專利名稱：一種快速檢測馬立克氏病抗性雞個(gè)體的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬生物學(xué)領(lǐng)域，具體是一種快速檢測馬立克氏病抗性雞個(gè)體的方法。
背景技術(shù)：
過去選定馬立克氏病(MD)抗病品系主要用攻毒幸存者的繁殖或/和后裔測定。例 如Cornell 1968年使用此方法進(jìn)行多代選擇，在第4代獲得了用于科學(xué)研究的康乃爾馬立 克氏病抗病系和易感系。方法雖然簡單，但需要專門的攻毒環(huán)境，基礎(chǔ)群數(shù)量大，以及繁瑣 的后裔測定，因此育種成本高。

發(fā)明內(nèi)容
為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足本發(fā)明提供一種快速檢測馬立克氏病抗性雞個(gè)體的方法。本發(fā)明解決上述技術(shù)問題的技術(shù)方案如下一種快速檢測馬立克氏病抗性雞個(gè)體的方法，建立和利用快速鑒定馬立克氏病 (MD)抗性/易感單倍體的半巢式PCR(snPCR)法，可以簡單、快速、方便地鑒定MD抗性/易 感單倍體，進(jìn)而鑒定出MD抗性雞個(gè)體。該方法操作按以下步驟進(jìn)行1.樣品RNA的提取無菌翅靜脈采集雞血，分離雞外周血淋巴白細(xì)胞(PBLs)，按產(chǎn)品說明書方法使用 Trizol RNA抽提試劑盒提取上述組織的總RNA ；2. cDNA 的合成取RNA樣品14. 5 μ L，力口入25pm BF基因夕卜下游引物1 μ L，弓I物序列 為 5~-GGAAGCAGAATGAGATGTGAGAGG-3~，70 "C 5min,置于-20 "C 5min ；然后加入 5 μ L5 X RT-Buffer, 2 μ LlOmM dNTP，200U M-MLV 逆轉(zhuǎn)錄酶，25U Rnasin 并混勻，37°C 放置 lh，96°C作用5min，最終得25yL cDNA，保存于_20°C備用；3. snPCR第一輪擴(kuò)增BF基因可變剪接部分——外顯子7設(shè)計(jì)一對外引物外上游引物-GCAGGGAAGAAGGGGAAGGG-3“，外下游引物 -GGAAGCAGAATGAGATGTGAGAGG-3“，用于擴(kuò)增BF基因的第6外顯子、第7外顯子、第8外顯
子以及3、非翻譯區(qū)；T-UT的編碼外顯子，PCR反應(yīng)體系10 XPCR buffer 5 μ LUOmM dNTP 1 μ L、25pM上、下游引物各1 μ L、Taq酶1. 5U、cDNA模板5 μ L，滅菌三蒸水補(bǔ)足50 μ L，反應(yīng) 循環(huán)參數(shù)95°C預(yù)變性5min，35個(gè)循環(huán)95°C變性30sec、61°C退火30sec、72°C延伸45sec， 72°C后延伸lOmin，產(chǎn)物用2. 0%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果并拍照，擴(kuò)增結(jié) 果如僅有195bp片段的單倍體，初步定為抗性單倍體；擴(kuò)增結(jié)果如有195bp和162bp片段的 單倍體，初步定為易感單倍體；4. snPCR第一輪擴(kuò)增產(chǎn)物的克隆、序列測定對雞的PBLs第一輪snPCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行克隆、序列測定用1. 5%的瓊脂糖凝膠 分離PCR產(chǎn)物，切下目的帶并用試劑盒純化回收，純化產(chǎn)物與PMD18-T載體連接后轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細(xì)胞，提取質(zhì)粒DNA測序，所有目的帶測序結(jié)果應(yīng)為BF基因的相應(yīng)片斷；5. snPCR第二輪擴(kuò)增BF基因可變剪接部分——外顯子7設(shè)計(jì)一對內(nèi)引物內(nèi)上游引物-TACAACATTGCGCCCGGG-3"，內(nèi)下游引物 -GGAAGCAGAATGAGATGTGAGAGG-3"，內(nèi)上游引物序列為第6外顯子末端15個(gè)堿基和第8
