專利名稱：一種用于預(yù)防和治療腫瘤的疫苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于疫苗及其制備，特別是指一種用于預(yù)防和治療腫瘤的疫苗及其制備。
背景技術(shù)：
腫瘤是嚴(yán)重威脅人類健康的頭號殺手，根據(jù)WHO報告，目前全球每年新發(fā)癌癥病 人約1000萬，死亡660萬，預(yù)計未來25年內(nèi)將有3億新病例，1億死于該病。我國每年新發(fā) 病例160萬至200萬，現(xiàn)有癌癥病人300多萬人，并以3%的速度遞增且呈年輕化趨勢。手 術(shù)、放療和化療是治療惡性腫瘤的三大傳統(tǒng)方法，由于惡性腫瘤的生物學(xué)特性，使上述治療 方法都存在一定的局限性，隨著免疫學(xué)、分子生物學(xué)與基因工程技術(shù)的發(fā)展，以免疫治療為 代表的生物治療己成為繼手術(shù)、化療和放療后的第四種腫瘤治療模式。腫瘤抗原被宿主免 疫系統(tǒng)的效應(yīng)細(xì)胞和效應(yīng)分子識別，是進(jìn)行免疫治療的基礎(chǔ)，伴隨人類腫瘤抗原的不斷揭 示，治療性腫瘤疫苗成為生物治療的熱點(diǎn)課題之一。體液免疫的作用是中和胞外抗原，而腫瘤抗原多是胞內(nèi)蛋白，因此腫瘤疫苗的設(shè) 計應(yīng)以誘導(dǎo)細(xì)胞免疫為主。腫瘤細(xì)胞一般不表達(dá)MHC-II類分子，所以腫瘤免疫中T細(xì)胞作 用的研究主要集中在CD8+細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)上，許多研究表明CTL在識別和清除 腫瘤細(xì)胞中發(fā)揮著重要的作用，過繼轉(zhuǎn)移腫瘤特異性CTL或用MHC-I限制的肽疫苗免疫小 鼠，均可有效抑制腫瘤；抗原刺激的DC(樹突狀細(xì)胞)疫苗在腫瘤治療中也具有巨大潛力； 然而當(dāng)這些治療措施進(jìn)行臨床試驗時，盡管也產(chǎn)生了 CTL，但療效極不明顯。造成腫瘤疫苗 臨床試驗失敗的原因是多方面的。在缺乏⑶4+T細(xì)胞的情況下，CTL抗腫瘤效應(yīng)微弱而且短暫，這一現(xiàn)象使人們逐漸 認(rèn)識到CD4+T細(xì)胞對于CD8+CTL細(xì)胞反應(yīng)的重要性。越來越多的證據(jù)表明，CD4+T細(xì)胞不僅 可直接抑制腫瘤，而且在激活CTL以及產(chǎn)生和維持長期記憶性CD8+T細(xì)胞方面發(fā)揮著中心 作用。⑶4+T細(xì)胞對于⑶8+T細(xì)胞的激活以及記憶細(xì)胞的產(chǎn)生和維持是必需的。給黑色素 瘤患者過繼轉(zhuǎn)移包括⑶8+和⑶4+T細(xì)胞的同源腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞(TIL)，可以觀察到顯著 的臨床應(yīng)答，并且轉(zhuǎn)移的T細(xì)胞保持長期活性(2年)。相反，僅過繼轉(zhuǎn)移腫瘤反應(yīng)性CD8+T 細(xì)胞克隆，則觀察不到臨床應(yīng)答，而且兩周后在外周血中就已經(jīng)檢測不到這些細(xì)胞了。這種 輔助作用的機(jī)制為(1)抗原提呈細(xì)胞(APC)表面的主要組織相容性抗原MHC-II提呈適當(dāng)抗原給 ⑶4+T細(xì)胞，并激活⑶4+T細(xì)胞，導(dǎo)致⑶40L的表達(dá)，與APC表面的⑶40結(jié)合，從而被激活的 APC表達(dá)共刺激分子(如B7)，這些被激活的APC進(jìn)一步通過B7-⑶28共刺激而激活⑶8+T 細(xì)胞。(2)⑶4+T細(xì)胞通過TRAIL依賴的機(jī)制控制記憶性⑶8+T細(xì)胞的產(chǎn)生。在缺乏 CD4+T細(xì)胞輔助下激活的CD8+T細(xì)胞會上調(diào)TRAIL，并且在再次遇到抗原時激活誘導(dǎo)細(xì)胞死 亡(Al⑶)，而那些在⑶4+T細(xì)胞輔助下激活的⑶8+T細(xì)胞不會上調(diào)TRAIL，當(dāng)再次遇到抗原 時就會產(chǎn)生大量的克隆擴(kuò)增。既然已經(jīng)證明⑶4+T細(xì)胞在臨床上的確是有用的，那么非特異性輔助(如乙肝核心抗原是最有效的CTL應(yīng)答促進(jìn)劑)還是蛋白特異性T細(xì)胞輔助(來自于同一個蛋白的 CD4+T細(xì)胞表位)更有效呢？研究表明后者是最有效的。幾個研究證實(shí)最有效的CTL產(chǎn) 生需要⑶4+T細(xì)胞和⑶8+T細(xì)胞識別同一個APC上的抗原。綜上所述一個抗原中同時含有可以激活⑶4+T和⑶8+T細(xì)胞的表位是腫瘤疫苗 的理想策略(即⑶4+T細(xì)胞表位和⑶8+T細(xì)胞表位串聯(lián)連接在一起)。腫瘤是由不同病理表現(xiàn)及生物學(xué)行為的細(xì)胞亞群構(gòu)成的，不同個體的同一類腫瘤 及同一腫瘤在不同器官或不同分化階段往往表達(dá)不同的相關(guān)抗原；含單一抗原的腫瘤疫苗 所誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答是高度特異性的，而它針對的靶標(biāo)是高度異質(zhì)性和變化性的，這是單一 肽疫苗僅能在個別腫瘤患者中產(chǎn)生臨床效果的主要原因之一，解決這一問題方法主要有兩 個，一是使用含多個抗原肽的疫苗，二是使用通用腫瘤抗原(或廣譜腫瘤抗原)，即無論哪 類腫瘤、無論在什么器官、也無論是什么分化階段的腫瘤均表達(dá)這種腫瘤抗原，而正常細(xì)胞 幾乎不表達(dá)。無疑后者是最理想的，目前絕對符合該條件的腫瘤抗原還未找到，但已經(jīng)發(fā)現(xiàn) 幾個可以在絕大部分腫瘤中表達(dá)的抗原，如(人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶)hTERT、Survivin等等。hTERT是端粒酶的催化亞單位，在90%以上的腫瘤中過表達(dá)，且與腫瘤的惡性程 度密切相關(guān)，而正常的人類細(xì)胞，除造血干細(xì)胞、激活的B細(xì)胞等分裂旺盛的細(xì)胞表達(dá)端粒 酶外，絕大多數(shù)無端粒酶活性，也不表達(dá)hTERT，這使得hTERT成為一種廣譜的腫瘤相關(guān)抗 原，是一個腫瘤免疫治療的重要靶點(diǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種含多個抗原肽的用于預(yù)防和治療腫瘤的疫苗及其制 備方法。當(dāng)用肽meTERT和/或真核表達(dá)重組質(zhì)粒免疫機(jī)體后，肽meTERT會被抗原提呈細(xì) 胞攝取，并被切割成上述的7個表位肽片段，然后分別提呈給7種T細(xì)胞克隆，特異性地激 活表位特異性的CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞；而真核表達(dá)重組質(zhì)粒被細(xì)胞攝取后，首先在細(xì)胞 中表達(dá)成肽meTERT，然后再被切割成上述的7個表位肽片段，分別提呈給7種T細(xì)胞克隆， 特異性地激活表位特異性的⑶4+T細(xì)胞和⑶8+T細(xì)胞；在⑶4+T細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子的輔 助下，CD8+CTL可以特異性殺死表達(dá)hTERT的腫瘤細(xì)胞，從而起到預(yù)防和治療作用。即在體 內(nèi)最終真正發(fā)揮免疫激活作用的實(shí)質(zhì)上是每一個獨(dú)立的表位肽，將它們串聯(lián)起來的目的是 為了使hTERT特異性(因為這些表位肽來源于抗原蛋白hTERT)的⑶4+T細(xì)胞和⑶8+T細(xì) 胞能夠同時被有效激活，通過這兩種細(xì)胞的相互作用，從而發(fā)揮更好的殺傷作用。因此，理 論上這7個肽無論以何種順序串聯(lián)連接不會影響其在體內(nèi)對T細(xì)胞的激活作用。表位的選擇查閱大量英文文獻(xiàn)，選擇目前已經(jīng)鑒定的并且有研究表明具有確切 的免疫原性的表位，另外，由于表位肽只有通過與抗原提呈細(xì)胞的MHC I或MHC II類分子 結(jié)合成復(fù)合物才能激活T細(xì)胞，所以表位的選擇同時考慮了兼顧大多數(shù)人群的MHC I或II 類分子的限制性。表位核苷酸序列的確定在Genbank中查到hTERT的全長氨基酸和核苷酸序列，通 過表位的氨基酸殘基序列和位置，在全長核苷酸序列中找到對應(yīng)的核苷酸序列以及表位序 列兩側(cè)各兩個氨基酸殘基對應(yīng)的核苷酸。表位序列的連接是共價連接，可以通過基因重組的方法實(shí)現(xiàn)。根據(jù)表位的核苷酸
10序列設(shè)計引物，使用重疊延伸PCR方法將各表位基因串聯(lián)連接成片段，經(jīng)一定的內(nèi)切酶切 害!]，與原核表達(dá)質(zhì)粒連接，轉(zhuǎn)化原核宿主細(xì)胞，表達(dá)復(fù)合表位肽；也可以與真核載體相連，直 接引入被免疫的機(jī)體，在體內(nèi)的細(xì)胞中表達(dá)復(fù)合表位肽。本發(fā)明的整體技術(shù)構(gòu)思是用于預(yù)防和治療腫瘤的疫苗，連接后的多表位端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶核苷酸序列如下gaggagatcctggccaagttcctgcactggctgatgagtaccttgacagacctccagccgtacatgcga cagttcgtggctcacctgctgcgtttggtggatgatttcttgttggtgacacctccggtgtacgccgagaccaagca cttcctctactcctggcaggtgtacggcttcgtgcgggcctgcctgcgccggaaactctttggggtcttgcggctga agtgtcaccgccccggcctcctgggcgcctctgtgctgggcctggacgatatc0用于預(yù)防和治療腫瘤的疫苗的制備，制備方法包括如下工藝步驟A、表位序列的選擇；B、多表位端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶的核苷酸的串聯(lián)連接；C、多表位端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶DNA疫苗的制備；D、多表位端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶多表位肽疫苗的制備。本發(fā)明的具體的技術(shù)解決方案還有所述的步驟A表位的選擇中包括如下特異性表位1540ILAKFLHWL ；
R865RLVDDFLLV ；
K973KLFGVLRLK ；
V324VYAETKHFL ；
V461VYGFVRACL ；
R672RPGLLGASVLGLDDI
