專利名稱：藥用野生稻抗白葉枯病主效基因Xa3/Xa26-2和它在改良水稻抗病性中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)領(lǐng)域。具體涉及一個(gè)水稻抗白葉枯病主效基因Xa3/ Xa26-2的分離克隆、功能驗(yàn)證和應(yīng)用。所述的DNA片段能夠賦予水稻抵抗由白葉枯病菌引 起的病害。將該片段與其內(nèi)源調(diào)節(jié)序列直接轉(zhuǎn)入植物體，轉(zhuǎn)基因水稻可以產(chǎn)生由該基因介 導(dǎo)的對(duì)白葉枯病菌的防衛(wèi)反應(yīng)。
背景技術(shù)：
植物在生長(zhǎng)的過(guò)程中，受到多種病原物的侵害。植物病原物的種類繁多，包括病 毒、細(xì)菌、真菌和線蟲(chóng)等。病原物侵入植物導(dǎo)致兩種結(jié)果(1)病原體成功的在寄主植物內(nèi) 繁殖，引起相關(guān)的病癥；(2)寄主植物產(chǎn)生抗病反應(yīng)，殺死病原物或阻止其生長(zhǎng)。利用抗性 基因資源改良植物的抗病性，是預(yù)防病害同時(shí)又保護(hù)環(huán)境的根本出路。植物的抗病反應(yīng)是多基因參于調(diào)控的復(fù)雜過(guò)程。參于植物抗病反應(yīng)的基因分為兩 類(1)抗病(主效)基因，又稱R(resistance)基因和(2)抗病相關(guān)基因。根據(jù)目前人們對(duì)抗病基因功能的認(rèn)識(shí)，抗病基因的產(chǎn)物主要是作為受體，直接或 間接與病原蛋白相互作用，啟動(dòng)植物體內(nèi)的抗病信號(hào)傳導(dǎo)路徑(Chisholm等，2006)。抗病 基因介導(dǎo)的抗病反應(yīng)抗性強(qiáng)，是很好的基因資源。但是農(nóng)作物栽培種中抗病基因的資源有 限。從近緣物種中發(fā)掘新的抗病基因用于農(nóng)作物遺傳改良一直是研究者工作的一個(gè)重要目 標(biāo)。水稻是世界上重要的糧食作物，但病害的影響常常造成其產(chǎn)量和品質(zhì)的下降。水 稻白葉枯病由白葉枯病菌(Xanthomonas oryzae pv. oryzae)引起，是世界上對(duì)水稻危害最 大的細(xì)菌性病害之一(過(guò)崇儉，1995)。水稻栽培種(Oryza sativa L.)中抗病基因的資源 非常有限。如目前知道的抗白葉枯病基因只有大約30個(gè)(儲(chǔ)昭暉和王石平，2007)。由于野 生稻長(zhǎng)期處于野生狀態(tài)，經(jīng)受了各種不良環(huán)境和災(zāi)害的自然選擇，形成了極其豐富的遺傳 多樣性。野生稻中蘊(yùn)藏有優(yōu)良抗病基因資源，是人們發(fā)掘新的優(yōu)良基因的一個(gè)重要資源庫(kù)。 已知的大約30個(gè)抗白葉枯病基因中就有多個(gè)基因是從野生稻中導(dǎo)入進(jìn)栽培稻中的。如抗 白葉枯病顯性基因Xa21源自西非長(zhǎng)藥野生稻(Oryza longistaminata)，對(duì)大多數(shù)白葉枯 病菌株表現(xiàn)高抗；但是該基因是成株期抗性，即只有在水稻成株期才對(duì)白葉枯病菌具有完 全抗性(Khush等，1990 ；Wang等，1996)。Xa21基因已經(jīng)被分離克隆(Song等，1995)。一個(gè) 尚未被分離克隆的抗白葉枯病顯性基因Xa23源自普通野生稻(Oryza rufipogon)，它具有 廣譜抗性(章琦等，2000)。另一個(gè)已經(jīng)被分離克隆的抗白葉枯病基因Xa27來(lái)自于四倍體 小粒野生稻(Orzyaminuta)，該基因抗白葉枯病菌菲律賓小種2、3、5和6 (Amante-Bordeos 等，1992 ；Gu等，2005)。