外顯子前3個(gè)堿基，因此，它恰好只能結(jié)合前面提到的162bp片斷，而不能結(jié)合前面提到 的 195bp 片斷，PCR 反應(yīng)體系10XPCR buffer 5 μ LUOmM dNTP 1 μ L、25pM 上、下游引物 各1 μ L、Taq酶1. 5U、cDNA模板5 μ L，滅菌三蒸水補(bǔ)足50 μ L。反應(yīng)循環(huán)參數(shù)95°C預(yù)變性 5min，35 個(gè)循環(huán)95°C變性 30sec、52°C退火 30sec、72°C延伸 45sec，72°C后延伸 lOmin。產(chǎn) 物用2. 0%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果并拍照，擴(kuò)增結(jié)果為陽性，即有141bp 片段的單倍體，定為易感單倍體；擴(kuò)增結(jié)果為陰性，即無141bp片段的單倍體，定為抗性單 倍體，此個(gè)體即相應(yīng)地的為MD抗性雞。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)比較的有益效果是快速鑒定馬立克氏病(MD)抗性/易感單倍體的半巢式PCR(snPCR)法可以簡單、 快速、方便地鑒定MD抗性/易感單倍體，進(jìn)而鑒定MD抗性雞。通過建立的snPCR法的第一 次PCR擴(kuò)增雞外周血淋巴白細(xì)胞(PBLs)的BF基因，如有大小為195bp的目的帶，此目的帶 測序結(jié)果確認(rèn)為BF基因的相應(yīng)片斷，且snPCR法的第二次PCR檢測結(jié)果為陰性，那么此雞 單倍體為MD抗性BF單倍體，此雞相應(yīng)地的為MD抗性雞。


圖1是本發(fā)明snPCR擴(kuò)增BF基因外顯子7的示意圖。圖2是本發(fā)明第一輪PCR擴(kuò)增A5、B21, A11, C23、D12和D8PBLs BF基因可變剪接部 分——外顯子7的產(chǎn)物。圖中，M:DNA標(biāo)準(zhǔn)；1，3 分別為A5和B21的產(chǎn)物——195bp和162bp ；2，4，5，6 分 別為A11, C23，D12和D8的產(chǎn)物——195bp ；7 陰性對照。圖3是本發(fā)明第一輪PCR擴(kuò)增D12和AJ干臟、脾臟、心臟BF基因可變剪接部分—— 外顯子7的產(chǎn)物。圖中，M :DNA標(biāo)準(zhǔn)；1，2，3 分別為D12肝臟、脾臟和心臟的產(chǎn)物——195bp ；4，5，6 分別為A5肝臟、脾臟和心臟的產(chǎn)物——195bp和162bp。圖4是本發(fā)明第一輪擴(kuò)增霞煙雞A5和D12PBLs中的BF基因外顯子7PCR產(chǎn)物的核 苷酸序列。注加下劃線的核苷酸序列為外引物序列，33個(gè)連續(xù)星號*表示可變外顯子7全 部的33個(gè)被剪接掉的堿基.圖5是本發(fā)明第二輪PCR擴(kuò)增A5, B21，A11, C23，D12和D8PBLs BF基因可變剪接部 分——外顯子7的產(chǎn)物。圖中，M :DNA標(biāo)準(zhǔn)；1,3 分別為A5和B21的產(chǎn)物——141bp ；2，4，5，6 分別為A11, C23，D12和D8的產(chǎn)物；7 陰性對照。圖6是本發(fā)明第二輪PCR擴(kuò)增A5和D12內(nèi)臟BF基因可變剪接部分——外顯子7的產(chǎn)物。
圖中，M :DNA標(biāo)準(zhǔn)；1，2，3 分別為D12肝臟、脾臟和心臟的產(chǎn)物；4，5，6 分別為、肝 臟、脾臟和心臟的產(chǎn)物——141bp。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步描述。
一種快速檢測馬立克氏病抗性雞個(gè)體的方法，按以下步驟進(jìn)行1.樣品RNA的提取選取我們獲得的4羽MD抗性霞煙雞——A11，C23，D8和D12和2羽MD易感霞煙雞—— A5和B21的PBLs、肝臟、脾臟和心臟，按產(chǎn)品說明書方法使用TrizolRNA抽提試劑盒提取上 述組織、器官的總RNA。2. cDNA 的合成取RNA樣品14. 5 μ L，力卩入25pm BF基因外下游引物1 μ L，引物序列為 -GGAAGCAGAATGAGATGTGAGAGG-3~, 70 "C 5min,置于-20 "C 5min ；然后加入 5yL