L766LTDLQPYMRQFVAHL。步驟B是設(shè)計8條首尾互補(bǔ)的引物，經(jīng)過4輪PCR反應(yīng)，得到編碼多表位肽的DNA 片段，即多表位端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶基因。步驟B包括如下工藝步驟Bi、第一步擴(kuò)增體系為10XPCR緩沖液2微升，2. 5毫摩爾的dNTP2微升，10微摩 爾合成引物RT1、FTl各1微升，5單位/微升Taq DNA聚合酶1微升，加去離子水至20微 升；PCR反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性1分鐘；94°C變性30秒，58°C退火30秒、72°C延伸30秒， 擴(kuò)增5個循環(huán)；72°C繼續(xù)延伸1分鐘；B2、隨后三步擴(kuò)增均以上一步PCR產(chǎn)物稀釋50倍作為模板進(jìn)行；擴(kuò)增體系同步驟 A，只是引物第二步PCR選用RT2和FT2，第三步選用RT3和FT3 ；PCR反應(yīng)條件為94°C預(yù)變 性1分鐘；94°C變性30秒，55 °C退火30秒、72 °C延伸30秒，擴(kuò)增30個循環(huán)；72 °C繼續(xù)延伸 5分鐘；第四次PCR擴(kuò)增后所得目的基因即為多表位端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶meTERT ；1. 2%瓊脂糖 凝膠電泳分析聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)產(chǎn)物；合成的首尾重疊的引物如下5，一3’FT4 GCGGGATCCGCCACCATGAGCGAGGAGATCCTGGCCAAGTTCCTGCACTGG ；FT3 CAAGTTCCTGCACTGGCTGATGAGTACCTTGACAGACCTCCAGCCGTACATGC ；FT2 CTCCAGCCGTACATGCGACAGTTCGTGGCTCACCTGCTGCGTTTGGTGGATGA ；
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FTl TGCGTTTGGTGGATGATTTCTTGTTGGTGACACCTCCGGTGTACGCCGAGACC ；RTl CGAAGCCGTACACCTGCCAGGAGTAGAGGAAGTGCTTGGTCTCGGCGTACACC ；RT2 AAGACCCCAAAGAGTTTCCGGCGCAGGCAGGCCCGCACGAAGCCGTACACCTG ；RT3 GGCGCCCAGGAGGCCGGGGCGGTGACACTTCAGCCGCAAGACCCCAAAGAGTT ；RT4 ATAGCGGCCGCGATATCGTCCAGGCCCAGCACAGAGGCGCCCAGGAGGCCG。步驟C是將PCR產(chǎn)物分別用BamH I.Not I雙酶切，連接到雙酶切的pcDNA3. 1⑴ V5His表達(dá)載體中，得重組質(zhì)粒pcDNA3. 1 (+) V5His_meTERT ；對構(gòu)建的載體分別進(jìn)行PCR、酶 切和DNA測序鑒定；以構(gòu)建的pcDNA3. 1 (+) V5His-meTERT質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR，經(jīng)瓊脂糖凝 膠電泳，在200-500bp之間出現(xiàn)目的條帶，結(jié)果與預(yù)期一致；pcDNA3. 1 (+) V5His_meTERT經(jīng) 內(nèi)切酶BamH I和Not I雙酶切，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，出現(xiàn)大小兩個片段，分別為質(zhì)粒和插入 的目的片段；經(jīng)測序鑒定，結(jié)果均表明該質(zhì)粒的插入序列正確。步驟C包括如下工藝步驟
Cl、PCR回收產(chǎn)物及PCDNA3. 1 (+)V5His質(zhì)粒的酶切
取pcDNA3. l(+)V5His質(zhì)粒10μ 1，用BamHI和EcoRI進(jìn)行雙酶切，酶切體系由如下體積的組份組成
pcDNA3. l(+)V5His 質(zhì)粒10 μ 1
BamHI1 μ 1
Not I1 μ 1
IOXK Buffer2μ 1
無菌水6 μ 1
將PCR回收產(chǎn)物15μ 1，用BamHI和Not I進(jìn)行雙酶切，酶切體系由如下體積的組份組成
PCR產(chǎn)物15μ 1
BamHI1 μ 1
Not I1 μ 1
IOXK Buffer 2μ 1
無菌水 1 μ 1
C2、DNA片段的純化回收
將酶切后的PCR片斷及pcDNA3. 1 (+)V5His載體電泳后切膠加入600微升的溶膠
液，50°C -60°C放置2分鐘；將融化后的溶液放入離心純化柱中，以13000轉(zhuǎn)/分鐘轉(zhuǎn)速離 心30秒，倒掉收集管中的廢液，加入500微升80%乙醇，以13000轉(zhuǎn)/分鐘轉(zhuǎn)速離心30秒， 倒掉收集管中的廢液；將純化柱套入干凈的1. 5毫升離心管中，加入30微升緩沖液，放置2 分鐘，離心30秒，-20°C保存；C3、DNA 的連接PCR產(chǎn)物及pcDNA3. 1⑴V5His酶切后經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，切膠回收目的片段后連 接，連接體系由如下體積的組份組成PCR回收產(chǎn)物7μ1pcDNA3. l(+)V5His 1 μ 1T4DNA 連接酶1 μ 1
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IOXBuffer1 μ 1反應(yīng)條件為16°C水浴16h。C4、細(xì)菌的轉(zhuǎn)化加入10 μ 1連接產(chǎn)物至感受態(tài)細(xì)胞，冰浴30分鐘，42°C熱休克90秒，再冰浴2分 鐘，加850 μ 1不含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基振搖45-50分鐘后，以4000轉(zhuǎn)/分鐘轉(zhuǎn)速離心10 分鐘，加100 μ 1新鮮的LB培養(yǎng)基將菌液懸起，涂于LB瓊脂平板上，瓊脂平板中含100 μ g/ ml氨芐青霉素，置于37°C培養(yǎng)過夜；C5、質(zhì)粒的小量提取挑取3個菌落用LB培養(yǎng)基進(jìn)行增菌，然后提取質(zhì)粒；質(zhì)粒DNA的提取采用堿裂解 方法進(jìn)行；按試劑盒說明取過夜培養(yǎng)的菌液3ml，以12000轉(zhuǎn)/分鐘轉(zhuǎn)速離心1分鐘，收集 菌體，重懸于250 μ 1溶液Pl，振蕩至徹底懸??；加入250 μ 1溶液Ρ2，溫和顛倒數(shù)次，使菌體充分裂解；加入350 μ 1溶液Ρ3，溫和顛倒數(shù)次，以1200轉(zhuǎn)/分鐘轉(zhuǎn)速離心10分鐘，小心將上 清加入吸附柱CB3，室溫放置1-2分鐘，以1200轉(zhuǎn)/分鐘轉(zhuǎn)速離心1分鐘，取出吸附柱，倒掉 流出的液體，將吸附柱重新放回收集管中；加入700ul洗液，以1200轉(zhuǎn)/分鐘轉(zhuǎn)速離心1分鐘，再重復(fù)洗一次，棄廢液后，以 1200轉(zhuǎn)/分鐘轉(zhuǎn)速空轉(zhuǎn)2分鐘，取出吸附柱，放入1. 5ml的Eppendorf管中，加入30 μ 1 ρΗ =8. 0的TE緩沖液洗脫，室溫放置2分鐘，以12000轉(zhuǎn)/分鐘轉(zhuǎn)速離心1分鐘，收集洗脫液 即為提取的質(zhì)粒，于-20°C貯存；C6、酶切鑒定質(zhì)粒取5 μ 1提取的質(zhì)粒，BamH I和Not I進(jìn)行雙酶切，酶切體系由如下體積的組份組 成pcDNA3. l(+)V5His_meTERT 10 μ 1BamH I1 μ 1Not I1 μ 1IOXM Buffer2μ 1無菌水6 μ 1反應(yīng)條件為37°C、3小時，酶切產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳；C7、PCR擴(kuò)增鑒定重組體PCR反應(yīng)體系由如下體積的組份組成pcDNA3. l(+)V5His_meTERT 5μ 12. 5mmol/L 4 XdNTP1 μ 1FT2 μ 1RT2 μ 1IOXM Buffer4μ 1TaqDNA 聚合酶1 μ 1無菌水25 μ 1PCR反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性1分鐘，94°C變性30秒，58°C復(fù)性30秒，72°C延伸30 秒，最后72°C延伸5分鐘；擴(kuò)增30個循環(huán)，抽取擴(kuò)增產(chǎn)物5μ 1，用瓊脂糖凝膠電泳分析擴(kuò)增結(jié)果，用DNA Marker來判斷擴(kuò)增片段的大??；C8、pcDNA3. 1 (+) V5His_meTERT 質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染 C0S-7 細(xì)胞C8 (1)、C0S-7 細(xì)胞培養(yǎng)于含10%滅活胎牛血清、青霉素100U/ml、鏈霉素100U/ml的RPMI-1640培養(yǎng)液 中，置于含5% C02、飽和濕度、37°C恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，每2-3天傳代一次。C8 (2)、pcDNA3. 1 (+) V5His_meTERT 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 C0S-7 細(xì)胞脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染(1)處理細(xì)胞轉(zhuǎn)染前一天將每孔IO5個細(xì)胞放入Iml無抗生素的RPMI1640培養(yǎng)液中，待細(xì)胞長 至70%時開始轉(zhuǎn)染；(2)準(zhǔn)備DNA-脂質(zhì)體混合液b液將2 μ 1脂質(zhì)體用無血清無雙抗培養(yǎng)基稀釋成100 μ 1，輕輕混勻，室溫放置5 分鐘；a液將5 μ g質(zhì)粒加入到100 μ 1無血清無雙抗培養(yǎng)基中，輕輕混勻；室溫放置5 分鐘后，與A液輕輕混勻，室溫放置20分鐘；(3)棄去孔內(nèi)培養(yǎng)基，每孔加入Iml無雙抗無血清1640培養(yǎng)基，將200 μ IDNA-脂 質(zhì)體溶液加入到含有細(xì)胞和培養(yǎng)基的培養(yǎng)孔中，輕輕混勻；(4)將細(xì)胞培養(yǎng)于37°C含5% C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48小時。C8 (3)、轉(zhuǎn)染后鑒定jestern-blot法鑒定meTERT多肽的表達(dá)C8 (3-1)、SDS-PAGE 培養(yǎng)48小時后分別收取轉(zhuǎn)染pcDNA3. l(+)V5His-meTERT質(zhì)粒的C0S-7細(xì)胞，轉(zhuǎn)染 pcDNA3. 1 (+)V5His空質(zhì)粒的C0S-7細(xì)胞以及未轉(zhuǎn)染的C0S-7細(xì)胞，用細(xì)胞裂解液將細(xì)胞裂 解，離心后取上清，分別加入等量2倍十二烷基磺酸鈉_聚丙烯酰胺凝膠電泳緩沖液，煮沸 5分鐘。各取20微升進(jìn)行轉(zhuǎn)移電泳；聚丙烯酰胺凝膠的配制方法如下分離膠12%積層膠5%水2.6ml2.1ml30% 丙稀酰胺3.2ml0.5mlTrispH = 8. 82. 0mlpH = 6. 80. 38ml10% SDS80 μ 130 μ 110% 過硫酸銨80μ130 μ 1TEMED4 μ 13 μ 1C8(3_2)、電轉(zhuǎn)膜電泳結(jié)束后，取一塊與凝膠等大的醋酸纖維素膜貼在凝膠上，夾于六片等大的濾 紙中間，各層之間避免產(chǎn)生氣泡；凝膠一側(cè)置于陰極，電流160毫安轉(zhuǎn)膜3小時；取出膠在 染液中染色，觀察效果；C8 (3-3)、轉(zhuǎn)膜結(jié)束后將膜取出用水洗凈，加封閉液于4°C封閉12小時，將封閉后 的膜用洗液以10分鐘/次的速度洗4次后，與1 500稀釋的抗鼠的HisB單克隆抗體共 同孵育1小時；用洗液洗2次，用磷酸鹽緩沖液洗兩次，每次10分鐘；然后與1 1000稀釋