此外，尚未被分離克隆的抗白葉枯病基因Xa29 (t)和Xa30 (t)是分 別從藥用野生稻(Orzya officinalis)和普通野生稻中鑒定出的(譚光軒等，2004 ；王春連 等，2004)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是分離克隆藥用野生稻(Oryza officinalis)中攜帶的抗白葉枯病 基因Xa3/Xa26-2和包含調(diào)控這個(gè)基因的啟動(dòng)子的DNA片段，利用這個(gè)基因改良水稻品種或 其他植物抵御病害的能力。本發(fā)明涉及分離和應(yīng)用包含Xa3/Xa26-2基因的DNA片段，它的核苷酸序列如序列 表SEQID NO :1所示，它的編碼序列如序列表SEQ ID NO :1中第3284-6191和6295-6662位 所示。該基因(片段)賦予水稻對(duì)由白葉枯病菌(Xanthomonas oryzae pv. oryzae)所引 起的病害產(chǎn)生特異性的抗病反應(yīng)。這一發(fā)明適用于所有對(duì)該病原菌敏感的植物。這些植物 包括單子葉植物和雙子葉植物。除上述所述的如SEQ ID NO :1所示的DNA片段外，本發(fā)明 所定義的基因還包括基本上相當(dāng)于SEQ IDNO 1所示的DNA序列，或者其功能相當(dāng)于SEQID NO :1所示序列的亞片段。對(duì)序列表SEQ ID NO :1所示序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析表明，該DNA 序列編碼一種受體蛋白激酶，它包含細(xì)胞外的富亮氨酸重復(fù)(leucine-rich repeat, LRR) 結(jié)構(gòu)域和細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)激酶結(jié)構(gòu)域。可以采用已經(jīng)克隆的Xa3/Xa26-2基因作探針，從cDNA和基因組文庫(kù)中篩選到本 發(fā)明的基因或同源基因。同樣，采用PCR(polymerase chain reaction)技術(shù)，也可以從基因 組、mRNA和cDNA中擴(kuò)增得到本發(fā)明的Xa3/Xa26_2基因以及任何感興趣的一段DNA或與其 同源的一段DNA。采用以上技術(shù)，可以分離得到包含Xa3/Xa26-2基因的序列或者包含一段 Xa3/Xa26-2基因的序列，將這一序列與合適的載體連接，可以轉(zhuǎn)入植物細(xì)胞，并表達(dá)Xa3/ Xa26-2基因，產(chǎn)生抗病轉(zhuǎn)基因植物。采用這種轉(zhuǎn)基因技術(shù)創(chuàng)造抗病植物是傳統(tǒng)育種技術(shù)所 不能達(dá)到的。將克隆的抗病基因轉(zhuǎn)入感病的植物，有助于產(chǎn)生新的抗病植物。特別是可以用遺 傳轉(zhuǎn)化技術(shù)在植物中累加多個(gè)抗病基因，而不會(huì)產(chǎn)生傳統(tǒng)育種技術(shù)中伴隨出現(xiàn)的將遺傳連 鎖累贅引入需改良的品種。同時(shí)，抗病基因的克隆可以克服傳統(tǒng)育種不能在植物種間轉(zhuǎn)移 抗病基因的問(wèn)題。本發(fā)明能夠進(jìn)一步提供或應(yīng)用利用上述DNA片段獲得的抗病的轉(zhuǎn)基因植 株和相應(yīng)的種子，可以用有性雜交的方式將本發(fā)明的基因轉(zhuǎn)入其它的植物。本發(fā)明為增強(qiáng)水稻對(duì)白葉枯病的抗性提供了一種新的方法。這種方法包括將來(lái)源 于野生稻的Xa3/Xa26-2基因和它的調(diào)控DNA序列與遺傳轉(zhuǎn)化載體連接、轉(zhuǎn)入感病水稻，改 良水稻對(duì)白葉枯病的抗性。更詳細(xì)的技術(shù)方案見(jiàn)《具體實(shí)施方式
》所述。


