 . 005g FeS04 '7H20,0. 06g CaCl2,0. 005g CuS04 '5H20,0. 005g MnS04 H20,藜蘆醇 2 4mM, pH 5. 5 6. 5。所述的優(yōu)化產(chǎn)酶合成培養(yǎng)基的培養(yǎng)條件為培養(yǎng)溫度28 30°C，震蕩型搖床速度 80轉(zhuǎn)/分鐘，培養(yǎng)時間7 9天。所述的固體發(fā)酵培養(yǎng)基的制備方法為4重量份麩皮和6重量份木糖渣充分混勻 后添加6 8倍的水于120°C滅菌30 50min后置于25 35°C隔24小時后再次于120°C 滅菌30 50min,即得。所述的固體發(fā)酵培養(yǎng)基的培養(yǎng)條件為淺層固態(tài)發(fā)酵，培養(yǎng)濕度45 75%，培養(yǎng) 溫度20 28°C，培養(yǎng)時間10 12天。本發(fā)明菌株白耙齒菌(Irpex lacteus) sdu-5 CGMCC No. 3548漆酶在生產(chǎn)中的應(yīng) 用本發(fā)明的耐熱性漆酶經(jīng)過以麩皮和木糖渣為培養(yǎng)基生產(chǎn)的漆酶可以應(yīng)用于造紙、紙漿 處理、造紙污水處理、印染污水處理、以及食品、飲料及生物傳感等行業(yè)。配制上述培養(yǎng)基的試劑均為市售產(chǎn)品，木糖渣為工業(yè)廢棄原料，可由木糖生產(chǎn)企 業(yè)購得。本發(fā)明有益效果如下1)白耙齒菌(Irpex lacteus) sdu-5能夠在液體或者固體培養(yǎng)情況下快速生長， 有效的減小發(fā)酵周期，縮小制造成本。2)培養(yǎng)產(chǎn)物易分離，培養(yǎng)基經(jīng)5 10倍水常溫浸提30到60分鐘后除去培養(yǎng)物， 浸出液經(jīng)超濾濃縮凍干成粉后可用于商業(yè)用途。3)白耙齒菌(Irpex lacteus) sdu-5可在能夠以麩皮和木糖渣作為發(fā)酵底物的情 況下產(chǎn)生較高的漆酶，由于培養(yǎng)基原料便宜易得，較現(xiàn)有產(chǎn)漆酶菌培養(yǎng)成本低，且可以較好 的解決農(nóng)副產(chǎn)品加工的廢料麩皮和木糖渣，利于資源的綜合利用。


圖1是PCR產(chǎn)物電泳檢測圖譜；圖2是時間產(chǎn)酶曲線；圖3是核酸序列測定圖譜；
具體實施例方式實施例1快速生長產(chǎn)漆酶菌株的分離篩選1.培養(yǎng)基分離培養(yǎng)基向20% (200g)麩皮中加入1L水，煮沸后30min，6層紗布過濾；稱 取2% (20g)瓊脂條加入1000ml三角瓶中；將濾得的麩皮液裝入此三角瓶中，加水定容至 1000ml ；將麩皮汁培養(yǎng)基和洗凈的培養(yǎng)皿121°C濕熱滅菌20min，添加青霉素和鏈霉素至 200mg/L，倒平板；備用。高通量快速生長產(chǎn)漆酶選擇性培養(yǎng)基10% (100g)麩皮中加入1L水，煮沸后 30min，6層紗布過濾；稱取2% (20g)瓊脂條加入1000ml三角瓶中；將濾得的麩皮液裝入此 三角瓶中，加水定容至1000ml ；將麩皮汁培養(yǎng)基和洗凈的培養(yǎng)皿121°C濕熱滅菌20min，添 加愈創(chuàng)木酚至200mg/L，倒平板備用。液體產(chǎn)漆酶選擇性培養(yǎng)基10% (100g)麩皮中加入1L水，煮沸后30min，6層紗布過濾；分裝到三角瓶中備用分裝體積占三角瓶體積的十分之一；于121°C濕熱滅菌20min備用。2.