14的堿性磷酸酶標(biāo)記兔抗鼠IgG反應(yīng)1小時；再用磷酸鹽緩沖液_吐溫20洗液洗4次，加底 物顯色后，放入水中終止顯色；與染色的凝膠對比觀察實(shí)驗結(jié)果，看有無特異性條帶出現(xiàn)。步驟D 是設(shè)計了引物 T-R(EcoR I) :5，ACAGAATTCGATATCGTCCAGGCCCAGCACAGA3，， 以FT4引物為上游引物，以T-R(EcoR I)為下游引物，以PCR產(chǎn)物序列為模板，進(jìn)行PCR反 應(yīng)，將上述PCR產(chǎn)物分別用BamH I.EcoR I雙酶切，連入原核表達(dá)質(zhì)粒pGEX_4T中，得重組 表達(dá)質(zhì)粒pGEX-meTERT，分別經(jīng)PCR、酶切及測序鑒定，表明meTERT的DNA片段正確插入了 質(zhì)粒中。將鑒定正確的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌E. coli 81^21，371培養(yǎng)至00600為0.4-0.6，1 丁6 誘導(dǎo)表達(dá)，收集菌體，SDS-PAGE分析；Western-blot檢測蛋白GST_meTERT的表達(dá)；親和層 析純化 GST-meTERT。步驟D包括如下工藝步驟Dl、PCR回收產(chǎn)物及pGEX-4T質(zhì)粒的酶切取pGEX-4T質(zhì)粒10μ 1，用BamHI和EcoRI進(jìn)行雙酶切，酶切體系由如下體積的組 分組成pGEX-4T 質(zhì)粒10 μ 1BamHI1 μ 1EcoRI1 μ 1IOXK Buffer2μ 1無菌水6μ1將PCR回收產(chǎn)物15 μ 1，用BamHI和EcoR I進(jìn)行雙酶切，酶切體系由如下體積的組 分組成PCR 產(chǎn)物15 μ 1BamHI1 μ 1EcoRI1 μ 1IOXK Buffer2μ 1無菌水1 μ 1D2、采用步驟Dl的方法將DNA片段純化回收；D3、DNA 的連接將步驟D2中的PCR產(chǎn)物及pGEX_4T酶切后經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳、切膠回收目的片段 后連接，連接體系由如下體積的組分組成
0139]PCR回收產(chǎn)物5μ1
0140]pGEX-4T Vector2μ 1
0141]T4DNA 連接酶Ιμ
0142]IOXBuffer1 μ 1反應(yīng)的條件為16°C水浴16小時；D4、酶切鑒定陽性克隆將步驟D3中的產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，提取質(zhì)粒，取提取的質(zhì)粒10 μ 1，行雙酶切鑒 定，酶切體系由如下體積的組分組成重組質(zhì)粒7μ1BamHI1 μ 1
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EcoRI1 μ 1IOXK Buffer 2μ 1無菌水9μ1反應(yīng)的條件為37°C、3小時，酶切產(chǎn)物行瓊脂糖電泳分析；D5、采用步驟D4的方法進(jìn)行PCR鑒定；D6、采用步驟D4的方法將鑒定陽性的質(zhì)粒和pGEX-4T空質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化至表達(dá)宿主 菌E.coli BL21；D7、小量誘導(dǎo)蛋白GST-meTERT和GST表達(dá)挑取單個菌落接種于含有氨芐青霉素ΙΟΟμ g/ml的LB培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)過夜； 次日按1 50擴(kuò)大培養(yǎng)，37°C培養(yǎng)至菌密度為A600 = 0. 6-0. 9時，加入終濃度為lmmol/L 的IPTG，繼續(xù)培養(yǎng)4小時，取1. 5ml離心菌，100 μ 1水懸浮沉淀，加100 μ 1 2xSDS凝膠加樣 緩沖液，煮沸10分鐘，離心后取10 μ 1進(jìn)行SDS-PAGE分析；
聚丙烯酰胺凝膠的配制過程如下 分離膠12%
水
2. 6ml 30% 丙稀酰胺 3.2ml
積層膠5% 2. Iml 0. 5ml Tris(lmol/L) pH = 8. 82. Oml pH6. 80. 38ml
10% SDS 10%過硫酸銨 TEMED
80 μ 130 μ 1
80 μ 1 30 μ 1 4μ 1 3μ 1 D8、Western-blot 檢測蛋白 GST-meTERT 和 GST 的表達(dá)
取誘導(dǎo)后的BL21表達(dá)菌株和BL21空菌株做SDS-PAGE電泳，電泳完畢，切膠浸泡 于去離子水中，并剪取與膠大小相似的PVDF膜及濾紙六張，PVDF膜在甲醇中浸泡3-5分鐘 后，將膠、PVDF膜及濾紙置電轉(zhuǎn)移液中平衡5分鐘。排列順序從負(fù)極到正極依次為三層濾 紙、膠、PVDF膜、三層濾紙，各層之間排空氣泡，兩端夾好，4°C、160毫安電轉(zhuǎn)移3小時，用IX 麗春紅染色觀察蛋白轉(zhuǎn)移效果。然后將其用水洗凈，加封閉液于4°C封閉12小時，TBST洗 液按照10分鐘/次洗4次后，與1 800稀釋的GST單抗37°C共同孵育1小時；采用上述 方法用TBST洗滌，然后與1 1000稀釋的AP標(biāo)記馬抗鼠IgG 37。C反應(yīng)1小時；TBST洗滌 2次，去離子水漂洗1次，BCIP/NBT顯色觀察結(jié)果；D9、大量誘導(dǎo)表達(dá)蛋白GST-meTERT和GST接種單菌落于IOOml含羧芐青霉素100 μ g/ml的LB培養(yǎng)基，37 °C培養(yǎng)過夜，按 1 4將過夜菌接種于新鮮的含羧芐青霉素100 μ g/ml的LB培養(yǎng)基，37°C、250轉(zhuǎn)/分鐘培 養(yǎng)3小時，至菌液0D600 = 0. 6，加入IPTG至終濃度lmmol/L，繼續(xù)培養(yǎng)5小時，離心菌，將菌 體反復(fù)3次，用超聲裂解液懸浮菌體，反應(yīng)條件為10ml/g濕菌體；超聲波破碎后，反應(yīng)條件 為350瓦X 30分鐘，4°C、8000g離心15分鐘，沉淀主要為包涵體，將上清、包涵體與Marker 進(jìn)行SDS-PAGE電泳鑒定；DlO、純化目的蛋白 GST-meTERT 和 GST將步驟D9中的沉淀重懸于9倍體積包涵體洗液中，室溫放置5分鐘，4°C、8000g 離心5分鐘；沉淀重懸于15mlTriton/lL菌液，充分混勻，4°C、12000g離心10分鐘，重
16復(fù)4次；再將沉淀重懸于去15mlTriton/lL菌液，4°C、12000g離心10分鐘；用尿素洗液 15mlTriton/lL菌液洗滌菌體，4°C、12000g離心10分鐘，重復(fù)4次；溶解純化的包涵體在15ml變性緩沖液/升菌液中，充分混勻，4°C過夜，使其充分 溶解；4°C、12000g離心20分鐘，吸上清置于一干凈的新管中，加入15μ 1 β-巰基乙醇， 40CU小時，將其裝入處理好的透析袋中，放在加入8Μ尿素的復(fù)性緩沖液中，4°C透析，濃度 梯度為1摩爾濃度/2小時。透析完成后，將GST-meTERT和GST分別分裝入Ep管，瞬時離心取上清，冷凍干 燥，-80°C保存。本發(fā)明所取得的實(shí)質(zhì)性特點(diǎn)和顯著的技術(shù)進(jìn)步在于該疫苗免疫機(jī)體后可激活表位特異性的⑶4+T細(xì)胞和⑶8+T細(xì)胞，在⑶4+T細(xì)胞 分泌的Thl型細(xì)胞因子的輔助下，⑶8+CTL可以特異性殺死表達(dá)hTERT的腫瘤細(xì)胞，從而對 腫瘤起到預(yù)防和治療作用。


圖1是meTERT的⑶4+和⑶8+T細(xì)胞表位的串聯(lián)連接片段電泳圖。圖2是真核重組表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3. 1 (+) V5His_meTERT的構(gòu)建示意圖。圖3是重組質(zhì)粒pcDNA3. 1 (+) V5His_meTERT的PCR(A)和酶切⑶鑒定電泳圖。圖4是真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3. 1 (+) V5His_meTERT轉(zhuǎn)化真核細(xì)胞C0S-7的Western blot鑒定圖譜。圖5是原核重組表達(dá)質(zhì)粒pGEX-meTERT的構(gòu)建示意圖。圖6是重組質(zhì)粒pGEX-meTERT的PCR (A)和酶切(B)鑒定電泳圖。圖7是重組蛋白GST-meTERT的表達(dá)(A) ,Western-blot鑒定(B)和純化(C)的電 泳圖。圖8是用流式細(xì)胞儀檢測的脾細(xì)胞中⑶4+T和⑶8+T細(xì)胞的比例。圖9是用LDH法檢測的特異性的CTL殺傷活性的示意圖。附圖中各個視圖中的標(biāo)記說明如下圖1中泳道1. DNA標(biāo)準(zhǔn)分子量Marker ；2.第一次重疊延伸PCR后的結(jié)果片段 (Tl) ；3.第二次重疊延伸PCR后的結(jié)果片段(T2) ；4.第三次重疊延伸PCR后的結(jié)果片段 (T3) ；5.第四次重疊延伸PCR后的結(jié)果片段(meTERT)。圖3中A，泳道1. DNA標(biāo)準(zhǔn)分子量Marker ；2. meTERT核苷酸片段對照；3. PCR擴(kuò)增 的片段；B，泳道1. DNA標(biāo)準(zhǔn)分子量Marker ；2. BamH I/Not I 雙酶切重組質(zhì)粒pcDNA3. 1 (+) V5His-meTERT ；3. meTERT 核苷酸片段對照。圖 4 中 1. pcDNA3. 1 (+) V5His_meTRET 轉(zhuǎn)染的 C0S-7 細(xì)胞；2.空質(zhì)粒 pcDNA3. 1 (+) V5His轉(zhuǎn)染的C0S-7細(xì)胞；3.未轉(zhuǎn)染的C0S-7細(xì)胞。圖6中A，泳道1.DNA標(biāo)準(zhǔn)分子量Marker ；2. PCR擴(kuò)增的片段；3. meTERT核苷酸片 段對照；B，泳道1. DNA標(biāo)準(zhǔn)分子量Marker ；2. meTERT核苷酸片段對照；3. BamHI/Not I雙 酶切重組質(zhì)粒 pcDNA3. 1 (+)V5His-meTERT。