序列表SEQ ID NO 1.是本發(fā)明克隆的Xa3/Xa26_2基因的DNA序列。圖1.本發(fā)明鑒定和分離克隆水稻抗白葉枯病基因Xa3/Xa26-2以及驗(yàn)證Xa3/ Xa26-2基因功能的流程圖。圖2.秈稻品種明恢63中Xa3/Xa26基因和MRKa基因的結(jié)構(gòu)及用于制備DNA探針 的PCR引物(箭頭)位置。圖3. Xa3/Xa26基因片段的DNA探針與9個(gè)BAC克隆的雜交結(jié)果。λ _ECoT14I是 DNA分子大小標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)參照物(DNAladder ；購(gòu)自大連TaKaRa公司)。圖4.秈稻品種明恢63和藥用野生稻中Xa3/Xa26基因家族成員的分布和序列同源性。每一個(gè)箭頭代表一個(gè)Xa3/Xa26家族成員和轉(zhuǎn)錄方向。Xa3/Xa26和Xa3/Xa26_2基因 下游約有1. 4kb核苷酸序列同源程度達(dá)到83%。11. 9kb區(qū)段是用于遺傳轉(zhuǎn)化DNA片段。圖5.遺傳轉(zhuǎn)化載體pCAMBIA1301的結(jié)構(gòu)。圖6. T1代遺傳轉(zhuǎn)化植株中的報(bào)告基因GUS與抗病表型共分離。說(shuō)明與GUS基因 緊密連鎖的Xa3/Xa26-2基因與抗病表型共分離。對(duì)照為水稻感病品種牡丹江8 (遺傳轉(zhuǎn)化 的受體)。病斑面積為接種白葉枯病菌PX061兩周后的數(shù)據(jù)。圖7.與對(duì)照牡丹江8相比，攜帶Xa3/Xa26-2基因的遺傳轉(zhuǎn)化植株(D1010M43)對(duì) 不同白葉枯病菌的抗性都增強(qiáng)了。圖8.Xa3/Xa26-2基因結(jié)構(gòu)。箭頭示用于基因結(jié)構(gòu)分析的PCR引物位置和方向。 “ATG”和“TGA”分別是翻譯起始密碼和終止密碼。數(shù)字示每一種結(jié)構(gòu)的核苷酸數(shù)目。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明的前期研究結(jié)果顯示來(lái)源于秈稻(Oryza sativa L. ssp. indica)品種明恢 63的抗白葉枯病顯性基因Xa3/Xa26屬于多基因家族成員；這個(gè)家族的成員以串連排列的 形式位于水稻11號(hào)染色體的長(zhǎng)臂(Yang等，2003 ；Sun等，2004，2006 ；Xiang等2006)。在 明恢63中，Xa3/Xa26家族由4個(gè)成員(Xa3/Xa26、MRKa、MRKc和MRKd)組成，它們的編碼區(qū) 之間的DNA序列同源性為60%至78% (Sun等，2004)。Xa3/Xa26編碼一個(gè)富亮氨酸重復(fù) (leucine-richrepeat,LRR)蛋白激酶類蛋白(Sun等，2004)。根據(jù)本發(fā)明中的目標(biāo)基因與 Xa3/Xa26基因序列同源性分析和它在藥用野生稻(Oryza officinalis)的Xa3/Xa26家族 中與其他成員的相對(duì)應(yīng)位置關(guān)系，確定該基因是Xa3/Xa26基因的等位基因，故命名為Xa3/ Xa26-2 基因(視 Xa3/Xa26 基因?yàn)?Xa3/Xa26_l)。以下實(shí)施例中進(jìn)一步定義本發(fā)明。圖1描敘了鑒定和分離克隆Xa3/Xa26-2基因 以及驗(yàn)證Xa3/Xa26-2基因功能的流程。根據(jù)以下的描述和這些實(shí)施例，本領(lǐng)域技術(shù)人員可 以確定本發(fā)明的基本特征、并且在不偏離本發(fā)明精神和范圍的情況下，可以對(duì)本發(fā)明做出 各種改變和修改，以使其適用各種用途和條件。實(shí)施例1 從藥用野生稻中分離克隆Xa3/Xa26-2基因和基因結(jié)構(gòu)分析1.