專(zhuān)利名稱(chēng)：穩(wěn)定的幾丁質(zhì)酶及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)酶制劑制備加工領(lǐng)域，特別涉及一種穩(wěn)定的幾丁質(zhì)酶及其制 備方法。
背景技術(shù)：
近年來(lái)的研究結(jié)果表明，幾丁質(zhì)酶在作物抗真菌病害、人類(lèi)治療真菌病、幾丁質(zhì)深 加工等領(lǐng)域有著良好的應(yīng)用前景。然而，幾丁質(zhì)酶在分離、純化及在保存過(guò)程中極易受PH、 溫度、重金屬離子、氧等因素的影響，導(dǎo)致活性降低，從而縮短使用壽命。如何減少酶活損 失，延長(zhǎng)酶的作用時(shí)間成為幾丁質(zhì)酶應(yīng)用研究必須解決的首要問(wèn)題，這一問(wèn)題成為制約幾 丁質(zhì)酶在果蔬采后病害防治領(lǐng)域的深入研究和應(yīng)用的瓶頸。磁性載體的酶固定化已成為酶工程研究的重點(diǎn)和熱點(diǎn)之一。磁性高分子微球表面 可具有各種功能性的基團(tuán)，用于共價(jià)結(jié)合目標(biāo)蛋白酶，改善其穩(wěn)定性，擴(kuò)大其使用范圍等。 此外，利用磁場(chǎng)，可以方便地分離回收磁性高分子微球修飾過(guò)的生物活性物質(zhì)，可供多次使 用。目前，關(guān)于幾丁質(zhì)酶的磁性功能載體固定化的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究將重組的幾丁質(zhì) 酶固定在功能化的磁性載體上，不但能夠加快酶的分離、純化過(guò)程，還可提高酶的穩(wěn)定性， 這能夠在一定程度上減少酶活損失，延長(zhǎng)酶的使用時(shí)間，為重組幾丁質(zhì)酶的產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用奠 定基石出。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種穩(wěn)定的幾丁質(zhì)酶及其制備方法，即功能 化磁性載體固定幾丁質(zhì)酶的制備方法。是一種用固體材料將酶束縛或限制于一定區(qū)域內(nèi)， 仍能進(jìn)行其特有的催化反應(yīng)，并可回收及重復(fù)使用的技術(shù)。本發(fā)明的技術(shù)方案是一種穩(wěn)定的幾丁質(zhì)酶，其特征在于所述的幾丁質(zhì)酶是被固定在帶有功能性基團(tuán) 的固定化磁性載體上。所述的磁性載體是指鐵氧體磁性載體。所述的鐵氧體磁性載體是指Fe304磁性微粒載體。所述的Fe304磁性微粒是指粒徑小于80nm的微粒。所述的功能性基團(tuán)是指醛基、環(huán)氧基、氯甲基、甲苯磺?；?、羥基、氨基、羧基、巰基 中的任意一種或幾種。上述穩(wěn)定的幾丁質(zhì)酶的制備方法，其特征在于包括如下步驟(1)制備磁性載體微粒采用高分子包埋法、單體聚合法、原位法或共沉淀法制備 磁性載體微粒；(2)磁性微粒的功能化采用帶有功能基團(tuán)的單體對(duì)磁性載體微粒進(jìn)行功能化；(3)磁性載體功能基團(tuán)的預(yù)活化對(duì)功能化的磁性載體微粒的功能基團(tuán)進(jìn)行預(yù)先 活化；
(4)幾丁質(zhì)酶的固定化以幾丁質(zhì)酶的不同結(jié)合區(qū)作為結(jié)合位點(diǎn)，將幾丁質(zhì)酶固 定在預(yù)先活化了的功能化磁性載體微粒上。穩(wěn)定的幾丁質(zhì)酶的制備方法，其特征在于(1)制備Fe304磁性載體微粒采用高分子包埋法、單體聚合法、原位法或共沉淀法 制備Fe304磁性載體微粒；(2)Fe304磁性微粒的功能化采用帶有功能基團(tuán)的單體對(duì)磁性載體微粒進(jìn)行功能 化，所述的功能性基團(tuán)單體為醛基、環(huán)氧基、氯甲基、甲苯磺?；?