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圖7中A，1.蛋白標(biāo)準(zhǔn)分子量Marker ；2.未誘導(dǎo)的coli-pGEX-meTERT ；3、4.誘導(dǎo)的 coli-pGEX-meTERT ；5.誘導(dǎo)的 coli-pGEX-meTERT 的上清；6.誘導(dǎo)的 E. coli-pGEX-meTERT 的沉淀；7.誘導(dǎo)的E. coli-pGEX-4T的沉淀；B，1.融合蛋白 GST-meTERT 的 Western-blot 結(jié)果；2.載體蛋白 GST 的 Western-blot 結(jié)果；C，1.蛋白標(biāo)準(zhǔn)分子量Marker ；2.未誘導(dǎo)的coli-pGEX-meTERT ；3.誘導(dǎo)的 E. coli-pGEX-meTERT ；4.純化的融合蛋白GST-meTERT ;5.純化的載體蛋白GST。圖9中A，靶細(xì)胞為GST-meTERT蛋白刺激的SP/^20時的特異性CTL殺傷活性；B,靶細(xì)胞為GST蛋白刺激的SP/20時的特異性CTL殺傷活性。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合附圖對本發(fā)明的實(shí)施例做進(jìn)一步描述，但不應(yīng)理解為對本發(fā)明的限定。 本發(fā)明的保護(hù)范圍以權(quán)利要求記載的內(nèi)容為準(zhǔn)。用于預(yù)防和治療腫瘤的疫苗，連接后的多表位端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶核苷酸序列如下gaggagatcctggccaagt tcctgcactggctgatgagtacct tgacagacctccagccgtacatgc gacagttcgtggctcacctgctgcgtttggtggatgatttcttgttggtgacacctccggtgtacgccgagaccaag cacttcctctactcctggcaggtgtacggcttcgtgcgggcctgcctgcgccggaaactctttggggtcttgcggct gaagtgtcaccgccccggcctcctgggcgcctctgtgctgggcctggacgatatc0用于預(yù)防和治療腫瘤的疫苗的制備，制備方法包括如下工藝步驟A、表位序列的選擇；B、多表位端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶的核苷酸的串聯(lián)連接；C、多表位端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶DNA疫苗的制備；D、多表位端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶多表位肽疫苗的制備。本發(fā)明的具體的技術(shù)解決方案還有所述的步驟A表位的選擇中包括如下特異性表位1540ILAKFLHWL ；
R865RLVDDFLLV ；
K973KLFGVLRLK ；
V324VYAETKHFL ；
V461VYGFVRACL ；
R672RPGLLGASVLGLDDI
L766LTDLQPYMRQFVAHL。所述的步驟B是設(shè)計8條首尾互補(bǔ)的引物，經(jīng)過4輪PCR反應(yīng)，得到編碼多表位肽 的 DNA 片段 meTERT。步驟B包括如下工藝步驟Bi、第一步擴(kuò)增體系為10XPCR緩沖液2微升，2. 5毫摩爾的dNTP2微升，10微摩 爾合成引物RT1、FTl各1微升，5單位/微升Taq DNA聚合酶1微升，加去離子水至20微 升；PCR反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性1分鐘；94°C變性30秒，58°C退火30秒、72°C延伸30秒， 擴(kuò)增5個循環(huán)；72°C繼續(xù)延伸1分鐘；
B2、隨后三步擴(kuò)增均以上一步PCR產(chǎn)物稀釋50倍作為模板進(jìn)行；擴(kuò)增體系同步驟 A，只是引物第二步PCR選用RT2和FT2，第三步選用RT 3和FT3 ；PCR反應(yīng)條件為94°C預(yù) 變性1分鐘；94°C變性30秒，55°C退火30秒、72°C延伸30秒，擴(kuò)增30個循環(huán)；72°C繼續(xù)延 伸5分鐘；第四次PCR擴(kuò)增后所得目的基因即為多表位端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶meTERT ；1. 2%瓊脂 糖凝膠電泳分析聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)產(chǎn)物；合成的首尾重疊的引物如下5，一3’FT4 GCGGGATCCGCCACCATGAGCGAGGAGATCCTGGCCAAGTTCCTGCACTGG ；FT3 CAAGTTCCTGCACTGGCTGATGAGTACCTTGACAGACCTCCAGCCGTACATGC ；FT2 CTCCAGCCGTACATGCGACAGTTCGTGGCTCACCTGCTGCGTTTGGTGGATGA ；FTl TGCGTTTGGTGGATGATTTCTTGTTGGTGACACCTCCGGTGTACGCCGAGACC ；RTl CGAAGCCGTACACCTGCCAGGAGTAGAGGAAGTGCTTGGTCTCGGCGTACACC ；RT2 AAGACCCCAAAGAGTTTCCGGCGCAGGCAGGCCCGCACGAAGCCGTACACCTG ；RT3 GGCGCCCAGGAGGCCGGGGCGGTGACACTTCAGCCGCAAGACCCCAAAGAGTT ；RT4 ATAGCGGCCGCGATATCGTCCAGGCCCAGCACAGAGGCGCCCAGGAGGCCG。PCR合成后的序列如下GCGGGATCC | GCC ACC ATG A丨 GCGAGGAGATCCTGGCCAAGTTCCTGCACTGGCTGATGAGTACCTTGACAGACCTCCAGCCGTACATGCGACAGTTCGTGGCTCACCTGCTGCGTTTGGTGGATGATTTCTTGTTGGTGACACCTCCGGTGTACGCCGAGACCAAGCACTTCCTCTACTCCTGGCAGGTGTACGGCTTCGTGCGGGCCTGCCTGCGCCGGAAACTCTTTGGGGTCTTGCGGCTGAAGTGTCACCGCCCCGGCCTCCTGGGCGCCTCTGTGCTGGGC
CTGGACGATATCGCGGCCGCTAT。該序列5’端含BamH I酶切位點(diǎn)，3’端含Not I酶切位點(diǎn)，這兩個酶切位點(diǎn)用于將 串聯(lián)序列插入到真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3. l(+)V5His中。電泳結(jié)果可見清晰的4條DNA片段，分別為4輪PCR的結(jié)果，第5泳道為目的片段 meTERT，片段大小與理論值相符，初步表明⑶4+和⑶8+T細(xì)胞表位正確連接(圖1)。所述的步驟C是將PCR產(chǎn)物分別用BamH I、Not I雙酶切，連接到雙酶切的 pcDNA3. 1 (+) V5Hi s表達(dá)載體中，得重組質(zhì)粒pcDNA3. 1 (+) V5Hi s-meTERT ；對構(gòu)建的載體 分別進(jìn)行PCR、酶切和DNA測序鑒定；以構(gòu)建的pcDNA3. 1 (+) V5His-meTERT質(zhì)粒為模板進(jìn) 行PCR，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，在200-500bp之間出現(xiàn)目的條帶，結(jié)果與預(yù)期一致(圖3A)； pcDNA3. l(+)V5His-meTERT經(jīng)內(nèi)切酶BamH I和Not I雙酶切，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，出現(xiàn)大小 兩個片段，分別為質(zhì)粒和插入的目的片段(圖3B)；經(jīng)測序鑒定，結(jié)果均表明該質(zhì)粒的插入 序列正確。所述的步驟C包括如下工藝步驟Cl、PCR回收產(chǎn)物及pcDNA3. 1 (+) V5His質(zhì)粒的酶切pcDNA3. l(+)V5His質(zhì)粒10 μ 1，用BamHI和EcoRI進(jìn)行雙酶切，酶切體系由如下體 積的組份組成pcDNA3. 1 (+) V5His 質(zhì)粒 10 μ 1BamHI1 μ 1Not I1 μ 1
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IOXK Buffer2μ 1
無菌水6 μ 1
將PCR回收產(chǎn)物15μ 1，用BamHI和Not I進(jìn)行雙酶切，酶切體系由如下體積的組份組成
PCR產(chǎn)物15μ 1
BamHI1 μ 1
Not I1 μ 1
IOXK Buffer2μ 1
無菌水1 μ 1
C2、DNA片段的純化回收
將酶切后的PCR片斷及pcDNA3. 1 (+)V5His載體電泳后切膠加入600微升的溶膠
液，50°C -60°C放置2分鐘；將融化后的溶液放入離心純化柱中，以13000轉(zhuǎn)/分鐘轉(zhuǎn)速離 心30秒，倒掉收集管中的廢液，加入500微升80%乙醇，以13000轉(zhuǎn)/分鐘轉(zhuǎn)速離心30秒， 倒掉收集管中的廢液；將純化柱套入干凈的1. 5毫升離心管中，加入30微升緩沖液，放置2 分鐘，離心30秒，-20°C保存；C3、DNA 的連接PCR產(chǎn)物及pcDNA3. 1⑴V5His酶切后經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，切膠回收目的片段后連 接，連接體系由如下體積的組份組成PCR回收產(chǎn)物7μ1pcDNA3. l(+)V5His1 μ 1T4DNA 連接酶1 μ 1IOXBuffer1 μ 1反應(yīng)條件為16°C水浴16h。C4、細(xì)菌的轉(zhuǎn)化加入10 μ 1連接產(chǎn)物至感受態(tài)細(xì)胞，冰浴30分鐘，42°C熱休克90秒，再冰浴2分 鐘，加850 μ 1不含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基振搖45-50分鐘后，以4000轉(zhuǎn)/分鐘轉(zhuǎn)速離心10 分鐘，加100 μ 1新鮮的LB培養(yǎng)基將菌液懸起，涂于LB瓊脂平板上，瓊脂平板中含100 μ g/ ml氨芐青霉素，置于37°C培養(yǎng)過夜；C5、質(zhì)粒的小量提取挑取3個菌落用LB培養(yǎng)基進(jìn)行增菌，然后提取質(zhì)粒；質(zhì)粒DNA的提取采用堿裂解 方法進(jìn)行；按試劑盒說明取過夜培養(yǎng)的菌液3ml，以12000轉(zhuǎn)/分鐘轉(zhuǎn)速離心1分鐘，收集 菌體，重懸于250 μ 1溶液Pl，振蕩至徹底懸浮；加入250 μ 1溶液Ρ2，溫和顛倒數(shù)次，使菌體充分裂解；加入350 μ 1溶液Ρ3，溫和顛倒數(shù)次，以1200轉(zhuǎn)/分鐘轉(zhuǎn)速離心10分鐘，小心將上 清加入吸附柱CB3，室溫放置1-2分鐘，以1200轉(zhuǎn)/分鐘轉(zhuǎn)速離心1分鐘，取出吸附柱，倒掉 流出的液體，將吸附柱重新放回收集管中；加入700ul洗液，以1200轉(zhuǎn)/分鐘轉(zhuǎn)速離心1分鐘，再重復(fù)洗一次，棄廢液后，以 1200轉(zhuǎn)/分鐘轉(zhuǎn)速空轉(zhuǎn)2分鐘，取出吸附柱，放入1. 