5XRT-Buffer,2y L IOmM dNTP，200U M-MLV 逆轉(zhuǎn)錄酶，25U Rnasin 并混勻，37°C 放置 lh， 96°C作用5min，最終得25 μ L cDNA，保存于_20°C備用。3. snPCR第一輪擴(kuò)增BF基因可變剪接部分——外顯子7根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫中提供的BF基因的mRNA序列，設(shè)計(jì)一對外引物外上游引 物 -GCAGGGAAGAAGGGGAAGGG-3“，外下游引物 -GGAAGCAGAATGAGATGTGAGAGG-3“，用于擴(kuò) 增BF基因的第6外顯子、第7外顯子、第8外顯子以及3、非翻譯區(qū)3:UT的編碼外顯子， 見圖1，預(yù)計(jì)擴(kuò)增片段約為195bp和162bp，引物合成由大連寶生物有限公司完成。PCR 反應(yīng)體系10XPCR buffer 5 μ LUOmM dNTP 1 μ L、25pM 上、下游引物各 1 μ L、Taq酶1. 5U、cDNA模板5 μ L，滅菌三蒸水補(bǔ)足50 μ L。反應(yīng)循環(huán)參數(shù)95°C預(yù)變性 5min，35 個(gè)循環(huán)95°C變性 30sec、61°C退火 30sec、72°C延伸 45sec，72°C后延伸 lOmin。產(chǎn) 物用2. 0%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果并拍照。4. snPCR第一輪擴(kuò)增產(chǎn)物的克隆、序列測定對MD抗性霞煙雞D12和MD易感霞煙雞A5的PBLs第一輪snPCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行克 隆、序列測定。用1. 5%的瓊脂糖凝膠分離PCR產(chǎn)物，切下目的帶并用試劑盒純化回收，純化 產(chǎn)物與pMDlS-T載體連接后轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細(xì)胞，提取質(zhì)粒測序，測序反應(yīng)由 上海生工生物工程有限公司完成。5. snPCR第二輪擴(kuò)增BF基因可變剪接部分——外顯子7根據(jù)snPCR第一輪擴(kuò)增產(chǎn)物的測序結(jié)果，見圖4，以及GenBank中的同源序列，設(shè)計(jì) 一條內(nèi)引物內(nèi)上游引物5—-TACAACATTGCGCCCGGG-3—，內(nèi)下游引物與外下游引物相同。內(nèi) 上游引物序列為第6外顯子末端15個(gè)堿基和第8外顯子前3個(gè)堿基，見圖4，它恰好只能結(jié) 合162bp片斷，而不能結(jié)合195bp片斷，預(yù)計(jì)擴(kuò)增片段約為141bp，引物合成由大連寶生物有 限公司完成。PCR 反應(yīng)體系10XPCR buffer 5 μ LUOmM dNTP 1 μ L、25pM 上、下游引物各 1 μ L、Taq酶1. 5U、cDNA模板5 μ L，滅菌三蒸水補(bǔ)足50 μ L。反應(yīng)循環(huán)參數(shù)95°C預(yù)變性 5min，35 個(gè)循環(huán)95°C變性 30sec、52°C退火 30sec、72°C延伸 45sec，72°C后延伸 lOmin。產(chǎn) 物用2. 0%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果并拍照。
6. snPCR第二輪擴(kuò)增產(chǎn)物的克隆、序列測定對MD易感霞煙雞A5的PBLs第二輪snPCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行克隆、序列測定。用1. 5% 的瓊脂糖凝膠分離PCR產(chǎn)物，切下目的帶并用試劑盒純化回收，純化產(chǎn)物與pMDlS-Τ載體連 接后轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細(xì)胞，提取質(zhì)粒DNA進(jìn)行測序，測序反應(yīng)由上海生工生物 工程有限公司完成。結(jié)果1. snPCR第一輪擴(kuò)增BF基因可變剪接部分——外顯子7MD易感霞煙雞A5和B21的PBLs cDNA樣品中都能擴(kuò)增到195bp和162bp兩個(gè)片 段，表明雞B復(fù)合體兩種BF mRNA中的一種有外顯子7缺失；MD抗性霞煙雞A11, C23，D12和 D8的PBLs cDNA樣品中只能擴(kuò)增到195bp的片段，表明兩種BF mRNA都無外顯子7缺失，見 圖2。