篩選步驟(1)取長有真菌的基質(zhì)或者真菌子實體，用小刀劈開從內(nèi)部取很少的一小塊接種 到分離純化培養(yǎng)基平板上，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)培養(yǎng)溫度28到30°C。土壤中真菌的分離制備土 壤稀釋液稱取土樣10克，放入盛90ml無菌水并帶有玻璃珠的三角瓶中，振搖約20min，使 土樣與水充分混勻，將細胞分散。用一支1ml無菌吸管從中吸取1ml 土壤懸液加入9ml無 菌水的大試管中充分混勻，然后用無菌吸管從此試管中吸取1ml加入另一盛有9ml無菌水 的試管中，混合均勻，以此類推制成lo^io^io-^io-^io^io-6不同稀釋度的土壤。涂布平板將上述純化培養(yǎng)基的三個平板地面分別用記號筆寫上10_2、10_4、10_6三 種稀釋度，然后用無菌吸管分別由10-2、10_4、10-6三管土壤稀釋液中各取0. 1ml對號放入已 寫好稀釋度的平板中。將0. lml菌懸液小心地滴在平板培養(yǎng)基表面中央位置。右手拿無菌 涂棒平放在平板培養(yǎng)基表面上，將菌懸液先沿一條直線輕輕地來回推動，使之分布均勻，然 后改變方向沿另一垂直線來回推動，平板內(nèi)邊緣可改變方向再涂布幾次。涂布均勻后，室溫 下靜置5 lOmin，使菌液吸附進培養(yǎng)基。(2)隔天觀察平板上真菌的生長情況。挑取平板上長出的真菌菌落，轉(zhuǎn)接到另外的 平板上，直到分離的真菌只長出一種純化的菌落為止，共取得真菌近百株。3.快速生長產(chǎn)漆酶菌株的粗篩培養(yǎng)皿中菌落的生長能力能夠近似的反映菌體 的生長能力；愈創(chuàng)木酚是一種酚型化合物，能夠被漆酶氧化產(chǎn)生紅色或者深紅色的產(chǎn)物，變 色的強弱能夠在一定程度上反映產(chǎn)漆酶能力的強弱，從近百株真菌中選擇生長迅速，且變 色較深的菌株，進行下一步篩選。4.快速生長產(chǎn)漆酶菌株的復(fù)篩取上述菌株中生長迅速，變色能力強的菌株進行 液體發(fā)酵驗證。發(fā)現(xiàn)菌株sdu-5具有生長迅速并能夠產(chǎn)生組成型和誘導(dǎo)型的漆酶，值得進 一步進行研究。液體發(fā)酵酶活性測定方法為ABTS[2，2' -azino-bis (3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid)，2，2，-連氮基-雙-(3-乙基苯并二氫噻唑啉-6-磺酸)二銨鹽]法 或者01^(2，6-0址6讓0巧口1^1101，2，6-二甲氧基苯酚)法其具體操作是ABTS(2，2’ -連 氮基-雙-(3-乙基苯并二氫噻唑啉-6-磺酸)二銨鹽)法的底物為ABTS(2，2’ -連氮 基-雙-(3-乙基苯并二氫噻唑啉-6-磺酸)二銨鹽)，其濃度為ImM，反應(yīng)體積是2ml，緩 沖體系是20mM的醋酸醋酸鈉緩沖液，測定波長為420nm，消光系數(shù)為￡ = 36，OOOM^cnT1 ； DMP(2，6-二甲氧基苯酚)法的底物為DMP (2，6-二甲氧基苯酚)，底物濃度為10mM，反應(yīng) 體積是2ml，緩沖體系是20mM的醋酸醋酸鈉緩沖液，測定波長為470nm，消光系數(shù)為￡ = 49，600M"1 cnT1。酶活性測定中用到的大型儀器是Shimadzu的UV-3100型紫外可見全波段 分光光度計。實施例2快速生長產(chǎn)漆酶菌株白耙齒菌的鑒定1.形態(tài)學及生理生化鑒定首先將采集到的子實體或者經(jīng)培養(yǎng)產(chǎn)生的子實體以及孢子形態(tài)與真菌分類學手 冊《真菌鑒定手冊》(魏景超著)進行對照初步鑒定該菌株成熟后實層體內(nèi)裂呈把齒狀，而 在發(fā)育初期是孔狀的。