5毫升的Eppendorf管中，加入30 μ 1 PH = 8. 0的TE緩沖液洗脫，室溫放置2分鐘，以12000轉(zhuǎn)/分鐘轉(zhuǎn)速離心1分鐘，收集洗脫液即為提取的質(zhì)粒，于-20°C貯存；C6、酶切鑒定質(zhì)粒取5 μ 1提取的質(zhì)粒，BamH I和Not I進(jìn)行雙酶切，酶切體系由如下體積的組份組 成pcDNA3. l(+)V5His_meTERT 10 μ 1BamH I1 μ 1Not I1 μ 1IOXM Buffer2μ 1無菌水6μ1反應(yīng)條件為37°C 3h，酶切產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳；C7、PCR擴(kuò)增鑒定重組體PCR反應(yīng)體系由如下體積的組份組成pcDNA3. l(+)V5His_meTERT 5μ 12. 5mmol/L 4 XdNTP1 μ 1FT2 μ 1RT2 μ 1IOXM Buffer4μ 1TaqDNA 聚合酶1 μ 1無菌水25 μ 1PCR反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性1分鐘，94°C變性30秒，58°C復(fù)性30秒，72°C延伸30 秒，最后72°C延伸5分鐘；擴(kuò)增30個循環(huán)，抽取擴(kuò)增產(chǎn)物5μ 1，用瓊脂糖凝膠電泳分析擴(kuò)增 結(jié)果，用DNA Marker來判斷擴(kuò)增片段的大??；C8、pcDNA3. 1 (+) V5His_meTERT 質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染 C0S-7 細(xì)胞C8 (1)、C0S-7 細(xì)胞培養(yǎng)于含10%滅活胎牛血清、青霉素100U/ml、鏈霉素100U/ml的RPMI-1640培養(yǎng)液 中，置于含5% C02、飽和濕度、37°C恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，每2-3天傳代一次。C8 (2)、pcDNA3. 1 (+) V5His_meTERT 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 C0S-7 細(xì)胞脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染(1)處理細(xì)胞轉(zhuǎn)染前一天將每孔IO5個細(xì)胞放入Iml無抗生素的RPMI1640培養(yǎng)液中，待細(xì)胞長 至70%時開始轉(zhuǎn)染；(2)準(zhǔn)備DNA-脂質(zhì)體混合液 b液將2 μ 1脂質(zhì)體用無血清無雙抗培養(yǎng)基稀釋成100 μ 1，輕輕混勻，室溫放置5 分鐘；a液將5 μ g質(zhì)粒加入到100 μ 1無血清無雙抗培養(yǎng)基中，輕輕混勻；室溫放置5 分鐘后，與A液輕輕混勻，室溫放置20分鐘；(3)棄去孔內(nèi)培養(yǎng)基，每孔加入Iml無雙抗無血清1640培養(yǎng)基，將200 μ IDNA-脂 質(zhì)體溶液加入到含有細(xì)胞和培養(yǎng)基的培養(yǎng)孔中，輕輕混勻；(4)將細(xì)胞培養(yǎng)于37°C含5% C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48小時。
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C8 (3)、轉(zhuǎn)染后鑒定jestern-blot法鑒定meTERT多肽的表達(dá)C8 (3-1)、SDS-PAGE 培養(yǎng)48小時后分別收取轉(zhuǎn)染pcDNA3. l(+)V5His_meTERT質(zhì)粒的C0S-7細(xì)胞，轉(zhuǎn)染 pcDNA3. 1 (+)V5His空質(zhì)粒的C0S-7細(xì)胞以及未轉(zhuǎn)染的C0S-7細(xì)胞，用細(xì)胞裂解液將細(xì)胞裂 解，離心后取上清，分別加入等量2倍十二烷基磺酸鈉_聚丙烯酰胺凝膠電泳緩沖液，煮沸 5分鐘。各取20微升進(jìn)行轉(zhuǎn)移電泳；聚丙烯酰胺凝膠的配制方法如下分離膠12% 積層膠5%水2. 6ml2. Iml30% 丙稀酰胺 3.2ml0.5mlTrispH = 8. 82. Oml pH = 6. 80. 38ml10% SDS80 μ 130 μ 110% 過硫酸銨80 μ 130 μ 1TEMED4 μ 13 μ 1C8 (3-2)、電轉(zhuǎn)膜電泳結(jié)束后，取一塊與凝膠等大的醋酸纖維素膜貼在凝膠上，夾于六片等大的濾 紙中間，各層之間避免產(chǎn)生氣泡；凝膠一側(cè)置于陰極，電流160毫安轉(zhuǎn)膜3小時；取出膠在 染液中染色，觀察效果；C8 (3-3)、轉(zhuǎn)膜結(jié)束后將膜取出用水洗凈，加封閉液于4°C封閉12小時，將封閉后 的膜用洗液以10分鐘/次的速度洗4次后，與1 500稀釋的抗鼠的HisB單克隆抗體共 同孵育1小時；用洗液洗2次，用磷酸鹽緩沖液洗兩次，每次10分鐘；然后與1 1000稀 釋的堿性磷酸酶標(biāo)記兔抗鼠IgG反應(yīng)1小時；再用磷酸鹽緩沖液_吐溫20洗液洗4次，加 底物顯色后，放入水中終止顯色；與染色的凝膠對比觀察實(shí)驗結(jié)果，看有無特異性條帶出現(xiàn) (圖 4)。所述的步驟D是設(shè)計了引物 T-R(EcoR I))) 5，ACAGAATTCGATATCGTCCAGGCCCAGCA CAGA3’，以FT4引物為上游引物，以T-R(EC0R I)為下游引物，以PCR產(chǎn)物序列為模板，進(jìn)行 PCR反應(yīng)，將上述PCR產(chǎn)物分別用BamH I、EcoR I雙酶切，連入原核表達(dá)質(zhì)粒pGEX_4T中， 得重組表達(dá)質(zhì)粒pGEX-meTERT，分別經(jīng)PCR(圖5A)、酶切(圖5B)及測序鑒定，表明meTERT 的DNA片段正確插入了質(zhì)粒中。將鑒定正確的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌E. coli BL21，37°C培養(yǎng) 至0D600為0. 4-0. 6，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，收集菌體，SDS-PAGE分析；Western-blot檢測蛋白 GST-meTERT的表達(dá)；親和層析純化蛋白GST-meTERT。將鑒定為陽性的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至Ε. coli BL21，誘導(dǎo)表達(dá)后，經(jīng)SDS-PAGE電泳，結(jié) 果顯示誘導(dǎo)產(chǎn)物在35KD分子量附近出現(xiàn)高表達(dá)的蛋白條帶，與目的蛋白的分子量(37KD) 一致，而未誘導(dǎo)的菌沒有表達(dá)目的產(chǎn)物(圖6A) ；Western-blot結(jié)果表明經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的菌 體蛋白與GST單抗可產(chǎn)生特異性結(jié)合反應(yīng)，在相應(yīng)的目的條帶處有明顯雜交信號，而未轉(zhuǎn) 染的coli BL21菌體蛋白不與GST單抗反應(yīng)，表明融合蛋白在coli BL21中成功表達(dá)(圖 6B)；經(jīng)親和層析純化，SDS-PAGE電泳結(jié)果表明獲得了純化蛋白GST-meTERT(圖6C)。具體 操作步驟如下Dl、PCR回收產(chǎn)物及pGEX-4T質(zhì)粒的酶切
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取pGEX-4T質(zhì)粒10μ 1，用BamHI和EcoRI進(jìn)行雙酶切，酶切體系由如下體積的組 分組成pGEX-4T 質(zhì)粒 10 μ 1BamHI1 μ 1EcoRI1 μ 1IOXK Buffer 2μ 1無菌水6 μ 1將PCR回收產(chǎn)物15 μ 1，用BamHI和EcoR I進(jìn)行雙酶切，酶切體系由如下體積的組 分組成PCR 產(chǎn)物15 μ 1BamHI1 μ 1EcoRI1 μ 1IOXK Buffer 2μ 1無菌水1 μ 1D2、采用步驟Dl的方法將DNA片段純化回收；D3、DNA 的連接將步驟D2中的PCR產(chǎn)物及pGEX_4T酶切后經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，切膠回收目的片段 后連接，連接體系由如下體積的組分組成PCR回收產(chǎn)物5μ1pGEX-4T Vector2 μ 1T4DNA 連接酶1 μ 1IOXBuffer1 μ 1反應(yīng)的條件為16°C水浴16小時；D4、酶切鑒定陽性克隆將步驟D3中的產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，提取質(zhì)粒，取提取的質(zhì)粒10μ 1，行雙酶切鑒 定，酶切體系由如下體積的組分組成重組質(zhì)粒7 μ 1BamHI1 μ 1EcoR I1 μ 1IOXK Buffer2μ 1無菌水9 μ 1反應(yīng)的條件為37°C、3小時，酶切產(chǎn)物行瓊脂糖電泳分析；D5、采用步驟D4的方法進(jìn)行PCR鑒定；。D6、采用步驟D4的方法將鑒定陽性的質(zhì)粒和pGEX-4T空質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化至表達(dá)宿主 菌 E.coli BL21 ；。D7、小量誘導(dǎo)蛋白GST-meTERT和GST表達(dá)挑取單個菌落接種于含有氨芐青霉素100μ g/ml的LB培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)過夜； 次日按1 50擴(kuò)大培養(yǎng)，37°C培養(yǎng)至菌密度為A600 = 0. 6-0. 9時，加入終濃度為lmmol/L 的IPTG，繼續(xù)培養(yǎng)4小時，取1. 5ml離心菌，100 μ 1水懸浮沉淀，加100 μ 1 2xSDS凝膠加樣