結(jié)果IsnPCR第一輪擴(kuò)增BF基因可變剪接部分——外顯子7MD易感霞煙雞A5和B21的PBLs cDNA樣品中都能擴(kuò)增到195bp和162bp兩個(gè)片段，表明雞B復(fù)合體兩種BF mRNA中的一個(gè)有外顯子7缺失；MD抗性霞煙雞All，C23，D12 和D8的PBLs cDNA樣品中只能擴(kuò)增到195bp的片段，表明兩種BF mRNA都無外顯子7缺失， 見圖2。從MD易感霞煙雞A5的肝臟、脾臟、心臟cDNA樣品中都能擴(kuò)增到195bp和162bp的 片段，表明兩種BF mRNA中的一種有外顯子7缺失；而從MD抗性霞煙雞D12的肝臟、脾臟、心 臟cDNA樣品中都只能擴(kuò)增到195bp的片段，表明都無外顯子7缺失，見圖3。測序結(jié)果和同 源性比較表明，所擴(kuò)增片段均為BF基因片段。2. snPCR第一輪擴(kuò)增產(chǎn)物的序列測定結(jié)果測定的BF*D12基因的195bp片斷核甘酸序列GenBank登錄號為EU746446 ；測定的 BF*A5基因162bp片斷核甘酸序列GenBank登錄號為EU746447，它們的比對結(jié)果見圖4。3. snPCR第二輪擴(kuò)增BF基因可變剪接部分一一外顯子7MD易感霞煙雞A5和B21PBLs的cDNA第二輪PCR擴(kuò)增到141bp的片段；而MD抗性 霞煙雞A11, C23，D12和D8PBLs的cDNA第二輪PCR擴(kuò)增不到141bp的片段及其它片斷，見圖 5。MD易感霞煙雞A5的肝臟、脾臟、心臟cDNA第二輪PCR擴(kuò)增到141bp的片段；而從 MD抗性霞煙雞D12的肝臟、脾臟、心臟cDNA第二輪PCR擴(kuò)增不到141bp的片段及其它片斷， 見圖6。4. snPCR第二輪擴(kuò)增產(chǎn)物的序列測定結(jié)果測定BF*A5基因的141bp片斷核甘酸序列，測序結(jié)果和同源性比較表明，所擴(kuò)增片 段為BF基因片段1 TACAACATTG CGCCCGGGAG CAACCCCTCC ATCTGAGTGC TGTGCTTCAGCCTGCAAGGA 61 GCCAACAGTC CACACCAGCA TTTGGGGTCG GCGATGGACA CAGCCCCATCCTCTTGACCT 121 CTCACATCTC ATTCTGCTTC C快速鑒定MD抗性/易感單倍體的snPCR法可以簡單、快速、方便地鑒定MD抗性/ 易感單倍體，進(jìn)而鑒定雞的MD抗性/易感。但針對BF基因純種雞和雜種雞，鑒定的具體結(jié) 果不盡相同。對于BF基因純種的雞，如果通過我們建立的snPCR法檢測結(jié)果為陽性，即有一條141bp的目的帶，且目的帶測序結(jié)果確認(rèn)為BF基因的部分片斷，那么此雞單倍體為MD易 感BF單倍體，此雞相應(yīng)地為MD易感雞，如本發(fā)明的霞煙雞A5和B21 ；如果通過我們建立的 snPCR法檢測結(jié)果為陰性，即無141bp的目的帶，且第一次PCR有大小為195bp的目的帶，此 目的帶測序結(jié)果確認(rèn)為BF基因的部分片斷，那么此雞單倍體為MD抗性BF單倍體，此雞相 應(yīng)地的為MD抗性雞，如本研究的霞煙雞A11, C23，D12和D8。對于BF基因雜種的雞，如果通過我們建立的snPCR法檢測結(jié)果為陽性，那么此雞 一定有一條單倍體為MD易感BF單倍體，但無法確定另一條單倍體是BF抗性還是BF易感 單倍體，因而無法確定此雜種雞是MD抗性雞還是易感雞；如果通過我們建立的snPCR法檢 測結(jié)果為陰性，那么此雜種雞的兩條單倍體一定都是MD抗性BF單倍體，此雜種雞相應(yīng)地的 為MD抗性雞。綜上所述，不管是BF基因純種還是雜種雞，如果通過我們建立的snPCR法檢測結(jié) 果為陰性，那么此雞的兩條單倍體一定都是MD抗性BF單倍體，此雞相應(yīng)地的為MD抗性雞。 這將為方便、經(jīng)濟(jì)地鑒定MD抗性雞個(gè)體及培育雞MD抗性的核心種群提供非常有用的分子工具。
權(quán)利要求