鑒定攜帶Xa3/Xa26基因同源序列的大片段DNA本發(fā)明研究人員首先用Xa3/Xa26基因的特異性PCR弓丨物RKb_3，race2 (5，-TGGTCA AATACCGGAAGGAG-3，)和 RKb_2R (5，-CAGTCCACCACATGGACAAG-3，)和 Xa3/Xa26 家族成員 MRKa 基因的特異性 PCR 引物 RKa-llL(5，-TTGGCTTGAACGGCTTAACT-3，)和 RKa-IR(5，-AAGATGA AATATGCTCGGTGGT-3，)從明恢63中擴(kuò)增出Xa3/Xa26基因和MRKa的DNA片段,擴(kuò)增長(zhǎng)度各 約Ikb (圖2)。將這兩段PCR擴(kuò)增產(chǎn)物混合作為探針篩選藥用野生稻(Oryza officinalis) 的基因組 BAC(bacterialartificial chromosome)文庫(kù)(Ammiraju 等，2006)，鑒定了 9 個(gè) 陽(yáng)性BAC克隆。這9個(gè)陽(yáng)性BAC克隆(Ammiraju等，2006)由美國(guó)University of Arizona 大學(xué)的Rod Wing教授惠贈(zèng)。將篩選到得BAC克隆擴(kuò)大培養(yǎng)，采用標(biāo)準(zhǔn)堿裂解法分離提取 BAC質(zhì)粒(Sambrook和Russell，2001)。將所得BAC質(zhì)粒用Hind III完全酶切、電泳、轉(zhuǎn)移 至尼龍膜；然后用上述Xa3/Xa26基因片段探針和MRKa基因片段探針?lè)謩e與載有BAC質(zhì)粒 的尼龍膜雜交(Sambrook和Russell，2001)。用Xa3/Xa26基因片段作探針的雜交結(jié)果顯示 BAC克隆00Ba0120J21具有最多雜交帶(圖3)，推測(cè)該BAC克隆可能覆蓋Xa3/Xa26基因家族區(qū)段。決定對(duì)00Ba0120J21克隆進(jìn)行測(cè)序。2. BAC克隆的shotgun文庫(kù)的構(gòu)建本發(fā)明研究人員首先構(gòu)建了用于測(cè)序的00Ba0120J21克隆的shotgun文庫(kù)。采用 超聲波法構(gòu)建shotgun文庫(kù)(Sambrook和Russell，2001)。用超聲波處理00Ba0120J21克 隆的環(huán)形質(zhì)粒1. 6秒(超聲破碎儀Sonipr印150為SANYO公司產(chǎn)品，具體操作參考該儀 器的使用說(shuō)明書(shū))。通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳分離大約2. 0-3. 5kb的DNA片段，用UNIQ-IO 柱式DNA膠回收試劑盒(購(gòu)自中國(guó)上海生工生物工程有限公司)從電泳凝膠中純化DNA。 純化后的DNA用T4 DNA聚合酶補(bǔ)平末端，與限制性內(nèi)切酶SmaI酶切的去磷酸化的pUC19 載體(購(gòu)自美國(guó)Amersham Bioscience公司)平端連接，電轉(zhuǎn)化大腸桿菌DHlOB(購(gòu)自美 國(guó)Invitrogen公司)(電轉(zhuǎn)化儀為印pendorf公司產(chǎn)品，本實(shí)施例所用電壓為1800V，具體 操作參考該儀器的使用說(shuō)明書(shū))。挑克隆檢測(cè)插入片段大小提取陽(yáng)性克隆質(zhì)粒，并用空 PUC19質(zhì)粒進(jìn)行電泳比較，剔除假陽(yáng)性克隆及小片段克隆，或用EcoRI和HindIII雙酶切重 組質(zhì)粒，檢測(cè)插入片段大小，篩選插入片段大小合適的克隆作為shotgun文庫(kù)用于測(cè)序。