23緩沖液，煮沸10分鐘，離心后取 ο μ 1進(jìn)行SDS-PAGE分析；聚丙烯酰胺凝膠的配制過程如下分離膠12%積層膠5%水2. 6ml2. Iml30% 丙稀酰胺3.2ml0.5mlTris (lmol/L)pH = 8. 82. OmlρΗ6· 80. 38ml10% SDS80 μ 130 μ 110%過硫酸銨80 μ 130 μ 1TEMED4μ 13μ 1D8、Western-blot 檢測蛋白 GST-meTERT 和 GST 的表達(dá)取誘導(dǎo)后的BL21表達(dá)菌株和BL21空菌株做SDS-PAGE電泳，電泳完畢，切膠浸泡 于去離子水中，并剪取與膠大小相似的PVDF膜及濾紙六張，PVDF膜在甲醇中浸泡3-5分鐘 后，將膠、PVDF膜及濾紙置電轉(zhuǎn)移液中平衡5分鐘。排列順序從負(fù)極到正極依次為三層濾 紙、膠、PVDF膜、三層濾紙，各層之間排空氣泡，兩端夾好，4°C，160毫安電轉(zhuǎn)移3小時，用IX 麗春紅染色觀察蛋白轉(zhuǎn)移效果。然后將其用水洗凈，加封閉液于4°C封閉12小時，TBST洗 液按照10分鐘/次洗4次后，與1 800稀釋的GST單抗37°C共同孵育1小時；采用上述 方法用TBST洗滌，然后與1 1000稀釋的AP標(biāo)記馬抗鼠IgG 37。C反應(yīng)1小時；TBST洗滌 2次，去離子水漂洗1次，BCIP/NBT顯色觀察結(jié)果；D9、大量誘導(dǎo)表達(dá)蛋白GST-meTERT和GST接種單菌落于IOOml含羧芐青霉素100 μ g/ml的LB培養(yǎng)基，37 °C培養(yǎng)過夜，按 1 4將過夜菌接種于新鮮的含羧芐青霉素100 μ g/ml的LB培養(yǎng)基，37°C、250轉(zhuǎn)/分鐘培 養(yǎng)3小時，至菌液0D600 = 0. 6，加入IPTG至終濃度lmmol/L，繼續(xù)培養(yǎng)5小時，離心菌，將菌 體反復(fù)3次，用超聲裂解液懸浮菌體，反應(yīng)條件為10ml/g濕菌體；超聲波破碎后，反應(yīng)條件 為350瓦X 30分鐘，4°C、8000g離心15分鐘，沉淀主要為包涵體，將上清、包涵體與Marker 進(jìn)行SDS-PAGE電泳鑒定；D10、純化目的蛋白 GST-meTERT 和 GST將步驟D9中的沉淀重懸于9倍體積包涵體洗液中，室溫放置5分鐘，4°C、8000g 離心5分鐘；沉淀重懸于15mlTriton/lL菌液，充分混勻，4°C、12000g離心10分鐘，重復(fù) 4次；再將沉淀重懸于去15mlTriton/lL菌液，4°C、12000g離心10分鐘；用尿素洗液15ml TriWlL菌液洗滌菌體，4 0C、12000g離心10分鐘，重復(fù)4次；溶解純化的包涵體在15ml變性緩沖液/升菌液中，充分混勻，4°C過夜，使其充分 溶解；4°C、12000g離心20分鐘，吸上清置于一干凈的新管中，加入15μ 1 β-巰基乙醇， 40CU小時，將其裝入處理好的透析袋中，放在加入8Μ尿素的復(fù)性緩沖液中，4°C透析，濃度 梯度為1摩爾濃度/2小時。。透析完成后，將GST-meTERT和GST分別分裝入Ep管，瞬時離心取上清，冷凍干 燥，-80°C保存。小鼠的免疫 6-9周齡的雌性BALB/c小鼠30只，隨機(jī)分為5組，分別為①PBS對照組；②空質(zhì)粒 (pcDNA3. 1 (+) V5His)組，簡稱 PC ；③ DNA 疫苗(pcDNA3. 1 (+) V5His_meTERT)組，簡稱 PCT ；
24④GST-meTERT肽疫苗組，簡稱PCG ；⑤PCT+PCG聯(lián)合免疫組，即第一次用PCT免疫，第二及 第三次用PCG免疫。均以20%的氫氧化鋁為佐劑，PCT(100微克)免疫途徑為大腿肌肉注 射，PCG(50微克)為皮內(nèi)多點(diǎn)注射免疫。共免疫3次，每次間隔10天，末次免疫后14天經(jīng) 小鼠內(nèi)眥靜脈取血，處死小鼠，取脾制備脾單細(xì)胞懸液，準(zhǔn)備進(jìn)行細(xì)胞免疫指標(biāo)的檢測。流式細(xì)胞儀檢測⑶4+T和⑶8+T細(xì)胞(1)用生理鹽水洗滌離心脾細(xì)胞2次，調(diào)整細(xì)胞濃度為IX IO6個/ml ；(2)將細(xì)胞懸液分為2管，分別加入⑶4-FITC和⑶8_PE各10 μ 1，混勻后，室溫下 避光孵育30分鐘；(3)加生理鹽水2ml，振蕩，離心，洗滌2次，以除去未結(jié)合的熒光抗體；(4)用FACSsort型流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測。結(jié)果見圖7，與PBS組比較，PCT、PG、PCT+PG組CD4+T和CD8+T細(xì)胞的百分率明顯 升高(P < 0. 01)，PCT+PG組與PCT或PG組比較⑶4+T和⑶8+T細(xì)胞的百分率亦明顯升高 (P < 0.01),表明肽疫苗和DNA疫苗單獨(dú)免疫和聯(lián)合免疫均能有效激活CD4+T和CD8+T細(xì) 胞，另外，聯(lián)合免疫能夠激活更多的CD4+T和CD8+T細(xì)胞。ELISP0T檢測細(xì)胞免疫應(yīng)答的類型ELISP0T檢測具體操作按Cayman公司ELISP0T試劑盒產(chǎn)品說明書進(jìn)行在96孔濾 膜板中加100微升/孔的70%乙醇，室溫放置10分鐘，倒掉乙醇，用PBS或包被緩沖液洗滌； 加100微升/孔適當(dāng)稀釋的捕獲抗體，4°C包被過夜；傾空板子，用包被緩沖液洗滌2次，加 200微升/孔RPMI1640完全培養(yǎng)基，室溫封閉1小時；棄液，加入100微升/孔用RPMI1640 稀釋的抗原(GST-meTERT或GST)；每孔加入脾細(xì)胞IO6個/100微升，在37°C、5%二氧化碳 CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36小時；將培養(yǎng)物倒掉、拍干，用洗液洗滌3次，加100微升/孔生物素標(biāo) 記的檢測抗體，室溫放2小時。棄液，用洗液洗滌4次，加100微升/孔親和素標(biāo)記的辣根 過氧化物酶，室溫放置45分鐘，洗滌，加100微升/孔新配置的底物液，室溫顯色10-60分 鐘，觀察斑點(diǎn)形成。加200微升/孔蒸餾水洗板3次終止反應(yīng)。自然干燥，用讀板機(jī)讀板。ELISP0T結(jié)果顯示GST蛋白刺激孔的各組細(xì)胞數(shù)無顯著性差異。而GST-meTERT 抗原刺激孔，PCT+PCG聯(lián)合免疫誘導(dǎo)的分泌干擾素IFN-Y的淋巴細(xì)胞數(shù)量顯著高于其它各 組(P <0.01)；另外，PCT+PCG誘導(dǎo)的分泌干擾素IFN-Y的淋巴細(xì)胞數(shù)顯著高于其誘導(dǎo)的 分泌白細(xì)胞介素IL-4的淋巴細(xì)胞數(shù)量。這些結(jié)果表明PCT+PCG聯(lián)合免疫比PCT或PCG單 獨(dú)免疫誘導(dǎo)的meTERT特異性⑶4+Th淋巴細(xì)胞免疫應(yīng)答更強(qiáng)，而且PCT+PCG誘導(dǎo)了淋巴細(xì) 胞CD4+Thl型優(yōu)勢應(yīng)答，即肽疫苗和DNA疫苗聯(lián)合免疫誘導(dǎo)了有利于清除腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞 免疫類型(圖8)。用乳酸脫氫酶(LDH)釋放法檢測特異性的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)活性最后一次免疫后14天處死小鼠，取脾細(xì)胞，用0. 5微摩爾GST-meTERT體外刺激脾 細(xì)胞5天得效應(yīng)細(xì)胞；取腫瘤細(xì)胞SP2/0細(xì)胞用10微摩爾GST-meTERT或GST蛋白刺激2 小時得兩種靶細(xì)胞，然后在96孔板中按不同的效/靶比100 1、50 1、25 1,12.5 1 加載效應(yīng)細(xì)胞和靶細(xì)胞，未刺激的腫瘤細(xì)胞SP2/0細(xì)胞作為對照細(xì)胞，同時設(shè)置腫瘤細(xì)胞 SP2/0自然釋放乳酸脫氫酶孔和最大釋放乳酸脫氫酶孔，分別設(shè)3個復(fù)孔，在CO2培養(yǎng)箱 37°C共培養(yǎng)6小時，根據(jù)乳酸脫氫酶釋放試劑盒說明書檢測細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞活性。特 異性細(xì)胞殺傷率(％)=(試驗組吸光度值-自然釋放組吸光度值)/(最大釋放吸光度
25值_自然釋放組吸光度值)。結(jié)果當(dāng)靶細(xì)胞為GST刺激的SP/20時，各組均未產(chǎn)生有效的 CTL ；而當(dāng)靶細(xì)胞為GST-meTERT刺激的SP/20時，與PBS組比較，PCT和PCG單獨(dú)免疫組在 效靶比為50 1和100 1時meTERT特異性殺傷活性均有一定的升高，但無統(tǒng)計學(xué)意義， 而PCT+PCG聯(lián)合免疫組所誘導(dǎo)的meTERT特異性CTL水平明顯高于其它各組(P < 0. 01)，表 明PCT+PCG聯(lián)合免疫誘導(dǎo)了顯著的特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞殺傷活性，即肽疫苗和DNA 疫苗聯(lián)合免疫誘導(dǎo)了具有強(qiáng)烈活性的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)，能夠有效殺死表達(dá)人端 粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)的腫瘤細(xì)胞(圖9)。 上述描述僅作為本發(fā)明一種用于預(yù)防和治療腫瘤的疫苗及其制備方法可實(shí)施的 技術(shù)方案提出，不作為對其本身的單一限制條件。
權(quán)利要求