、羥基、氨基、羧基、巰基中 的任意一種或幾種；(3)Fe304磁性載體功能基團(tuán)的預(yù)活化對(duì)功能化的磁性載體微粒的功能基團(tuán)進(jìn)行 預(yù)先活化，其中功能基團(tuán)的預(yù)先活化的方法為溴化氰法、戊二醛法、碳二亞胺法中的任意一 種或幾種；(4)幾丁質(zhì)酶的固定化以幾丁質(zhì)酶的不同結(jié)合區(qū)作為結(jié)合位點(diǎn)，將幾丁質(zhì)酶固 定在預(yù)先活化了的功能化Fe304磁性載體微粒上，其中所述的幾丁質(zhì)酶的不同結(jié)合區(qū)是指 不同氨基酸殘基上的巰基、C-端羧基或N-端氨基。本發(fā)明效果是磁性高分子微球表面具有的各種功能性的基團(tuán)，用于共價(jià)結(jié)合目標(biāo)蛋白酶，改善 其穩(wěn)定性，擴(kuò)大其使用范圍等。此外，利用磁場(chǎng)，可以方便地分離回收磁性高分子微球修飾 過(guò)的生物活性物質(zhì)，可供多次使用。將重組的幾丁質(zhì)酶固定在功能化的磁性載體上，能夠加 快酶的分離、純化過(guò)程，還可提高酶的穩(wěn)定性，能夠在一定程度上減少酶活損失，延長(zhǎng)酶的 使用時(shí)間，為重組幾丁質(zhì)酶的產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。功能化磁性載體固定幾丁質(zhì)酶技術(shù)，將為幾丁質(zhì)酶產(chǎn)業(yè)化開(kāi)辟一條更為切實(shí)可行 的新途徑，必將促進(jìn)幾丁質(zhì)及幾丁質(zhì)酶工產(chǎn)業(yè)技術(shù)革新和發(fā)展。


圖1是4°C條件下固定化重組幾丁質(zhì)酶的貯藏穩(wěn)定性圖表圖2是固定化重組幾丁質(zhì)酶重復(fù)利用性圖表
具體實(shí)施例方式本發(fā)明采用功能化磁性載體對(duì)幾丁質(zhì)酶進(jìn)行固定化，具體方法為采用化學(xué)共沉 淀法制備Fe304磁性微粒。然后采用帶有功能基團(tuán)的單體對(duì)磁性微粒進(jìn)行功能化，制備出酶 固定化載體。以重組幾丁質(zhì)酶的結(jié)合區(qū)(CBD)中不同氨基酸殘基上的巰基、C端的羧基或N 端的氨基作為結(jié)合位點(diǎn)，對(duì)重組幾丁質(zhì)酶進(jìn)行固定化。功能化磁性載體固定幾丁質(zhì)酶技術(shù)， 將為幾丁質(zhì)酶產(chǎn)業(yè)化開(kāi)辟一條更為切實(shí)可行的新途徑，必將促進(jìn)幾丁質(zhì)及幾丁質(zhì)酶工產(chǎn)業(yè) 技術(shù)革新和發(fā)展。功能化磁性載體以鐵氧體為核。鐵氧體主要指四氧化三鐵(Fe403)。鐵氧體為納 米級(jí)鐵氧體，粒徑小于80nm。磁性微粒功能化制備方法包括高分子包埋法、單體聚合法、原位法、共沉淀法等。其中引入的基團(tuán)包括醛基、環(huán)氧基、氯甲基、甲苯磺酰、羥基、氨基、羧基、巰基等。功能基團(tuán)預(yù)先活化的方法包括溴化氰法、戊二醛法、碳二亞胺法等。
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實(shí)例1 以Fe3O4的磁性微球?yàn)榇藕耍捎铆h(huán)氧基化和氨基化修飾的兩種磁性高分子微球(A-type和P-type)，作為酶固定化載體，對(duì)重組幾丁質(zhì)酶進(jìn)行固定化研究。結(jié)果表 明P-type單位蛋白載量、純化倍數(shù)均高于A-type，分別為1689. 7436mg/g、6. 8013 ；4°C環(huán) 境中貯藏10d，P-type固定的重組幾丁質(zhì)酶剩余酶活力為69. 66% ；重復(fù)利用7次后，剩余 酶活力在44%以上。
權(quán)利要求