3. Shotgun文庫(kù)的測(cè)序采用Ml 3-F (5 ‘ - G T A A A A C G A C G G C CA G T - 3 ‘)禾口 M13-R 5' -CAGGAAACAGCTATGAC-3 ‘)通用引物(購(gòu)自中國(guó)上海生工生物工程有限公司)、美國(guó) Perkin Elmer公司的測(cè)序試劑盒(BigDye Kit)，根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)以雙脫氧核苷酸末端終 止法分別從shotgun文庫(kù)中隨機(jī)挑選的克隆兩端測(cè)序。4.原始序列的拼接使用Squencer 4. 5 軟件(美國(guó) Gene Codes Corporation)拼接序列。用 Squencer4. 5軟件自動(dòng)去除末端測(cè)序較差的序列和pUC19載體序列；軟件沒(méi)有去除干凈的 序列則用手工刪除。BAC載體的碎片序列和污染的細(xì)菌DNA序列通過(guò)和BAC序列進(jìn)行比較 或BLAST分析的方法(Altschul等，1997)加以去除。用Squencer 4. 5軟件對(duì)兩條序列進(jìn) 行拼接的參數(shù)是重疊序列長(zhǎng)度(Mini Overlap)大于20bp(base pair)，重疊序列的一致 性(Mini Match)大于85%。每一個(gè)堿基的確定都要參照重疊在該位點(diǎn)的多個(gè)shotgun片 段序列。對(duì)于由一個(gè)shotgun片段序列所覆蓋的區(qū)域要再次測(cè)序驗(yàn)證，以確保堿基的準(zhǔn)確 性。5. DNA序列分析首先用Blastn和Blastx方法(Altschul等，1997)分析所得序列。然后采 用 Fgenesh(http//www. softberry.ru/berry.phtml) (Salamov 禾口 Solovyev, 2000) 禾口 GeneMark. hmm (http//exon.gatech. edu/GeneMark/eukhmm. cgi) (Besemer 禾口 Borodovsky, 2005)軟件分析預(yù)測(cè)基因結(jié)構(gòu)，分析結(jié)果進(jìn)一步用Blastp方法(Altschul等， 1997)進(jìn)行確定。兩條或多條核苷酸或氨基酸序列的比較分析使用BLAST2 sequence方法 (Tatusova 等，1999)和 Clustalff 方法(http //www. ebi. ac. uk)。對(duì)BAC克隆00Ba0120J21測(cè)序和序列拼接形成三個(gè)大的序列片段，其長(zhǎng)度分別為 84. Ikb, 25. 8kb和3. 3kb。序列分析發(fā)現(xiàn)在84. Ikb的片段上有4個(gè)基因編碼LRR-蛋白激 酶類蛋白，與水稻抗白葉枯病基因Xa3/Xa26編碼的產(chǎn)物有不同程度的同源性，它們被命名 為 OoRKa、OoRKb 1、OoRKb 和 OoRKf (圖 4)。用 Fgenesh,GeneMark. hmm 和 Blastx 分析表明， OoRKa, OoRKb和OoRKf是3個(gè)完整的基因，OoRKbl是一個(gè)不完整基因(圖4)。OoRKa和OoRKb的轉(zhuǎn)錄方向相同，而OoRKf的轉(zhuǎn)錄方向與OoRKa和OoRKb相反(圖4)。將該區(qū)段與水稻明恢63中Xa3/Xa26基因家族區(qū)段進(jìn)行比較分析。發(fā)現(xiàn)藥用野生 稻中的OORKa基因和明恢63中的MRKa基因的同源程度達(dá)到80 %，藥用野生稻中的OoRKb 基因和和明恢63中的Xa3/Xa26 (又稱為MRKb)基因同源程度高達(dá)95 % ；并且OoRKb和MRKb 基因下游約有1. 4kb區(qū)段同源程度達(dá)到83%，所以O(shè)oRKb為Xa3/Xa26的等位基因，我們命 名該基因?yàn)閄a3/Xa26-2 (圖4)。實(shí)施例2 :Xa3/Xa26-2基因的功能驗(yàn)證1.