用于預(yù)防和治療腫瘤的疫苗，其特征在于連接后的多表位端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶核苷酸序列如下gaggagatcctggccaagttcctgcactggctgatgagtaccttgacagacctccagccgtacatgcgacagttcgtggctcacctgctgcgtttggtggatgatttcttgttggtgacacctccggtgtacgccgagaccaagcacttcctctactcctggcaggtgtacggcttcgtgcgggcctgcctgcgccggaaactctttggggtcttgcggctgaagtgtcaccgccccggcctcctgggcgcctctgtgctgggcctggacgatatc。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于預(yù)防和治療腫瘤的疫苗的制備，其特征在于制備方法包 括如下工藝步驟A、端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶表位序列的選擇；B、多表位端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶的核苷酸的串聯(lián)連接；C、多表位端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶DNA疫苗的制備；D、多表位端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶多表位肽疫苗的制備。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的用于預(yù)防和治療腫瘤的疫苗的制備，其特征在于所述的步驟 A表位的選擇中包括如下特異性表位1540 ILAKFLHWL ； R865 RLVDDFLLV ； K973 KLFGVLRLK ； V324 VYAETKHFL ； V461 VYGFVRACL ； R672 RPGLLGASVLGLDDI ； L766 LTDLQPYMRQFVAHL。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的用于預(yù)防和治療腫瘤的疫苗的制備，其特征在于所述的步驟 B是設(shè)計8條首尾互補(bǔ)的引物，經(jīng)過4輪PCR反應(yīng)，得到編碼多表位肽的DNA片段，即多表位 端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶基因。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的用于預(yù)防和治療腫瘤的疫苗的制備，其特征在于所述的步驟 B包括如下工藝步驟Bi、第一步擴(kuò)增體系為10XPCR緩沖液2微升，2. 5毫摩爾的dNTP2微升，10微摩爾 合成引物RT1、FT1各1微升，5單位/微升Taq DNA聚合酶1微升，加去離子水至20微升； PCR反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性1分鐘；94°C變性30秒，58°C退火30秒、72°C延伸30秒，擴(kuò)增 5個循環(huán)；72°C繼續(xù)延伸1分鐘；B2、隨后三步擴(kuò)增均以上一步PCR產(chǎn)物稀釋50倍作為模板進(jìn)行；擴(kuò)增體系同步驟A，只 是引物第二步PCR選用RT2和FT2，第三步選用RT3和FT3 ；PCR反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性1 分鐘；94°C變性30秒，55°C退火30秒、72°C延伸30秒，擴(kuò)增30個循環(huán)；72°C繼續(xù)延伸5分 鐘；第四次PCR擴(kuò)增后所得目的基因即為多表位端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶meTERT ；1. 2%瓊脂糖凝膠 電泳分析聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)產(chǎn)物；合成的首尾重疊的引物如下5’ —3'FT4 GCGGGATCCGCCACCATGAGCGAGGAGATCCTGGCCAAGTTCCTGCACTGG ； FT3 CAAGTTCCTGCACTGGCTGATGAGTACCTTGACAGACCTCCAGCCGTACATGC ； FT2 CTCCAGCCGTACATGCGACAGTTCGTGGCTCACCTGCTGCGTTTGGTGGATGA ；FTl TGCGTTTGGTGGATGATTTCTTGTTGGTGACACCTCCGGTGTACGCCGAGACC ； RTl CGAAGCCGTACACCTGCCAGGAGTAGAGGAAGTGCTTGGTCTCGGCGTACACC ； RT2 AAGACCCCAAAGAGTTTCCGGCGCAGGCAGGCCCGCACGAAGCCGTACACCTG ； RT3 GGCGCCCAGGAGGCCGGGGCGGTGACACTTCAGCCGCAAGACCCCAAAGAGTT ； RT4 ATAGCGGCCGCGATATCGTCCAGGCCCAGCACAGAGGCGCCCAGGAGGCCG。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的用于預(yù)防和治療腫瘤的疫苗的制備，其特征在于所述的步驟 C是將PCR產(chǎn)物分別用BamH I、Not I雙酶切，連接到雙酶切的pcDNA3. 1 (+)V5His表達(dá)載 體中，得重組質(zhì)粒pcDNA3. 1 (+) V5His-meTERT ；對構(gòu)建的載體分別進(jìn)行PCR、酶切和DNA測 序鑒定；以構(gòu)建的pcDNA3. 1 (+)V5His-meTERT質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，在 200-500bp之間出現(xiàn)目的條帶，結(jié)果與預(yù)期一致；pcDNA3. 1 (+) V5His_meTERT經(jīng)內(nèi)切酶BamH I和Not I雙酶切，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，出現(xiàn)大小兩個片段，分別為質(zhì)粒和插入的目的片段； 經(jīng)測序鑒定，結(jié)果均表明該質(zhì)粒的插入序列正確。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的用于預(yù)防和治療腫瘤的疫苗的制備，其特征在于所述的步驟 C包括如下工藝步驟Cl、PCR回收產(chǎn)物及pcDNA3. 1 (+)V5His質(zhì)粒的酶切取pcDNA3. l(+)V5His質(zhì)粒10μ 1，用BamHI和EcoRI進(jìn)行雙酶切，酶切體系由如下體積 的組份組成pcDNA3. 1 (+) V5His 質(zhì)粒10 μ 1BamHI1 μ 1Not I1 μ 1IOXK Buffer2μ 1無菌水6 μ 1將PCR回收產(chǎn)物15μ 1，用BamHI和Not I進(jìn)行雙酶切，酶切體系由如下體積的組份組成C2、DNA片段的純化回收將酶切后的PCR片斷及pcDNA3. 1 (+)V5His載體電泳后切膠加入600微升的溶膠液， 500C _60°C放置2分鐘；將融化后的溶液放入離心純化柱中，以13000轉(zhuǎn)/分鐘轉(zhuǎn)速離心30 秒，倒掉收集管中的廢液，加500微升80%乙醇，以13000轉(zhuǎn)/分鐘轉(zhuǎn)速離心30秒，倒掉收 集管中的廢液；將純化柱套入干凈的1. 5毫升離心管中，加入30微升緩沖液，放置2分鐘， 離心30秒，_20°C保存； C3、DNA的連接PCR產(chǎn)物及pcDNA3. 1 (+) V5His酶切后經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，切膠回收目的片段后連接， 連接體系由如下體積的組份組成PCR回收產(chǎn)物7μ1PCR產(chǎn)物 BamHI Not I15μ 1 1 μ 1 1 μ 1 2μ 1 1 μ 110ΧΚ Buffer無菌水pcDNA3. 1(+) V5His T4DNA連接酶 IOXBuffer1 μ 1 1 μ 1 1 μ 1反應(yīng)條件為16°C水浴16h。 C4、細(xì)菌的轉(zhuǎn)化加入10 μ 1連接產(chǎn)物至感受態(tài)細(xì)胞，冰浴30分鐘，42°C熱休克90秒，再冰浴2分鐘，加 850 μ 1不含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基振搖45-50分鐘后，以4000轉(zhuǎn)/分鐘轉(zhuǎn)速離心10分 鐘，加100 μ 1新鮮的LB培養(yǎng)基將菌液懸起，涂于LB瓊脂平板上，瓊脂平板中含100 μ g/ml 氨芐青霉素，置于37°C培養(yǎng)過夜； C5、質(zhì)粒的小量提取挑取3個菌落用LB培養(yǎng)基進(jìn)行增菌，然后提取質(zhì)粒；質(zhì)粒DNA的提取采用堿裂解方法 進(jìn)行；按試劑盒說明取過夜培養(yǎng)的菌液3ml，以12000轉(zhuǎn)/分鐘轉(zhuǎn)速離心1分鐘，收集菌體， 重懸于250 μ 1溶液Pl，振蕩至徹底懸浮；加入250 μ 1溶液Ρ2，溫和顛倒數(shù)次，使菌體充分裂解；加入350 μ 1溶液Ρ3，溫和顛倒數(shù)次，以1200轉(zhuǎn)/分鐘轉(zhuǎn)速離心10分鐘，小心將上清加 入吸附柱CB3，室溫放置1-2分鐘，以1200轉(zhuǎn)/分鐘轉(zhuǎn)速離心1分鐘，取出吸附柱，倒掉流出 的液體，將吸附柱重新放回收集管中；加入700ul洗液，以1200轉(zhuǎn)/分鐘轉(zhuǎn)速離心1分鐘，再重復(fù)洗一次，棄廢液后，以1200 轉(zhuǎn)/分鐘轉(zhuǎn)速空轉(zhuǎn)2分鐘，取出吸附柱，放入1. 5ml的Eppendorf管中，加入30 μ 1 ρΗ = 8. 0的TE緩沖液洗脫，室溫放置2分鐘，以12000轉(zhuǎn)/分鐘轉(zhuǎn)速離心1分鐘，收集洗脫液即 為提取的質(zhì)粒，于_20°C貯存； C6、酶切鑒定質(zhì)粒取5 μ 1提取的質(zhì)粒，BamH I和Not I進(jìn)行雙酶切，酶切體系由如下體積的組份組成pcDNA3. 1(+)V5His-meTERT 10 μ 1BamH I1 μ 1Not I1 μ 1IOXM Buffer2μ 1無菌水6 μ 1反應(yīng)條件為37°C、3小時，酶切產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳；C7、PCR擴(kuò)增鑒定重組體PCR反應(yīng)體系由如下體積的組份組成pcDNA3. 1(+)V5His-meTERT 5 μ 2. 5mmol/L4XdNTP1 μ 1FT2μ 1RT2μ 1IOXM Buffer4μ 1TaqDNA聚合酶1 μ 1無菌水25 μ 1PCR反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性1分鐘，94°C變性30秒，58°C復(fù)性30秒，72°C延伸30秒，最后72°C延伸5分鐘；擴(kuò)增30個循環(huán)，抽取擴(kuò)增產(chǎn)物5 μ 1，用瓊脂糖凝膠電泳分析擴(kuò)增結(jié) 果，用DNA Marker來判斷擴(kuò)增片段的大??；C8、pcDNA3. 1 (+) V5His_meTERT 質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染 C0S-7 細(xì)胞 C8(l)、C0S-7細(xì)胞培養(yǎng)于含10%滅活胎牛血清、青霉素100U/ml、鏈霉素100U/ml的RPMI-1640培養(yǎng)液中，置 于含5% C02、飽和濕度、37°C恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，每2-3天傳代一次。 C8 (2)、pcDNA3. 