上表面白色至奶油色或淡黃色、有密生的硬毛，無環(huán)帶，有淺的溝紋，邊緣同色?？卓诿姘咨聊逃蜕?，孔口有棱角，近邊緣處每毫米間一個，孔間隔壁薄，初期就 深裂成耙齒狀。菌肉白色至淡色，軟纖維質(zhì)，無環(huán)帶。擔子果一年生，平展至反卷，菌蓋8 15X9 20mm，厚1. 5 3mm表面白色，有細長毛，菌管長1 2mm孔面微黃白色，管口約2 個/mm，常裂為齒狀.菌絲系統(tǒng)二體型生殖菌絲具簡單隔膜，直徑3 4um，囊狀體顯著。該 菌株的應(yīng)屬于白耙齒菌，具體還需要分子生物學的方法進行驗證鑒定。2. ITS的序列分析基因組DNA的提取，在麩皮液體培養(yǎng)基中生長的菌體(約2 3天)用兩層紗布過 濾，把菌體放在液氮預(yù)冷的研缽中進行研磨進行研磨。提取基因組DNA，然后用濃度為 的瓊脂糖凝膠電泳進行DNA的電泳檢測。經(jīng)檢測合格的DNA進行PCR基因擴增，PCR采用的 引物為ITS5 位于1881 離序列66六六61六六狀61^61六六0六六66(5￡0 ID NO. 2)，ITS4 位于28sRNA 序列為TCCTCCGCTTATTGATATGC (SEQ ID NO. 3)；經(jīng)PCR擴增得到的DNA電泳檢測(圖1)后 連接到PMD20-T質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌，轉(zhuǎn)化的菌體經(jīng)過添加LA (Luria-Bertani培養(yǎng)基添加氨 芐青霉素)培養(yǎng)基篩選后，提取質(zhì)粒進行電泳驗證；轉(zhuǎn)化成功的菌種送上海英駿公司測序。 測序結(jié)果如圖3所示，其有效序列為SEQ ID No. 1，其余序列為質(zhì)粒載體的部分序列。實施例3白耙齒菌漆酶的液體發(fā)酵測定合成培養(yǎng)基缺少部分生長因子，絕大部分菌體在合成培養(yǎng)基上生長較慢，白耙齒 菌在上述培養(yǎng)基上生長迅速，在第八天生長量和漆酶產(chǎn)量達到最大。添加藜蘆醇作為誘導(dǎo) 劑后產(chǎn)酶量能夠提高，說明該菌株既能夠產(chǎn)組成型漆酶，又能夠產(chǎn)誘導(dǎo)型漆酶。分別對培養(yǎng) 基的碳源和氮源進行了選擇性試驗。碳源有葡萄糖、麥芽糖、草酸鈉、檸檬酸；氮源有硫酸 氨、氯化氨、尿素、硝酸鈉、磷酸氫二氨，試驗發(fā)現(xiàn)該液體培養(yǎng)基的最佳碳源和最佳氮源分別 是葡萄糖和硫酸氫二銨。對培養(yǎng)條件進行優(yōu)化后得到優(yōu)化產(chǎn)酶合成培養(yǎng)基，成分如下每升液體培養(yǎng)基含9. 5 10. 5g葡萄糖，0. 4 0. 5g K2HP04，1. 5 2. 5g(NH4)2HP04，0. 3 0. 5gNaH2P04，0. 4 0. 6g MgS04.7H20，1. 5 2. 5g 酵母浸膏，0. OOlg ZnS04，0. 005g FeS04 7H20，0. 06g CaCl2，0. 005g CuS04 5H20，0. 005g MnS04 H20，藜蘆醇 2 4mM，pH 在 5. 5 6. 5 ;優(yōu)化產(chǎn)酶合成培養(yǎng)基的最佳培養(yǎng)條件如下振蕩型搖床培養(yǎng)，搖床轉(zhuǎn)速80r/min，培養(yǎng)溫度28 30°C，培養(yǎng)時間7 9天。實施例4白耙齒菌漆酶的固體發(fā)酵固體發(fā)酵物的選取固體發(fā)酵物的選取采用發(fā)酵成本的工業(yè)廢棄生物質(zhì)和營養(yǎng)物 質(zhì)較豐富的添加物，既能有效的降低發(fā)酵成本，有能充分利用廢棄物。