一種快速檢測馬立克氏病抗性雞個(gè)體的方法，其特征在于，該方法操作按以下步驟進(jìn)行1)樣品RNA的提取無菌翅靜脈采集雞血，分離雞外周血淋巴白細(xì)胞(PBLs)，按產(chǎn)品說明書方法使用Trizol RNA抽提試劑盒提取上述組織的總RNA；2)cDNA的合成取RNA樣品14.5μL，加入25pm BF基因外下游引物1μL，引物序列為5`-GGAAGCAGAATGAGATGTGAGAGG-3`，70℃5min，置于-20℃5min；然后加入5μL 5×RT-Buffer，2μL 10mM dNTP，200U M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶，25U Rnasin并混勻，37℃放置1h，96℃作用5min，最終得25μL cDNA，保存于-20℃?zhèn)溆茫?)snPCR第一輪擴(kuò)增BF基因可變剪接部分——外顯子7設(shè)計(jì)一對外引物外上游引物5`-GCAGGGAAGAAGGGGAAGGG-3`，外下游引物5`-GGAAGCAGAATGAGATGTGAGAGG-3`，用于擴(kuò)增BF基因的第6外顯子、第7外顯子、第8外顯子以及3`非翻譯區(qū)3`-UT的編碼外顯子，PCR反應(yīng)體系10×PCR buffer 5μL、10mM dNTP 1μL、25pM上、下游引物各1μL、Taq酶1.5U、cDNA模板5μL，滅菌三蒸水補(bǔ)足50μL，反應(yīng)循環(huán)參數(shù)95℃預(yù)變性5min，35個(gè)循環(huán)95℃變性30sec、61℃退火30sec、72℃延伸45sec，72℃后延伸10min，產(chǎn)物用2.0％瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果并拍照，擴(kuò)增結(jié)果如僅有195bp片段的單倍體，初步定為抗性單倍體；擴(kuò)增結(jié)果如有195bp和162bp片段的單倍體，初步定為易感單倍體；4)snPCR第一輪擴(kuò)增產(chǎn)物的克隆、序列測定對雞的PBLs第一輪snPCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行克隆、序列測定用1.5％的瓊脂糖凝膠分離PCR產(chǎn)物，切下目的帶并用試劑盒純化回收，純化產(chǎn)物與pMD18-T載體連接后轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，提取質(zhì)粒DNA測序，所有目的帶測序結(jié)果應(yīng)為BF基因的相應(yīng)片斷；5)snPCR第二輪擴(kuò)增BF基因可變剪接部分——外顯子7設(shè)計(jì)一對內(nèi)引物內(nèi)上游引物5`-TACAACATTGCGCCCGGG-3`，內(nèi)下游引物5`-GGAAGCAGAATGAGATGTGAGAGG-3`，內(nèi)上游引物序列為第6外顯子末端15個(gè)堿基和第8外顯子前3個(gè)堿基，因此，它恰好只能結(jié)合前面提到的162bp片斷，而不能結(jié)合前面提到的195bp片斷，PCR反應(yīng)體系10×PCR buffer 5μL、10mM dNTP 1μL、25pM上、下游引物各1μL、Taq酶1.5U、cDNA模板5μL，滅菌三蒸水補(bǔ)足50μL。反應(yīng)循環(huán)參數(shù)95℃預(yù)變性5min，35個(gè)循環(huán)95℃變性30sec、52℃退火30sec、72℃延伸45sec，72℃后延伸10min。產(chǎn)物用2.0％瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果并拍照，擴(kuò)增結(jié)果為陽性，即有141bp片段的單倍體，定為易感單倍體；擴(kuò)增結(jié)果為陰性，即無141bp片段的單倍體，定為抗性單倍體，此個(gè)體即相應(yīng)地的為MD抗性雞。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種快速檢測馬立克氏病抗性雞個(gè)體的方法。該方法操作按以下步驟進(jìn)行1)樣品RNA的提取，2)cDNA的合成，3)snPCR第一輪擴(kuò)增BF基因可變剪接部分——外顯子7，4)snPCR第一輪擴(kuò)增產(chǎn)物的克隆、序列測定，5)snPCR第二輪擴(kuò)增BF基因可變剪接部分——外顯子7。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)比較的有益效果是建立和利用快速鑒定馬立克氏病(MD)抗性/易感單倍體的半巢式PCR(snPCR)法，可以簡單、快速、方便地鑒定MD抗性/易感單倍體，進(jìn)而鑒定出MD抗性雞個(gè)體。
文檔編號C12Q1/68GK101838695SQ201010127859
公開日2010年9月22日 申請日期2010年3月19日 優(yōu)先權(quán)日2010年3月19日
發(fā)明者李婭, 趙子軼, 金元昌, 韋信賢, 韋平 申請人:廣西大學(xué)