1 (+) V5His_meTERT 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 C0S-7 細(xì)胞 脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染(1)處理細(xì)胞轉(zhuǎn)染前一天將每孔IO5個細(xì)胞放入Iml無抗生素的RPMI1640培養(yǎng)液中，待細(xì)胞長至 70%時開始轉(zhuǎn)染；(2)準(zhǔn)備DNA-脂質(zhì)體混合液b液將2 μ 1脂質(zhì)體用無血清無雙抗培養(yǎng)基稀釋成100 μ 1，輕輕混勻，室溫放置5分鐘；a液將5 μ g質(zhì)粒加入到100 μ 1無血清無雙抗培養(yǎng)基中，輕輕混勻；室溫放置5分鐘 后，與A液輕輕混勻，室溫放置20分鐘；(3)棄去孔內(nèi)培養(yǎng)基，每孔加入Iml無雙抗無血清1640培養(yǎng)基，將200μ IDNA-脂質(zhì)體 溶液加入到含有細(xì)胞和培養(yǎng)基的培養(yǎng)孔中，輕輕混勻；(4)將細(xì)胞培養(yǎng)于37°C含5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48小時。C8 (3)、轉(zhuǎn)染后鑒定jestern-blot法鑒定meTERT多肽的表達(dá) C8(3-1)、SDS-PAGE 培養(yǎng)48小時后分別收取轉(zhuǎn)染pcDNA3. l(+)V5His-meTERT質(zhì)粒的C0S-7細(xì)胞，轉(zhuǎn)染 pcDNA3. l(+)V5His空質(zhì)粒的C0S-7細(xì)胞以及未轉(zhuǎn)染的C0S-7細(xì)胞，用細(xì)胞裂解液將細(xì)胞裂 解，離心后取上清，分別加入等量2倍十二烷基磺酸鈉_聚丙烯酰胺凝膠電泳緩沖液，煮沸 5分鐘。各取20微升進(jìn)行轉(zhuǎn)移電泳；聚丙烯酰胺凝膠的配制方法如下分離膠12% 水2.6ml30%丙稀酰胺 3.2mlTris 10% SDS 10%過硫酸銨 TEMEDC8 (3-2)、電轉(zhuǎn)膜pH = 8. 82. Oml 80 μ 1 80 μ 1 4μ 1積層膠5% 2. Iml 0. 5mlpH = 6. 80. 38ml 30 μ 1 30 μ 1 3 μ 1電泳結(jié)束后，取一塊與凝膠等大的醋酸纖維素膜貼在凝膠上，夾于六片等大的濾紙中 間，各層之間避免產(chǎn)生氣泡；凝膠一側(cè)置于陰極，電流160毫安轉(zhuǎn)膜3小時；取出膠在染液 中染色，觀察效果；C8(3-3)、轉(zhuǎn)膜結(jié)束后將膜取出用水洗凈，加封閉液于4°C封閉12小時，將封閉后的膜 用洗液以10分鐘/次的速度洗4次后，與1 500稀釋的抗鼠的HisB單克隆抗體共同孵5育1小時；用洗液洗2次，用磷酸鹽緩沖液洗兩次，每次10分鐘；然后與1 1000稀釋的堿 性磷酸酶標(biāo)記兔抗鼠IgG反應(yīng)1小時；再用磷酸鹽緩沖液-吐溫20洗液洗4次，加底物顯 色后，放入水中終止顯色；與染色的凝膠對比觀察實(shí)驗結(jié)果，看有無特異性條帶出現(xiàn)。
8.根據(jù)權(quán)利要求2所述的用于預(yù)防和治療腫瘤的疫苗的制備，其特征在于所述的步 驟 D 是設(shè)計了引物 T-R(EcoR I) :5，ACAGAATTCGATATCGTCCAGGCCCAGCACAGA3，，以 FT4 引物 為上游引物，以T-R(EcoR I)為下游引物，以PCR產(chǎn)物序列為模板，進(jìn)行PCR反應(yīng)，將上述 PCR產(chǎn)物分別用BamH I、EcoR I雙酶切，連入原核表達(dá)質(zhì)粒pGEX_4T中，得重組表達(dá)質(zhì)粒 pGEX-meTERT,分別經(jīng)PCR、酶切及測序鑒定，表明meTERT的DNA片段正確插入了質(zhì)粒中；將 鑒定正確的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌E. coli BL21，37°C培養(yǎng)至0D600為0.4-0.6，IPTG誘導(dǎo)表 達(dá)，收集菌體，SDS-PAGE分析；Western-blot檢測蛋白GST-meTERT的表達(dá)；親和層析純化 GST-meTERT。
9.根據(jù)權(quán)利要求2所述的用于預(yù)防和治療腫瘤的疫苗的制備，其特征在于所述的步驟 D包括如下工藝步驟Dl、PCR回收產(chǎn)物及pGEX-4T質(zhì)粒的酶切取PGEX-4T質(zhì)粒10 μ 1，用BamHI和EcoRI進(jìn)行雙酶切，酶切體系由如下體積的組分組成PGEX-4T 質(zhì)粒10 μ 1BamHI1 μ 1EcoR I1 μ 1IOXK Buffer2μ 1無菌水6 μ 1將PCR收產(chǎn)物15μ 1，用BamHI和EcoR I進(jìn)行雙酶切，酶切體系由如下體積的組分組成PCR 產(chǎn)物15 μ 1BamHI1 μ 1EcoR I1 μ 1IOXK Buffer2μ 1無菌水1 μ 1D2、采用步驟Dl的方法將DNA片段純化回收；D3、DNA的連接將步驟D2中的PCR產(chǎn)物及pGEX-4T酶切后經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳、切膠回收目的片段后連 接，連接體系由如下體積的組分組成PCR回收產(chǎn)物5μ1PGEX-4T Vector2 μ 1T4DNA連接酶1 μ 1'10 X Buffer1 μ 1反應(yīng)的條件為16°C水浴16小時； D4、酶切鑒定陽性克隆將步驟D3中的產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，提取質(zhì)粒，取提取的質(zhì)粒10μ 1，行雙酶切鑒定，酶切體系由如下體積的組分組成重組質(zhì)粒7 μ 1BamHI1 μ 1EcoR I1 μ 1IOXK Buffer2μ 1無菌水9 μ 1反應(yīng)的條件為37°C、3小時，酶切產(chǎn)物行瓊脂糖電泳分析；D5、采用步驟D4的方法進(jìn)行PCR鑒定；D6、采用步驟D4的方法將鑒定陽性的質(zhì)粒和PGEX-4T空質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化至表達(dá)宿主菌 E.coli BL21 ；D7、小量誘導(dǎo)蛋白GST-meTERT和GST表達(dá)挑取單個菌落接種于含有氨芐青霉素ΙΟΟμ g/ml的LB培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)過夜；次日 按1 50擴(kuò)大培養(yǎng)，37°C培養(yǎng)至菌密度為A600 = 0.6-0.9時，加入終濃度為lmmol/L的 IPTG，繼續(xù)培養(yǎng)4小時，取1. 5ml離心菌，100 μ 1水懸浮沉淀，加100 μ 1 2xSDS凝膠加樣緩 沖液，煮沸10分鐘，離心后取10 μ 1進(jìn)行SDS-PAGE分析； 聚丙烯酰胺凝膠的配制過程如下分離膠12%積層膠5%/K2.6ml2. Iml30% 丙稀酰胺3.2ml0.5mlTris(lmol/L)pH = 8. 82. OmlρΗ6· 80. 38ml10% SDS80 μ 130 μ 110%過硫酸銨80 μ 130 μ 1TEMED4 μ 13 μ 1D8、Western-blot 檢測蛋白 GST-meTERT 和 GST 的表達(dá)取誘導(dǎo)后的BL21表達(dá)菌株和BL21空菌株做SDS-PAGE電泳，電泳完畢，切膠浸泡于去 離子水中，并剪取與膠大小相似的PVDF膜及濾紙六張，PVDF膜在甲醇中浸泡3-5分鐘后， 將膠、PVDF膜及濾紙置電轉(zhuǎn)移液中平衡5分鐘。排列順序從負(fù)極到正極依次為三層濾紙、 膠、PVDF膜、三層濾紙，各層之間排空氣泡，兩端夾好，4°C、160毫安電轉(zhuǎn)移3小時，用IX麗 春紅染色觀察蛋白轉(zhuǎn)移效果。然后將其用水洗凈，加封閉液于4°C封閉12小時，TBST洗液 按照10分鐘/次洗4次后，與1 800稀釋的GST單抗37°C共同孵育1小時；采用上述 方法用TBST洗滌，然后與1 1000稀釋的AP標(biāo)記馬抗鼠IgG 37。C反應(yīng)1小時；TBST洗滌 2次，去離子水漂洗1次，BCIP/NBT顯色觀察結(jié)果；D9、大量誘導(dǎo)表達(dá)蛋白GST-meTERT和GST接種單菌落于100ml含羧芐青霉素100 μ g/ml的LB培養(yǎng)基，37°C培養(yǎng)過夜，按1 4 將過夜菌接種于新鮮的含羧芐青霉素100μ g/ml的LB培養(yǎng)基，37°C、250轉(zhuǎn)/分鐘培養(yǎng)3 小時，至菌液0D600 = 0.6，加入IPTG至終濃度lmmol/L，繼續(xù)培養(yǎng)5小時，離心菌，將菌體 反復(fù)3次，用超聲裂解液懸浮菌體，反應(yīng)條件為10ml/g濕菌體；超聲波破碎后，反應(yīng)條件為 350瓦X 30分鐘，4°C、8000g離心15分鐘，沉淀主要為包涵體，將上清、包涵體與Marker進(jìn) 行SDS-PAGE電泳鑒定；7D10、純化目的蛋白GST-meTERT和GST將步驟D9中的沉淀重懸于9倍體積包涵體洗液中，室溫放置5分鐘，4°C、8000g離心5 分鐘；沉淀重懸于15mlTriton/lL菌液，充分混勻，4°C、12000g離心10分鐘，重復(fù)4次；再將 沉淀重懸于去15ml Triton/IL菌液，4°C、12000g離心10分鐘；用尿素洗液15ml Triton/IL 菌液洗滌菌體，40C、12000g離心10分鐘，重復(fù)4次；溶解純化的包涵體在15ml變性緩沖液/升菌液中，充分混勻，4°C過夜，使其充分溶解； 4°C、12000g離心20分鐘，吸上清置于一干凈的新管中，加入15μ 1β-巰基乙醇，4°C、1小 時，將其裝入處理好的透析袋中，放在加入8M尿素的復(fù)性緩沖液中，4°C透析，濃度梯度為1 摩爾濃度/2小時。透析完成后，將GST-meTERT和GST分別分裝入Ep管，瞬時離心取上清，冷凍干 燥，-80°C保存。
全文摘要
本發(fā)明屬于疫苗及其制備，特別是指一種用于預(yù)防和治療腫瘤的疫苗及其制備。提供一種用于預(yù)防和治療腫瘤的疫苗，采用包括端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶表位序列的選擇、多表位端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶的核苷酸的串聯(lián)連接、多表位端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶DNA疫苗的制備、多表位端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶多表位肽疫苗的制備等工藝步驟制成。本發(fā)明解決了單一肽疫苗僅能在個別腫瘤患者中產(chǎn)生臨床效果的不足。具有免疫機(jī)體后可激活表位特異性的CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞，在CD4+T細(xì)胞分泌的Th1型細(xì)胞因子的輔助下，CD8+CTL可以特異性殺死表達(dá)TERT的腫瘤細(xì)胞，對腫瘤起到預(yù)防和治療作用等優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號C12N15/12GK101920009SQ201010131658
公開日2010年12月22日 申請日期2010年3月6日 優(yōu)先權(quán)日2010年3月6日
發(fā)明者吳麗娜, 曾瑞紅 申請人:河北醫(yī)科大學(xué)