遺傳轉(zhuǎn)化載體的構(gòu)建本發(fā)明所用載體是pCAMBIA1301 (圖5)，它是常用的水稻遺傳轉(zhuǎn)化載體(Sim等， 2004)。用限制性內(nèi)切酶EcoRV從BAC克隆00Ba0120J21上酶切后回收11.9kb包含Xa3/ Xa26-2基因的編碼區(qū)、啟動(dòng)子以及尾部序列的片段(圖4)。同時(shí)，用限制性內(nèi)切酶SmaI酶 切遺傳轉(zhuǎn)化載體PCAMBIA1301 ；酶切完畢，用SAP(蝦堿性磷酸酶)去磷酸化；用氯仿異戊 醇(體積比24 1)抽提、純化酶切產(chǎn)物。用包含Xa3/Xa26-2基因的酶切回收片段和純化 好的載體做連接反應(yīng)。通過(guò)酶切驗(yàn)證陽(yáng)性克隆，獲得的重組質(zhì)粒被命名為D1010。2.遺傳轉(zhuǎn)化和Ttl代遺傳轉(zhuǎn)化植株分析采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法(Lin和Zhang，2005)將DlOlO導(dǎo)入水稻感病品 種牡丹江8(0ryza sativa ssp. japonica)。獲得的遺傳轉(zhuǎn)化植株被命名為DlOlOM (該命名 的前面部分即DlOlO為遺傳轉(zhuǎn)化載體名稱，M代表水稻品種牡丹江8)。本發(fā)明共獲得獨(dú)立轉(zhuǎn) 化植株33株。對(duì)其中一半轉(zhuǎn)化植株接種白葉枯病菌株P(guān)X061，另一半轉(zhuǎn)化植株接種白葉枯 病菌株P(guān)X0341。白葉枯病菌接種采用剪葉法對(duì)成株期的水稻進(jìn)行接種(Sim等，2004)。白 葉枯病菌株P(guān)X061和PX0341由菲律賓國(guó)際水稻研究所惠贈(zèng)(Sun等，2004 ；Wu等，2008)。白 葉枯病菌的培養(yǎng)遵循已經(jīng)公開(kāi)發(fā)表的方法(Sim等，2004)。接種14天后調(diào)查病斑面積(病 斑長(zhǎng)度/病葉長(zhǎng)度X % )。與對(duì)照牡丹江8及遺傳轉(zhuǎn)化陰性植株相比，絕大部分的陽(yáng)性遺 傳轉(zhuǎn)化植株的抗性顯著增強(qiáng)(表1)。表1. T0代遺傳轉(zhuǎn)化植株(DlOlOM)接種白葉枯病菌株P(guān)X061和PX0341的表型
7 (1)每株遺傳轉(zhuǎn)化基因植株接種3-5片葉，14天后調(diào)查病斑和病葉長(zhǎng)度，每個(gè)數(shù)據(jù) 來(lái)自多個(gè)葉片的平均值士標(biāo)準(zhǔn)差。(2)陰性轉(zhuǎn)化植株，其它植株為陽(yáng)性轉(zhuǎn)化植株。3.遺傳轉(zhuǎn)化植株的共分離分析為了驗(yàn)證遺傳轉(zhuǎn)化植株的抗病能力增強(qiáng)是否與Xa3/Xa26-2基因轉(zhuǎn)入相關(guān)，對(duì)在Ttl 代抗性增強(qiáng)的3株遺傳轉(zhuǎn)化植株(D1010M1、D1010M14、D1010M43)的T1代家系進(jìn)行基因型和 抗性共分離分析。在孕穗期時(shí)接種白葉枯病菌PX061，接種14天后調(diào)查病斑面積。同時(shí)取樣 抽取DNA，采用遺傳轉(zhuǎn)化載體所攜帶的報(bào)告基因GUS ( β -葡萄糖醛酸酶)的PCR引物Gus2F (5’-CCAGGCAGTTTTAACGATCAGTTCGC-3’)和 Gus2R(5’-GAGTGAAGATCCCTTTCTT GTTACCG-3 ’) 擴(kuò)增檢測(cè)陽(yáng)性遺傳轉(zhuǎn)化植株。分析發(fā)現(xiàn)遺傳轉(zhuǎn)化植株的抗性增強(qiáng)和GUS基因共分離(圖 6)。說(shuō)明遺傳轉(zhuǎn)化植株的抗性增強(qiáng)是因?yàn)閄a3/Xa26-2基因的存在，Xa3/Xa26-2是一個(gè)抗 白葉枯病基因。