鑒于該菌既存在組成 型的漆酶又存在誘導(dǎo)型的漆酶，采用工業(yè)廢料木糖渣(山東禹城龍力集團)和造紙廢棄木 質(zhì)素(山東華泰紙業(yè)股份有限公司)與麥稈，玉米秸稈，楊木粉，蔗渣，麩皮等生物質(zhì)混合添 加6 8倍的水后發(fā)酵。發(fā)酵產(chǎn)物經(jīng)過5倍的水浸泡30分鐘提取后離心以DMP為底物測 定酶活性。經(jīng)培養(yǎng)測定，該菌株能夠以麩皮和木糖渣作為發(fā)酵底物的情況下產(chǎn)生較高的漆 酶。經(jīng)部分因子試驗對主要的產(chǎn)酶影響因素進行篩選，麩皮和木糖渣的混合比例和培養(yǎng)時 間對漆酶的產(chǎn)量影響最大。對麩皮和木糖渣的混合比例和培養(yǎng)時間進行優(yōu)化，當混合比例 為4重量份麩皮6重量份木糖渣時產(chǎn)酶效果最佳，其產(chǎn)酶最佳時間為10 12天，如圖2所 示。培養(yǎng)過程中不需要添加金屬銅離子和誘導(dǎo)劑，培養(yǎng)產(chǎn)物經(jīng)5 10倍水常溫浸提30到60分鐘后除去培養(yǎng)物，浸出液經(jīng)濃縮凍干后的酶粉可用于工業(yè)造紙、紙漿改性、造紙污水處 理、印染污水處理、食品工業(yè)、飲料行業(yè)、服裝行業(yè)、有機合成行業(yè)中。
經(jīng)過優(yōu)化后的固體發(fā)酵條件是4重量份麩皮和6重量份木糖渣充分混勻后添加 6 8倍的水進行淺層固態(tài)發(fā)酵，培養(yǎng)濕度控制在45 75%，培養(yǎng)溫度20 28°C，培養(yǎng)時 間為10 12天。培養(yǎng)產(chǎn)物經(jīng)5 10倍水常溫浸提30到60分鐘后除去培養(yǎng)物，浸出液經(jīng) 超濾濃縮凍干成粉后酶活力大于3000U/g(DMP作為底物)。培養(yǎng)時間較肖亞忠等人培養(yǎng)的 栓菌AH28-2的培養(yǎng)時間有效縮短10天左右，凍干后酶粉活性略低。與施曉燕等人分離得 到的菌株相比發(fā)酵時間大致一致但酶活性大大高于其發(fā)酵酶活性。此外國外有用香蕉皮葡 萄核等固體發(fā)酵能夠產(chǎn)高酶活性的漆酶，但原料來源相比木糖渣和麩皮比較難收集，很難 大規(guī)模培養(yǎng)，且其發(fā)酵最佳時間在22天左右，較白耙齒菌培養(yǎng)時間長10天左右。
權(quán)利要求
一種白耙齒菌(Irpex lacteus)sdu-5，該菌株已于2009年12月28日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC No.3548。
2.一種如權(quán)利要求1所述的白耙齒菌(Irpex laCteuS)Sdu-5的培養(yǎng)方法，其特征在 于，具體步驟如下取菌種保藏編號為CGMCC No. 3548的白耙齒菌sdu-5菌株，將該菌株接種至麩皮浸出 液斜面培養(yǎng)基中活化3 4天，溫度為28 30°C ；取活化后的白耙齒菌sdu-5接種于麩皮 液體培養(yǎng)基擴大培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為28 30°C ；培養(yǎng)時間為3 4天，震蕩型搖床的速度為 80轉(zhuǎn)/分鐘；將經(jīng)擴大培養(yǎng)的菌液接種于優(yōu)化產(chǎn)酶合成培養(yǎng)基中或固體發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng)。