一種穩(wěn)定的幾丁質(zhì)酶，其特征在于所述的幾丁質(zhì)酶是被固定在帶有功能性基團(tuán)的固定化磁性載體上。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的穩(wěn)定的幾丁質(zhì)酶，其特征在于所述的磁性載體是指鐵氧體 磁性載體。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的穩(wěn)定的幾丁質(zhì)酶，其特征在于所述的鐵氧體磁性載體是指 Fe3O4磁性微粒載體。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的穩(wěn)定的幾丁質(zhì)酶，其特征在于所述的Fe3O4磁性微粒是指粒 徑小于80nm的微粒。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的穩(wěn)定的幾丁質(zhì)酶，其特征在于所述的功能性基團(tuán)是指醛基、 環(huán)氧基、氯甲基、甲苯磺?；⒘u基、氨基、羧基、巰基中的任意一種或幾種。
6.根據(jù)權(quán)利要求1、2、3、4或5所述的穩(wěn)定的幾丁質(zhì)酶的制備方法，其特征在于包括 如下步驟(1)制備磁性載體微粒采用高分子包埋法、單體聚合法、原位法或共沉淀法制備磁性 載體微粒；(2)磁性微粒的功能化采用帶有功能基團(tuán)的單體對(duì)磁性載體微粒進(jìn)行功能化；(3)磁性載體功能基團(tuán)的預(yù)活化對(duì)功能化的磁性載體微粒的功能基團(tuán)進(jìn)行預(yù)先活化；(4)幾丁質(zhì)酶的固定化以幾丁質(zhì)酶的不同結(jié)合區(qū)作為結(jié)合位點(diǎn)，將幾丁質(zhì)酶固定在 預(yù)先活化了的功能化磁性載體微粒上。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的穩(wěn)定的幾丁質(zhì)酶的制備方法，其特征在于(1)制備Fe3O4磁性載體微粒采用高分子包埋法、單體聚合法、原位法或共沉淀法制備 Fe3O4磁性載體微粒；(2)Fe3O4磁性微粒的功能化采用帶有功能基團(tuán)的單體對(duì)磁性載體微粒進(jìn)行功能化， 所述的功能性基團(tuán)單體為醛基、環(huán)氧基、氯甲基、甲苯磺?；⒘u基、氨基、羧基、巰基中的任 意一種或幾種；(3)Fe3O4磁性載體功能基團(tuán)的預(yù)活化對(duì)功能化的磁性載體微粒的功能基團(tuán)進(jìn)行預(yù)先 活化，其中功能基團(tuán)的預(yù)先活化的方法為溴化氰法、戊二醛法、碳二亞胺法中的任意一種或 幾種；(4)幾丁質(zhì)酶的固定化以幾丁質(zhì)酶的不同結(jié)合區(qū)作為結(jié)合位點(diǎn)，將幾丁質(zhì)酶固定在 預(yù)先活化了的功能化Fe3O4磁性載體微粒上，其中所述的幾丁質(zhì)酶的不同結(jié)合區(qū)是指不同氨基酸殘基上的巰基、C-端羧基或N-端氨基。
全文摘要
一種穩(wěn)定的幾丁質(zhì)酶及功能化磁性載體固定幾丁質(zhì)酶的制備方法，采用功能化磁性載體對(duì)幾丁質(zhì)酶進(jìn)行固定化，功能化磁性載體以鐵氧體為核；制備Fe3O4磁性微粒；然后采用帶有功能基團(tuán)的單體對(duì)磁性微粒進(jìn)行功能化，制備出酶固定化載體；以重組幾丁質(zhì)酶的結(jié)合區(qū)不同基團(tuán)作為結(jié)合位點(diǎn)，先進(jìn)行功能基團(tuán)預(yù)先活化，再對(duì)重組幾丁質(zhì)酶進(jìn)行固定化。磁性高分子微球表面的各種功能性基團(tuán)，可共價(jià)結(jié)合目標(biāo)蛋白酶，改善穩(wěn)定性，擴(kuò)大使用范圍。利用磁場(chǎng)可以方便地分離回收磁性高分子微球修飾過(guò)的生物活性物質(zhì)，可供多次使用。將重組的幾丁質(zhì)酶固定在功能化的磁性載體上，能夠加快酶的分離、純化過(guò)程，提高酶的穩(wěn)定性，減少酶活損失，延長(zhǎng)酶的使用時(shí)間。
文檔編號(hào)C12N11/14GK101805729SQ20101012693
公開(kāi)日2010年8月18日 申請(qǐng)日期2010年3月18日 優(yōu)先權(quán)日2010年3月18日
發(fā)明者關(guān)文強(qiáng), 封麗, 李昆侖, 賈凝, 閻瑞香 申請(qǐng)人:國(guó)家農(nóng)產(chǎn)品保鮮工程技術(shù)研究中心(天津)