4.遺傳轉(zhuǎn)化植株的抗譜分析對(duì)T1代遺傳轉(zhuǎn)化家系D1010M43及對(duì)照牡丹江8在孕穗期接種不同白葉枯病菌 株，分析遺傳轉(zhuǎn)化植株的抗譜。接種采用上述剪葉法。菲律賓白葉枯病菌株P(guān)X061、PX071、 PX0112、PX0341由菲律賓國(guó)際水稻研究所惠贈(zèng)(Sun等，2004 ；Wu等，2008)。中國(guó)白葉枯病 菌株是常用菌株(Sun等，2004 ;Li等，2009)。日本菌株T7174也是常用白葉枯病菌株(Cao 等，2007)。與遺傳轉(zhuǎn)化受體水稻品種牡丹江8相比，攜帶Xa3/Xa26-2基因的遺傳轉(zhuǎn)化植株 顯著增強(qiáng)(P < 0. 01) 了對(duì)不同白葉枯病菌株的抗性(圖7)。遺傳轉(zhuǎn)化植株的病斑面積只 是對(duì)照牡丹江8的12%至75%。這些結(jié)果說(shuō)明Xa3/Xa26-2基因?qū)Π兹~枯病菌具有廣譜抗 性。5. Xa3/Xa26-2基因結(jié)構(gòu)和編碼產(chǎn)物分析本發(fā)明研究人員利用轉(zhuǎn)基因植株(D1010M)分析了 Xa3/Xa26-2基因的結(jié)構(gòu)。轉(zhuǎn)基 因植株的總RNA的抽提采用TRIzol Reagent (美國(guó)Invitrogen公司)，操作方法按公司提 供的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。先將用于反轉(zhuǎn)錄的總RNA用無(wú)RNA酶活性的DNA酶I (美國(guó)Invitrogen公司)處 理，室溫放置15分鐘，去除總RNA中可能存在的DNA污染；再將總RNA在65°C處理10分 鐘，滅活DNA酶I。用superscript III反轉(zhuǎn)錄酶(美國(guó)Invitrogen公司)，按其提供的說(shuō) 明書(shū)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。采用跨越預(yù)測(cè)內(nèi)含子位置的PCR引物RKb3F和RKb2R(表2)擴(kuò)增基因組 DNA和RNA反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，RT-PCR產(chǎn)物比基因組擴(kuò)增產(chǎn)物小，說(shuō)明該區(qū)段確實(shí)存在一個(gè)內(nèi)含子 (圖8)。采用Xa3/Xa26-2基因區(qū)段的其它引物(表2)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄(RT)-PCR分析，沒(méi)有再 發(fā)現(xiàn)其它內(nèi)含子的存在?；蚰┒诵蛄蟹治霾捎肅lontech 公司 SMARTer RACE cDNA Amplification Kit 試劑盒，根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)，通過(guò)RACE (rapid amplification of cDNA end)分析方法，確 定Xa3/Xa26-2基因的5，和3，末端序列。