3.如權(quán)利要求2所述的培養(yǎng)方法，其特征在于，所述麩皮浸出液體培養(yǎng)基的制備方法 如下麩皮195 205g加到1L水中，沸煮30min，六層紗布過濾，自然pH，121°C滅菌20 30mino
4.如權(quán)利要求2所述的培養(yǎng)方法，其特征在于，所述麩皮浸出液斜面培養(yǎng)基的制備方 法如下麩皮195 205g加到1L水中，沸煮30min，六層紗布過濾，添加19. 5 20. 5g瓊 脂，自然pH，121°C滅菌20 30min。
5.如權(quán)利要求2所述的培養(yǎng)方法，其特征在于，所述優(yōu)化產(chǎn)酶合成培養(yǎng)基的配方為 每升液體培養(yǎng)基含9. 5 10. 5g葡萄糖，0.4 0. 5g K2HP04,1. 5 2. 5g(NH4)2HP04， 0. 3 0. 5gNaH2P04，0. 4 0. 6g MgS04 7H20,1. 5 2. 5g 酵母浸膏，0. OOlg ZnS04，0. 005g FeS04 7H20，0. 06g CaCl2，0. 005g CuS04 5H20，0. 005g MnS04 H20,藜蘆醇 2 4mM，pH 5. 5 6. 5。
6.如權(quán)利要求5所述的培養(yǎng)方法，其特征在于，所述的優(yōu)化產(chǎn)酶合成培養(yǎng)基的培養(yǎng)條 件為培養(yǎng)溫度28 30°C，震蕩型搖床速度80轉(zhuǎn)/分鐘，培養(yǎng)時間7 9天。
7.如權(quán)利要求2所述的培養(yǎng)方法，其特征在于，所述的固體發(fā)酵培養(yǎng)基的制備方法為 4重量份麩皮和6重量份木糖渣充分混勻后添加6 8倍的水于120°C滅菌30 50min后 置于25 35°C隔24小時后再次于120°C滅菌30 50min，即得。
8.如權(quán)利要求7所述的培養(yǎng)方法，其特征在于，所述的固體發(fā)酵培養(yǎng)基的培養(yǎng)條件為 淺層固態(tài)發(fā)酵，培養(yǎng)濕度45 75%，培養(yǎng)溫度20 28°C，培養(yǎng)時間10 12天。
9.權(quán)利要求1所述的白耙齒菌(IrpexlaCteuS)Sdu-5應(yīng)用于需要添加漆酶的工業(yè)造 紙、紙漿改性、造紙污水處理、印染污水處理、食品工業(yè)、飲料行業(yè)、服裝行業(yè)、有機合成行業(yè) 中。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種新的生長迅速的高效漆酶產(chǎn)生真菌菌株白耙齒菌及其培養(yǎng)方法和應(yīng)用，屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域。該白耙齒菌(Irpex lacteus)sdu-5已于2009年12月28日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCCNO.3548；該菌株能夠在液體培養(yǎng)基添加誘導(dǎo)劑或者固體發(fā)酵不添加任何誘導(dǎo)劑的情況下經(jīng)濟高效的產(chǎn)漆酶。
文檔編號C12N9/02GK101855973SQ201010124690
公開日2010年10月13日 申請日期2010年3月16日 優(yōu)先權(quán)日2010年3月16日
發(fā)明者張應(yīng)龍, 張海波, 李夏, 黃峰 申請人:山東大學