表2.用于RT-PCR和RACE分析的基因特異性引物 采用上述DNA測(cè)序方法，對(duì)RT-PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序。比較分析Xa3/Xa26-2基因的 cDNA序列和基因組序列，確定該基因由3600個(gè)核苷酸組成，包含兩個(gè)外顯子和一個(gè)內(nèi)含子 (圖8)。第一個(gè)外顯子由2954個(gè)核苷酸組成(位于序列表SEQ ID NO 1的3238-619Ibp 處)，其中包含由46個(gè)核苷酸組成的5，端非翻譯區(qū)(untranslated region，UTR)(位 于序列表SEQ ID NO 1的3238-3283bp處)和2908個(gè)核苷酸組成的編碼區(qū)(位于序列 表SEQ ID N0:1的3284-6191bp處)；內(nèi)含子由103個(gè)核苷酸組成(位于序列表SEQ ID NO :1的6192-6294bp處)；第二個(gè)外顯子由543個(gè)核苷酸組成(位于序列表SEQ ID NO 1的6295-6837bp處)，其中包含由368個(gè)核苷酸組成的編碼區(qū)(位于序列表SEQ ID NO 1的6295-6662bp處)和由175個(gè)核苷酸組成的3，端UTR(位于序列表SEQ ID NO 1的 6663-6837bp 處)。Xa3/Xa26_2基因編碼一個(gè)由1092氨基酸組成的LRR受體激酶類蛋白質(zhì)。XA3/ XA26-2蛋白與XA3/XA26蛋白的氨基酸一致性為92%，氨基酸的同源性為95%。參考文獻(xiàn)儲(chǔ)昭暉，王石平，(2007)，抗性基因分離克隆、結(jié)構(gòu)與功能和分子進(jìn)化，見(jiàn)章琦主 編，水稻白葉枯病抗性的遺傳及改良。北京科學(xué)出版社，pp. 349-377。過(guò)崇儉(1995)中國(guó)農(nóng)作物病蟲(chóng)害。中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所主編，中國(guó)農(nóng) 業(yè)出版社，PP. 14-24。譚光軒，任翔，翁清妹，時(shí)振英，祝莉莉，何光存，藥用野生稻轉(zhuǎn)育后代一個(gè)抗白葉 枯病新基因的定位，遺傳學(xué)報(bào)，(2004)31 :724-729。王春連，趙炳宇，章琦，趙開(kāi)軍，邢全黨，水稻白葉枯病新抗源Y238的鑒定及其近 等基因系培育，植物遺傳資源學(xué)報(bào)，(2004)5 :26-30。章琦，趙炳宇，趙開(kāi)軍，普通野生稻的抗水稻白葉枯病新基因Xa23的鑒定和分子 標(biāo)記定位，作物學(xué)報(bào)，(2000)26 :536-542。
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權(quán)利要求
一種分離的對(duì)白葉枯病產(chǎn)生抗性的基因Xa3/Xa26 2，它的核苷酸序列如序列表SEQ IDNO1所示。
2.一種分離的對(duì)白葉枯病產(chǎn)生抗性的基因Xa3/Xa26-2，它的編碼序列如序列表SEQ IDNO 1 中第 3284-6191 和 6295-6662 位所示。
3.權(quán)利要求1或2所述的基因在增加水稻對(duì)白葉枯病抗性中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及植物基因工程技術(shù)領(lǐng)域。具體涉及包含藥用野生稻抗白葉枯病主效基因Xa3/Xa26-2的DNA片段的分離克隆和功能驗(yàn)證。Xa3/Xa26-2基因編碼富亮氨酸蛋白激酶類蛋白質(zhì)。它能夠賦予水稻抵抗由細(xì)菌性病原菌-白葉枯病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae)引起的病害。將該片段與其自身調(diào)控序列直接轉(zhuǎn)入水稻，攜帶Xa3/Xa26-2的轉(zhuǎn)基因水稻對(duì)白葉枯病的抵抗能力顯著增強(qiáng)。
文檔編號(hào)C12N15/29GK101892244SQ20101012593
公開(kāi)日2010年11月24日 申請(qǐng)日期2010年3月17日 優(yōu)先權(quán)日2010年3月17日
發(fā)明者李弘婧, 王石平 申請(qǐng)人:華中農(nóng)業(yè)大學(xué)